CN107326037A

CN107326037A - 一种提高重组猪干扰素‑β融合蛋白抗病毒活性的方法

Info

Publication number: CN107326037A
Application number: CN201710584158.1A
Authority: CN
Inventors: 吴云舟; 赵伟; 朱明杰; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Harbin Zijin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Harbin Zijin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明公开了一种重组猪干扰素‑β融合蛋白的制备方法。其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明将猪干扰素‑β基因与猪免疫球蛋白CH3片段融合表达，既利于增加蛋白的稳定性和活性又增加了蛋白的表达量，经实验证明，本发明所表达的重组猪干扰素‑β与天然猪干扰素‑β的生物活性相比具有显著提高。

Description

一种提高重组猪干扰素-β融合蛋白抗病毒活性的方法

技术领域

本发明涉及一种重组的基因，尤其涉及重组猪干扰素-β基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备猪干扰素-β中的用途，属于干扰素基因工程领域。

背景技术

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。由于干扰素具有无毒、副作用和抗病毒范围广泛的优势，在发现之初就受到关注，经过多年的应用发展，干扰素已经成为一种广泛的免疫增强剂用于病毒病和肿瘤等疾病的防治领域。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为ɑ、β、γ三种。其中，干扰素-β主要是由成纤维细胞产生，在体内具有增强细胞表面HLA I、II类抗原表达，提高血清新蝶吟和-β2-微球蛋白水平、增强NK细胞活力和ADCC作用以及外周淋巴细胞2ˊ,5ˊ-寡腺苷合成酶活性。临床已将干扰素-β应用于多发性硬化症、乙型肝炎、丙型肝炎等的治疗中。

我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国,猪肉产量约占世界总产量的46%。病毒性传染病如猪瘟，蓝耳病等疾病一直是我国养猪业面临的重要问题。干扰素-β具有较强的抗病毒效应及免疫调节活性。同时，干扰素-β还可抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞以及造血细胞的增殖，抑制和杀伤肿瘤细胞，以及对免疫系统起调节作用，因此在兽药领域中的应用越来越广泛。以往干扰素-β以野生型的形式生产，虽然与天然结构相近，但半衰期较短，造成养殖户使用成本较高。因此，本专利运用基因工程操作，对原始序列进行改造，获得效果更有益的重组猪干扰素-β是当前的研究思路。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组猪干扰素-β基因，该基因可以在原核表达系统中稳定、高效的表达重组猪干扰素；

本发明目的之二是提供含有上述重组猪干扰素-β基因的表达载体；

本发明目的之三是提供由上述重组猪干扰素-β基因所转化的工程菌株；

本发明目的之四是提供一种制备重组猪干扰素-β的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组猪干扰素-β基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的重组猪干扰素-β基因是以猪干扰素-β、猪源抗体CH3区域和6个His连接而成，其中核酸序列通过优化改造为最适合原核表达宿主生产的核酸序列。

本发明的重组猪干扰素基因的结构由猪干扰素-β、6个His和猪抗体CH3区串联而成，该基因由894个核苷酸构成编码297个氨基酸。

本发明还构建了含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及用该重组表达质粒转化得到的工程菌株。

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将重组猪干扰素-β基因与大肠杆菌原核表达载体pET27b利用酶切位点BamHI和 HindIII相连，命名为pET-rIFN-β。

本发明所构建的重组表达质粒可通过各种常规的方法转化宿主细胞。作为参考，可以将含有重组猪干扰素-β基因的表达载体pET-rIFN-β转化大肠杆菌Rosetta(购自北京全式金生物技术有限公司，货号目录CD801)得到的菌株，命名为Escherichia coliRosetta/pET-rIFN-β，简称Rosetta/pET-rIFN-β。

利用大肠杆菌重组菌株Rosetta/pET-rIFN-β生产重组蛋白的具体方法可以：

1、种子液的制备：将菌种划线培养后获得单菌落，挑取单菌落于10mL LB液体培养基中，同时加入100 mg/L氨苄青霉素，37℃培养12h。

2、发酵：将获得的种子液按1：100接种于发酵培养基中，当培养至OD₆₀₀为0.4左右时，加入IPTG诱导，其终浓度为5 mM，37℃培养3h左右收菌。

本发明还提供一种制备重组猪干扰素-β的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

上述制备重组蛋白的方法中，所述的重组表达质粒优选是pET-rIFN-β；所述的宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta (DE3)，所述的重组菌株优选为Escherichia coli Rosetta/pET-rIFN-β。

上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

1、将收集的菌体悬于磷酸盐缓冲液，破碎后低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；

2、将粗提纯的蛋白再利用AKTA系统进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90%以上的蛋白。

以天然猪干扰素-β基因（猪干扰素-β基因的原始序列见附录一）代替重组猪干扰素-β基因进行以上步骤，得到可用于后续实验的天然猪干扰素-β作为对照。

本发明将猪干扰素-β与猪抗体CH3区融合表达，增加了蛋白的稳定性和活性，同时本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组猪干扰素-β在半衰期上显著优于天然猪干扰素-β。

附图说明

图1 重组猪干扰素-β的SDS-PAGE凝胶电泳结果。

图2 重组猪干扰素-β对PK-15细胞增殖的抑制作用。

图3 重组猪干扰素-β刺激p53表达的时间依赖性。

图4 重组猪干扰素-β刺激p53表达的剂量依赖性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

PK-15细胞：购自ATCC，CCL-33，由本实验室传代培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。

实施例1 重组猪干扰素-β基因质粒的构建

1、通过化学合成的方法合成所需的重组猪干扰素-β基因。

2、重组猪干扰素-β基因与pET27b载体的构建

用限制性内切酶BamHI和HindIII将上述步骤1合成的重组猪干扰素-β基因切下，同时与被相同酶切割之后的pET27b载体相连接并转化大肠杆菌DH5ɑ感受态，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序后证明重组猪干扰素-β基因已克隆至pET27b载体上，得到的重组质粒命名为pET-rIFN-β。

实施例2 高效表达重组猪干扰素基因的大肠杆菌菌株E.coli Rosetta/pET-rIFN-β的构建

用化学转化方法将pET-rIFN-β转化至E.coli Rosetta，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序分析证明获得的重组子E.coli Rosetta/pET-rIFN-β和预期一致。

实施例3 利用大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/pET-rIFN-β生产重组猪干扰素-β

1、菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/pET-rIFN-β，按1%接种量将工程菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养12-14h，次日1：100扩大培养至OD值为0.4，加IPTG至终浓度0.5mM，继续培养3h，4000 r/min，离心30 min收集菌体。

2、重组猪干扰素-β的纯化

将上述收集的菌体超声破碎离心后收集上清，将上清过滤后利用AKATA蛋白纯化系统进行纯化，先后进行亲和层析和分子筛层析得到纯化后的重组猪干扰素-β。

取少量纯化后的重组猪干扰素-β蛋白加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果见图1。

实施例4 MTT法检测猪重组猪干扰素-β蛋白对猪肾细胞PK-15增殖的抑制作用

将处于对数生长期的猪PK-15细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成细胞悬液，吹打均匀后接种于96孔板，在37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。

完成步骤1后，去掉培养基，分为6组，每组实验孔各加入2、10、50、250、1250、6250ng的重组猪干扰素-β蛋白100 μL，对照孔加100 μL DMEM。37℃，5%CO₂的条件下培养48 h。

完成步骤2后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），4 h后，弃去培养液，每孔加入150 μL的DMSO，震荡10 min后，用酶联免疫分析仪于测定波长为570 nm测定OD值，计算细胞生长的抑制率。

抑制率%=（对照组OD均值-治疗组OD值）/对照组OD均值×100%

结果见图2。从图2中可以看出，与蛋白缓冲液对照组和天然猪干扰素-β蛋白对照组相比，纯化后的重组猪干扰素-β对PK-15细胞生长有明显的抑制作用，随着浓度的增加，对PK-15细胞抑制率逐渐增加(**p<0.01)。

实施例5 Real-time PCR检测重组猪干扰素-β蛋白上调PK-15细胞p53 mRNA的表达水平

1、将处于对数生长期的PK-15细胞接种于2个六孔板（每孔2 mL），取其中一个六孔板用纯化后的重组猪干扰素-β蛋白进行刺激，将蛋白进行100倍稀释后，分别进行2h、4 h、6 h刺激。同时取另一6孔板，分别将蛋白进行10倍、100倍、1000倍稀释，刺激4 h，其中天然干扰素蛋白-β作为对照。

2、完成步骤1后，取细胞，提取细胞总RNA，反转录成cDNA。

3、以步骤2得到的cDNA为模板，使用实时荧光定量PCR技术检测p53 mRNA的相对表达情况，以-β-actin基因作为内参基因。

用于检测p53基因的引物对如下：

上游：5ˊ-TTGAGGTGCGTGTTTGTG-3ˊ

下游：5ˊ-GCAGGCTGGGCATCCTTC-3ˊ

用于检测-β-actin基因的引物对如下：

上游：5ˊ-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3ˊ

下游：5ˊ-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3ˊ

结果见图3。由图3可以看出，在相同量的重组猪干扰素-β蛋白的刺激下，重组猪干扰素-β蛋白刺激PK-15细胞的内源p53的表达水平显著高于天然猪干扰素-β蛋白(*p<0.05)。且重组猪干扰素-β蛋白刺激PK-15细胞的内源p53的表达水平在4h时达到最高。

结果见图4。由图4可以看出，并且随着天然干扰素-β和重组干扰素-β蛋白剂量的不断增加，p53 mRNA水平也具有逐渐增加的趋势，呈剂量依赖性关系，差异显著(**p<0.01)。

附录一

ATGAGCTATG ATGTGCTTCG ATACCAACAA AGGAGCAGCA ATTTGGCATG 50

TCAGAAGCTC CTGGAACAGT TGCCTGGGAC TCCTCAATAT TGCCTCGAAG 100

ATAGGATGAA CTTCGAGGTC CCTGAGGAGA TTATGCAACC ACCACAATTC 150

CAGAAGGAAG ATGCAGTATT GATTATCCAC GAGATGCTCC AGCAGATCTT 200

CGGCATTCTC AGAAGAAATT TCTCTAGCAC TGGCTGGAAT GAAACCGTCA 250

TTAAGACTAT CCTTGTGGAA CTTGATGGGC AGATGGATGA CCTGGAGACA 300

ATCCTGGAGG AAATCATGGA GGAGGAAAAT TTCCCCAGGG GAGACATGAC 350

CATTCTTCAC CTGAAGAAAT ATTACTTGAG CATTCTGCAG TACCTGAAGT 400

CCAAGGAGTA CAGAAGCTGT GCCTGGACAG TCGTCCAAGT GGAAATCCTC 450

AGGAACTTTT CTTTCCTTAA CAGACTTACA GATTACCTCC GGAACGGTGG 500

TGGTGGTAGC GGTGGTGGTG GTAGCGGTGG TGGTGGTAGC GCCAAAGGGC 550

AGACCCGGGA GCCGCAGGTG TACACCCTGC CCCCACACGC CGAGGAGCTG 600

TCCAGGAGCA AAGTCAGCAT AACCTGCCTG GTCATTGGCT TCTACCCACC 650

TGACATCGAT GTCGAGTGGC AAAGAAACGG ACAGCCGGAG CCAGAGGGCA 700

ATTACCGCAC CACCCCGCCC CAGCAGGACG TGGACGGGAC CTACTTCCTG 750

TACAGCAAGT TCTCGGTGGA CAAGGCCAGC TGGCAGGGTG GAGGCATATT 800

CCAGTGTGCG GTGATGCACG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACCCAGAAGT 850

CTATCTCCAA GACTCCGGGT AAACATCATC ATCATCATCA TTAA

序列表

<110> 哈尔滨紫霞生物科技有限公司

<120> 一种提高重组猪干扰素-β融合蛋白抗病毒活性的方法

<160> 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 894

<212> DNA

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO: 1

1 ATGTCTTACG ACGTTCTGCG TTACCAGCAG CGTTCTTCTA ACCTGGCTTG

51 CCAGAAACTG CTGGAACAGC TGCCGGGTAC CCCGCAGTAC TGCCTGGAAG

101 ACCGTATGAA CTTCGAAGTT CCGGAAGAAA TCATGCAGCC GCCGCAGTTC

151 CAGAAAGAAG ACGCTGTTCT GATCATCCAC GAAATGCTGC AGCAGATCTT

201 CGGTATCCTG CGTCGTAACT TCTCTTCTAC CGGTTGGAAC GAAACCGTTA

251 TCAAAACCAT CCTGGTTGAA CTGGACGGTC AGATGGACGA CCTGGAAACC

301 ATCCTGGAAG AAATCATGGA AGAAGAAAAC TTCCCGCGTG GTGACATGAC

351 CATCCTGCAC CTGAAAAAAT ACTACCTGTC TATCCTGCAG TACCTGAAAT

401 CTAAAGAATA CCGTTCTTGC GCTTGGACCG TTGTTCAGGT TGAAATCCTG

451 CGTAACTTCT CTTTCCTGAA CCGTCTGACC GACTACCTGC GTAACGGTGG

501 TGGTGGTTCT GGTGGTGGTG GTTCTGGTGG TGGTGGTTCT GCTAAAGGTC

551 AGACCCGTGA ACCGCAGGTT TACACCCTGC CGCCGCACGC TGAAGAACTG

601 TCTCGTTCTA AAGTTTCTAT CACCTGCCTG GTTATCGGTT TCTACCCGCC

651 GGACATCGAC GTTGAATGGC AGCGTAACGG TCAGCCGGAA CCGGAAGGTA

701 ACTACCGTAC CACCCCGCCG CAGCAGGACG TTGACGGTAC CTACTTCCTG

751 TACTCTAAAT TCTCTGTTGA CAAAGCTTCT TGGCAGGGTG GTGGTATCTT

801 CCAGTGCGCT GTTATGCACG AAGCTCTGCA CAACCACTAC ACCCAGAAAT

851 CTATCTCTAA AACCCCGGGT AAACACCACC ACCACCACCA CTAA

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 297

<212> PRT

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO: 2

1 MET Ser Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Gln Gln Arg Ser Ser Asn Leu Ala Cys Gln Lys Leu

21 Leu Glu Gln Leu Pro Gly Thr Pro Gln Tyr Cys Leu Glu Asp Arg MET Asn Phe Glu Val

41 Pro Glu Glu Ile MET Gln Pro Pro Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Val Leu Ile Ile His

61 Glu MET Leu Gln Gln Ile Phe Gly Ile Leu Arg Arg Asn Phe Ser Ser Thr Gly Trp Asn

81 Glu Thr Val Ile Lys Thr Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Gln MET Asp Asp Leu Glu Thr

101 Ile Leu Glu Glu Ile MET Glu Glu Glu Asn Phe Pro Arg Gly Asp MET Thr Ile Leu His

121 Leu Lys Lys Tyr Tyr Leu Ser Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Arg Ser Cys

141 Ala Trp Thr Val Val Gln Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe Leu Asn Arg Leu Thr

161 Asp Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

181 Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu

201 Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp

221 Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro

241 Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser

261 Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val MET His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

281 Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys His His His His His His ***

Claims

1.一种重组猪干扰素-β基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1的重组猪干扰素-β基因所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述重组猪干扰素-β基因的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：其为原核表达载体。

5.由权利要求3或4的重组表达载体所转化得到的重组菌株。

6.一种制备重组猪干扰素-β的方法，包括以下步骤：

构建含有权利要求1所述重组猪干扰素-β基因的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

（1）将收集的菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，破碎后0-4℃低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；

（2）将粗提纯的蛋白再利用AKTA系统进行分子筛的纯化，即得。