DD243713A1

DD243713A1 - PROCESS FOR OBTAINING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST RAT PERITONEAL MAST CELLS

Info

Publication number: DD243713A1
Application number: DD27969585A
Authority: DD
Inventors: Heinrich Repke; Suse-Brigitte Savoly; Jutta Odarjuk; Norbert Rossow
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-08-15
Filing date: 1985-08-15
Publication date: 1987-03-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikoerpern gegen Ratten-Peritonealmastzellen. Durch den Einsatz dieses Antikoerpers zur Separation von Mastzellpopulationen und potentiellen Praekusorzellen von Mastzellen aus natuerlichen Peritonealzellsuspensionen bzw. Kulturen unreifer lymphatischer Stammzellen ist eine neue Moeglichkeit zur Analyse des Problems der Mastzelldifferenzierung gegeben. Die Aufgabe wurde durch die Immunisierung von Maeusen mit chemisch modifizierten Praeparationen zytoplasmatischer Membranen reiner Ratten-Peritonealmastzellen geloest, wobei durch Fusion der Immun-Milzzellen mit einer speziellen Maus-Myelomzellinie Klone von Hybridzellen gebildet werden koennen, die den genannten Antikoerper in das Kulturmedium absondern. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a method for obtaining monoclonal antibodies to rat peritoneal mast cells. The use of this antibody to separate mast cell populations and potential precancerous cells from mast cells from natural peritoneal cell suspensions or cultures of immature lymphoid stem cells provides a new opportunity to analyze the problem of mast cell differentiation. The object was achieved by the immunization of mice with chemically modified preparations of cytoplasmic membranes of pure rat peritoneal mast cells, wherein clones of hybrid cells can be formed by fusion of the immune spleen cells with a special mouse myeloma cell line, secrete said antibody in the culture medium. The field of application of the invention is the pharmaceutical industry.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-Pertionealmastzellen. Durch den Einsatz dieses Antikörpers zur Separation von Mastzellpopulationen und potentiellen Präkusorzellen von Mastzellen aus natürlichen Peritoneal-Zellsuspensionen bzw. Kulturen unreifer lymphatischer Stammzellen ist eine neue Möglichkeit zur Analyse des Problems der Mastzelldifferenzierung gegebenThe invention relates to a method for obtaining monoclonal antibodies against rat Pertionealmastzellen. By using this antibody for the separation of mast cell populations and potential precancer cells from mast cells from natural peritoneal cell suspensions or cultures of immature lymphoid stem cells, a new possibility for analyzing the problem of mast cell differentiation is given

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie. The field of application of the invention is the pharmaceutical industry.

Characteristic of the known technical solutions

In der Fachliteratur ist bereits bekannt, daß durch Fusion einer Zelle, die einen Antikörper zu erzeugen vermag, mit einer in vitro kultivierten Myelomzelle ein Hybridoma-Zellklon erhalten werden kann, der einen spezifischen Antikörper produziert (Köhler et al., Nature 256,495-497 [1975] und Eur. J. Immunol. 6, 511-519 [1976]).It is already known in the literature that a hybridoma cell clone which produces a specific antibody can be obtained by fusion of a cell which is capable of producing an antibody with an in vitro cultured myeloma cell (Köhler et al., Nature 256, 495-497). 1975] and Eur. J. Immunol., 6, 511-519 [1976]).

Es wurden monoklonale Antikörper beschrieben, die mit hoher Selektivität mit den Granula menschlicher Mastzellen (Rimmer et al., J. Clin. Pathol.37,1 249-1255 [1984]) reagieren. Darüber hinaus wurde über solche monoklonalen Antikörper berichtet, mit deren Hilfe Membranantigene von monokleären Zellen und Mastzellen der Maus erkannt werden können. Dabei konnten unterschiedliche Antigene auf in Kultur differenzierten Mastzellen und Peritonealmastzellen nachgewiesen werden (Katz et al., Proc. Nat. Acad. Sei [USA] 80, 5916-5918 [1983]). . ·Monoclonal antibodies have been described which react with high selectivity with human mast cell granules (Rimmer et al., J. Clin. Pathol. 37, 1249-1255 [1984]). In addition, monoclonal antibodies have been reported that can be used to detect membrane antigens from monoclonal cells and mouse mast cells. Different antigens could be detected on culture-differentiated mast cells and peritoneal mast cells (Katz et al., Proc. Nat. Acad. [USA] 80, 5916-5918 [1983]). , ·

Es ist jedoch nachteilig, daß die hier genannten Antikörper nicht für das international gebräuchliche Modell zur Testung potentieller Antianaphylaktika, die Ratten-Peritonealmastzelle, anwendbar sind.However, it is disadvantageous that the antibodies mentioned here are not applicable to the internationally used model for testing potential antianaphylactics, the rat peritoneal mast cell.

Weiterhin ist nachteilig, daß die Antikörper, die gegen Maus-Mastzellen hergestellt wurden, durch Immunisierung mit kultivierten (d.h. hinsichtlich ihres Antigenspektrums veränderten) Mastzellen induziert wurden. Weiterhin sind diese Antikörper hinsichtlich ihrer Selektivität unzureichend charakterisiert. Die gegen humane Mastzellgranula gerichteten Antikörper erlauben nicht den Nachweis undegranulierter Mastzellen.It is also disadvantageous that the antibodies produced against mouse mast cells were induced by immunization with cultured (i.e., altered in their antigenic spectrum) mast cells. Furthermore, these antibodies are insufficiently characterized in terms of their selectivity. The antibodies directed against human mast cell granules do not allow the detection of undegranulated mast cells.

Bisher ist ein Hybridoma-Zellklon, der einen gegen antigene Oberflächendeterminanten der RattenmastzelIe gerichteten Antikörper in das Nährmedium ausscheidet, nicht bekannt geworden.Heretofore, a hybridoma cell clone secreting an antibody directed against antigenic surface determinants of the rat mast cell into the nutrient medium has not become known.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von Antikörpern, die in der Lage sind, selektiv mit Differenzierungsantigenen zu reagieren, die auf derZytoplasmamembran von Ratten-Peritonealmastzellen und deren potentiellen Präkursorzellen aus der mononukleären Reihe vorkommen. Damit sollen neue Möglichkeiten für das Verständnis der Mastzelldifferenzierung sowie zur Trennung bislang unbekannter Subpopulationen von Peritonealzellen eröffnet werden. Derartige Subpopulationen'sollen u.a. als neuartige Testmodelle für Immunpharmaka Verwendung finden.The object of the invention is to produce antibodies capable of selectively reacting with differentiation antigens present on the cytoplasmic membrane of rat peritoneal mast cells and their potential precursor cells from the mononuclear series. This will open up new possibilities for the understanding of mast cell differentiation as well as for the separation of previously unknown subpopulations of peritoneal cells. Such subpopulations should u.a. find use as novel test models for immunopharmaceuticals.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Hybridome herzustellen, die monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächenantigene der Rattenmastzelle und ihrer potentiellen Präkursorzellen erzeugen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß mit kultivierten Myelomzellen der Maus und Zellen aus der Milz einer zur Antikörperproduktion gegen Rattenmastzellen stimulierten Maus eine Zellfusion durchgeführt wurde. Die Kultivierung der entstandenen Hybride im Selektionsmedium führte zu Populationen von Hybridzellen, die die genannten monoklonalen Antikörper zu bilden imstande sind. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in folgendem:The object of the invention is to produce hybridomas which generate monoclonal antibodies against cell surface antigens of the rat mast cell and its potential precursor cells. The object was achieved by carrying out a cell fusion with cultured mouse myeloma cells and cells from the spleen of a mouse stimulated to produce antibodies against rat mast cells. The cultivation of the resulting hybrids in the selection medium resulted in populations of hybrid cells capable of producing said monoclonal antibodies. The advantage of the present invention consists in the following:

1. Es werden Antikörper gegen die, international als Modell für die Testung potentieller Antianaphylaktika gebräuchliche Ratten-Peritonealmastzelle erzeugt.1. Antibodies to the rat peritoneal mast cell commonly used as a model for the testing of potential antianaphylactics are generated.

2. Als Ausgangsmaterial der zur Immunisierung verwendeten Präparationen wurden frisch präparierte, nahezu vollständig gereinigte Ratten-Peritonealmastzellen benutzt.2. As starting material of the preparations used for immunization, freshly prepared, almost completely purified rat peritoneal mast cells were used.

3. Zur Vermeidung immunsuppressiver Effekte der Inhaltsstoffe der Mastzellgranula wurden diese durch Homogenisation mit anschließender Dichtegradientenzentrifugation nahezu vollständig von den zytoplasmatischen Membranen getrennt.3. To avoid immunosuppressive effects of the ingredients of the mast cell granules they were almost completely separated from the cytoplasmic membranes by homogenization followed by density gradient centrifugation.

4. Eine weitere Antigenpräparation wurde ausgehend von intakten, nahezu vollständig gereinigten Ratten-Peritonealmastzellen durch Acetonextraktion und Glutaraldehydfixierung erzeugt. Durch dieses Verfahren findet neben der Eliminierung der Granula-Inhaltsstoffe eine strukturelle chemische Modifikation der potentiellen Antigene statt.4. Another antigen preparation was generated from intact, almost completely purified rat peritoneal mast cells by acetone extraction and glutaraldehyde fixation. Through this process, in addition to the elimination of the granule ingredients, a structural chemical modification of the potential antigens takes place.

5. Zur Immunisierung wurden Mastzellpräparatipnen analog Punkt 3. und 4. (die 5 χ 10⁶ Zellen entsprachen) im Verhältnis 1:1 i.p. injiziert sowie ein 0,5 bis 1 x 10⁶ Zellen entsprechendes Äquivalent unter Zusatz von kompletten Freundschen Adjuvans in die axilliären Lymphknoten gespritzt.5. For immunization, mast cell preparations were injected ip analogously to items 3 and 4 (which corresponded to 5 × 10 ⁶ cells) in a ratio of 1: 1, and an equivalent equivalent to 0.5 to 1 × 10 ⁶ cells was added with Freund's complete adjuvant injected axillary lymph node.

6. Entsprechend der Aufgabenstellung konnte eine spezifische Reaktion der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit Peritonealmastzellen und bestimmten Zellpopulationen der mononukleären Reihe nachgewiesen werden, während mit den anderen untersuchten Zellen bzw. Geweben der Ratte keine Reaktion auftrat (Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark, mononukleäre Zellen und Granulozyten des Blutes, Erythrozyten, Leber, Hirn; vergl. Abb. 1). Die o. g. Antikörper gehören nicht zur Immunglobulinklasse E und weisen keine Anti-Ratte-lgE-Aktivität auf. Die Klone 14-1 /D5,14-1/F2,14-3/C12 und 14/3/A12 sind im Institut für Wirkstofforschung der ADW der DDR zugänglich und die Antikörper wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie der ADW der DDR unter den Nummern DDR 0130, DDR 0131 registriert. Die Erfindung soll anhand eines Beispiels näher erläutert werden.6. According to the task, a specific reaction of the monoclonal antibodies according to the invention with peritoneal mast cells and certain cell populations of the mononuclear series could be detected, whereas no reaction occurred with the other cells or tissues of the rat examined (spleen, lymph node, thymus, bone marrow, mononuclear cells and Granulocytes of the blood, erythrocytes, liver, brain, see Fig. 1). The o. G. Antibodies do not belong to immunoglobulin class E and have no anti-rat IgE activity. The clones 14-1 / D5,14-1 / F2,14-3 / C12 and 14/3 / A12 are available at the Institute of Drug Discovery of the ADW of the GDR and the antibodies were in the Central Institute of Molecular Biology of the ADW of the GDR under the numbers DDR 0130, DDR 0131 registered. The invention will be explained in more detail by way of example.

embodiment

A) Herstellung einer den Antikörper erzeugenden Zelle 1. Präparation des AntigensA) Preparation of an antibody-producing cell 1. Preparation of the antigen

Nach Ethernarkose und Dekapitierung männlicher Wistarratten im Alter von 3 bis 4 Monaten wurden 10 ml isotonische Phosphatpuffer, pA 7,4 (PBS), intraperitoneal appliziert. Nach Peritonealmassage (1,5 Minuten) wurde der Bauchraum geöffnet, das Peritonealexsudat entnommen und in ein 10μ,Ι Heparin enthaltendes Zentrifugenglas gegeben. Das durch Zentrifugation gewonnene Zellpellet (10 Min./160 χ g; 4°C) wurde in 1 ml isotonischem Phosphatpuffer suspendiert und auf einen kontinuierlichen Percoll-Gradienten geschichtet. Es schloß sich eine Zentrifugation bei 4°C für 20 Minuten bei 380 χ g an. Die Mastzellfraktion (Ausbeute 40 bis 60%) wurde durch Zentrifugation (10 Min. 160 x g, 4 C) zweimal in PBS-(I % HSA) gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet in 1 ml PBS-(I % HSA) aufgenommen, die Zellzahl ermittelt und mittels Neutralrotfärbung der Reinheitsgrad der Präparation bestimmt, der bei 97 bis 100% Mastzellen lag.After ether anesthesia and decapitation of male Wistar rats at the age of 3 to 4 months, 10 ml of isotonic phosphate buffer, pA 7.4 (PBS), were administered intraperitoneally. After peritoneal massage (1.5 minutes), the abdomen was opened, the peritoneal exudate removed and placed in a centrifuge tube containing 10μ, heparin. The cell pellet recovered by centrifugation (10 min / 160 g, 4 ° C) was suspended in 1 ml of isotonic phosphate buffer and layered on a continuous Percoll gradient. It was followed by centrifugation at 4 ° C for 20 minutes at 380 χ g. The mast cell fraction (yield 40 to 60%) was washed by centrifugation (10 min. 160 x g, 4 C) twice in PBS (1% HSA). Finally, the pellet was taken up in 1 ml of PBS (I% HSA), the cell count determined and determined by neutral red staining the purity of the preparation, which was 97 to 100% mast cells.

Zur Herstellung granulafreier Membranfragmente wurde die so gereinigte Mastzellsuspension im Potter-Homogenisator homogensiert, gewaschen (4°C, 10Min. bei 160 χ g) und in 1 ml PBS-(I % HSA) aufgenommen. Die erste Abtrennung freier Mastzellgranula erfolgte durch Überschichtung auf eine 100%ige Saccharoselösung und nachfolgender Zentrifugation bei 160 χ g (10 Min., 4⁰C). Das entstandene Pellet setzt sich aus Membranen und Zytoskelett-Granula-Assoziaten zusammen. Das in isotonem Puffer gewaschene Pellet wird mit 0,3 ml einer gesättigten Saccharoselösung für 15 Minuten inkubiert und anschließend mit 10ml eines hypotonen Phosphatpuffers (30 Minuten) einem osmotischen Schock unterworfen. Durch die nachfolgende milde Ultraschallbehandlung (45Min., Raumtemperatur) werden Zytoskelett-Granula-Aggregate aufgelöst. Das durch Zentrifugation (10 Minuten, 160 χ g,4°C) entstehende Pellet wird in 1 ml isotonischem Phosphatpuffer resuspendiert. Die Abtrennung der freien Granula erfolgt wie oben beschrieben. Die Fixierung der Mastzellen erfolgte so, daß das Pellet gereinigter Mastzellen für 5 Minuten mit 5 ml eiskaltem Aceton (p.A.) versetzt und anschließend zentrifugiert wurde (4⁰C, 10 Min., 160 x g). Danach erfolgte bei Raumtemperatur die Zugabe von 2 ml Glutaraldehyd (2,5%ig) für 5 Min., dessen Überschuß durch zweimaliaes Waschen im PBS (4⁰C, 10Min., 160 x g) entfernt wurde.To prepare granule-free membrane fragments, the thus purified mast cell suspension was homogenized in a Potter homogenizer, washed (4 ° C., 10 min at 160 g) and taken up in 1 ml PBS (I% HSA). The first separation of free mast cell granules was carried out by coating on a 100% sucrose solution and subsequent centrifugation at 160 g (10 min., 4 ⁰ C). The resulting pellet is composed of membranes and cytoskeletal granule associates. The pellet washed in isotonic buffer is incubated with 0.3 ml of a saturated sucrose solution for 15 minutes and then subjected to osmotic shock with 10 ml of a hypotonic phosphate buffer (30 minutes). Subsequent mild sonication (45 min, room temperature) dissolves cytoskeletal granule aggregates. The pellet formed by centrifugation (10 minutes, 160 χ g, 4 ° C) is resuspended in 1 ml of isotonic phosphate buffer. The separation of the free granules is carried out as described above. The fixation of the mast cells was carried out so that the pellet of purified mast cells for 5 minutes with 5 ml of ice-cold acetone (pA) and then centrifuged (4 ⁰ C, 10 min., 160 xg). Thereafter, at room temperature, the addition of 2 ml of glutaraldehyde (2.5%) for 5 min., The excess was removed by washing twice in PBS (4 ⁰ C, 10min, 160 xg).

2. Immunisierung der Mäuse2. Immunization of the mice

Zur Immunisierung der weiblichen A/J χ Balb/c F1-Hybride wurde eine Mischung von Membranen und fixierten Zellen im Volumenverhältnis 1:1 verwendet. Es wurden jeweils 5 χ 10⁶ Zellen (und die aus dieser Zellmenge gewonnenen Membranfragmente) in 0,5mi PBS i.p. und 0,5 bis 1 x 10⁶Zellen bzw. Zelläquivalente (1:3 mit komplettem Freundschen Adjuvans gemischt) in die axilliären Lymphknoten appliziert. Immunisiert wurde am 1 .,8. und 29.Tag. Die Fusion erfolgte 4 Tage nach der letzten Immunisierung.For immunization of the female A / J Balb / c F1 hybrids, a mixture of membranes and fixed cells in the volume ratio 1: 1 was used. In each case, 5 × 10 ⁶ cells (and the membrane fragments obtained from this amount of cells) were mixed in 0.5 ml PBS ip and 0.5 to 1 × 10 ⁶ cells or cell equivalents (mixed 1: 3 with Freund's complete adjuvant) into the axillary lymph nodes applied. Was immunized on 1, 8. and 29th day. The fusion took place 4 days after the last immunization.

3. Gewinnung der Milzzellsuspension3. Extraction of the spleen cell suspension

Immun-Milzzellen der Maus wurden unter sterilen Bedingungen durch Homogenisation vereinzelt und nach Filtration durch Müller-Gaze 2 x mit PRMI 1640 mit2mM Glutamin (RPMI-GIu) gewaschen (10Min., 200 X g) und auf 1,4 x 10⁷ Milzzellen/ml verdünnt.Murine immune spleen cells were isolated by homogenization under sterile conditions and, after filtration through Müller gauze, washed twice with PRMI 1640 with 2 mM glutamine (RPMI-Glu) (10 mM, 200 × g) and on 1.4 × 10 ⁷ spleen cells / ml diluted.

B) Cell fusion to form the hybridoma cell clones

Die nach A) 3. erzeugte Milzzellsuspension (7 χ 10⁷ Zellen) wurde mit 5 x 10^e serumfrei gewaschenen Myelomzellen der ZellinieP301 (ACOLLA, Lousanne) bei 4⁰C vermischt, welche vorher 48 Std. in vitro kultiviert wurden. Die Zellsuspension wurde anschließend bei4°Csedimentiert. Die anschließende Fusionsprozedur erfolgte im Wasserbad bei +37⁰C. Zunächst wurden 0,5 ml Polyethylenglykol, MG: 1000 (42%ig), unter ständigem Bewegen der Zellsuspension im Verlaufe einer Minute und dann 0,5ml Polyethylenglykol (25%ig) ebenfalls innerhalb der gleichen Zeitspanne zugetropft. Anschließend wurden in der gleichen Weise 4ml RPMI-GIu im Verlaufe von 4 Minuten zugesetzt. In 27 ml desauf 37⁰C vorgewärmten kompletten Nährmediums (RPMI-GIu + 20% ultrafiltriertes Rinderserum der Fa. Bioveta, CSSR + 5 x 10"⁵M Mercaptoethanol) wird diese Zellsuspension in einem Erlenmeyer-Kolben unterschichtend zugesetzt. Dann erfolgte zum Abschluß der Fusionsprozedur die Inkubation bei 37⁰C über 3 Stunden in einem CO₂-lnkubator. Während dieser Zeit wurde der Kolben mehrmals vorsichtig geschwenkt. Nach Abschluß der Inkubation werden je 0,1 ml der Zellsuspension in die jeweils 96 Vertiefungen von Falcon-Mikrotestplatten übertragen. Diese wurden 24 Stunden vorher mit 7 χ 10~⁴ Feederzellen in 0,1 ml beschickt.The 3rd to A) generated spleen cell suspension (7 χ 10 ⁷ cells) was incubated with 5 x 10 ^e serum-free washed myeloma cells ZellinieP301 (Acolla, Lousanne) mixed at 4 ⁰ C, which 48 hours previously. Were cultured in vitro. The cell suspension was then sedimented at 4 ° C. The subsequent fusion procedure was carried out in a water bath at +37 ⁰ C. First, 0.5 ml of polyethylene glycol, MG: 1000 (42%), while constantly moving the cell suspension in the course of a minute and then 0.5 ml of polyethylene glycol (25%) also dropped within the same time period. Subsequently, 4 ml of RPMI-Glu were added in the same manner over 4 minutes. In 27 ml desauf 37 ⁰ C pre-warmed complete growth medium (RPMI-Glu + 20% ultrafiltered bovine serum Fa. Bioveta, CSSR + 5 x 10 ^"5 M mercaptoethanol), this cell suspension was added with schichtend in an Erlenmeyer flask. Then followed the completion of the Fusion procedure, the incubation at 37 ⁰ C for 3 hours in a CO ₂ -lnkubator. During this time, the flask was repeatedly gently mixed. After completion of the incubation, each 0.1 ml of the cell suspension are transferred into each of 96 wells of Falcon microtest plates. these were incubated for 24 hours in advance charged with 7 χ ~ 10 ⁴ feeder cells in 0.1 ml.

C) Selection of hybridoma cell clones

Die Selektio der aufwachsenden Hybridzellklone erfolgte im HAT-Medium nach Littlefield. Nach 1,3, 6 und 9 Tagen wurden 100/aI des Mediums entnommen und durch frisches HAT-Medium ersetzt. Nach weiteren 4 Tagen wurde HT-Medium verwendet.The selection of the growing hybrid cell clones was carried out in the HAT medium according to Littlefield. After 1.3, 6 and 9 days, 100 / aI of the medium was removed and replaced with fresh HAT medium. After another 4 days HT medium was used.

D) Generation and isolation of the antibodies

Nach 14 Tagen erfolgte der erste Test der Klonüberstände gegen gereinigte intakte Mastzellen im indirekten Immunofluoreszenztest. Zur Testung unter Einsatz geringer Zellmengen wurde eine Testplatte mit 96 Vertiefungen und einem Glasboden verwendet. Pro Vertiefung wurden ca. 5 bis 20000 Zellen eingesetzt, die durch Zentrifugation der Platte (10 Min., 150g, Raumtemperatur) so fest an den Glasboden gebunden werden, daß eine nachweisbare Ablösung während der Waschprozeduren unterbleibt. 50μΙ der Klonüberstände wurden pro Vertiefung appliziert. Anschließend wurde die Testplatte in einer feuchten Kammer bei 37⁰C für 60 Min. inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden pro Vertiefung 20μΙ ZAMAK-FITC pipettiert und erneut bei 37⁰C für 45 Min. inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS erfolgte die Auswertung.After 14 days, the first test of the clone supernatants against purified intact mast cells was carried out in the indirect immunofluorescence test. For testing using small amounts of cells, a test plate with 96 wells and a glass bottom was used. Approximately 5 to 20,000 cells were used per well, which are so firmly bound to the glass bottom by centrifuging the plate (10 min, 150 g, room temperature) that there is no detectable detachment during the washing procedures. 50μΙ of the clone supernatants were applied per well. Subsequently, the test plate was incubated in a humid chamber at 37 ⁰ C for 60 min. After washing twice with PBS were pipetted per well 20μΙ ZAMAK-FITC, and incubated again at 37 ⁰ C for 45 min.. After washing three times in PBS, the evaluation was carried out.

E) Specificity and properties of the monoclonal antibodies

Zur Untersuchung der Spezifität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wurden diese mit Hilfe des indirekten Immunofluoreszenztestes hinsichtlich der Reaktion mit anderen lymphatischen Zellen der Ratte getestet bzw. mit Homogenaten verschiedener Organe der Ratte absorbiert. Die hierzu benötigten Gewebspräparationen wurden wie folgt hergestellt:To investigate the specificity of the monoclonal antibodies according to the invention, they were tested with the aid of the indirect immunofluorescence test with respect to the reaction with other rat lymphatic cells or absorbed with homogenates of various organs of the rat. The tissue preparations required for this purpose were prepared as follows:

— Peritonealzellen wurden aus dem Bauchraum nach Injektion von 10ml isotonischem Puffer und Massage gewonnen,- Peritoneal cells were obtained from the abdominal cavity after injection of 10ml isotonic buffer and massage,

— Peritonealmakrophagen wurden 3 Tage nach Paraffinstimulation aus dem Peritoneum entnommen,- peritoneal macrophages were removed from the peritoneum 3 days after paraffin stimulation,

— Knochenmarkzellen wurden aus Knochen der hinteren Extremitäten gewonnen,Bone marrow cells were derived from hind limb bones,

— Einzelzellsuspensionen von Milz, Thymus und Lymphknoten werden durch schonende Homogenisation des Gewebes und Gazefiltration gewonnen,- Single cell suspensions of spleen, thymus and lymph nodes are obtained by careful homogenization of the tissue and gauze filtration,

— Granulozyten und mononukleäre Zellen des Blutes wurden mit Hilfe von Ficoll/Visotrast-Gradienten gewonnen.- Granulocytes and blood mononuclear cells were obtained using Ficoll / Visotrast gradients.

— Zu Absorbtionsuntersuchungen wurden Homogenatevon Leber, Hirn und Milz hergestellt, die im Volumenverhältnis4:1 mit unterschiedlichen Verdünnungsstufen der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bei 25⁰C für 60 Min. inkubiert und durch Zentrifugation eliminiert wurden. Der Absorbtionserfolg wurde durch den Vergleich der Reaktion der unterschiedlichen Verdünnungsstufen mit der Reaktion unabsorbierter Klonüberstände gegenüber Ratten-Peritonealmastzellen im Immunofluoreszenztest bewertet.For absorption studies, homogenates of liver, brain and spleen were prepared, which were incubated at a volume ratio of 4: 1 with different dilution stages of the monoclonal antibodies according to the invention at 25 ^° C. for 60 min. And eliminated by centrifugation. Absorbance success was assessed by comparing the reaction of different dilution levels with the reaction of unabsorbed clone supernatants to rat peritoneal mast cells in the immunofluorescence assay.

Die in Abb. 1 zusammengefaßten typischen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Antikörper mit 100% der Peritonealmastzellen, 60% der Gesamtperitonealzellen und rund 35% der Peritonealmakrophagen, die nach Paraffinstimulation gewonnen wurden, reagieren. Alle anderen untersuchten Zellen bzw. Gewebe der Ratte weisen keine Reaktion mit den Antikörpern auf.The typical results summarized in FIG. 1 show that the antibodies according to the invention react with 100% of the peritoneal mast cells, 60% of the total peritoneal cells and approximately 35% of the peritoneal macrophages obtained after paraffin stimulation. All other cells or tissues of the rat examined have no reaction with the antibodies.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gehören nicht zur Klasse der Immunoglobuline E, wie durch die fehlende Reaktion mit Peritonealmastzellen und anderen Peritonealzellen von zwei Mausstämmen gezeigt werden konnte. Die o.g.The monoclonal antibodies of the invention do not belong to the class of immunoglobulins E, as could be demonstrated by the lack of reaction with peritoneal mast cells and other peritoneal cells of two mouse strains. The o.g.

Antikörperführen in Abwesenheit von Phosphatidylserin nicht zur Mediatorfreisetzung aus Ratten-Peritonealmastzellen und stellen somit keine Anti-Ratten-lgE-Antikörper dar.In the absence of phosphatidylserine, antibodies do not mediate release from rat peritoneal mast cells and thus do not constitute anti-rat IgE antibodies.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper beeinflussen die durch Protaminsulfat, Poly-L-Lysin, Compound 48/80, A23187 bzw. durch Mellitin induzierte Mediatorfreisetzung aus Ratten-Peritonealmastzellen nicht.The monoclonal antibodies according to the invention do not influence the mediator release from rat peritoneal mast cells induced by protamine sulfate, poly-L-lysine, compound 48/80, A23187 or by mellitin.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wird nicht durch Einfrieren (-2O⁰C) und Auftauen beeinflußt.The activity of the monoclonal antibodies of the invention is not affected by freezing (-2O ⁰ C) and thawing.

Das Einfrieren und Reaktivieren der entsprechenden antikörperproduzierenden Hybridzellklone beeinflußt deren Antikörperbildung nicht.The freezing and reactivation of the corresponding antibody-producing hybrid cell clones does not affect their antibody formation.

Claims

A process for the production of monoclonal antibodies to rat peritoneal mast cells, characterized in that a hybrid cell between a cell that has been stimulated. To form antibodies against freshly prepared rat peritoneal mast cells, using a mixture of mast cell membranes and fixed mast cells for immunization, and a cell that can be permanently maintained by in vitro culture, and that which is secreted by the hybrid cell Antibody specific for a surface antigen of mast cells and other rat peritoneal cells.

2. Method according to item!, Characterized in that the cell which can form the antibody is a spleen cell.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the cell originates from a mouse.

4. The method according to item 1 to 3, characterized in that it is the mouse is a BALB / c mouse or a hybrid mouse thereof.

5. Method according to item 1, characterized in that the cell, which can be permanently maintained by an in vitro subculture, is a myeloma cell.

6. The method according to item 1, characterized in that the cell, which can be maintained permanently by an in vitro subculture, has a lack of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase.

7. The method according to item 5 or 6, characterized in that the cell originates from a mouse.

8. Method according to item 7, characterized in that the cell originates from the cell line P301.

9. The method according to item!, Characterized in that the spleen cell originates from an animal immunized with mast cell preparations.

10. The method according to item 1 and 9, characterized in that a mixture of mast cells and native mast cell membranes is used for immunization.

11. The method according to item 1,9 and 10, characterized in that mast cell preparations of 95 to 99% purity are used.

12. The method according to item 1 and 9 to 11, characterized in that the mast cells are fixed with acetone and glutaraldehyde.

13. The method according to item 9 to 11, characterized in that are produced by homogenization, osmotic shock, ultrasound treatment and density gradient centrifugation granulafreie membrane preparations from rat peritoneal mast cells.

14. The method according to item 1 and 9 to 11, characterized in that the fixed mast cells and the mast cell membranes in a ratio of 1: 1 mixed used for the immunization.

15. The method according to item 1 and 9 to 14, characterized in that about 5 χ 10 ⁶ mast cells or the membranes obtained from this amount of cells per immunization ip and 0.5 to 1 χ 10 ⁶ mast cells corresponding number of membrane fragments in the axillary lymph nodes which are mixed with 1: 3 Freunds complete adjuvant.

16. The method according to item!, Characterized in that the hybrid cell is prepared in the presence of polyethylene glycol.

17. The method according to item I, characterized in that the hybrid cell is cultured in hypoxanthine, aminoopterin and thymidine containing medium for selection.

18. The method according to item!, Characterized in that clones are produced by hybrid cells.

19. The method according to item 1 and 18, characterized in that the limited dilution method is used for cloning.

20. The method according to item 1, characterized in that hybrid cells for secretion of the antibody are cultured in vitro.

See 1 page table