PT2200622E - Células aderentes provenientes de tecido adiposo ou placentário e respetiva utilização terapêutica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

CÉLULAS ADERENTES PROVENIENTES DE TECIDOS ADIPOSOS OU DE PLACENTA E RESPETIVA UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICA

ÂMBITO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos de tratamento de doenças que utilizam células aderentes de tecidos adiposos ou da placenta, mais especificamente a métodos de tratamento da isquemia e/ou de situações médicas que exijam a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo através da utilização das células aderentes.

No mundo da Medicina em desenvolvimento existe uma crescente necessidade de grandes quantidades de células estaminais adultas para enxertos de células e engenharia de tecidos. Para além disso, a terapia com células estaminais adultas está em continuo desenvolvimento no que respeita ao tratamento e à cura de diversas patologias, como os distúrbios hematopoiéticos, as doenças cardíacas, a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, os acidentes vasculares cerebrais, queimaduras, a distrofia muscular, as doenças autoimunes, a diabetes e a artrite.

Nos últimos anos, considerável atividade tem-se centrado no potencial terapêutico das células estromais mesenquimatosas (MSC) para várias aplicações médicas, entre as quais a reparação de tecidos de órgãos danificados como o cérebro, o coração, os ossos e o fígado, e o apoio de transplantes de medula (BMT). As MSC, uma população heterogénea de células obtida, por exemplo, a partir da medula óssea, do tecido 1 adiposo, da placenta e do sangue, conseguem diferenciar diferentes géneros de células maduras mesenquimatosas (por exemplo, as células endoteliais reticulares, fibroblastos, adipócitos, células precursoras osteogénicas) consoante as influências de diversos fatores bioativos. Por conseguinte, as MSC têm sido amplamente estudadas na medicina regenerativa como base para a construção de novos tecidos como o osso, a cartilagem e a gordura para a reparação de lesões ou a substituição de tecidos patológicos, e como tratamento para as doenças genéticas e adquiridas [Fibbe and Noort, Ann N Y Acad Sei (2003) 996: 235-44; Horwitz et al., Cytotherapy (2005) 7(5): 393-5; Zimmet and Hare, Basic Res Cardiol (2005) 100(6): 471-81]. Além disso, a capacidade multipotente das MSC, o seu fácil isolamento e cultura, bem como o seu potencial de expansão ex vivo, torna-as um instrumento terapêutico atraente [Fibbe and Noort, supra; Minguell et al. Exp Biol Med (Maywood) (2001) 226(6): 507-20].

As MSC derivadas da placenta exibem muitos marcadores comuns às MSC isolados a partir de outros tecidos, como por exemplo, CD105, CD73, CD90 e CD29, e uma ausência de expressão de marcadores celulares hematopoiéticos, endoteliais e trofoblástico-especificos. A diferenciação adipogénica, osteogénica e neurogénica foi alcançada depois de se fazerem culturas de MSC derivadas da placenta em condições apropriadas [Yen et al., Stem Cells (2005) 23 (1): 3-9]. Para além disso, as MSC isoladas a partir da placenta e colocadas em cultura in vitro mostraram ser imunologicamente privilegiadas de uma forma semelhante às MSC. Por conseguinte, a placenta fornece uma fonte eticamente não controversa e facilmente acessível de MSC para aplicações 2 experimentais e clinicas [Zhang et al., Exp Hematol (2004) 32 (7): 657-64] .

Os presentes inventores conceberam anteriormente condições de cultura tridimensionais (3D) adequadas à expansão de MSC derivadas da placenta (WO 2007/108003).

As principais utilizações das MSC são listadas abaixo.

Isquemia

Doença arterial periférica (DAP) A doença arterial periférica (DAP) é uma doença crónica que restringe progressivamente o fluxo sanguíneo nos membros, podendo causar graves complicações médicas. Esta doença está com frequência associada a outros problemas clínicos, entre eles a hipertensão, a doença cardiovascular, a hiperlipidémia, a diabetes, a obesidade e acidentes vasculares cerebrais. A isquemia crítica dos membros (ICM) é utilizada para descrever doentes com dor induzida pela isquemia crónica, úlceras, perda ou gangrena de tecidos nos membros. A ICM representa a fase final da DAP, que necessita de tratamento global por cirurgia vascular ou de um especialista vascular. Contrariamente à doença coronária e à doença vascular cerebral, a doença arterial periférica (DAP) continua a ser um problema subestimado que, apesar de ser grave e de grande prevalência, raramente é diagnosticado e menos frequentemente ainda tratado. Por consequência, a ICM leva muitas vezes à amputação ou à morte, e as taxas de mortalidade entre doentes com DAP excedem as dos doentes com infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. 3

Em tentativas de tratar quadros isquémicos, foram utilizadas várias células estaminais adultas. Por conseguinte, a co-cultura de células estromais derivadas de tecido adiposo (ADSC) e de células endoteliais (CE) originou um aumento significativo na viabilidade, migração e formação do tubo de CE, sobretudo através da secreção de VEGF e HGF. Quatro semanas após o transplante das células estromais para o membro posterior do ratinho isquémico, os resultados angiogénicos foram melhorados [Nakagami et al., J Atheroscler Thromb (2006) 13(2): 77-81]. Moon et al. [Cell Physiol Biochem. (2006) 17: 279-90] testaram a capacidade das células progenitoras derivadas de tecido adiposo (ADSC) para tratar a isquemia dos membros em ratinhos imunodeficientes e demonstraram um aumento importante no índice de perfusão por laser Doppler no grupo transplantado com ADSC.

Além disso, quando as células estaminais mesenquimatosas derivadas de sangue do cordão umbilical (SCU) foram transplantadas em quatro homens com doença de Buerger, que haviam já sido submetidos a tratamento médico e a terapias cirúrgicas, a dor isquémica em repouso desapareceu subitamente das extremidades afetadas [Kim et al., Stem Cells (2006) 24(6): 1620-6]. Além disso, o transplante de células estaminais mesenquimatosas humanas isoladas a partir de membranas fetais de placenta de termo (FMhMSC) em corações de ratinho infartados foi associado ao aumento da densidade capilar, à normalização da função ventricular esquerda e a uma diminuição significativa do tecido de cicatrização, que foi aumentado quando as células estaminais foram pré-condicionadas com uma mistura de éster de ácido hialurónico 4 com ácido butírico e retinoico [Ventura et al., (2007) J.

Biol. Chem., 282: 14243-52].

Acidente vascular cerebral O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de morte em todo o mundo, provocando aproximadamente 9% de todas as mortes e consumindo cerca de 2-4% do total dos custos de saúde. Embora tenha havido uma redução constante na mortalidade por acidente vascular cerebral nos paises em desenvolvimento, devido muito provavelmente a um maior controlo dos fatores de risco de acidente vascular cerebral (sobretudo tensão arterial elevada, diabetes e tabagismo), o acidente vascular cerebral provoca ainda lesões permanentes (por exemplo, lesões nos tecidos e lesões neurológicas).

Novos regimes de tratamento para acidentes vasculares cerebrais incluem terapia de células estaminais. O transplante de células estaminais ou progenitoras para o local lesado, quer localmente, quer por vias intravenosas, a fim de substituir células não-funcionais, aumentar a proliferação e/ou diferenciação de células estaminais endógenas ou células progenitoras e fornecer moduladores imunológicos necessários, foi contemplado e continua a ser a mais importante estratégia baseada em células. Potenciais fontes de células estaminais/progenitoras para acidentes vasculares cerebrais incluem células estaminais fetais e neurais, células estaminais embrionárias, células de neuroteratinhocarcinoma, células estaminais não- hematopoiéticas derivadas de sangue do cordão umbilical, células estaminais derivadas de medula óssea e células 5 estaminais mesenquimatosas derivadas de placenta [Andrés et al., Neurosurg Focus (2008) m 24(3-4): E16].

Num estudo recente, Koh et. al. [Koh et al., Brain Res. (2008)] examinaram os efeitos e mecanismos neuroprotetores de células estaminais mesenquimatosas derivadas de cordão umbilical humano implantadas (hUC-MSCs) num acidente vascular cerebral isquémico num modelo experimental em ratinhos. Vinte dias após a indução de diferenciação neuronal in vitro, as hUC-MSCs exibiam caracteristicas morfológicas de neurónios e expressavam marcadores de células neuronais e fatores neuronais (por exemplo, o fator neurotrófico derivado de linha de células gliais , fator neurotrófico derivado do cérebro). Além disso, o implante in vivo das hUC-MSCs no hemisfério lesado de ratinhos com acidente vascular cerebral isquémico imunodeprimidos melhorou a função neurocomportamental e reduziu o volume de enfarte comparativamente com os ratinhos de controlo. Três semanas após o implante, as hUC-MSCs estavam presentes no hemisfério lesado e apresentavam marcadores neurónio-especificos, mas estas células não se tornaram células neuronais funcionalmente ativas.

Aplicações ortopédicas Várias doenças e patologias requerem a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo (por exemplo, ossos, tendões e ligamentos). Estas incluem, por exemplo, fraturas ósseas, queimaduras, feridas de queimadura, ferimentos profundos, degenerações ósseas, diversos cancros associados à perda de 6 tecido conjuntivo (por exemplo, cancro ósseo, osteosarcoma, metástases ósseas) e defeito da cartilagem articular. A utilização de MSC-MO autólogas para aumentar a consolidação óssea foi descrita para aplicações ortopédicas veterinárias e humanas, e inclui a injeção percutânea de medula óssea para consolidação de ligamentos (Carstanjen et al., 2006), tratamento de defeitos ósseos com autoenxertos ou aloenxertos de medula óssea em clínica ortopédica (Horwitz et al., 1999, Horwitz et al., 2002), regeneração de defeitos ósseos de dimensão crítica em cães, utilizando o carregamento com MSC da medula óssea alogénicas [Arinzeh TL, et al., J Bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(10):1927-35] ou autólogas [Bruder SP, et al. , J Bone Joint Surg Am. 1998 Jul; 80 ( 7) : 985-96 ] de um cilindro cerâmico constituído por hidroxiapatite-fosfato tricálcico, ou em coelhos, utilizando MSC alogénicas derivadas de sangue periférico (Chao et al., 2006.), e formação óssea extensa utilizando implante de MSC em babuínos (Livingston et al, 2003).

Na área da ortopedia de eguinos, as células estaminais mesenquimatosas provenientes de medula óssea e de tecido adiposo foram utilizadas experimentalmente para tratamento cirúrgico de quistos ósseos subcondrais, reparação de fraturas ósseas [Kraus and Kirker-Head,Vet Surg (2006) 35(3): 232-42] e reparação de cartilagem [Brehm et al., Osteoarthritis Cartilage (2006) 14(12): 1214-26; Wilke et al., J Orthop Res (2007) 25 (7) : 913-25] e, clinicamente, no tratamento de lesões induzidas por distensão em tendões de cavalos. Para além disso, foram utilizadas diferentes abordagens terapêuticas para promover a cicatrização de 7 ligamentos de apoio em cavalos (Herthel, 2001). Herthel (2001) apresentou uma abordagem biológica inovadora para facilitar a cicatrização de ligamentos de apoio que envolvia a injeção intralesional de células estaminais autólogas e associava componentes de medula óssea para estimular a regeneração natural dos ligamentos.

Os estudos de tendões lesionados em coelhos mostravam que os tecidos tratados com MSC eram mais fortes e mais rígidos do que os tecidos naturais regenerados (Gordon et al., 2005). Para além disso, a inoculação de MSC de cultura numa falha do tendão originava numa biomecânica de reparação significativamente melhorada (Young et al., 1998, Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

Osiris Chondrogen (células estaminais mesenquimatosas adultas) está a ser testado em doentes, a fim de avaliar a sua segurança e eficácia. Em animais tratados com MSC, o tecido meniscal removido cirurgicamente foi regenerado, a superfície da cartilagem foi protegida e observou-se uma diminuição das lesões articulares por comparação com animais de controlo. Estes benefícios persistiram em estudos com modelos animais, pelo menos durante um ano (Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Algumas formas de realização da presente invenção podem ser utilizadas para tratar a isquemia num indivíduo necessitado de tratamento através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que inclui um tecido adiposo e um tecido de placenta, tratando desta maneira a isquemia.

Algumas formas de realização da presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma situação médica que exija a regeneração e/ou reparação de tecido conjuntivo num doente que delas necessite, através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que inclui tecido adiposo e tecido de placenta, realizando assim o tratamento da situação médica que exige a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo.

Algumas formas de realização da presente invenção permitem a utilização de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que inclui um tecido adiposo e um tecido de placenta no fabrico de um medicamento identificado para o tratamento da isquemia.

Algumas formas de realização da presente invenção permitem uma utilização de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste em tecido adiposo e de placenta no fabrico de um medicamento identificado para o tratamento de uma situação médica que exija regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo.

Algumas formas de realização da presente invenção fornecem um artigo de fabrico que contém um material de embalagem que compreende uma etiqueta para utilização no tratamento da isquemia, sendo que o material de embalagem embala uma quantidade farmaceuticamente eficaz de células aderentes de 9 um tecido selecionado do grupo que consiste em um tecido adiposo e um tecido de placenta.

Algumas formas de realização da presente invenção fornecem um artigo que consiste num material de embalagem que contém uma etiqueta para utilização no tratamento de uma condição clinica que exija a regeneração e/ou reparação de tecido conjuntivo, embalando o material de embalagem uma quantidade farmaceuticamente eficaz de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste em um tecido adiposo e um tecido de placenta.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes conseguem suprimir a resposta imunológica no sujeito.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, pelo menos 10% das células aderentes estão numa fase proliferativa.

De acordo com algumas formas de realizaçao da invenção, a isquemia é doença arterial periférica (DAP).

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a doença arterial periférica (DAP) é isquemia critica de membros (ICM).

De acordo com algumas isquemia compreende a (SNC). formas de realizaçao da invenção, a isquemia do sistema nervoso central 10

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a isquemia é selecionada do grupo que consiste em doença arterial periférica, doença vascular isquémica, doença isquémica cardíaca, doença isquémica cerebral, doença isquémica renal e placenta isquémica.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes são obtidas de uma cultura tridimensional (3D) .

De acordo com algumas formas de realizaçao da invenção, a cultura tridimensional (3D) compreende um biorreator 3D.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a cultura das células na cultura 3D é realizada sob perfusão.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as condições de cultura da cultura tridimensional compreende um material aderente selecionado do grupo que contém um poliéster e um polipropileno.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a cultura das células é realizada durante, pelo menos, 3 dias.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a cultura das células é realizada até, pelo menos, 10% das células estarem a proliferar.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes contêm um marcador de expressão positiva selecionado do grupo que contém CD73, CD90, CD29 e CD105. 11

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes contêm um marcador de expressão negativa selecionado do grupo que contém CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD 14, CD 19, CD34 e CD79.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes contêm um perfil de expressão essencialmente como aqui descrito.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, as células aderentes são compostas por células que contêm um fenótipo de célula estaminal estromal.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, o fenótipo de célula estaminal estromal compreende atividade de supressão de células T.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, o tecido conjuntivo é composto por tendão, osso e/ou ligamento. De acordo com algumas formas de realização da invenção, a situação médica que exige a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo é selecionada do grupo que consiste em fratura óssea, cancro ósseo, feridas de queimadura, defeitos da cartilagem articular e ferimentos profundos.

De acordo com algumas formas de realização da invenção, a condição clinica é selecionada do grupo que contém um quisto ósseo subcondral, uma fratura óssea, uma osteoporose, uma osteoartrite, um osso degenerado, um cancro ósseo, uma lesão de cartilagem, um defeito da cartilagem articular, uma doença discai degenerativa, uma osteogénese imperfeita (01), uma 12 queimadura, uma ferida de queimadura, um ferimento profundo, uma cicatrização demorada, um tendão lesionado e um liqamento lesionado.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado normalmente utilizado pelo perito da especialidade em que se insere esta invenção. Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos na prática ou no ensaio da invenção, os métodos e os materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, prevalecerá a especificação da patente, nomeadamente as definições. Para além disso, os materiais, os métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção é aqui descrita, apenas através de exemplos, com referência aos desenhos que a acompanham. Relativamente aos desenhos em concreto, sublinha-se que os elementos apresentados são-no através de exemplos e apenas para efeitos de discussão ilustrativa das formas de realização da invenção, e são apresentados com o objetivo de fornecer o que se crê ser a descrição mais útil e facilmente compreensível dos princípios e aspetos conceptuais da invenção. Relativamente a isto, não há qualquer tentativa de mostrar os pormenores estruturais da invenção de uma forma mais detalhada do que aquela que é necessária para uma compreensão fundamental da invenção, sendo que em conjunto com os desenhos, a descrição torna evidente para o perito a maneira 13 como as várias formas da invenção podem ser realizadas na prática.

Nos desenhos:

As FIGs. 1A-G representam o microambiente semelhante ao osso criado no sistema biorreator que contém portadores 3D. As figuras 1A-B são micrografias eletrónicas que representam a comparação de osso natural (Figura IA) com a estrutura do portador 3D PluriX™ 7 dias após a sementeira de células aderentes, simulando o microambiente ósseo (Figura 1B) . As figuras 1C-F são micrografias eletrónicas que representam a matriz 3D PluriX™ semeada com células aderentes, produzidas a partir de medula óssea, 20 dias (Figuras 1C-D, ampliadas 150 e 250 vezes respetivamente) e 40 dias (Figuras 1E-F, ampliadas 350 e 500 vezes respetivamente) após sementeira. A figura 1G é um diagrama do biorreator de fluxo tampão 3D PluriX com partes separadas definidas por números: reservatório de meio de cultura (1), fornecimento da mistura gasosa (2), filtro (3), ponto de injeção (4), coluna onde são colocados os portadores 3D (5) monitor de fluxo (6), válvula de fluxo (6a), recipiente de separação (7), analisadores de crescimento celular (8); bomba peristáltica (9), ponto de amostragem (10), elétrodo de medição de 02 dissolvido (11), elétrodo de medição de pH (12), sistema de controlo (13), meio de cultura fresco (14), meio de cultura utilizado (15) . A FIG. 2 é um gráfico que representa diferentes lotes de produção de células aderentes (Lotes 5-8) provenientes 14 de placenta, cultivadas em condições de crescimento 3D nos sistemas biorreator. Foram semeadas células aderentes (2xl06) no biorreator a uma densidade de 10000-15000 células por portador. Após uma cultura de 12 dias, as 3D-aderentes atingiram uma densidade de 150.000 a 250.000 células/portador, ou seja 22,5-37,5X106 num biorreator contendo 150 portadores.

As FIGs. 3A-B são gráficos de barras que representam a diferença nos níveis de expressão de marcadores de membrana expressos em células 3D-aderentes derivadas de placenta (roxo escuro), em comparação com marcadores de membrana de células de placenta cultivadas em condições de cultura 2D convencionais (roxo claro). As células aderentes foram cultivadas durante 4 a 6 semanas em balões (2D) ou durante 2 a 3 semanas no sistema biorreator, em portadores de poliestireno (3D). Após a colheita dos balões e dos portadores, as células foram incubadas e ligadas a um painel de anticorpos monoclonais (AcM), que reconhece marcadores de membrana característicos de células aderentes (Figura 3A), ou de células hematopoiéticas (Figura 3B). É de notar a expressão significativamente mais elevada dos marcadores de membrana MSC nas células cultivadas em 2D, como se verifica nos marcadores de membrana CD90, CD 105, CD73 e CD29, comparativamente com os marcadores de membrana MSC expressos nas células aderentes cultivadas em 3D, em particular a CD105, que mostrava uma expressão de 56% em células cultivadas em 3D em comparação com 8 7% nas células cultivadas em 2D (Figura 3A) . As células aderentes de ambas as culturas, 2D e 3D, não expressaram 15 quaisquer marcadores de membrana hematopoiéticos (Figura 3B) .

As FIGs. 4A-D são gráficos de barras que representam uma comparação de níveis de proteína em células aderentes produzidas a partir da placenta cultivadas em condições 2D e 3D ou meios condicionados das mesmas. As figuras 4A-C mostram níveis de ligante Flt-3 (Figura 4A) , IL-6 (Figura 4B) e SCF (Figura 4C) em pg/ml, normalizados para lxlO6 células/ml, como analisado por ELISA, nos meios condicionados de células aderentes cultivadas em 2D e 3D. Os resultados representam uma de três experiências independentes. A Figura 4D representa os níveis de expressão de diferentes proteínas celulares, conforme analisado por espectrometria de massa com amostras de proteínas marcadas com reagentes iTRAQ, comparados uns com os outros. Foram retiradas amostras de proteínas de células aderentes cultivadas em condições 2D (barras brancas) e 3D (barras cinzentas). A figura representa uma de duas réplicas de experiências. É de notar a diferença de nivel de expressão de algumas das proteínas em células e meios condicionados das condições de culturas em 2D e 3D.

As FIGs. 5A-D são micrografias que mostram a capacidade de diferenciação in vitro da célula aderente 3D derivada de placenta em osteoblastos. Foram cultivadas células aderentes derivadas de placenta humana num meio de indução osteogénico (DMEM contendo 10% FCS, 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, 10 mM de B- glicerofosfato) durante um período de 3 semanas. As figuras 5A-B mostram células que expressam 16 uma matriz calcificada, como indicado por coloração com Vermelho de Alizarina S.

As figuras 5C-D representam células de controlo, que não foram tratadas com meio de indução osteogénico, que mantiveram um fenótipo semelhante a fibroblasto e não demonstraram qualquer mineralização. A FIG. 6 é um gráfico que representa a percentagem de células CD45+ humanas detetadas na medula óssea (MO) de ratinhos NOD-SCID, tratados com quimioterapia (injeções intraperitoneais de 25 mg/kg de bussulfano durante duas semanas consecutivas) 3,5 semanas após o transplante. Células CD34+ (100.000) purificadas de células mononucleares derivadas de cordão umbilical, foram transplantadas isoladamente (5 ratinhos, a) ou co-transplantadas com 0,5xl06 células aderentes derivadas de placenta cultivadas em condições 2D (célula 2D-aderente; 2 ratinhos, b), células aderentes derivadas de placenta cultivadas em condições 3D (célula 3D-aderente), no biorreator pluriX™ (5 ratinhos, c) . Foi seguidamente recolhida MO dos fémures e das tíbias dos ratinhos. As células humanas na MO foram detetadas por citometria de fluxo. A percentagem de células humanas expressando CD45 foi determinada incubando células com CD45-FITC anti-humano. É de notar a percentagem mais elevada de células humanas (hCD45+) na medula óssea de ratinhos co-transplantados com células 2D-aderentes (b), bem como com células 3D-aderentes (c), em comparação com a percentagem de células humanas nos ratinhos tratados apenas com HSC (a). O maior enxerto observado nos ratinhos tratados com células cultivadas com células 3D-aderentes, por comparação com os ratinhos tratados com 17 células cultivadas com células 2D-aderentes, indica uma vantagem terapêutica mais elevada, característica das células aderentes cultivadas em 3D.

As FIGs. 7A-B são análises de FACS de células humanas CD45+ de enxerto em ratinhos transplantados apenas com células CD34+ (Figura 7A) , por comparação com células CD34+ em conjunto com células aderentes derivadas de tecido adiposo (Figura 7B) . É de notar a percentagem significativamente mais elevada de população hematopoiética humana (hCD45+) (7A-29%) num ratinho co-transplantado com células aderentes derivadas de tecido adiposo por comparação com um ratinho tratado apenas com CD34+ humanas (7B-12%). A FIG. 8A é um gráfico de barras que mostra uma reação mista de linfócitos conduzida entre células mononucleares de sangue de cordão umbilical humano (SCU) e iguais quantidades de células de sangue de cordão umbilical irradiadas (SCUi) (3000 Rad), monócitos derivados de sangue periférico humano (PBMC), células aderentes cultivadas em 2D (2D) ou 3D (3D) derivadas de placenta, ou uma combinação de PBMC e de células aderentes derivadas de placenta cultivadas em 2D e 3D (PBMC+2D e PBMC+3D). O tamanho da população de células SCU é representado pela absorção de 3H-timidina (medida em CPM), que foi medida durante as últimas 18 horas de cultura. O aumento da proliferação de células SCU estimuladas indica uma resposta imune de nível mais elevado. É de notar o nível mais baixo de resposta imune exibida por células incubadas com células aderentes, e, em particular, a redução de resposta imune das células 18 SCU a PBMCs quando co-incubadas com células aderentes. Foram realizadas três réplicas de cada resposta. A FIG. 8B é um fluxograma que mostra a produção de células 3D-aderentes provenientes de placenta por Celligen™ (designadas células PLX-C). A FIG. 8C é um diagrama de vaso e portas do biorreator Celligen™ adaptado do website The New Brunswick Scientific.

As FIGs. 9A-B representam análises do ciclo celular do fabrico de células 3D-aderentes por Plurix (designadas PLX, figura 9B) e por Celligen (designadas PLX-C, figura 9A) . As células foram fixadas em 70% EtOH O.N, centrifugadas e re-suspensas numa solução de iodeto de propidio (IP) e em seguida analisadas por FACS.

As FIGs. 10A-C representam a expressão de marcadores fibroblasto-tipicos mas não a expressão de marcadores endotelial-tipicos nas PLX-C. A figura 10A mostra a expressão negativa do marcador endotelial CD31; A figura 10B mostra a expressão negativa do marcador endotelial KDR; e a figura 10C mostra a expressão positiva do marcador de fibroblastos humano (D7-FIB). É de notar que os histogramas vermelhos do isotipo IgGl (FITC) representam o controlo negativo, ao passo que os histogramas azuis representam as células positivamente coradas.

As FIGs. 11A-D representam a expressão de moléculas estimuladoras e co-estimuladoras em células PLX-C. A figura 11A mostra a expressão PLX-C de CD80; a figura 11B mostra a expressão PLX-C de CD86; a figura 11C mostra a expressão PLX-C de CD40; e a figura 11D mostra a expressão PLX-C de HLA-A/B/C. Foram preparados 19 controlos negativos com moléculas de florescência de isotipo relevante. É de notar que os histogramas vermelhos representam populações de células que expressam o marcador PLX-C, os histogramas azuis representam populações de células que expressam o marcador de medula óssea (MO), e os histogramas verdes indicam populações de células que expressam o marcador de célula mononuclear (CMN).

As FIGs. 12A-B representam a inibição de proliferação de linfócitos por PLX-C. A figura 12A mostra testes de RML realizados com 2xl05 CMN (dador A) derivadas de sangue periférico (PB) estimuladas com igual quantidade de CMN (dador B) derivadas de PB irradiadas (3000 Rad) , seguidos pela adição de quantidades crescentes de células PLX-C nas culturas. Três réplicas de cada grupo foram semeadas em placas de 96 poços. A taxa de proliferação foi medida por incorporação de timidina [3 H]; A figura 12B mostra MNCs derivadas de sangue periférico (PB) estimuladas com ConA (1,5 mg /ml). Foram adicionadas às culturas quantidades crescentes de células PLX-C. Três réplicas de cada grupo foram semeadas em placas de 96 poços. A taxa de proliferação foi medida por incorporação de [3H]timidina ;

As FIGs. 13A-C representam a regulação de PLX-C da secreção de citocina pró-inflamatória e anti-inflamatória na sequência de co-cultura com células de sangue periférico. As figuras 13A-B mostram a secreção de IFNy (Figura 13A) e de TNFa (Figura 13B) na sequência da co-cultura de CMN provenientes de humanos (isoladas do sangue periférico) , estimuladas com ConA com PLX-C; 20 A figura 13C representa a secreção de IFNy, TNFa e IL-10 na sequência de co-cultura de CMN derivadas de humanos (isoladas de sangue periférico), estimuladas com LPS com PLX-C. Os sobrenadantes foram recolhidos e submetidos a análise de citocina utilizando ELISA. A FIG. 14 representa o vetor de expressão de luciferase utilizado para infetar as células PLX-C. Foi aqui utilizado o vetor de expressão Lv33 da OmicsLink. 0 gene da luciferase foi clonado no ORF. A FIG. 15 mostra uma elevada expressão de luciferase em células PLX-C infetadas. As células foram infetadas com o vetor de expressão da luciferase e visualizadas pelo sistema IVIS 48 horas após a infeção. É de notar que as células exibem elevados níveis de expressão da luciferase.

As FIGs. 16A-D descrevem a injeção de 2xl06 células PLX-C que expressam luciferase em ratinhos SCID/Bege. Um ratinho foi injetado por via IM e outro por via IV. Os ratinhos injetados foram monitorizados com o sistema IVIS, a fim de avaliar a biodistribuição in vivo de PLX-C. São apresentados os resultados do IVIS do dia 1 (Figura 16A), dia 4 (Figura 16B) , dia 6 (Figura 16C) e dia 22 (Figura 16D) . A FIG. 17 é um gráfico que mostra o aumento da perfusão em ancas e patas de ratinhos tratados com as células aderentes da invenção(designadas por PLX-C). A figura apresenta a mediana da percentagem de perfusão na anca e pata do ratinho. 0 fluxo sanguíneo na anca e na pata foi medido utilizando um laser Doppler de não-contacto em ambos os lados nos dias 0, 6, 9, 14 e 21 após a operação (são apresentadas as medições do dia 21). Os resultados 21 são expressos como a razão entre o fluxo sanguíneo no membro isquémico e no membro normal durante a experiência. A FIG. 18 é um gráfico que representa a avaliação in vivo da função do membro e do dano isquémico. Foi realizada seriadamente uma avaliação semiquantitativa da utilização deficiente do membro isquémico utilizando o seguinte sistema de pontuação: 3 = arrastar de pés, 2 = sem arrastar de pés mas sem flexão plantar, 1 = flexão plantar, e 0 = flexão dos dedos para resistir à tração suave da cauda.

As FIGs. 19A-C representam o aumento da densidade capilar após tratamento com PLX-C. A figura 19A representa a densidade capilar em ratinhos tratados com PBS; a figura 19B representa a densidade capilar em ratinhos tratados com células PLX-C; a figura 19C é um gráfico de barras que representa o número de capilares por células musculares. É de notar um aumento de densidade capilar verificado em ratinhos tratados com PLX-C, mas não em ratinhos de controlo, na sequência de isquemia dos membros induzida, demonstrada por coloração capilar específica.

As FIGs. 20A-B mostram inflamação endotelial e stress oxidativo reduzidos na sequência da administração de PLX-C. A Figura 20A é um gráfico de barras que representa o stress oxidativo (coloração com nitrotirosina); e a Figura 20B é um gráfico de barras que representa a inflamação endotelial (avaliação VCAM). É de notar que os ratinhos tratados com PLX-C apresentam inflamação endotelial e stress oxidativo reduzidos. 22

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção está relacionada com o aumento de angiogénese num tecido e com o tratamento da isquemia ou de situações médicas que exijam a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo, utilizando células aderentes de placenta ou tecidos adiposos. Os princípios e técnicas da invenção serão mais bem compreendidos se relacionados com os desenhos e as descrições que os acompanham.

Antes de explicar detalhadamente, pelo menos, uma forma de realização da invenção, deve entender-se que a invenção não se limita na sua aplicação aos pormenores apresentados na descrição que se segue ou exemplificados nos Exemplos. A invenção pode ter outras formas de realização ou ser praticada ou levada a cabo de diversas maneiras. Deve igualmente ser tido em conta que a fraseologia e terminologia aqui utilizadas têm uma função descritiva e não devem ser consideradas limitativas.

Ao porem em prática a invenção, os presentes inventores descobriram que as células aderentes de uma placenta ou de um tecido adiposo são altamente eficientes no aumento da angiogénese num tecido e no tratamento da isquemia e de situações médicas que exijam a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo.

Como ilustrado abaixo e no Exemplo 1-8 da secção dos Exemplos que se segue, os presentes inventores conseguiram expandir células aderentes derivadas de tecido adiposo e de placenta que contêm propriedades de células estaminais estromais. As 23 células expandidas desta maneira demonstraram ser viáveis, na sequência da criopreservação, como evidenciado por ensaios de aderência e de repopulação (ver Exemplo 1) . A análise de citometria de fluxo de células aderentes derivadas de placenta revelou um padrão de expressão de marcador distinto (ver Figuras 3A-B). Como é mostrado mais adiante, no Exemplo 6 da secção dos Exemplos que se segue, a implantação de células aderentes derivadas de placenta induz de forma significativa o fluxo sanguíneo na anca e na pata (Figura 17) de ratinhos submetidos a laqueação arterial (o modelo do membro posterior isquémico), melhora de forma significativa a função dos membros (Figura 18), aumenta a densidade capilar (Figurasl9A-C) e reduz o stress oxidativo e a inflamação endotelial (Figuras 20A-B).

Por conseguinte, um aspeto da invenção relaciona-se com o aumento da angiogénese num tecido produzido pelo contacto do tecido com células aderentes de um tecido selecionado do grupo que inclui um tecido adiposo e um tecido de placenta, aumentando assim a angiogénese no tecido. A frase "aumento da angiogénese num tecido", tal como aqui utilizada, refere-se a um aumento (indução, regulação ascendente) do processo de produção de novos capilares sanguíneos num tecido. 0 termo "células aderentes", tal como aqui utilizado, refere-se a uma população de células homogénea ou heterogénea que são dependentes de ancoramento, isto é, que têm de estar ligadas a uma superfície a fim de crescerem in vitro. 24 0 termo "tecido adiposo", tal como aqui utilizado, refere-se a um tecido conjuntivo que contém células de gordura (adipócitos). 0 termo "tecido de placenta", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer parte do órgão feminino dos mamíferos que reveste a parede uterina e que durante a gravidez envolve o feto, ao qual está ligado pelo cordão umbilical. Na sequência do nascimento, a placenta é expelida (sendo então designada por placenta pós-parto). Numa forma de realização exemplificativa, a placenta refere-se à placenta completa. Células aderentes derivadas de placenta ou de tecido adiposo podem ser propagadas através de condições de cultura bidimensionais ou tridimensionais.

As condições para a propagação de células aderentes em cultura 2D são descritas mais adiante e na secção dos Exemplos que se segue. 0 termo "cultura tridimensional", como aqui é utilizado, refere-se a uma cultura em que as células são colocadas em condições compatíveis com o crescimento celular, permitindo ao mesmo tempo que as células cresçam em mais do que uma camada. É do conhecimento geral que o ambiente in situ de uma célula num organismo vivo (ou num tecido) tem uma arquitetura tridimensional. As células estão rodeadas por outras células. Estão retidas numa rede complexa de fibras em nanoescala da matriz extracelular que permite a criação de diversos microambientes locais. Os seus ligantes extracelulares medeiam, não apenas a ligação à membrana basal, mas também o 25 acesso a uma série de vasos vasculares e linfáticos. 0 oxigénio, as hormonas e os nutrientes são transportados para as células, e os resíduos eliminados. As condições na cultura tridimensional da invenção servem para simular um tal ambiente como é explicado mais adiante.

Deve ter-se em conta que as condições da cultura tridimensional são criadas de forma a permitir a expansão das células aderentes.

Os termos "expandir" e "expansão", tal como aqui utilizados, referem-se a manutenção das células substancialmente sem diferenciação e, em última análise, ao crescimento celular, isto é, ao aumento de uma população de células (por exemplo, pelo menos duas vezes) sem que uma diferenciação acompanhe esse aumento.

Os termos "manter" e "manutenção", tal como aqui utilizados, referem-se a uma renovação celular substancialmente sem diferenciação, isto é, a uma população de células substancialmente estacionária, sem que qualquer diferenciação acompanhe essa estacionariedade.

Tal como mencionado, as células aderentes deste aspeto da invenção são recolhidas de tecido adiposo ou placentário.

As células placentárias podem ser obtidas de uma placenta de termo ou de uma placenta pré-termo. A placenta é preferencialmente recolhida assim que for liberta de sangue. A placenta é preferencialmente perfundida durante um período de tempo suficiente para remover células residuais. Os termos 26 "perfundir" ou "perfusão", tal como aqui utilizados, referem-se ao ato de verter ou deixar correr um liquido por cima ou através de um órgão ou tecido. 0 tecido placentário pode provir de qualquer mamífero; o tecido placentário pode, por exemplo, ser humano. Uma fonte conveniente de tecido placentário é uma placenta pós-parto (por exemplo, 1-6 horas). Contudo, a fonte de células ou de tecido placentário ou o método de isolamento de tecido placentário não são cruciais para a invenção.

As células aderentes derivadas de placenta podem ser obtidas tanto de partes fetais (isto é, partes do amnio ou partes internas da placenta, ver Exemplo 1) como de partes maternas (isto é, decídua basal e decídua parietal) da placenta. As amostras de tecido são lavadas num tampão fisiológico [por exemplo, uma solução salina tamponizada com fosfato (PBS) ou solução de Hank]. As suspensões de uma única célula são produzidas tratando o tecido com uma enzima digestiva (ver abaixo) e/ou picando e lavando as partes dos tecidos através de um filtro de nylon ou pipetando suavemente (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) com solução de lavagem.

As células aderentes derivadas de tecido adiposo podem ser isoladas através de uma variedade de métodos conhecidos do perito. Esses métodos estão descritos, por exemplo, na Pat. U.S. 6,153,432. 0 tecido adiposo pode ser derivado de locais de tecidos omental/visceral, mamário, gonadal ou outros tecidos adiposos. Uma fonte de tecido adiposo é o tecido adiposo omental. No ser humano, o tecido adiposo é tipicamente isolado por lipossucção. 27

As células aderentes isoladas de tecido adiposo podem ser obtidas tratando o tecido com uma enzima digestiva como a colagenase, a tripsina e/ou a dispase; e/ou concentrações eficazes de hialuronidase ou ADN-ase; e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); a temperaturas entre 25 e 50°C, durante períodos de 10 minutos a 3 horas. As células podem então ser passadas através de um filtro de nylon ou de malha de gaze de 20 microns a lmm. As células são seguidamente submetidas a centrifugação diferencial diretamente no meio ou sobre um Ficoll ou Percoll ou outro gradiente particulado. As células são centrifugadas a velocidades de 100 a 3000xg durante períodos de 1 minuto a 1 hora, a temperaturas entre 4-50°C (ver Pat. U.S. 7, 078,230).

Além das células aderentes derivadas de placenta ou de tecido adiposo, a invenção prevê igualmente a utilização de células aderentes de outras fontes de células, caracterizadas por fenótipo de célula estaminal estromal (como será descrito abaixo) . As fontes de tecido de onde as células aderentes podem ser retiradas incluem, mas não se limitam a, sangue do cordão umbilical, couro cabeludo, folículos capilares [por exemplo, como descrito na Pat. US App. 20060172304], testículos [por exemplo, como descrito em Guan K., et al., Nature. 2006 Apr 27; 440 (7088): 1199-203] , mucosa olfativa humana [por exemplo, como descrito em Marshall, CT., et al., Histol Histopathol. 2006 Jun;21 (6) :633-43], saco vitelino [por exemplo, como descrito em Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427(6970):148-54] e líquido amniótico [Pieternella et al. (2004) Stem Cells 22:1338-1345], que contêm todos células estaminais mesenquimatosas. As células aderentes destas fontes de tecidos podem ser isoladas cultivando as células 28 numa superfície aderente, isolando assim as células aderentes de outras células na população inicial.

Independentemente da origem (por exemplo, placenta ou tecido adiposo), a recolha de células é preferencialmente efetuada em condições de esterilidade. Assim que são obtidas as células isoladas, deixam-se estas aderir a um material aderente (por exemplo, configurado como uma superfície) para deste modo isolar células aderentes. A cultura pode prosseguir em condições bidimensionais como descrito no Exemplo 4 da secção dos Exemplos, e as células podem ser depois transferidas para condições 3D. 0 termo "material aderente", tal como aqui utilizado, refere-se a um material sintético, que ocorre naturalmente, ou uma combinação do mesmo de um material não citotóxico (isto é, biologicamente compatível) que possua uma estrutura química (por exemplo, grupos carregados expostos na superfície) capaz de reter as células numa superfície.

Exemplos de materiais aderentes que podem ser utilizados de acordo com este aspeto da invenção incluem, mas não se limitam a, um poliéster, um polipropileno, um polialquileno, um polifluorocloroetileno, um cloreto de polivinilo, um polistireno, uma polissulfona, um acetato de celulose, uma fibra de vidro, uma partícula cerâmica, um matrigel, um componente de matriz extracelular (por exemplo, fibronectina, condronectina, laminina), um colagéneo, um ácido poli-L-láctico e uma fibra metálica inerte. 29

Outros passos de purificação ou enriquecimento de células estaminais estromais podem ser realizados utilizando os métodos conhecidos da especialidade (designadamente por FACS utilizando expressão do marcador de células estaminais estromais, como descrito abaixo).

Exemplos não-limitativos de meios de base úteis para realizar culturas de acordo com a invenção incluem meio essencial mínimo de Eagle, ADC-1, LPM (isento de albumina sérica bovina), FIO(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, meio de BGJ (com e sem modificação de Fitton-Jackson) , meio basal de Eagle (BME-com a adição de base de sal de Earle), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM-sem soro), Yamane, IMEM-20, meio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM) , meio Leibovitz L-15, meio 5A de McCoy, meio M199 (M199E-com base de sal de Earle), meio M199 (M199H-com sal de base de Hank), meio essencial mínimo de Eagle (MEM-E-com base de sal de Earle), meio essencial mínimo de Eagle (MEM-H-com base de sal de Hank) e meio essencial mínimo de Eagle (MEM-NAA com aminoácidos não essenciais), entre muitos outros, nomeadamente meio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, G de Williams, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Um meio preferencial para utilizar na invenção é o DMEM. Estes e outros meios úteis estão disponíveis na GIBCO, Grand Island, N.Y., USA e na Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, entre outros. Vários destes meios estão listados em Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, editado por William B. Jakoby e Ira H. Pastan, publicado pela Academic Press, Inc. 30 0 meio pode ser suplementado, por exemplo, com soro, como o soro fetal de bovino ou outras espécies e, opcionalmente ou alternativamente, com fatores de crescimento, vitaminas (por exemplo, ácido ascórbico), citocinas, sais (por exemplo, B-glicerofosfato), esteroides (por exemplo, dexametasona) e hormonas, como por exemplo, hormona de crescimento, eritropoeitina, trombopoietina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, fator estimulador de colónias de macrófago, ligante c-kit/fator de células estaminais, ligante osteoprotegerina, insulina, fatores de crescimento semelhantes à insulina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento do fibroblasto, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento derivado de plaquetas e proteína morfogenética do osso em concentrações de níveis de picograma/ml a miligrama/ml. É ainda reconhecido que podem ser adicionados componentes suplementares ao meio de cultura. Estes componentes podem ser antibióticos, antimicóticos, albumina, aminoácidos e outros componentes conhecidos da especialidade para a cultura de células. Adicionalmente, os componentes podem ser adicionados para reforçar o processo de diferenciação quando necessário (ver abaixo).

Deve ser tido em conta que, caso as células aderentes da invenção sejam administradas a um sujeito humano, as células e o meio de cultura (com os meios aditivos acima descritos, por exemplo) devem ser substancialmente xeno-free, isto é, desprovidos de quaisquer contaminantes animais, como por exemplo, micoplasma. For exemplo, o meio de cultura pode ser 31 suplementado com um substituto de soro, soro humano e/ou fatores produzidos por via sintética ou recombinante.

Como foi referido, assim que as células aderentes estão disponíveis, podem ser transferidas para ambientes bidimensionais ou tridimensionais (ver exemplos 1 e 4 da secção Exemplos que se segue). Contudo, deve ter-se em conta que as células podem ser transferidas para uma matriz de configuração tridimensional imediatamente após o isolamento, ou alternativamente, podem ser transferidas para ambientes tridimensionais na sequência de condições bidimensionais (como mencionado acima).

Por conseguinte, o material aderente deste aspeto da invenção é configurado para cultura 3D, fornecendo assim uma matriz de crescimento que aumenta substancialmente a superfície de ligação disponível para a aderência das células, para simular a infraestrutura do tecido (por exemplo, de placenta).

Para uma produção em grande escala, a cultura pode ser efetuada num biorreator 3D.

Exemplos deste género de biorreatores incluem, mas não se limitam a, um biorreator de fluxo tampão, um biorreator de reservatório com agitação contínua, um biorreator de leito estacionário, um sistema biorreator CelliGen Plus® (New Brunswick Scientific (NBS) ou um sistema biorreator BIOFLO 310 (New Brunswick Scientific (NBS).

Como se mostra no Exemplo 4 da secção Exemplos, o biorreator Celligen é capaz de expansão 3D de células aderentes em 32 condições controladas (por exemplo, níveis de oxigénio, pH e temperatura) e com perfusão constante do meio de crescimento celular. Além disso, as culturas de células podem ser diretamente monitorizadas para medir os níveis de concentração de glucose, lactato, glutamina, glutamato e amónio. A taxa de consumo de glucose e a taxa de formação de lactato das células aderentes permite medir a taxa de crescimento celular e determinar o momento da colheita.

Outros biorreatores 3D que podem ser utilizados com a invenção incluem, mas não se limitam a, um biorreator de reservatório de agitação contínua, onde um meio de cultura é continuamente introduzido no biorreator e um produto é continuamente retirado, a fim de manter um estado estacionário constante ao longo do tempo dentro do reator. Um biorreator de tanque agitado com um cesto de leito fibroso está disponível, por exemplo, em New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) , um biorreator de leito estacionário, um biorreator de fluxo ascendente, onde o ar é introduzido tipicamente no fundo de um tubo de exaustão central, subindo enquanto forma bolhas e libertando gás de escape no cimo da coluna], um biorreator de perfusão de sementeira de células com espumas poliativas [como descrito em Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], estruturas porosas de ácido poli-L-lático (PLLA) tubulares num biorreator de perfusão de fluxo radial [como descrito em Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)]. Outros biorreatores que podem ser utilizados de acordo com a invenção são descritos em Pat. U.S. 6,277,151, 6,197,575, 6,139,578, 6,132,463, 5,902,741 e 5,629,186. 33 A sementeira de células é efetuada preferencialmente com 100.000-1.500.000 células/mm na sementeira. Numa forma de realização exemplificativa, é semeado um total de 150±30xl06 células, 3-5xl06 célula/gr de portador, ou 0,015-0,lxlO6 células/ml.

As células podem ser colhidas quando, pelo menos, cerca de 10% delas estão a proliferar, mas evitando a senescência e a diferenciação não controladas. A cultura de células é efetuada durante, pelo menos, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 10 dias, 20 dias, um mês ou ainda mais. É de assinalar que a cultura de células num biorreator pode prolongar este período. A cultura das células aderentes na cultura 3D pode ser efetuada sob um fluxo contínuo de um meio de cultura. Também pode ser efetuada passagem de células para aumentar o número de células. Note-se que o meio de cultura pode ser mudado, a fim de prolongar e melhorar as condições de cultura.

As células aderentes de algumas formas de realização da presente invenção compreendem, pelo menos, cerca de 10%, 28%, 30%, 50%, 80% ou mais de células proliferativas (como pode ser verificado por monitorização por FACS das fases S e G2/M).

As células aderentes de algumas formas de realização da invenção podem compreender, pelo menos, um "fenótipo de células estaminais estromais". 34 0 termo "fenótipo de células estaminais estromais", tal como aqui utilizado, refere-se a um fenótipo estrutural ou funcional típico de uma célula estaminal estromal (isto é, mesenquimatosa) derivada de medula óssea. 0 termo "célula estaminal", tal como é aqui utilizado, refere-se a uma célula que não é terminalmente diferenciada. Por conseguinte, as células podem ser fusiformes. Alternativa ou adicionalmente, as células podem expressar um marcador ou uma coleção de marcadores (designadamente marcadores de superfície) típicos das células estaminais estromais. Exemplos de marcadores de superfície de células estaminais estromais (positivos e negativos) incluem, mas não se limitam a, CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD3-, CD4-, CD34-, CD45-, CD80-, CD 19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD 1 i—1 CD19-, CD79-, HLA-DR-, e FMC7-. Outros marcadores de células estaminais estromais incluem, mas não se limitam a, tirosina hidroxilase, nestina e H-NF.

As células aderentes de tecido de placenta geradas de acordo com esta prática possuem um perfil de expressão genética essencialmente semelhante ao descrito no Exemplo 4 da secção Exemplos que se segue.

Exemplos de fenótipos funcionais típicos de células estaminais do estroma incluem, mas não se limitam a, atividade de supressão de células T (não estimular células T e inversamente suprimir as mesmas), atividade de apoio de células estaminais hematopoiética, bem como qualquer diferenciação adipogénica, hepatogénica, osteogénica e neurogénica. 35

Qualquer destes aspetos estruturais ou funcionais pode ser utilizado para qualificar as células da invenção (ver Exemplos 4 da secção Exemplos que se seque).

As populações de células produzidas de acordo com a presente prática são caracterizadas por um perfil de expressão de proteínas distinto, como mostra o Exemplo 1 da secção

Exemplos. Assim, por exemplo, as células aderentes de placenta ou de tecido adiposo produzidas de acordo com a presente prática conseguem expressar e/ou segregar altos níveis de fatores selecionados. Estas células podem, por exemplo, expressar ou segregar níveis de SCF, Flt-3, histonas da família H2A (H2AF) ou aldeído desidrogenase X (ALDH X) , pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou até 12 vezes mais elevados do que os expressos ou segregados por células aderentes da placenta ou de tecido adiposo cultivadas numa cultura 2D. Adicional ou alternativamente, a população de células da invenção segrega ou expressa IL-6, fator eucariótico de alongamento da tradução 2 (EEEF2), reticulocalbina 3, domínio de ligação a cálcio EF-hand (RCN2) ou calponina 1 básica, músculo liso (CNN1) a um nível de, pelo menos, 2, 3 ou 5 vezes mais elevado do que o expresso ou segregado pelas células aderentes de placenta ou de tecido adiposo cultivadas numa cultura 2D. Adicional ou alternativamente, a população de células da invenção é caracterizada por um nível de expressão menor de diversas outras proteínas quando comparado com as células cultivadas em 2D. Assim, por exemplo, segregam ou expressam menos que 0,6, 0,5, 0,25 ou 0,125 do nível de expressão de ribonucleoproteína nuclear heterogénea Hl (Hnrphl), precursor da isoforma 2 do antigénio CD44, isoforma a da 3 36 fosfoadenosina 5 fosfossulfato sintase 2 (Papss2) ou proteína ribossómica L7a (rpL7a), expresso ou segregado por células aderentes de placenta ou de tecido adiposo cultivado numa cultura 2D.

Como mostram os Exemplos 3-4 da secção Exemplos, descobriu-se que as células aderentes, e particularmente as células aderentes 3D, suprimiam a reação imunológica de células mononucleares de sangue de cordão umbilical humano num ensaio de reação mista de linfócitos (RML), exibindo assim atividades biológicas que podem ser preferencialmente utilizadas na clínica (por exemplo, atividade de supressão de células T, atividade de apoio de células estaminais hematopoiéticas).

De acordo com uma das formas de realização da invenção, as células aderentes da invenção conseguem suprimir a reação imune num indivíduo. A frase "suprimir a reação imune num indivíduo", tal como aqui utilizada, refere-se à diminuição ou inibição da reação imune que ocorre num indivíduo em resposta a um antigénio (por exemplo, uma célula estranha ou uma porção da mesma). A resposta imune que pode ser suprimida pelas células aderentes inclui as respostas imunes humorais e as respostas imunes celulares, que pressupõem o reconhecimento específico de antigénios do patogéneo através de anticorpos e linfócitos T (proliferação de células T), respetivamente.

De acordo com uma das formas de realização da invenção, as células aderentes da invenção caracterizam-se por uma 37 atividade imunossupressora mais elevada do que a das células aderentes da placenta ou do tecido adiposo cultivadas numa cultura bidimensional (2D).

De acordo com uma das formas de realização da invenção, a atividade imunossupressora compreende a redução de proliferação de células T.

Como referido acima e descrito no Exemplo 6 da secção Exemplos que se segue, as células aderentes da invenção induziram a angiogénese in vivo (por exemplo, o fluxo sanguíneo na anca e na perna) , melhoraram de forma significativa a função dos membros de animais submetidos a laqueação arterial, aumentaram a densidade capilar e reduziram o stress oxidativo e a inflamação endotelial. Para além disso, como descrito pormenorizadamente no Exemplo 7 da secção Exemplos, as células aderentes da invenção melhoraram de forma significativa a recuperação de um acidente vascular cerebral num modelo experimental em ratinhos.

Por conseguinte, outro aspeto da invenção relaciona-se com o tratamento da isquemia num doente que necessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células aderentes da invenção, tratando, portanto, a isquemia do doente. 0 termo "isquemia", como aqui utilizado, refere-se a qualquer patologia (doença, situação, síndrome ou perturbação) caracterizada por ou associada a angiogénese insuficiente. Exemplos incluem, mas não se limitam a, doença arterial periférica (DAP), como isquemia dos membros e isquemia 38 crítica dos membros (ICM), doença cardíaca isquémica, doença cerebral isquémica (por exemplo, acidente vascular cerebral), cicatrização de feridas demorada, cicatrização de úlceras demorada, distúrbios associados com a reprodução, arteriosclerose, doença vascular isquémica, doença cardíaca isquémica, isquemia do miocárdio, doença arterial coronária (DAC), doença cardiovascular aterosclerótica, doença arterial coronária esquerda, doença arterial obstrutiva, isquemia periférica, doença vascular periférica, doença vascular renal, doença arterial periférica, isquemia dos membros, isquemia das extremidades inferiores, isquemia cerebral, doença vascular cerebral, retinopatia, reparação de retina, perturbação de remodelação, doença de von Hippel-Lindau, telangiectasia hemorrágica hereditária, doença vascular isquémica, doença de Buerger, doença renal isquémica e placenta isquémica. 0 termo "tratamento/tratar", tal como aqui utilizado, refere-se a inibir ou deter o desenvolvimento de uma patologia (por exemplo, a isquemia) e/ou a causar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. Os especialistas compreenderão que diversas metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia e, de forma semelhante, diversas metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. 0 termo "tratamento/tratar" pode igualmente referir-se a aliviar ou diminuir um sintoma associado à patologia. A frase "um indivíduo que necessite da mesma", tal como aqui utilizada, refere-se a qualquer indivíduo (por exemplo, 39 mamífero) , tal como o indivíduo humano, a quem seja diagnosticada a patologia ou que dela sofra.

Como foi referido acima e descrito no Exemplo 8 da secção Exemplos que se segue, os presentes inventores descobriram que as células aderentes da invenção são capazes de regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo.

Assim, um aspeto adicional da invenção relaciona-se com o tratamento de uma situação médica que exija a regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo num indivíduo que necessite da mesma, através de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células aderentes da invenção. 0 termo "tecido conjuntivo" refere-se a um tecido estrutural de suporte que contém filamentos de colagénio, fibras elásticas (por exemplo, entre músculos e vasos sanguíneos e à volta deles) e células simples. Exemplos de tecidos conjuntivos incluem, mas não se limitam a, tecido conjuntivo denso (por exemplo, ligamento, tendão, ligamento periodontal), tecido conjuntivo areolar (por exemplo, com fibras proteicas como o colagénio e a elastina), tecido conjuntivo reticular, tecido adiposo, sangue, osso, cartilagem, pele, disco intervertebral, polpa dentária, dentina, tecido gengival, células formadoras da matriz extracelular (MEC), tecido conjuntivo frouxo e células do músculo liso. A frase "situação médica que exige regeneração e/ou reparação de tecido conjuntivo", tal como aqui utilizada, refere-se a qualquer patologia caracterizada por dano (isto é, tecido não 40 tecido funcionante, tecido canceroso ou pré-canceroso, quebrado, tecido fraturado, tecido fibrótico ou tecido isquémico) ou perda (isto é, na sequência de um traumatismo, uma doença infecciosa, uma doença genética, e similares) do tecido conjuntivo. Exemplos não limitativos deste género de patologias incluem fratura óssea, cancro ósseo (por exemplo, osteossarcoma, metástase do cancro ósseo), feridas de queimaduras, defeito de cartilagem articular e feridas profundas. A frase "administrar ao indivíduo" refere-se à introdução das células da invenção no tecido alvo. As células podem ser derivadas do recetor ou de um dador alogénico ou xenogénico. Esta frase abrange igualmente "transplante", "substituição de células" ou "enxerto" das células da invenção no indivíduo. 0 indivíduo pode ser qualquer mamífero que necessite de regeneração e/ou reparação de tecido conjuntivo, incluindo, por exemplo, seres humanos ou animais domesticados, nomeadamente, mas não se limitando a, cavalo (isto é, equino), gado, cabras, ovelhas, porco, cão, gato, camelo, alpaca, lama e iaque.

As células aderentes da presente invenção podem ser utilizadas para tratar situações que incluem quistos ósseos subcondrais, fraturas ósseas, osteoporose, osteoartrite, osso degenerado, diversos cancros associados à perda de tecido conjuntivo (por exemplo, cancro ósseo, osteossarcoma, metástases ósseas), degradação da cartilagem, defeito articular da cartilagem, doença degenerativa do disco, osteogénese imperfeita (01), queimaduras, feridas de 41 queimaduras, feridas profundas, cicatrização de feridas demorada, ligamentos lesionados e tendões lesionados, como, por exemplo, lesões de tendões induzidas por distensões em cavalos e outros indivíduos que dela necessitem (com indicado acima).

As células que podem ser administradas de acordo com este aspeto da invenção incluem as células aderentes acima mencionadas, que podem ser cultivadas em ambientes tridimensionais e bidimensionais, bem como derivados mesenquimatosos e não mesenquimatosos, parcial ou terminalmente diferenciados das mesmas. Métodos para obter células de linhagens específicas a partir das células estaminais estromais da invenção são bem conhecidos da especialidade. Ver, por exemplo, Pat. U.S. 5,486,359, 5,942,225, 5,736,396, 5,908,784 e 5,902,741.

As células podem ser ingénuas ou geneticamente modificadas, a fim de obter uma linhagem de interesse (ver Pat. U.S. Appl. 20030219423).

As células podem ser de fonte autóloga ou não autóloga (isto é, alogénica e xenogénica) de preparações frescas ou congeladas (por exemplo, criopreservadas).

Consoante a situação médica, podem ser administrados ao indivíduo células ou fármacos químicos adicionais (por exemplo, imunomodulatórios, quimioterapia, etc.). 42

Uma vez que as células autólogas podem induzir uma reação imunológica quando administradas ao organismo, foram desenvolvidas várias abordagens a fim de reduzir a probabilidade de rejeição de células não autólogas. Estas incluem suprimir o sistema imunitário do recetor ou encapsular as células não autólogas em membranas semipermeáveis imuno-isoladoras antes do transplante.

As técnicas de encapsulamento são geralmente classificadas como microencapsulamento, com pequenos veiculos esféricos, e macroencapsulamento, com membranas de fibra oca e de folha lisa maiores (Uludag, H. et al. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).

Os métodos de preparação de microcápsulas são conhecidos da especialidade e incluem, por exemplo, os dados divulgados por Lu MZ, et al., Cell encapsulat ion with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM and Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, e Lu MZ, et al., A novel cell encapsulat ion method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylidene-acetate). J Microencapsul. 2000, 17: 245-51.

As microcápsulas são preparadas, por exemplo, por complexação de colagénio modificado com um invólucro de terpolimero de 2-hidroxietil metilacrilato (HEMA) , ácido metacrilico (AMA) e metil metacrilato (MMA) , produzindo uma espessura de cápsula de 2-5pm. Estas microcápsulas podem ser novamente encapsuladas com outros invólucros de terpolimero de 2-5pm, a 43 fim de produzir uma superficie lisa carregada negativamente e de minimizar a absorção da proteína plasmática (Chia, S.M. et al. Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

Outras microcápsulas têm como base alginato, um polissacarídeo marinho (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) ou os seus derivados. As microcápsulas podem ser preparadas, por exemplo, por complexação polieletrolítica dos polianiões alginato de sódio e celulose sulfato de sódio com o policatião hidrocloreto de poli(metileno-co-guanidina) na presença de cloreto de cálcio. É de notar que o encapsulamento de células é melhorado quando são utilizadas cápsulas mais pequenas. Por conseguinte, o controlo de qualidade, a estabilidade mecânica, as propriedades de difusão e as atividades in vitro de células encapsuladas melhoraram quando o tamanho das cápsulas foi reduzido de lmm para 400ym (Canaple L. et al., Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sei Polym Ed. 2002;13:783-96). Além disso, descobriu-se que biocápsulas nanoporosas com poros de dimensões bem controladas até um mínimo de 7nm, produtos químicos de superfície adequados e microarquiteturas precisas imunoisolavam com êxito microambientes para células (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medicai devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46). 44

Exemplos de agentes imunossupressores incluem, mas não se limitam a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores do TNF-alfa, um agente biológico que tem como alvo uma citocina inflamatória e medicamentos anti-inflamatórios não esteroides (ΑΙΝΕ). Exemplos de ΑΙΝΕ incluem, mas não se limitam a, ácido acetilsalicílico, salicilato de magnésio colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salsalato, salicilato de sódio, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, ketorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inibidores da Cox-2 e tramadol.

Em qualquer dos métodos aqui descritos, as células podem ser administradas per se ou, de preferência, como parte de uma composição farmacêutica que contenha ainda um portador farmaceuticamente aceitável. 0 termo "composição farmacêutica", tal como aqui utilizado, refere-se a uma preparação das células aderentes da invenção (isto é, células aderentes de um tecido selecionado do grupo que contém tecido placentário e tecido adiposo, que são obtidas de uma cultura tridimensional), com outros componentes quimicos, como os excipientes e portadores farmaceuticamente adequados. 0 objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração das células a um indivíduo. 45

Daqui em diante, o termo "portador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um portador ou diluente que não cause irritação significativa a um indivíduo e não elimine a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Exemplos de portadores, sem limitações, são o propilenoglicol, solução salina, emulsões e misturas de solventes orgânicos com água. 0 termo "excipiente" aqui contido refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica, a fim de facilitar ainda mais a administração de um composto. Exemplos de excipientes, sem limitação, incluem o carbonato de cálcio, o fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o portador farmacêutico é uma solução salina aquosa. Técnicas para formulação e administração de medicamentos podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, aqui incorporada por referência. A composição farmacêutica pode ser administrada de uma maneira sistémica (como descrito acima). Alternativamente, é possível administrar a composição farmacêutica localmente, for exemplo, através de injeção da composição farmacêutica diretamente numa zona de tecido de um doente. 46

As composições farmacêuticas da invenção podem ser produzidas por processos bem conhecidos da especialidade, como, por exemplo, através de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabrico de drageias, levigação, emulsão, encapsulamento, aprisionamento ou liofilização.

As composições farmacêuticas para utilização de acordo com a invenção podem assim ser formuladas de uma forma convencional utilizando um ou mais portadores fisiologicamente aceitáveis que contenham excipientes e auxiliares, o que facilita o processamento dos ingredientes ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

Para injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como a solução de Hank, a solução de Ringer, tampão salino fisiológico, ou meio de congelação contendo criopreservantes. Para administração transmucosa, são utilizados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Estes penetrantes são geralmente conhecidos da especialidade.

Para qualquer preparação utilizada na invenção, a dose ou quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios in vitro e em culturas celulares. Preferencialmente, uma dose é formulada num modelo animal, a fim de alcançar uma concentração ou título desejados. Esta informação pode ser utilizada para determinar com mais exatidão as doses úteis em humanos. A toxicidade e a eficácia terapêutica dos ingredientes ativos aqui descritos podem ser determinadas por técnicas farmacêuticss normais in vitro, em culturas de células ou em animais experimentais.

Os dados obtidos destes ensaios in vitro e culturas celulares e dos estudos em animais podem ser utilizados para formular uma gama de dosagens para utilização no homem. A dosagem pode variar consoante a forma de dosagem empregue e a via de administração utilizada. A formulação, via de administração e dosagem exatas podem ser escolhidas pelo médico tendo em conta a situação do doente, (ver, por exemplo, Fingi, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l) . 0 doente de Parkinson, por exemplo, pode ser monitorizado sintomaticamente para detetar funções motoras melhoradas que indiquem uma resposta positiva ao tratamento. Para a injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis como a solução de Hank, a solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A quantidade e o intervalo das dosagens podem ser ajustados individualmente para níveis do ingrediente ativo que sejam suficientes para regular de forma eficaz a síntese do neurotransmissor pelas células implantadas. As dosagens necessárias para alcançar o efeito desejado dependerão das características individuais e da via de administração. Podem ser utilizados ensaios de deteção para determinar concentrações de plasma. 48

Consoante a gravidade e a resposta da situação médica a ser tratada, as doses podem ser administradas uma ou diversas vezes, podendo o tratamento durar entre vários dias e várias semanas ou até ser alcançada a diminuição do estado da doença. A quantidade de uma composição a ser administrada dependerá, como é evidente, do indivíduo que esteja a ser tratado, da gravidade da doença, da forma de administração, da avaliação do médico responsável, etc. A dosagem e a calendarização da administração atenderão a uma monitorização cuidadosa e contínua das alterações da situação do indivíduo. Por exemplo, a um doente de Parkinson será administrada uma quantidade de células suficiente para aliviar os sintomas da doença, com base nas indicações monitorizadas.

Os modelos de lesão do ligamento incluem, mas não se limitam a, um modelo de coelho para a reconstrução do ligamento cruzado anterior, utilizando células estaminais mesenquimatosas [Jit-Kheng et al., Arthroscopy (2004) 20 (9): 899-910], um modelo de caprino para uso em estruturas biorreabsorviveis a longo prazo para reparação de ligamento cruzado anterior [Altman et al., J Am Acad Orthop Surg. (2008) 16(4):177-187]. Modelos para reparação do tendão incluem, mas não se limitam a, modelo de coelho Nova Zelândia branco adulto para reparação de tendão mediada por células estaminais mesenquimatosas autólogas [Awad et al., Tissue Eng. (1999) 5(3):267-77]. Modelos para reparação óssea foram descritos, por exemplo, em Stem Cells in Endocrinology, Humana Press (2005) 183-206, que descreve a manipulação de células estaminais mesenquimatosas para reparação óssea. 49

Na sequência do transplante, as células da invenção sobrevivem preferencialmente na área afetada durante um período de tempo (por exemplo, cerca de 1 mês) para que possa ser observado um efeito terapêutico.

As composições que incluem a preparação da invenção formulada num portador farmacêutico compatível podem igualmente ser preparadas, colocadas num recipiente adequado e rotuladas para tratamento de uma situação indicada.

As composições da invenção podem, se assim se desejar, ser apresentadas numa embalagem ou dispensador, como um kit aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, conter película metálica ou plástica, como as embalagens alveolares. A embalagem ou dispensador podem ser acompanhados por instruções para administração. A embalagem ou dispensador podem igualmente ser acompanhados por um aviso associado ao recipiente num modelo numa forma definida por uma agência governamental que regule o fabrico, a utilização ou vendas de produtos farmacêuticos, aviso esse que indique a aprovação por parte da agência da forma das composições ou da administração humana ou veterinária. Este aviso pode, por exemplo, ser uma etiqueta aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para medicamentos sujeitos a receita médica ou um folheto informativo aprovado.

As células aderentes da invenção podem ser adequadamente formuladas como composições farmacêuticas, que podem ser adequadamente embaladas como artigo de fabrico. Este artigo de fabrico compreende um material de embalagem que compreende 50 um rótulo para uso em aumento da angiogénese num tecido, tratamento da isquemia e/ou tratamento de uma patologia que exija regeneração e/ou reparação do tecido conjuntivo, em que o material de embalagem acondicione as células aderentes da invenção.

Note-se que as células aderentes da presente invenção conseguem induzir a imunossupressão e/ou tolerância num indivíduo. Por conseguinte, as células aderentes podem ser utilizadas para tratar qualquer situação médica que necessite de imunossupressão e/ou tolerância. Este género de situações incluem, mas não se limitam a, doenças autoimunes e doenças inflamatórias (nomeadamente doenças inflamatórias agudas e crónicas), incluindo, mas não se limitando a, doenças cardiovasculares, doenças reumatoides, doenças glandulares, doenças gastrointestinais, doenças cutâneas, doenças hepáticas, doenças neurológicas, doenças musculares, doenças nefríticas, doenças relacionadas com a reprodução, doenças do tecido conjuntivo e doenças sistémicas.

Exemplos de doenças cardiovasculares autoimunes incluem, mas não se limitam a, aterosclerose (Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), infarto do miocárdio (Vaarala 0. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), trombose (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al. , Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25,-112 (15-16):660), doença autoimune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157), vasculite necrosante de pequenos vasos, poliangite microscópica, síndrome de Churg e Strauss, glomerulonefrite crescêntica e necrosante pauci- 51 imune (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178), síndrome antifosfolipido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171), insuficiência cardíaca induzida por anticorpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245), anemia hemolítica autoimune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285; Sallah S. et al. , Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3):139), autoimunidade cardíaca na doença de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15,-98 (8):1709) e autoimunidade anti-linfócito T auxiliar (Caporossi AP. et al., Virai Immunol 1998,-11 (1):9).

Exemplos de doenças reumatoides autoimunes incluem, mas não se limitam a, artrite reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sei units S A 1994 Jan 18,-91 (2):437) e espondilite anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3) : 189) .

Exemplos de doenças glandulares autoimunes incluem, mas não se limitam a, doença pancreática, diabetes tipo I, doença da tiroide, doença de Graves, tiroidite, tiroidite autoimune espontânea, tiroidite de Hashimoto, mixedema idiopático, autoimunidade ovariana, infertilidade anti-esperma autoimune, prostatite autoimune e síndrome poliglandular autoimune tipo I. AS doenças incluem, mas não se limitam a, doenças autoimunes do pâncreas, diabetes tipo 1 (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev.. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl: S125), doenças autoimunes 52 da tiroide, doença de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2): 339; Sakata S. et al. , Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77), tiroidite autoimune espontânea (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15,-165 (12):7262), tiroidite de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (8):1810), mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759), autoimunidade ovariana (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87), infertilidade anti-esperma autoimune (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):134), prostatite autoimune (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893) e sindrome poliglandular autoimune tipo 1 (Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127).

Exemplos de doenças gastrointestinais autoimunes incluem, mas não se limitam a, doenças inflamatórias intestinais crónicas (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16), doença celíaca (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122), colite, ileíte e doença de Crohn.

Exemplos de doenças cutâneas autoimunes incluem, mas não se limitam a, doenças cutâneas bolhosas autoimunes, como por exemplo, mas não se limitando a, pênfigo vulgar, penfigoide bolhosa e pênfigo foliáceo.

Exemplos de doenças hepáticas autoimunes incluem, mas não se limitam a, hepatite, hepatite crónica ativa autoimune (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3):382), cirrose biliar primária (Jones DE. Clin Sei (Colch) 1996 Nov;91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol 53

Hepatol. 1999 Jun;ll (6):595) e hepatite autoimune (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2) : 3 2 6) .

Exemplos de doenças neurológicas autoimunes incluem, mas não se limitam a, esclerose múltipla (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1), doença de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49: 77), miastenia grave (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563), neuropatias, neuropatias motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191); sindrome de Guillain-Barre e neuropatias autoimunes (Kusunoki S. Am J Med Sei. 2000 Apr;319 (4):234), miastenia, sindrome miasténico de

Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sei. 2000 Apr;319 (4):204); doenças neurológicas paraneoplásticas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplástica e sindrome da coluna rígida (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sei units S A 2001 Mar 27; 98 ( 7) :3988) ; sindrome da coluna rígida não- paraneoplástico, atrofias cerebelares progressivas, encefalite, encefalite de Rasmussen, esclerose amiotrófica lateral, coreia de Sydeham, sindrome de Gilles de la Tourette e poliendocrinopatias autoimunes (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23); neuropatias desimunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); neuromiotonia adquirida, artrogripose múltipla congénita (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sei. 1998 May 13;841:482), neurite, neurite ótica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544) e doenças neurodegenerativas. 54

Exemplos de doenças musculares autoimunes incluem, mas não se limitam a, miosite, miosite autoimune e sindrome de Sjõgren primária (Feist E. et al. , Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92) e doença autoimune do músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234).

Exemplos de doenças nefriticas autoimunes incluem, mas não se limitam a, nefrite e nefrite intersticial autoimune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;l (2) :140) .

Exemplos de doenças autoimunes relacionadas com a reprodução incluem, mas não se limitam a, perda fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9).

Exemplos de doenças autoimunes do tecido conjuntivo incluem, mas não se limitam a, doenças dos ouvidos, doenças autoimunes dos ouvidos (Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1) :249) e doenças autoimunes do ouvido interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sei 1997 Dec 29;830:266).

Exemplos de doenças autoimunes sistémicas incluem, mas não se limitam a, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49) e esclerose sistémica (Renaudineau Y. el al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2) :156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107).

Além disso, as células aderentes podem ser utilizadas para tratar doenças associadas a transplantes de um enxerto, nomeadamente, mas não se limitando a, rejeição de enxerto, rejeição crónica de enxerto, rejeição subaguda de enxerto, rejeição hiperaguda de enxerto, rejeição aguda de enxerto e doença enxerto-contra-hospedeiro. 55 0 termo "cerca de", como aqui utilizado, refere-se a ±10%.

Objetos, vantagens e aspetos inovadores adicionais da invenção serão visíveis para o perito depois de analisar os exemplos que se seguem, que não devem considerar-se limitadores. Adicionalmente, cada um dos diversos aspetos e formas de realização da invenção, conforme delineado acima e reivindicado nas reivindicações, tem suporte experimental nos exemplos que se seguem.

EXEMPLOS

Referem-se em seguida alguns exemplos que, juntamente com as descrições acima apresentadas, ilustram a invenção de uma maneira não limitativa.

Em termos gerais, a nomenclatura aqui utilizada e as técnicas laboratoriais utilizadas na invenção abrangem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de ADN recombinante. Estas técnicas estão minuciosamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA",

Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series ", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 56 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); na literatura de patentes e cientifica estão amplamente descritos imunoensaios: por exemplo, Pat. U.S. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas elas estão incorporadas aqui por referência, como se estivessem descritas completamente. Neste documento são fornecidas outras referências gerais. Consideramos que as técnicas envolvidas são bem conhecidas do perito, sendo apresentadas para conveniência do leitor. Toda a informação ai contida está incorporada aqui por referência. 57 EXEMPLO 1

PRODUÇÃO E CULTURA DE CÉLULAS ADERENTES DA MEDULA ÓSSEA, DE TECIDO PLACENTÁRIO E DE TECIDO ADIPOSO

Efetuou-se a cultura de células aderentes num sistema biorreator contendo portadores 3D para produzir células 3D-aderentes, caracterizadas por um perfil específico de expressão de marcadores celulares. A eficiência do crescimento foi testada por meio de contagem celular. A capacidade de diferenciação destas células foi testada através de cultura num meio de diferenciação.

Materiais e Técnicas experimentais Células aderentes da medula óssea - Obtiveram-se células aderentes da medula óssea (MO) a partir da medula externa aspirada de dadores hematologicamente saudáveis sujeitos a cirurgia de coração aberto ou biópsia da MO. Os aspirados de medula óssea foram diluídos três vezes em solução salina balanceada de Hank (HBSS; GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersburg MD) e sujeitos a centrifugação em gradiente de densidades Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA). Seguidamente, foram extraídas células mononucleares da medula (<1,077 g/cm3), lavas 3 vezes em HBSS e novamente suspensas em meios de crescimento [DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) complementados com 10% FCS (GIBCO BRL), 10“4 M mercaptoetanol (Merck, White House Station, NJ) , mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 pg/ml:1.25 un/ml; Beit

Ha'Emek), 2 mM L-glutamina (Beit Ha'Emek)]. Incubaram-se separadamente células provenientes de dadores individuais em 58 balões de cultura de tecidos (Corning, Acton, MA) a 37°C (CO2 5%) com mudança semanal dos meios de cultura. As células foram separadas todos os 3-4 dias utilizando tripsina-EDTA 0,25% (Beit Ha'Emek). Ao fim de 2-40 passagens, quando atingidos os 60-80% de confluência, as células foram recolhidas para análise ou para cultura em biorreatores. Células aderentes provenientes da placenta - Cortaram-se, em condições estéreis, partes internas de uma placenta de um parto de termo (Bnei Zion medicai center, Haifa, Israel), lavaram-se estas 3 vezes com tampão de Hank e incubaram-se durante 3 horas a 37°C com colagenase 0,1% (lmg/ml de tecido; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO). Seguidamente, utilizando uma pipetagem suave, as células suspensas foram lavadas com DMEM complementado com FCS 10%, mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 yg/ml:1,25 un/ml) e 2 mM de L-glutamina, semeadas em balões de 75 cm2 e incubadas a 3 7°C numa incubadora de cultura de tecidos em atmosfera humidificada com C02 5%.

Deixaram-se então as células aderir a uma superfície plastic durante 72 horas, após as quais os meios foram mudados todos os 3-4 dias. Quando atingidos os 60-80% de confluência (geralmente 10-12 dias), as células foram separadas do balão de crescimento utilizando tripsina-EDTA 0,25% e semeadas em novos balões. Seguidamente as células cultivadas foram recolhidas para análise ou para cultura em biorreatores. Células aderentes provenientes de tecidos adiposos

Obtiveram-se células aderentes de tecido adiposo humano de técnicas de lipossucção (Rambam Haifa, Israel). O tecido adiposo foi extensamente lavado com volumes iguais de PBS e digerido a 37°C durante 30 minutos com colagenase (20 mg/ml). 59

Seguidamente, as células foram lavadas com DMEM contendo FCS 10%, mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 pg/ml:1,25 un/ml) e L-glutamina e centrifugadas a 1200 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA), novamente suspensas com solução de lise (1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, para eliminar glóbulos vermelhos), centrifugadas e novamente suspensas com DMEM contendo FCS 10%, mistura Pen-Strep-Nistat ina (100 U/ml:100 pg/ml:1.25 un/ml) e L-glutamina. Seguidamente, as células lavadas foram semeadas num balão de meio de cultura tecidular estéril a 3-10x107 células/balão. No dia seguinte, lavaram-se as células com PBS para eliminar os glóbulos vermelhos residuais e as células mortas. As células foram mantidas a 37°C numa incubadora de cultura de tecidos numa atmosfera humidificada com C02 5%. Mudou-se o meio todos os 3 a 4 dias. Aos 60-80% de confluência, as células foram separadas do balão de crescimento utilizando tripsina-EDTA 0,25% e semeadas em novos balões. Após 2-40 passagens, quando as células atingiram 60-80% de confluência, estas foram recolhidas para análise ou para cultura em biorreatores.

Biorreator De Fluxo Tampão PluriXm - O Biorreator de fluxo tampão PluriX™ (Pluristem, Haifa, Israel; conforme ilustrado na Figura 1G, ver também Pat. U.S. 6,911,201), foi carregado com 1-100 ml de portadores porosos 3D empacotados (4 mm de diâmetro) feitos de uma matriz de tecido sintético de poliester. Estes portadores permitem a propagação de uma grande quantidade de células num volume relativamente pequeno. O material de vidro foi concebido e fabricado pela Pluristem (Pluristem, Haifa, Israel). O biorreator foi mantido numa incubadora de 37°C, com débito regulado e 60 monitorizado por uma válvula (6a na Figura 1G) , e bomba peristáltica (9 na Figura 1G) . 0 biorreator contém um ponto de amostragem e injeção (4 na Figura 1G), permitindo a sementeira sequencial de células. 0 meio de cultura foi fornecido a pH 6,7-7,4 a partir de um reservatório (1 na Figura 1G) . 0 reservatório foi abastecido por uma mistura gasosa filtrada (2, 3 na Figura 1G) , contendo ar/C02/02 em proporções diferentes, consoante a densidade celular no biorreator. A proporção de 02 estava ajustada ao teor de 02 dissolvido à saida do reator, determinado por um monitor (6 na Figura 1G). A mistura gasosa foi fornecida ao reservatório através de tubos ou de um difusor de silicone (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel) . Fez-se passar o meio de cultura através de um depósito de separação (7 na Figura 1G) que permite a recolha de células circulantes, não aderentes. A circulação do meio foi efetuada recorrendo a uma bomba peristáltica (9 in Figura 1G). 0 biorreator foi adicionalmente equipado com um ponto de amostragem (10 na Figura 1G) e depósitos para troca continua de meio.

Produção de células 3D-aderentes - Culturas de células 2D aderentes humanas primárias não confluentes, desenvolvidas como o descrito acima, foram tripsinizadas, lavadas, re-suspensas em DMEM complementado com FBS 10%, mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 pg/ml:l,25 un/ml) e 2 mM de L-glutamina, e semeadas (103-105 células/ml), através de um ponto de injeção, nos portadores 3D num biorreator de fluxo de tampão estéril (ver Figura 1G) . Antes da sementeira, o biorreator foi preenchido com PBS-Ca-Mg (Biological

Industries, Beit Ha'emek, Israel), colocado em autoclave (120°C, 30 min) e lavado com meio de crescimento de Dulbecco 61 contendo 10% de soro de vitelo fetal inativado pelo calor e uma mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 pg/ml:l,25

un/ml). O débito do fluxo foi mantido em 0,1-5 ml/min. O processo de sementeira implicou a paragem da circulação durante 2-48 horas, permitindo assim que as células se depositassem nos portadores. O biorreator foi mantido a uma temperatura (37°C) e condições de pH (pH=6,7-7,4) controladas utilizando uma incubadora abastecida com ar e CO2 estéreis na medida em que se revelar necessário. O meio de crescimento foi substituído 2-3 vezes por semana. O meio de circulação foi substituído por meios DMEM frescos, todas as 4 hr a 7 dias. À densidade de Ixl06-lxl07 células/ml (depois de 12-40 dias de crescimento), o volume total do meio foi eliminado do biorreator, e o biorreator e os portadores foram lavados 3-5 vezes com PBS. Seguidamente as células 3D-aderentes foram separadas dos portadores com Tripsina-EDTA; (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel; 3-15 minutos com agitação ligeira, 1-5 vezes), e seguidamente re-suspensas em DMEM e criopreservadas.

Ensaio biológico da qualidade das células 3D-aderentes - As células 3D-aderentes criopreservadas foram descongeladas e contadas. Para avaliação da viabilidade celular, semearam-se 2xl05 células num balão de cultura tecidular de 150 cm2 e avaliou-se a sua capacidade de aderência e repopulação 7 dias depois da sementeira. Seguidamente, analisou-se o fenótipo do marcador da membrana das células 3D-aderentes utilizando um citómetro de fluxo de anticorpos monoclonais com fluorescência (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Comparação entre o perfil do marcador da membrana celular das 62 células aderentes cultivadas 3D e 2D utilizando ensaios de citometria de fluxo - 100,000-200,000 células aderentes, provenientes de culturas 2D e de culturas de sistema de fluxo 3D, foram suspensas em 0,1 ml de meio de cultura num tubo de 5 ml e incubadas (4°C, 30 minutos, condições de escuridão) com concentrações saturadas de cada um dos seguintes anticorpos monoclonais: FITC-conjugado anti-humano CD90 (Chemicon International Inc. Temecula, CA), PE-conjugado anti-humano CD73 (Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), PE-conjugado anti-humano CD105 (eBioscience, San Diego, CA), FITC-conjugado anti-humano CD29 (eBioscience, San Diego, CA) , Cy7-PE-conjugado anti-humano CD45 (eBiosience), PE-conjugado anti-humano CD19 (IQProducts, Groningen, Holanda), PE-conjugado anti-humano CD14 (IQProducts), FITC-conjugado anti-humano CDllb (IQProducts) e PE-conjugado anti-humano CD34 (IQProducts) ou com FITC-conjugado anti-humano HLA-DR (IQProducts). A seguir à incubação, as células foram lavadas duas vezes em PBS gelado contendo 1% FCS inactivado pelo calor, re-suspensas em 500 μΐ de formaldeído 0,5% e analisadas utilizando o citómetro de fluxo FC-500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Comparação entre o perfil do marcador da membrana celular das células aderentes cultivadas 3D e 2D utilizando análise de espectrometria de massa - Foram produzidas células aderentes provenientes da placenta, com técnicas de cultura 2D e 3D, como descrito acima. Sucintamente, as culturas 2D foram produzidas cultivando 0,3-0,75xl06 células em balões de 175 cm2 durante 4 dias numa atmosfera humidificada com 5% C02 a 37°C, até à obtenção de 60-80% de confluência. As culturas 3D foram produzidas semeando 2-10xl06 células/grama num 63 biorreator contendo 2000 portadores, e cultivando durante 18 dias. Depois da colheita, as células foram lavadas (x 3) para remover todo o soro, peletizadas e congeladas. As proteínas foram isoladas dos pellets [utilizando o kit Tri Reagent (Sigma, Saint Louis, USA) e digeridas com tripsina e marcadas com reagente iTRAQ (Applied Biosciences, Foster City, CA) ] , de acordo com o protocolo do fabricante. Sucintamente, os reagents iTRAQ são reagents de marcação não poliméricos, isobáricos. Os peptídeos dentro de cada amostra são marcados com uma de quatro etiquetas isóbaricas isotopicamente codificadas, através das suas cadeias N-terminal e/ou laterais de lisina. As quarto amostras marcadas são misturadas e os peptídeos são analisados com espectrometria de massa. Após fragmentação peptídica, cada etiqueta liberta um ião repórter de massa distinta; deste modo, a relação dos quatro repórteres fornece as abundâncias relativas dos peptídeos dados numa amostra. (informação em: www.does.appliedbiosystems.com/pebiodocs/001133 79.pdf) .

Uma análise proteómica da cultura 2D versus cultura 3D de células aderentes provenientes da placenta foi efectuada no centro proteómico Smoler (departamento de Biologia, Technion, Haifa, Israel) utilizando LC-MS/MS em QTOF-Premier (Waters, San Francisco, CA) , com identificação e análise realizados por software Pep-Miner [Beer, I., et al., Proteomics, 4, 950-6 0 (2004)] contra a parte humana da base de dados nr. As proteínas analisadas foram as seguintes: ribonucleoproteína nuclear heterogénea Hl (Hnrphl GenBank Acesso No. NP_005511), família da histona H2A (H2AF, GenBank Acesso No. NP_034566.1) , fator 2 de elongação da tradução eucariótica (EEEF2, GenBank Acesso No. NP_031933.1), reticulocalbina 3, domínio de ligação de cálcio EF-hand (RCN2, GenBank Acesso No. NP_065701), precursor 2 da isoforma do antigénio CD44 (GenBank Acesso No. NP_001001389), músculo liso básico calponina 1 (CNN1, GenBank Accession No. NP_001290), isoforma a da 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintase 2 (Papss2, GenBank Acesso No. NP_004661), proteína ribossómica L7a (rpL7a, GenBank Acesso No. NP_000963) e Aldeído desidrogenase X (ALDH X, GenBank Acesso No. P47738) . Todas as experiências foram feitas duas vezes. Devido à natureza da análise, todas as proteínas foram analisadas de acordo com o número dos respectivos peptídeos que apareceram numa amostra (2-20 aparecimentos de uma proteína em cada análise) .

Comparação entre proteínas segregadas em células aderentes cultivadas 3D e 2D utilizando o ELISA - Foram produzidas células aderentes provenientes da placenta, com técnicas de cultura 2D e 3D, como descrito acima, tendo as culturas 3D a duração de 24 dias. Os meios condicionados foram seguidamente recolhidos e analisados para a pesquisa do ligante Flt-3, IL-6, Trombopoietina (TPO) e o fator de célula estaminal (SCF), utilizando o ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) , em três experiências independentes. Os resultados foram normalizados para lxlO6 células/ml.

Meio de diferenciação osteoblástica - A diferenciação osteogénica foi avaliada por cultura de células num meio de diferenciação osteoblástica constituído por DMEM complementado com 10% FCS, 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, 10 mM de B-glicerofosfato, durante um período de 3 semanas. A matriz calcificada foi indicada por coloração com alizarina vermelha S, e a fosfatase 65 alcalina foi detetada com o kit de ensaio da fosfatase alcalina (todos os reagentes da Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO) .

Resultados Experimentais O Sistema Biorreator PluriX™ cria um microambiente semelhante a um ambiente fisiológico.

Com o objectivo de obter condições de cultura eficientes para as células aderentes, foi criado artificialmente um ambiente semelhante a um ambiente fisiológico (descrito na Figura IA), utilizando um biorreator PluriX (Pluristem, Haifa, Israel; o portador é ilustrado na Figura 1G e mostrado antes da sementeira na Figura 1B). Como mostram as Figuras 1C-F, células 3D-aderentes produzidas da medula óssea foram cultivadas com sucesso e expandidas na matriz 3D, 20 dias (Figuras 1B-C, aumentadas xl50 e x250 respetivamente) e 40 dias (Figuras 1C-D, aumentadas x350 e x500 respetivamente) após a sementeira.

As células desenvolvidas no sistema biorreator PluriX foram significativamente expandidas - Foram desenvolvidos diferentes lotes de produção de células 3D-aderentes provenientes da placenta no sistema biorreator PluriX. A densidade de sementeira foi de 13.300 células/portador (num total de 2xl06 células) . Catorze dias após a sementeira, a densidade celular aumentou guinze vezes, atingindo aproximadamente 200,000 células/portador (Figura 2), ou 30xl06 num biorreator de 150 portadores. Numa experiência diferente, as células foram semeadas no biorreator com uma 66 densidade de l,5xl04 células/ml e 30 dias depois da sementeira os portadores continham um número de células mais de 50 vezes superior, ou seja, aproximadamente 0,5xl06 células/portador, ou 0,5xl07 células/ml. A densidade celular dos portadores nos vários níveis da coluna de crescimento era uniforme, o que indicava uma transferência homogénea de oxigénio e nutrientes para as células. Assim, o sistema de cultura 3D mostrou proporcionar condições de suporte para o desenvolvimento e manutenção prolongada de culturas de alta densidade de células mesenquimatosas, que podem ser desenvolvidas eficientemente até uma quantidade suficiente para o objetivo de apoiar o enxerto e um transplante bem-sucedido .

As células 3D-aderentes revelam característlcas únicas de marcador de membrana - Com o objetivo de definir a diferença de perfil de secreção de moléculas solúveis e produção proteica realizada pela técnica de cultura 3D com simulação do ambiente ósseo, efetuou-se uma análise de FACs. Como mostra a Figura 3A, a análise de FACS de marcadores celulares revela que as células 3D-aderentes apresentam um padrão de expressão de marcador diferente relativamente às células aderentes desenvolvidas em condições 2D. As células de cultura 2D expressavam níveis significativamente mais elevados de marcadores de membrana positivos CD90, CD105, CD73 e CD29 em comparação com células de cultura 3D. Por exemplo, o CD105 mostrou uma expressão de 56% nas células de cultura 3D em comparação com 87% nas células de cultura 2D. As células aderentes de cultura de placenta tanto 2D como 3D não expressaram qualquer marcador de membrana hematopoiético (Figura 3B). 67

As células 3D-aderentes revelam um perfil único de fatores solúveis - 0 nicho hematopoiético inclui células de apoio que produzem uma abundância de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Para definir melhor a diferença entre células aderentes de cultura 2D e 3D, foi realizado com o ELISA o perfil das quatro principais proteínas segregadas hematopoiéticas nos meios condicionados de culturas 2D e 3D de células aderentes. As Figuras 4A-C mostram que o crescimento celular nas condições 3D produziam meios condicionados com níveis mais elevados do ligante Flt-3 (Figura 4A) , IL-60 (Figura 4B) , e SCF (Figura 4C) , enquanto foram detetados níveis baixos de IL-6, e níveis quase nulos do ligante Flt-3 e de SCF nos meios condicionados das culturas 2D. Production of Trombopoietin (TPO) was very low and equal in both cultures.

As células 3D-aderentes revelam um perfil proteico único na análise de espectrometria de massa - Para definir melhor a diferença entre células aderentes de cultura 2D e 3D, analisou-se por espectrometria o perfil proteico destas células. A Figura 4D mostra que células aderentes de culturas 2D e 3D apresentam um perfil de expressão proteica notavelmente diferente. Como mostra o Quadro 1 abaixo, as células de cultura 3D mostram um nível de expressão muito mais elevado de H2AF e ALDH X (mais de 9 e 12 vezes mais elevado, respetivamente) e um nível mais elevado das proteínas EEEF2, RCN2 e CNN1 (aproximadamente 3, 2,5 e 2 vezes, respetivamente). Além disso, as células de cultura 3D apresentam cerca de metade dos níveis de expressão das proteínas Hnrphl e precursor da isoforma 2 do antigénio CD44 68 e cerca de um terço dos níveis de expressão de Papss2 e rpL7a.

Quadro 1

Proteína Nível de proteína (relativo ao grupo repórter iTRAQ) Células aderentes com cultura 2D Células aderentes de cultura 3D Av SD Av SD Hnrphl 1,434493 0,260914 0,684687 0,197928 H2AF 0,203687 0,288058 1,999877 0,965915 EEEF2 0,253409 0,130064 0,799276 0,243066 RCN2 0,54 0,25 1,34 0,26 precursor da isoforma 2 do antigénio CD44 1,68 0,19 0, 73 0,17 CNN1 0, 77 0,15 1,55 0, 17 Papss2 1,48352 0,314467 0,45627 0,137353 rpL7a 1,22 0,24 0,43 0,05 ALDH X 0,15847 0,22411 1,986711 0,212851

As células 3D-aderentes têm a capacidade de se diferenciar em osteoblastos - Para caraterizar melhor as células 3D-aderentes, cultivaram-se as células num meio de diferenciação osteoblástica durante um período de 3 semanas. Seguidamente, foi realizada a precipitação do cálcio. Mostrou-se que as células diferenciadas produziam cálcio (representadas a vermelho nas Figuras 5A-B) enquanto as células de controlo 69 mantinham um fenótipo semelhante a fibroblasto e não revelaram mineralização (Figuras 5C-D). Estes resultados mostram que as células 3D-aderentes provenientes da placenta têm a capacidade de se diferenciarem in vitro em células osteoblásticas. EXEMPLO 2

AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DAS CÉLULAS 3D—ADERENTES PROVENIENTES DA PLACENTA PARA MELHORAR O ENXERTO DE HSC

Avaliou-se o apoio das células 3D-aderentes ao enxerto de HSC através do nível de células hematopoiéticas humanas (hCD45+) detetado em ratinhos NOD-SCID imunodeficientes irradiados com doses subletais ou pré-tratados com quimioterapia.

Materiais e Técnicas Experimentais

Isolamento de células CD34+ - Recolheram-se, em condições estéreis, amostras de sangue do cordão umbilical durante o parto (Bnei Zion Medicai Center, Haifa, Israel) e fraccionaram-se células mononucleares utilizando centrifugação de gradiente de densidade com Lymphoprep (Axis-Shield PoC As, Oslo, Norway), sendo depois criopreservadas. As células mononucleares descongeladas foram lavadas e incubadas com anticorpos anti-CD34 e isoladas utilizando midi MACS (Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Germany). Foram reunidas células de mais de uma amostra para obtenção da quantidade desejada (50,000-100,000 células). 70

Deteção de células transplantadas em ratinhos irradiados -

Ratinhos NOD-SCID, machos e fêmeas, com sete semanas (NOD-CB 17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot Israel) foram mantidos em gaiolas de sistema aberto estéril, tendo-se-lhes dado dietas estéreis e água acidulada autoclavada. Os ratinhos foram irradiados em doses subletais (350 cGy), e seguidamente (48 horas após irradiação) transplantados com 50,000-100,000 células hCD34+, com ou sem células aderentes adicionais (0,5x106-lxlO6) provenientes de placenta ou de tecido adiposo (3-7 ratinhos em cada grupo), por injeção intravenosa numa veia lateral da cauda. Quatro a seis semanas depois do transplante, os ratinhos foram sacrificados por deslocação e a medula óssea foi recolhida lavando ambos os fémures e tíbias com tampão FACS (50 ml de PBS, 5 ml de FBS, 0,5 ml de azida de sódio 5%) . As células humanas na MO dos ratinhos foram detectadas por citometria de fluxo, e a percentagem de células expressoras do marcador de células hematopoiéticas CD45 humano e murino nos ratinhos NOD-SCID tratados foi determinada incubando células com CD45-FITC anti-humano (IQ Products, Groningen, The Netherlands). O limiar mais baixo para enxerto humano inequívoco foi estabelecido em 0,5%.

Deteção de células transplantadas em ratinhos tratados com quimioterapia - Injetaram-se intraperitonealmente ratinhos NOD-SCID machos com 6,5 semanas (NOD.CB17/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot Israel), mantidos conforme o descrito acima para os ratinhos irradiados, com Busulfan (25 mg/kg durante 2 dias consecutivos). Dois dias depois da segunda injeção de Busulfan, os ratinhos foram injetados apenas com células CD34+, ou juntamente com 0,5xl06 células aderentes, 71 produzidas a partir da placenta. Passadas 3,5 semanas do transplante, os ratinhos foram sacrificados, e a presença de células hematopoiéticas humanas foi determinada de acordo com o descrito acima para os ratinhos irradiados.

Resultados Experimentais

As células 3D-aderentes melhoraram o enxerto de RSC em ratinhos irradiados - Células hematopoiéticas CD34+ humanas e células 3D-aderentes provenientes da placenta ou de tecido adiposo foram cotransplantadas em ratinhos NOD-SCID irradiados. A eficiência do enxerto foi avaliada 4 semanas após o cotransplante, e comparada com ratinhos transplantados apenas com HSC. Como mostra o Quadro 2, o cotransplante de células 3D-aderentes e células UCB CD34+ produziu taxas de enxerto consideravelmente mais elevadas e níveis mais elevados de células humanas na MO de ratinhos recetores em comparação com ratinhos tratados apenas com células UCB CD34+.

Quadro 2 células transplantadas h-CD45 médio STDEV CD34 3, 8 7,9 CD34+células 3D-aderentes de placenta 5,1 12,2 CD34+células 3D-aderentes de tecido adiposo 8, 7 9,6

As células 3D-aderentes melhoraram o enxerto de HSC em ratinhos tratados com quimioterapia - Cotranplantaram-se 72 células hematopoiéticas CD34+ humanas com 500,000 células 2D- aderentes ou 3D-aderentes provenientes de placenta em ratinhos NOD- SCID pré-tratados com quimioterapia. A eficiência do enxerto foi avaliada 3,5 semanas depois do cotransplante, e comparada com ratinhos transplantados apenas com HSC. Como mostram o Quadro 3 e a Figura 6, o cotransplante de células aderentes e células UCB CD34+ produziu níveis de enxerto superiores na MO dos ratinhos recetores em comparação com as células UCB CD34+ isoladamente. Além disso, como mostra o Quadro 3, o nível médio de enxerto foi mais elevado nos ratinhos cotransplantados com células aderentes provenientes da placenta desenvolvidas no sistema biorreator PluriX (células 3D-aderentes) do que nos ratinhos cotransplantados com células do mesmo dador, desenvolvidas nas condições de cultura 2D estática convencional (balão).

Quadro 3 Células transplantadas h-CD45 médio STDEV CD34 0,9 1,1 CD34+culturas 2D convencionais da placenta 3,5 0,2 CD34+células 3D-aderentes da placenta 6, 0 7,9

Os resultados da análise de FACS apresentados nas Figuras 7A-B demonstram a vantagem de cotransplantar células aderentes com hHSCs (Figura 7B) , e a capacidade das células aderentes 73 melhorarem a recuperação do sistema hematopoiético após transplante de HSC.

Considerados no seu conjunto, estes resultados mostram que as células aderentes podem servir de células de apoio para melhorar a recuperação hematopoiética após transplante de HSCs (autóloga ou alogénica). A capacidade das células 3D-adeerentes aumentarem o enxerto de células estaminais e/ou progenitoras hematopoiéticas após transplante de HSCs pode resultar da capacidade das células 3D-aderentes de segregar citocinas que apoiam a HSC, suscetível de melhorar a capacidade de homing, auto-renovação e proliferação das células transplantadas, ou da capacidade dessas células reconstituírem o microambiente hematopoiético danificado necessário para o homing e a proliferação das HSCs transplantáveis. EXEMPLO 3

SUPRESSÃO DA RESPOSTA LINFOCÍTICA PELAS CÉLULAS ADERENTES DE CULTURAS 2D E 3D

Verificou-se que as células aderentes, e particularmente as células 3D-aderentes, suprimiam a reação imunitária de células mononucleares de sangue de cordão humano num ensaio MLR.

Materiais e Técnicas Experimentais

Ensaio de reacção linfocitária mista (MLR) - As propriedades imunossupressoras e imunoprivilegiadas das células aderentes 74 provenientes de técnicas de cultura 2D e 3D produzidas a partir da placenta, foram determinadas pelo ensaio MLR, que mede a histocompatibilidade no locus HLA, determinada pela taxa de proliferação de linfócitos incompatíveis em culturas mistas de células que respondem (proliferativas) e células que estimulam (não proliferativas) . Células mononucleares do sangue do cordão (SC) humano (2xl05) foram utilizadas como células que respondem, e foram estimuladas por meio da sua co-cultura com quantidades iguais (105) de monócitos provenientes do sangue periférico humano (PBMC) irradiados (3000 Rad) , ou com células aderentes de culturas 2D ou 3D, produzidas a partir da placenta, ou uma combinação de células aderentes e de PBMCs. Cada ensaio foi repetido três vezes. A co-cultura das células foi realizada durante 4 dias em meio RPMI 1640 (contendo 20% de FBS numa atmosfera humidificada de 5% CO2 a 37°C), numa placa de 96 poços. As placas foram pulsadas com lpC de 3H-timidina durante as últimas 18 horas de cultura. As células foram seguidamente recolhidas sobre filtro de fibra de vidro e a absorção de timidina foi quantificada com um contador de cintilações.

Resultados Experimentais A Figura 8A mostra a resposta imunitária de células SC representada pela elevada proliferação destas células quando estimuladas com PBMCs, que, sem que isso esteja estabelecido pela teoria, está provavelmente associada a proliferação de células T em resposta a incompatibilidade HLA. Contudo, estas células exibiram um nível consideravelmente inferior de resposta imunitária quando incubadas com as células aderentes da invenção. Além disso, a resposta imunitária do SC às PBMCs 75 foi substancialmente reduzida quando co-incubado com estas células aderentes. Assim, de uma forma semelhante às CEMs, observou-se que as células aderentes tinham uma capacidade potencial de reduzir a proliferação de células T das células do dador, típica de DECH. Embora ambas as culturas, 2D e 3D, tenham reduzido a resposta imunitária dos linfócitos, e em linha com as outras vantagens das células 3D-aderentes descritas acima, as células 3D-aderentes eram mais imunossupressoras. EXEMPLO 4

CÉLULAS 3D—ADERENTES PRODUZIDAS POR PLURIX EM COMPARAÇÃO COM CÉLULAS 3D—ADERENTES PRODUZIDAS POR CELLIGEN

Para obter células 3D-aderentes em grande escala, utilizou-se um novo sistema de fabrico aqui designado por Celligen.

Materiais e Métodos Experimentais

Biorreator de Fluxo Tampão PluriX™ - descrito no Exemplo 1, acima.

Produção de células 3D-aderentes por Plurix (células PLX) - descrita no Exemplo 1, acima.

Biorreator de Fluxo Tampão Celligen™ - A produção de células aderentes por Celligen™ (células PLX-C) é composta por várias etapas fundamentais como está ilustrado na Figura 8B. 0 processo incia-se com a recolha de uma placenta de um parto de termo por cesariana, planeado. 76

Seguidamente, as células aderentes foram separadas de placentas completas, desenvolvidas em balões de cultura de tecidos (culturas 2D) , recolhidas e armazenadas em azoto liquido como stock de células 2D (2DCS), sendo depois as quantidades adequadas de 2DCS são descongeladas, lavadas e semeadas sobre portadores em biorreatores para posterior expansão como cultura 3D. Após 1-3 semanas de crescimento nos biorreatores, as células são colhidas e criopreservadas em fase gasosa de azoto líquido como PLX-C.

Receção do Tecido Humano

Todas as placentas obtidas foram recebidas da maternidade sob aprovação do Comité de Helsínquia de instalações médicas. Deste modo, todas as dadoras de placenta assinaram um consentimento informado, tendo sido realizada a despistagem e exame das dadoras (IPC1). Imediatamente após a obtenção da placenta da dadora (no decurso da cesariana), aquela foi colocada num saco de plástico estéril e depois numa caixa de esferovite com sacos de gelo. A placenta foi entregue e imediatamente colocada numa área de quarentena até ser libertada para uso pelo Controlo de Qualidade (CQ) e pela Garantia de Qualidade (GQ). Todas as etapas de produção seguintes foram efetuadas numa sala limpa, de isolamento, até chegar a aprovação pelo CQ dos resultados da análise do micoplasma e as células serem libertadas para crescimento celular 2D.

Recuperação e Processamento de células aderentes

Para iniciar o processo, a placenta completa foi cortada em 77 pedaços em condições assépticas sob uma capela de fluxo laminar, lavada com solução tampão de Hank e incubada durante 3 horas a 37°C com 0,1% colagenase (1 mg colagenase/ml tecido). Adicionou-se meio celular 2D (meio 2D compreendendo DMEM complementado com 10% FBS, fungizone 0,25 yg/ml e gentamicina 50 pg/ml) e o tecido digerido foi submetido a uma filtração grosseira através de um filtro metálico estéril, recolhido num copo estéril e centrifugado (10 minutos, 1200 RPM, 4°C) . Seguidamente, utilizando uma pipetagem suave, as células suspensas foram lavadas com meio 2D complementado com antibióticos, semeadas em balões de 80 cm2 e incubadas a 37°C numa incubadora de cultura de tecidos numa atmosfera humidificada complementada com 5% C02. Ao fim de 2-3 dias, em que se deixaram as células aderir à superfície do balão, estas foram lavadas com PBS e adicionou-se meio 2D.

Crescimento celular bidimensional (2D)

Antes da primeira passagem, retiraram-se, para análise do micoplasma (IPC2), amostras de meio de crescimento de 10% do número total de balões em isolamento. Se as células fossem negativas para o micoplasma (kit de micoplasma EZ-PCR, Biological Industries, Israel), eram libertadas do isolamento. Após 1-2 passagens adicionais, as células foram transferidas para a sala limpa de produção 2D (2DP) . Uma vez na sala 2DP, a cultura foi continuada em mais 3-5 passagens. Após a passagem 4, foi retirada uma amostra IPC3 para determinação do fenótipo imune. Durante todo o processo, as culturas foram desenvolvidas em meio 2D sem antibióticos numa incubadora de cultura de tecidos em atmosfera humidificada com 5% C02 a 37°C. Após um total de 6-8 passagens (9-16 78 duplicações celulares), as células foram recolhidas e criopreservadas como stock celular 2D (SC2D). A primeira passagem foi geralmente realizada ao fim de 10-15 dias. Começando na passagem 2 e continuando até à passagem 6-8, as passagens celulares foram realizadas quando a cultura atingiu 70-80% de confluência, geralmente após 3-5 dias (1,5-2 duplicações). As células foram separadas dos balões utilizando 0,25% tripsina-EDTA (4 minutos a 37°C) e semeadas numa densidade de cultura de 3±0,2xl03 células/cm2. À medida que as passagens prosseguiam, o tamanho dos balões de cultura de tecidos foi aumentando. O processo de cultura iniciou-se em balões de 80 cm2, continuou em balões de 175 cm2, depois em balões de 500 cm2 (balão triplo) e finalmente as células foram semeadas em fábrica celular de 10 bandejas (6320 cm2).

Antes da criopreservação, no final do period de crescimento SC2D, o meio de crescimento foi retirado e a amostra foi preparada para ser enviada para um laboratório BPL aprovado para análise do micoplasma (IPC4).

Técnica de Criopreservação para Produto de Stock Celular 2D

Para a criopreservação SC2D, foram recolhidas células de culturas 2D em condições assépticas utilizando 0,25% tripsina-EDTA. As células foram centrifugadas (1200 RPM, 10', 4°C), contadas e novamente suspensas em meio 2D.

Para a congelação, as suspensões celulares foram diluidas 1:1 com mistura de congelação 2D (as concentrações finais eram de 10% DMSO, 40% FBS e 50% meio 2D) . Foram produzidas 79 aproximadamente l,5-2,5xl09 células a partir de uma placenta. Armazenaram-se 4 ml de células com uma concentração final de 10xl06/ml em frascos de criopreservação de polipropileno de 5 ml. Os frascos foram rotulados e transferidos para um congelador de taxa controlada para um processo de redução gradual da temperatura (l°C/min), após o que foram transferidos para armazenagem em fase gasosa de um congelador de azoto liquido localizado na sala de armazenamento a frio. Este material foi designado como lote de stock celular 2D (SC2D) .

Início das Técnicas de Cultura Tridimensionais

Para começar a cultura 3D, uma quantidade adequada (150±30xl06) de células de SC2D foi descongelada na sala 2DP e lavada com meio 3D (DMEM com 10% FBS e 20 Mm Hepes) para eliminar o DMSO antes de semear nos biorreatores preparados antecipadamente. O conteúdo de cada frasco SC2D foi pipetado e diluído 1:9 com meio 3D pré-aquecido (37°C). As células foram centrif ugadas (1200 RPM, 10', 4°C) e novamente re-suspensas em 50-100 ml de meio 3D pré-aquecido (37°C) num frasco estéril de 250 ml. Recolheu-se uma amostra e as células foram contadas utilizando um corante azul de tripano para determinar o número e viabilidade das células. A suspensão celular foi transferida sob uma capela de fluxo laminar para um frasco de sementeira de 0,5 L. A suspensão celular foi transferida, através de tubos estéreis, do frasco de sementeira para o biorreator por gravitação.

Produção de células 3D-aderentes no biorreator Celligen (PLX-C). Descrição do biorreator. 80 A fase de crescimento 3D foi efetuada utilizando um biorreator CelliGen Plus® ou BIOFLO 310 automático [ (New Brunswick Scientific (NBS)] descrito na Figura 8C. O biorreator foi utilizado para o cultivo de culturas celulares, em que as condições eram adequadas para concentrações celulares elevadas. O processo de cultivo foi realizado utilizando um biorreator num modo de perfusão. O biorreator de escala laboratorial foi construído com base em dois sistemas principais - o sistema de controlo e o biorreator propriamente dito (vaso e acessórios). Os parâmetros do processo foram monitorizados e controlados por uma consola de controlo que incluía ligações para sondas, motor e bombas, circuitos de controlo para Oxigénio Dissolvido (OD) , pH, perfusão e agitação (com um motor), um sistema de controlo de gases, circulação de água e sistema de aquecimento para controlo da temperatura e uma interface do utilizador. Os parâmetros do processo controlados (tais como temperatura, pH, OD etc.) podiam ser exibidos na interface do utilizador e monitorizados por um controlador designado. Técnica de crescimento de culturas celulares nos biorreatores

Como se disse na secção acima, 150±30xl06 células do SC2D criopreservado foram descongeladas, lavadas e semeadas num biorreator estéril. 0 biorreator continha portadores de 30-50 gr (FibraCel® disks, NBS), feitos de poliester e polipropileno e 1,5±0,1 L de meio 3D. O meio de crescimento no biorreator foi mantido nas seguintes condições: 37°C, 70% Oxigénio Dissolvido (OD) e pH 7,3. Foram fornecidos gases filtrados (Ar, CO2, N2 e O2) Segundo o determinado pelo sistema de controlo de modo a manter o valor de OD nos 70% e 81 ο ρΗ nos 7,3. Durante as primeiras 24 horas, o meio foi agitado a cinquenta rotações por minuto (RPM), velocidade que foi aumentada para 200 RPM no dia 2. Durante os primeiros 2-3 dias, as células foram desenvolvidas em modo por lotes. A perfusão foi iniciada quando a concentração de glucose do meio diminuiu para menos de 550 mg/liter. O meio foi bombeado do recipiente de alimentação para o biorreator utilizando tubos de silicone estéreis. Todas as ligações por tubos foram efetuadas sob fluxo laminar utilizando conectores estéreis. A perfusão foi ajustada diariamente de modo a manter a concentração de glucose constante em aproximadamente 550±50 mg\litro. Todos os 1-2 dias, retirou-se uma amostra do meio de crescimento para determinação das concentrações de glucose, lactato, glutamina, glutamato e amónio (Bio-Profile 400 analyzer, Nova Biomedical). A taxa de consumo de glucose e a taxa de formação de lactato da cultura celular permitiu medir a taxa de crescimento das células. Estes parâmteros foram utilizados para determinar o tempo de colheita com base nos dados experimentais acumulados.

Colheita das células PLX-X desenvolvidas em culturas 3D do biorreator 0 processo de colheita de células começou no final da fase de crescimento (4-10 dias). Foram recolhidas duas amostras do meio de crescimento. Preparou-se uma amostra para ser enviada a um laboratório BPL para análise do micoplasma de acordo com os padrões USP e Eu, e a outra foi transferida para um congelador de taxa controlada para um processo de redução gradual da temperatura (l°C/min), após o que foram transferidas para armazenamento em fase gasosa de um 82 congelador de azoto líquido localizado na sala de armazenamento a frio, para o caso de ser necessário repetir a análise do micoplasma. Estas amostras de meio foram consideradas parte da análise do micoplasma do produto final, e os resultados foram considerados como parte dos critérios para libertação do produto. A cultura de crescimento 3D foi colhida na área laminar Classe 100 na sala 3DP da seguinte maneira: O vaso do biorreator foi esvaziado por gravitação através de tubos para um recipiente de resíduos. O vaso foi aberto, retirando a placa superior, e os portadores foram transferidos assepticamente, utilizando pinças estéreis, do cesto para a rede do cesto superior (ver Figura 8C). Seguidamente, o vaso do biorreator foi fechado e novamente cheio com 1,5 L de PBS pré-aquecido (37°C) . Aumentou-se a velocidade de agitação para 150 RPM durante 2 minutos. O PBS foi escoado através de tubos, por pressão ou gravidade, para o frasco de resíduos. A lavagem foi repetida duas vezes.

Para libertar as células dos portadores, adicionou-se ao vaso do biorreator 1,5 L de tripsina-EDTA pré-aquecida a 37°C (tripsina 0,25%, EDTA 1 mM) e agitaram-se os portadores durante cinco minutos a 150 RPM, 37°C. Recolheu-se a suspensão celular para um recipiente estéril de 5 L contendo 250 ml de FBS. Dividiu-se a suspensão celular por 4 tubos de centrifugadora estéreis de 500 ml e retirou-se uma amostra para análise do micoplasma. Os tubos de centrifugadora fechados foram transferidos, através de passagem ativa 3DP, para a sala de enchimento classe 10,000 (FRl) na qual as 83 células foram assepticamente enchidas e criopreservadas como PLX-C.

Análise do ciclo celular - As células PLX-C obtidas por Celligen e as células PLX obtidas por Plurix foram fixadas com 70% EtOH O.N, centrifugadas e novamente suspensas numa solução de iodeto de propídio (IP) contendo 2 yg/ml de IP (Sigma), 0,2 mg/ml de Rnase A (Sigma) e 0,1% (v/v) de Triton (Sigma) durante 30 minutos. O ciclo celular foi analisado por FACS .

Ensaio de expressão génica (Microarray) - Obtiveram-se células aderentes de placentas humanas de termo e expandiram-se por Plurix ou por Celligen. Obtiveram-se três lotes diferentes de células de cada um dos métodos de expansão para exame mais aprofundado.

Extraiu-se o ARN de células (micro-kit Qiagen-Rneasy) e submeteu-se este a um ensaio de expressão do genoma completo Affymetrix. Chip utilizado: GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia, USA).

Análise de FACS de marcadores de membrana - as células foram coradas com anticorpos monoclonais como se descreveu anteriormente. Sucintamente, 400,000-600,000 células foram suspensas em 0,1 ml de tampão de citometria de fluxo num tubo de ensaio de 5 ml e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente (TA), no escuro, com cada um dos seguintes anticorpos monoclonais (AcMs): AcM CD29 anti-humano FITC-conjugado (eBioscience) , AcM CD73 anti-humano PE-conjugado (Becton Dickinson), AcM CD105 anti-humano PE- 84 conjugado (eBioscience) , AcM CD90 anti-humano PE conjugado (Becton Dickinson) , AcM CD45 anti-humano FITC-conjugado (IQProducts), AcM CD19 anti-humano PE-conjugado (IQProducts), AcM CD14 anti-humano PE-conjugado (IQProducts) , AcM HLA-DR anti-humano FITC-conjugado (IQProduct), AcM CD34 anti-humano PE-conjugado (IQProducts) , AcM CD31 anti-humano FITC-conjugado (eBioscience) , AcM KDR anti-humano FITC-conjugado (R&D systems), AcM marcador de fibroblastos anti-humano (D7-FIB) (ACRIS), AcM CD80 anti-humano FITC-conjugado (BD), AcM CD86 anti-humano FITC-conjugado (BD), AcM CD40 anti-humano FITC-conjugado (BD), AcM HLA-ABC anti-humano FITC-conjugado (BD), Isotipo IgGl FITC-conjugado (IQ Products), Isotipo IgGl PE-conjugado (IQ Products).

As células foram lavas duas vezes com tampão de citometria de fluxo, re-suspensas em 500 μΐ de tampão de citometria de fluxo e analisadas por citometria de fluxo utilizando o citómetro de fluxo FC-500 (Beckman Coulter). Prepararam-se controlos negativos com moléculas de fluorescência do isotipo relevante.

Reacção Linfocitária Mista (RIM) 2 x 105 CMNs provenientes de sangue periférico (PB) (do dador A) foram estimuladas com igual quantidade de CMNs provenientes de PB irradiado (3000 Rad) (do dador B). Adicionaram-se às culturas quantidades crescentes de PLX-Cs. Três réplicas de cada grupo foram semeadas em placas de 96 poços. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 20% FBS. As placas foram pulsadas com 1 yC de 3H-timidina durante as últimas 18 horas do 5o dia de cultura. As células 85 foram colhidas sobre um filtro de fibra de vidro e a absorçao de timidina foi quantificada com contador de cintilações.

Para coloração por CFSE, células PB-CMN foram coradas para determinação da coloração CFSE (sondas moleculares) para medição da proliferação antes do cultivo. As células foram colhidas ao fim de cinco dias e a intensidade da coloração CFSE foi detetada por citometria de fluxo.

ELISA 0 ensaio ELISA foi efectuado como anteriormente descrito. Sucintamente, CMNs (isoladas do sangue periférico) foram estimuladas com 5 pg/ml ConA (Sigma), 0,5 pg/ml LPS (SIGMA), ou 10 yg/ml PHA (SIGMA) na presença de PLX-C em atmosfera humidificada 5% C02 a 37°C. Os sobrenadantes foram colhidos e sujeitos a análise de citoquina utilizando os kits ELISA kits for IFNy(DIACLONE), TNFcx (DIACLONE) e IL-10 (DIACLONE).

Resultados Experimentais

As alterações no fabric com Celligen em comparação com Plurix produziram diversas diferenças importantes (resumidas no Quadro 4, abaixo). 86

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Volume de Aumento da escala do processo. Nível de produção mais trabalho (ml) 280 1500 elevado nos ensinamentos presentes (2-8 duplicações da população) Peso do portador (gr) 1, 4 30 Aumento da escala do processo 87

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Configuração do leito Cónico, coluna de 50 ml Leito empacotado em cilindro Presentes ensinamentos - melhor fluxo do meio e nutrientes. Ensinamentos do Exemplo 1 - fluxo ineficiente devido à forma estreita do orifício de saída da estrutura cónica. Maior homogeneidade do fluxo do meio. Canalização nos ensinamentos do Exemplo 1.

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Concentração celular na sementeira (células/gr portador) 3x106 células/gr portador 5x106 células/gr portador Maior interação entre células nos presentes ensinamentos Concentração celular na sementeira (células/ml) 0,015x106 células/ml 0,lxlO6 células/ml Maior interação entre células nos presentes ensinamentos 89

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Técnica de Sementeira Sementeira Ensinamentos do sementeira com baixo como o volume Exemplo 1 volume do de trabalho - distribuição meio durante final com heterogénea da 24 hr seguida da adição de meio ao volume de trabalho final agitação cultura celular no leito do portador. Volume de meio insuficiente nas primeiras 24 hr do processo. Conducente a condições de trabalho inadequadas (ambiente acidico) 90

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Duração da fase de produção 14-21 dias 4-10 dias Melhor qualidade do produto. Processo de colheita eficiente. Melhor produção. Processo com menores custos nos presentes ensinamentos. 91

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Modo de operação Lotes repetidos - mudança de meio duas vezes por semana Modo de perfusão - a taxa foi ajustada de acordo com a concentração de glucose (o meio foi mudado a uma concentração de glucose de 550±50 mg/L) Presentes ensinamentos - alterações moderadas das condições respeitantes à composição do meio em todo o processo. Eliminação continua de agentes tóxicos produzidos pelas células. No modo de lotes - concentração inferior dos nutrientes essenciais (fac-tores limitantes) Menos detritos celulares 92

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Técnica de Colheita em Colheita no Ensinamentos colheita tubos de 50 interior do presentes - ml biorreator processo mais 3 ciclos de 1 ciclo de eficiente. tripsinização tripsinização Colheita efetuada num sistema fechado. 1 ciclo de tripsinização - melhor qualidade das células. 93

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Agitação Circulação do rotor de Ensinamentos meio do ascensão presentes - o reservatório para a coluna utilizando bomba peristáltica celular meio flui através do leito empacotado -Melhor fornecimento de nutrientes e oxigénio à cultura. A homogeneidade do meio melhora outros circuitos de controlo (temp. , OD, pH) 94

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Controlo de A produção Controlo Ensinamentos temperatura foi efetuada direto em presentes numa linha. - Medição mais incubadora. Transferência apurada da Controlo de calor via temperatura da indireto da camisa de cultura. Resposta temperatura arrefecimento rápida. Tempo (da câmara da incubadora). Transferência de calor através de interface de ar. a água curto para atingir valor-alvo . 95

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Monitoriza- Manualmente. Monitorização Ensinamentos ção da Monitorização direta em presentes temperatura indireta da temperatura da água. linha - Melhor monitorização e controlo do processo. Resposta rápida a avarias. Monitoriza- Nenhuma Monitorização Ensinamentos ção do OD em linha presentes - Melhor monitorização e controlo do processo. Resposta rápida a avarias. 96

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Controlo do Nenhum. Controlo Ensinamentos OD Apenas direto em presentes - introdução de linha de um Melhor controlo ar. valor-alvo especifico usando ar, 02 e N2. do nível de OD. Melhor manutenção de condições de trabalho especificadas. Monitoriza- Apenas Controlo e Ensinamentos ção e monitorização monitorização presentes - controlo do visual em linha Melhor controlo PH (vermelho de fenol como parte do meio). do pH. Melhor manutenção de condições de trabalho especificadas. 97

Quadro 4:

Comparação entre o sistema Plurix e o sistema Celligen (continuação)

Parâmetro Crescimento celular de acordo com Exemplo 1 Ensinamentos da presente invenção Melhoria Arejamento Apenas por Cobertura Ensinamentos do aspersão (aspersão como opção) Exemplo 1 -Arejamento por aspersão cria espuma suscetível de danificar as células.

As alterações no processo de fabrico produziram alterações nas caracteristicas das células aderentes 3D obtidas. Estas diferenças estão resumidas abaixo.

Análise do ciclo celular da PLX fabricada por Plurix em comparação com a PLX-C fabricada por Celligen - Compararam-se as células PLX-C obtidas por Celligen com células PLX obtidas por Plurix para examinar a distribuição das células entre as diferentes fases do ciclo celular. Como se pode ver claramente nas Figuras 9A-B, as células PLX-C expandidas por Celligen exibiam um perfil proliferativo típico (distribuição de células entre as diferentes fases do ciclo celular). 98

Especificamente, 28% das células estavam nas fases S e G2/M (Figura 9A). Estes resultados indicavam que as células foram colhidas durante a proliferação e que as condições do biorreator Celligen apoiavam o crescimento celular.

Comparação de Microarray entre células obtidas com Plurix e células obtidas com Celligen - os ensaios de expressão génica permitiram monitorizar simultaneamente perfis de expressão pangenómica de células aderentes provenientes de placentas de termo expandidas por Plurix (PLX) ou por Celligen (PLX-C). Estes resultados permitiram avaliar o mecanismo molecular subjacente à variação fenotipica entre células obtidas por estes diferentes métodos de crescimento (ver Quadro 5, abaixo).

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) proteína induzida pelo interferão com repetições de tetratricopeptídeo 17,52 0,0401812 família aldeído desidrogenase 1, membro AI 16,76 0,00145807 arginina aminopeptidase derivada de leucócito 13, 99 3,88E-06 ceratina 27 pseudogene 27 12,25 0,000224998 99

Quadro 5:

Expressão génica em células Celllgen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene Celllgen vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) semelhante a ceratina, tipo I 11,83 0,000304949 citoesquelético 18 (Citoqueratina) recetor acoplado à proteína G, 10,35 3,39E-05 família C, grupo 5, membro A integrina, alfa 6 9, 84 0,0411667 recetor acoplado à proteína G 8,73 0,00197635 126 fator de coagulação III 7,36 0,012192 (tromboplastina, fator tecidular) inibidor da dissociação do Rho- 7,36 0,00200066 GDP (GDI) beta peptídeo sinal, domínio CUB, 7,20 0,0255115 EGF-like 3 proteína induzida pelo 7,09 0,0139777 interferão com repetições de tetratricopeptídeo homólogo 1 de Dickkopf (Xenopus 7,06 3,06E-07 laevis) NAD(P)H desidrogenase, quinona I 6, 63 0,000282423 Ceratina 18 6,46 0,000514523 100

Quadro 5: Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene semelhante a recetor 1 do fator de crescimento opióide mal, semelhante a proteína de diferenciação das células T neurofilamento, meio polipeptídeo 150 kDa contendo domínio DEP 1 catepsina C WAS inibidor da serpina peptidase, clade B (ovalbumina), membro família 7 de portador de soluto (transporte de aminoácidos catiónicos) proteína induzida pelo interferão com repetições de tetratricopeptideo componente do complexo NUF2,NDC80 cinetócoro (S.

Celligen vs. Plurix (fold change) 5,96 5, 95 5, 86 5,82 5,72 5,47 5,44 5,33

Valor de p (tratamento) 0,00114551 0,00664216 0,0190611 0, 000370513 0,00532262 0,00178153 0,0190218 0,00688017 5,18 5, 05 cerevisiae) proteína 1 de ligação do domínio 4,95 SHC SH2 0,00357376 0,00276524 0,00430878 101

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) tioredoxina redutase 1 4,86 0,000197486 proteína associada a metástases 4,85 0,00148024 de cancro do pulmão proteína 29 activadora da Rho 4,85 0,0466211 GTPase homólogo do ciclo de divisão 4,80 0,00514206 celular 20 (S. cerevisiae) família com semelhança de 4,63 0,000125819 sequência 111, membro B cinase de ligação PDZ 4,54 0,00784983 homólogo 2 do estabelecimento de 4,53 0,000773033 coesão 1 (S. cerevisiae) proteína 4 de ligação do 4,47 0, 000215944 guanilato lipase A,ácido 4,42 0,0167385 lissosómico,colesterol esterase (Wolman dise) família da cinesina membro 20A 4,39 0,00582352 KIAA0101 4,28 0,0105909 inibidor 3 da cinase ciclino- 4,25 0,000732492 dependente (dual associado a CDK2) 102

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) timidilato sintetase 4,23 0,00685584 quadro 3 de leitura aberta do 4,18 0,000548296 cromossoma 13 aurora cinase A 4,16 0,00632571 nei endonuclease VlII-like 3 (E. 4,14 0,00115606 coli) proteína centrosomal 55 kDa 4,13 0,0021952 recetor I (semelhante a lectina) 4,11 0,0205198 4,05 4,01 3,98 3,93 3.89 3.89 3,88 3,87 0,00141153 0,010923 0,00834059 0,00911953 0,00109627 0,000112551 0,00537097 0,000203389 das lipoproteínas de baixa densidade oxidadas homólogo denticleless (Drosophila) proteína de ligação da anilina, actina polipeptídeo M2 da ribonucleótido reductase domínio 1 de repetição da anguirina (músculo cardíaco) factor de transcrição 19 (SCI) ceratina complexo condensina I não-SMC, subunidade G ciclina E2 103

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) tripsinogénio C 3,86 0,00416276 ARN nucleolar pequeno, C 3,81 0,0334484 proteína 2 de junção apertada 3,81 0,00012562 (zona occludens 2) membro 18A da família da 3,78 0,00134108 quinesina membro 2C da família da 3,77 0,0059888 quinesina semelhante a shugoshina (s. 3,76 0,00101318 pombe) cinase 1 semelhante a polo 3,75 0,0140309 (Drosophila) timidina cinase 1, solúvel 3,73 0,00124134 factor de transcrição 19 (SCI) 3,73 0,00124327 factor de transcrição 19 (SCI) 3,73 0,00124327 homólogo da claspina (Xenopus 3,71 0,00683624 laevis) subunidade 1 do complex GINS 3,69 0,00104515 (Psfl homolog) glutationa S-transferase 1 3, 67 0,041701 microssómica semelhante a arilacetamida 3,67 0,000902645 desacetilase 1 104

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) componente do complexo 3, 65 0,00568662 cinetócoro SPC25,NDC80, homólogo (s. ce integrina, alfa 4 (antigénio 3,62 0,0158411 CD49D, subunidade alfa 4 de VLa- ‘i ) catenina (proteína associada a 3,57 7,46E-05 caderina), semelhante a alfa 1 discos, homólogo 7 3,56 0,0317074 grande(Drosophila) semelhante ao homólogo do 3,55 0,0043878 oncogene virai (aviano) da mieloblastose v-myb serglicina 3,54 0,0443487 proteína N de centrómero 3,53 0,000540143 ciclina A2 3,53 0,00965934 proteína 8 de 22 kDa de choque 3,52 0,0219583 térmico domínio sema, domínio 3,49 0,008548 imunoglobulina (Ig), domínio básico curto 3,49 0,00834174 proteína 11A activadora da Rho GTPase 105

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) anemia de Fanconi, grupo I de 3,43 0,00464532 complementação homólogo do BUB1 gemulação não 3,42 0,0108258 inibida por benzimidazoles 1 (levedura) proteína acídica específica do 3, 42 0,00334641 ovário recetor colinérgico, muscarínico 0 3,41 0,0320078 X ciclo de divisão cellular 2, G1 a S e G2 a M 3,41 0,0017111 regulador proteico da citocinese 1 3,39 0,0325664 X componente 5 do complexo de manutenção minicromossómico 3,38 0,00475504 antigénio 5 associado ao esperma 3,37 0,00906321 leucina zipper cinase embriónica 3,34 0,00908391 materna ARN nucleolar pequeno, C 3,33 0,0298703 carnitina palmitoiltransferase 3,33 0,00170894 IA (fígado) semelhante a enzima E2S 3,33 0,000415822 conjugada da ubiquitina 106

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) membro I da família da cinesina 1 3,33 0,00915145 1 cinase 7 relacionada com o NIMA (nunca no gene a da mitose) 3,33 0,00159114 ADAM metalopeptidase com motivo 3,32 0,0102751 trombospondina tipo 1 proteína 3 contendo espiral 3,31 0,0014577 enrolada ácida de transformação ciclina BI 3,29 0,0103092 semelhante a MAD2 mitotic arrest 3,28 0,00488102 deficient 1 (levedura) di-hidrofolato redutase 3,28 0,00178879 contendo domínio NIPA-like 3 3,27 0,00164708 associado ao ciclo de divisão 3,26 0,0122226 celular 2 enzima editora de mRNA da 3,26 0,00308692 apolipoproteína B, polipeptídeo catalítico ciclina B2 3,25 0,016544 contendo domínio de endonuclease 1 3,24 0,000429245 X di-hidrofolato reductase 3,23 0,00141306 pseudogénio 107

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (cont inuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) ATPase, Na+ 3,23 0, 000381464 factor de replicação C (activador 1) 3, 38 kDa 3,23 0,00109668 domínio de repetição WD 76 3,22 0,0023531 pleckstrina 3,17 0,0304429 proteína I activadora da Rac GTPase 3,17 0,00381613 proteína do dedo de PHD 19 3,17 0,000177604 apagado na leucemia linfocitária 0 3,15 0,0109528 proteína centromérica I 3,15 0,0106816 domínio RING associado ao BRCA1, 1 3,14 0,000540414 _L regulador de sinalizador de proteína G, 4 3,13 0,00781061 semelhante a proteína de ligação a STAM 1 3,11 0,0181743 homólogo da sulfiredoxina 1 (S. cerevisiae) 3,10 5,14E-05 quadro de leitura aberta 23 do cromossoma 15 3,08 0,000147331 TTK proteína quinase 3,08 0,0112171 108

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurlx (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) complexo condensina II não SMC, subunidade G2 3,08 0,0130322 villin 2 (ezrin) 3, 07 0,0131934 estomatina 3,06 0,00387095 contendo domínio A proteína tirosina fosfatase- like 3, 06 0,0419644 inibidor da serpina peptidase, clade B (ovalbumina), membro 3, 05 0,0030439 membro 4A da família da cinesina 3,05 0,0114203 proteína hipotética DKFZp762El312 3,05 0,00726778 enzima E2S conjugada da ubiquitina 3,04 0,00118205 semelhante a hidroxiesteróide desidrogenase 2 3,03 3,71E-05 contendo domínio AAA, família ATPase 2 3,01 0,00415258 homólogo TPX2, associado a microtúbulos (Xenopus laevis) 3,00 0,0253137 cluster de histonas 1, H4d 3,00 0,030183 membro 23 da família da cinesina 2, 99 0,00790585 proteína 2 de 70 kDa do choque térmico 2,99 0,0215102 109

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) semelhante a complexo de reconhecimento da origem, subunidade 1 (levedura) 2, 99 0,00207753 di-hidrofolato reductase 2,98 0,00307793 receptor da motilidade mediado por hialuronano (RHAMM) 2, 97 0,00467816 3'-fosfoadenosina 5'-fosfossulfato sintase 2 2, 97 1,43E-05 glicerol-3-fosfato desidrogenase 2 (mitocondrial) 2,95 0,00211969 proteína 1 nucleolar e associada ao fuso 2,95 0,00520875 homólogo diáfano 3 (Drosophila) 2,95 0,00107709 membro 14 da família da cinesina 2,94 0,00947901 cluster de histonas 1, Hlb 2,93 0,0470898 proteína de ligação a nucleotídeo guanina (proteína G), inibid alfa 2,92 0,00184597 componente 8 do complexo de manutenção minicromossómico 2,92 0,000841489 candidato 5 a susceptibilidade 2, 92 0,0330594 ao cancro 110

Quadro 5:

Expressão génica em células Celllgen em comparação com células Plurlx (continuação)

Gene

leucotrieno B4 12- hidroxidesidrogenase glutamato-cisteína ligase, subunidade modificadora forkhead box Ml proteína relacionada com diferenciação adiposa contendo domínio de 0-aciltransferase ligado a membrana, 1 enzima ubiquitina-conjugada E2T (suposta) associado ao ciclo de divisão celular 3 integrina, alfa 3 (antigénio CD49C, subunidade alfa 3 de VLA-3) fator de coagulação XIII, polipeptídeo B homólogo do RAD51 (homólogo do RecA, E. coli) (S. cerevisae) cassete de ligação ATP, subfamília C (CFTR

Celllgen vs. Plurlx (fold change) 2,92 2.91 2.91 2.90 2.90 2.90 2,89 2,88 2,88 2.87 2.87

Valor de p (tratamento) 0,000685452 0,00378868 0,0203154 0,000331751 0,01185 0,00741886 0,006289 0,00574148 0,0294465 0,000854739 0,00382491 111

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) família com semelhança de 2,85 0,00111165 sequência 29, membro A contendo domínio SH2, 4A 2,84 0,0323646 proteína de membrana, 2,84 0,000396285 palmitoílada 1, 55 kDa subunidade reguladora 1B da 2,84 0,0107391 proteína quinase CDC28 proteína de interacção PSMC3 2,84 0,00766442 interface de microfribila de 2,84 0,0192072 elastina 2 topoisomerase (DNA) II alfa 170 2,83 0,0321109 kDa proteína transmembrana 106C 2,82 0,000214223 cluster de histonas 1, H3b 2,80 0,0304598 quadro de leitura aberta do 2,80 0,00347442 cromossoma 18, 24 substrato 8 da via do recetor do 2,79 0,0194949 fator de crescimento epidérmico domínio do grupo de alta 2,78 0,0030536 mobilidade da ligação nucleossómica, 2 SCL 2,78 0,00390288 domínio hect e RLD4 2,78 0,00679184 112

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene Celligen vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) homólogo B da função anti- 2,77 0,00543408 silenciadora 1, ASF1 (S. cerevisae) recetor de interacção 13 da 2,76 0,0118319 hormona tiroideia associado ao ciclo de divisão 2,75 0,00619878 celular, 8 membro da família da cinesina Cl 2,74 0,00821937 domínio do grupo de alta 2,73 0,00384071 mobilidade da ligação nucleossómica, 2 ornitina descarboxilase 1 2,73 0,00144868 semelhante a homólogo do 2,71 0,00989416 oncogene virai (aviano) da mieloblastose, v-myb, 2 ligando KIT 2,70 0,00641955 ki regulado de especificidade 2,70 0,0234606 dual tirosina-(Y)-fosforilação homólogo do transporte 2,70 0,0247286 intraflagelar 80 (Clamidomonas) proteína transmembrana 48 2,69 0,00458248 113

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (cont inuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) proteína de ligação EBNA 1, 2 2,69 0,00296292 de interacção ZW 10 2,69 1,88E-05 exonuclease 1 2, 68 0,00739393 transcetolase (síndroma de 2,68 1.92E-05 Wernicke-Korsakoff) recetor 1 da somatostatina 2, 68 0,0144901 isocitrato desidrogenase 3 2, 67 0,00297129 (NAD+) alfa proteína 2 associada ao 2,67 0,0030499 citoesgueleto componente 4 do complexo de 2,67 0,00342054 manutenção minicromossómico inibidor da ligação 1 do ADN, 2, 66 0,036485 hélice-laço-hélice negativo dominante subunidade de regulação 1B da 2,66 0,0145263 proteína guinase CDC28 gueratina 18 2,66 8,40E-05 molécula CD97 2,66 0,00994045 guadro de leitura aberta 173 do 2,64 0,00222408 cromossoma 6 contendo domínio BTB (POZ), 3 2,62 0,0166824 surdez, autosomal dominante 5 2,62 0,00235481 114

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) proteína KIAA0286 2,62 0,00130563 anemia de Fanconi, grupo de complementação D2 2,61 0,0281405 quinase 4 semelhante a polo (Drosophila) 2,60 0,00209633 polipeptídeo ribonucleótido redutase Ml 2,60 0,000170076 enzima málica 1, citosólica NADP(+)-dependente 2,59 0,0435444 complexo condensina I, subunidade H não SMC 2,59 0,0216752 proteína A3 de ligação ao cálcio S100 2,58 0,0324073 enzima ubiquitina-conjugada E2L3 2,57 0,00343347 homólogo beta do BUB 1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 2,56 0,0166047 glicerol quinase 2,55 2,66E-05 TAF9B ARN polimerase II, 2,54 0,0170365 proteína de ligação ao TATA-box (TBP)-as 115

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) TAF9B ARN polimerase II, 2,54 0,0170365 proteína de ligação ao TATA-box (TBP)-as cluster de histonas 1, H2bg 2,52 0,000180822 grupo de alta mobilidade box 2 2,52 0,0196872 quinase 2 relacionada como NIMA 2,50 0,00289469 (nunca no gene a da mitose) rico em prolina 11 2,50 0,0357125 miopaladina 2,49 0,0255088 contendo domínio brix 1 2,49 0,00471977 associado ao ciclo de divisão 2,49 0,01021 celular 5 fucosidade, alfa-L-2, plasma 2,49 0,00540929 quinase ciclina-dependente 2 2,49 0,00250724 recetor da lamina B 2,49 0,000151784 hipoxantina 2,49 0,000634057 fosforibosiltransferase 1 (Lesch-Nyhan synd) contendo motivo tripartido 25 2,47 0,0456344 subunidade do proteassoma 2,46 0,0202595 (prossoma, macropain), tipo beta, 9 (lar 116

Quadro 5:

Expressão génica em células Celllgen em comparação com células Plurix (continuação)

Celllgen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) subunidade do proteassoma 2,46 0,0202595 (prossoma, macropain), tipo beta, 9 (lar subunidade do proteassoma 2,46 0,0202595 (prossoma, macropain), tipo beta, 9 (lar subunidade do proteassoma 2,46 0,0202595 (prossoma, macropain), tipo beta, 9 (lar esfingomielina sintase 2 2,46 0,0020701 proteína transmembrana 62 2,45 0,00761064 glucose-6-fosfato desidrogenase 2,44 0,00278311 proteína dedo PHD I 2,44 0,010191 semelhante a retinoblastoma 1 2,44 0,00319946 (pl0 7) KIAA 1524 2,43 0,0380688 ST6 (alfa- -N-acetil-neuraminil- 2,43 0,00830766 2,3-beta-galactosil-l, cofilina 2 (músculo) 2,43 0,0459235 proteína hipotética LOC201725 2,42 0,000313319 homólogo A do ciclo de divisão 2,42 0,000341692 celular 25 (S. pombe) 117

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento cancro do pulmão 1, primeiros sintomas 2,41 0,0180553 transaldolase 1 2,41 0,00199537 homólogo do turnover do mRNA 4 (S. cerevisiae) 2,41 0,00373104 glucosaminil(N- acetil)transferase l,core 2 (beta-1,6-N- 2,41 0,0197148 regulador BMP transmembrana rico em cisteína 1 (semelhante à cordina) 2,41 0,0267286 inibidor da via do fator tecidular (associado à lipoproteina 2,40 0,0356227 quadro de leitura aberta 59 do cromossoma 16 2,40 0,00185191 glicogenina 1 2,39 0,0224317 proteína transmembrana 154 2,39 0,0045589 semelhante ao antigénio da nefrite tubulointersticial 2,39 0,00510812 CTP sintase 2,38 8.80E-05 Fenilalanil-tRNA sintetase, subunidade beta 2,38 0,000245973 118

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) geminina, inibidor da replicação 2,38 0,00167629 do DNA lamina B 1 2,37 0,0477748 homólogo SPC24, componente do 2,36 0,00287227 complexo cinetócoro NDC80 (S. ce glutationa redutase 2,36 0,00353875 proteína ribossomal, semelhante 2,36 0,00335381 a L22, 1 fumarilacetoacetato hidrolase 2,36 3,88E-05 (fumarilacetoacetase) ARN nucleolar pequeno, C 2,35 0,0188991 família com semelhança de 2,35 0,0019785 sequência 64, membro A oncogene da sequência de 2,35 0,000571152 transformação das células epiteliais 2 polimerase (ADN dirigida), 2,34 0,00479612 epsilon 2 (subunidade p59) glicerol quinase 2,34 3,37E-06 glutaniona S-transferase M2 2,33 0,0402076 (músculo) fator de elongação, ARN 2,33 0,0130017 polimerase II, 2 119

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen vs. Plurix (fold change) 2,33 2,32

Valor de p (tratamento) 0,009636 0,0033903

Gene tiorredoxina polimerase (ADN dirigida), alfa 2 (subunidade 70 kDa) cancro da mama 2, primeiros 2,32 0,00586847 sintomas semelhante a CDC45 ciclo de 2,32 0,00735977 divisão celular 45 (S. cerevisiae) família das histonas H2A, membro <7 2,32 0,0129697 Li transportador 1, cassete de 2,31 0,0164234 ligação de ATP, subfamília B (MDR transportador 1, cassete de 2,31 0,0164234 ligação de ATP, subfamília B (MDR transportador 1, cassete de 2,31 0,0164234 ligação de ATP, subfamília B (MDR homólogo associado ao complexo 2,30 0,000373346 nucleolar 3 (S. cerevisiae) 120

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento ATPase, transporte de Ca++, membrana plasmática 4 2,30 0,023011 componente 7 do complexo de manutenção minicromossómica 2,30 0,0457691 proteína de interacção TIMELESS 2,29 0,00771062 proteína de ligação von Hippel-Lindau 1 2,28 0,00329061 ras-ralacionados C3 toxina botulínica substrato 2 (família rho, sma IO to 00 0,0292466 timopoietina 2,28 0,0223176 peptidilprolil isomerase F (ciclofilina F) 2,28 0,00093846 molécula de adesão de leucócito ativado 2,27 0,00242163 dedo anelar 5 do grupo policomb 2,27 0,000294142 proteína ativadora da GTPase do Ran 2,27 9,68E-05 fator de replicação C (ativador 1) 4, 37 kDa 2,26 0,00164152 tubulina, beta 2C 2,26 0,000346744 componente 10 do complexo de manutenção minicromossómica 2,26 0,0037925 121

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene Celligen vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) família das histonas H2B, 2,25 0,000885505 membro S gama-glutamil 2,25 0,0195219 hidrolase(conjugase, folilpoligamaglutamil fator de terminação da 2,25 0,000393489 transcrição, ARN polimerase II Polimerase (ADN dirigida) , delta 2,25 0,0123823 2, subunidade de regulação 50 k transportador 1, cassete de 2,25 0,00859077 ligação de ATP, subfamília B (MDR transportador 1, cassete de 2,25 0,00859077 ligação de ATP, subfamilia B (MDR transportador 1, cassete de 2,25 0,00859077 ligação de ATP, subfamilia B (MDR cluster de histonas 1, H2bf 2,25 0,0124279 Fator de iniciação de translação 2,24 0,00330183 eucariótica IA,ligado ao X fosfoglucomutase 2 2,24 0,00818204 122

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) peroxisomal D3, D2-enoil -CoA 2,24 0,00148722 isomerase proteína induzida pelo 2,24 0,0177928 interferão com repetições de tetratricopeptideo expresso nas fases G2 e S 1 2,23 0,0241887 componente 2 do complexo de 2,23 0,0021347 manutenção minicromossómica família com semelhança de 2,23 0,00143248 sequência 72, membro A RMI 1, instabilidade 1 do genoma 2,23 0,00294705 mediada por RecQ, homólogo (S. cerevisiae) proteína FLJ20105 2,23 0,0127979 deficiência 2 do fator de 2,22 0,0116892 coagulação múltipla fitoceramidase, alcalina 2,22 0,0157729 contendo domínio em espiral 2,22 0,00227586 dedicator of cytokinesis 11 2,21 0,00697577 fator de crescimento derivado 2,21 0,00176418 das plaquetas alfa polipeptídeo 123

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene

Celligen vs. Plurix (fold change) 2,20

Valor de p (tratamento) 0,00728536 N-acilesfingosina amido- hidrolase (ceramidas não lisosomal) proteína 2 associada 2,20 0,00230153 à quinase da fase S (p45) polimerase (ARN) III (ADN 2,20 0,0298794 dirigida) polipeptídeo G (32 kDa) proteína 1 de interação com 2,20 0,00139745 semelhante a fator 6 de ribosilação do ADP cluster de histonas 1, H2bh 2,19 0,0377748 complexo de reconhecimento de 2,19 0,049697 origem, semelhante a subunidade 5 (levedura) subunidade de regulação 2 da 2,19 0,0128024 proteína quinase CDC28 cluster de histonas 1, H4c 2,19 0,0112695 proteína hipotética LOC729012 2,19 0,000446087 polipeptídeo 39 de DEAD (Asp- 2,19 0,000340561 Glu-Ala-Asp)-box fator 1 de assemblagem da 2,18 0,0119687 cromatina, subunidade B (p60] 124

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) proteína de interação MLF 1 2,18 0,0177203 serina associada a microtúbulos 2,18 0,00536974 sequência B relacionada com MHC 2,18 0,0165406 polipeptídeo classe 1 semelhante a shugoshina 2 (S. 2,18 0,000852557 pombe) subunidade 6 do homólogo 2,18 0,000793512 fotomorfogénico constitutivo COP9 (Arab... metilenotetra-hidrofolato 2,18 0,00119726 desidrogenase (NADP+ dependente) quadro de leitura aberta 167 do 2,18 0, 0011095 cromossoma 6 transformador do tumor da 2,17 0,0485166 pituitária 1 ribonuclease H2, subunidade A 2,17 0,00669936 reparação por raios X a 2,16 0,0369865 complementar reparação deficiente no hamster chinês proteína de membrana, 2,16 0,00211873 palmitoílada 5 (MAGUK membro da subfamília p55) 125

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) carioferina alfa 2 (RAG cohort 2,16 0,000650645 1, importina alfa 1) contendo domínio de homologia da 2,15 0,0256434 pleckstrina, família A (phosphoi... semelhante a proteína ribosomal 2,15 0,00429384 L39 carioferina alfa 2 (RAG cohort 2,15 0,000700649 1, importina alfa 1) de ligação à proteína precursora 2,15 0,00201004 beta-amilóide (A4), família B, m... componente 3 do complexo de 2,14 0,0018389 manutenção minicromossómica cluster de histonas 1, H2ai 2,14 0,0129155 quadro de leitura aberta 34 do 2,14 0,000702936 cromossoma 13 homólogo RAD18 (S. cerevisiae) 2,14 0,0016685 proteína com repetição HD e de 2,13 0,0034833 ligação ao ADN HMG-box semelhante a sulfito quinona 2,13 0,0473641 redutase (levedura) 126

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Gene Celligen vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) quadro de leitura aberta 63 do 2,12 0,000804179 cromossoma 16 fosfoproteína M-fase 1 2,12 0,0271814 componente 6 do complexo de 2,12 0,0161279 manutenção minicromossómica homeobox A9 2,11 0,00520942 fator de crescimento de 2,10 0,0475844 fibroblastos 9 (fator de ativação de glia) homólogo C do ciclo de divisão 2,10 0,0169914 celular 25 (s. pombe) quadro de leitura aberta 64 do 2,10 0,0265979 cromossoma 9 motivo de homologia U2AF (UHM) 2,09 0,0255167 quinase 1 fator de replicação C (ativador 2,09 0,00768959 1) 2, 40 kDa proteína hipotética LOC440894 2,09 0,0103358 polipeptídeo nuclear pequeno da 2,09 0,0334665 ribonucleoproteina Dl 16 kDa semelhante a segregação 2,09 0,0013662 cromossómica 1 CSE1 (levedura) 127

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurlx (continuação)

Celligen Gene vs. Plurlx Valor de p (fold change) (tratamento) Biossíntese da âncora do 2,09 0,0151967 fosfatidilinositol glicano, classe W proteína 0 do centrómero 2,09 0,00397056 família com semelhança de 2,09 0,00460031 sequência 20, membro B proteína hipotética FLJ40869 2,09 0,00444509 proteína de ligação a 2,08 0,00140559 nucleotídeo guanina (proteína G), gama 11 proteína de ligação à calciclina 2,08 0,00524566 cassete de ligação ATP, 2,08 0,00454751 subfamília E (OABP), membro 1 molécula CD44 (Indian blood 2,08 0,000651436 group) componente 8 do exosoma 2,08 0,00132017 família com semelhança de 2,08 0,025743 sequência 102, membro B cluster de histonas 2, H3d 2,07 0,0102932 família com semelhança de 2,07 0,000318673 sequência 33, membro A anemia de Fanconi, grupo de 2,07 0,000255109

complementaçao B 128

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) membro da família da cinesina 22 2,07 0,0192406 cluster de histonas 1, H2ai 2,07 0,0161621 quinase relacionada com o 2,06 0,0233182 vaccinia 1 subunidade 7 do complexo 2,06 0,000841371 integrador endonuclease específica da 2,06 0,006882 estrutura flap 1 proteína hipotética FLJ25416 2,06 0,000177531 sítio de integração virai 2,06 0,0171408 ecotrópica 2B retinite pigmentosa 2 (ligado ao 2,05 0,0264185 X recessivo) proteína L do centrómero 2,05 0,000880856 cofactor necessário para 2,04 0,00141809 ativação transcricional Spl, subu quadro de leitura aberta 121 do 2,04 0,0146323 cromossoma 20 família com semelhança de 2,04 0,00162905

sequência 72, membro A 129

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) família com semelhança de sequência 72, membro A 2,04 0,00165234 fator de iniciação de translação eucariótica IA,ligado ao X 2,04 0,00520549 fator de elongação, ARN polimerase II, 2 2,03 0,0458007 ATPase, Na+ 2,03 0,0189108 cluster de histonas 1, H3a 2,03 0,0244273 contendo domínio brix 1 2,03 0,00981178 contendo domínio sushi 1 2,03 0,0258164 Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 6 (suposto... 2,03 0,00423628 fructosamina 3 quinase 2,03 0,00470972 síndroma de Bloom 2,02 0,0209259 tubulina, alfa lc 2,01 0,00862586 fator de transcrição 2 E2F 2,01 0,0496479 componente 2 do exosoma 2,01 0,00649147 membro 22 da família da cinesina 2,01 0,0242075 homólogo LTV 1 (S. cerevisiae) 2,01 0,00812652 di-hidrolipoamida S-acetil-transferase (componente E2 de 2,01 0,00179011 pyruv 130

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) homólogo B do oncogene virai da 2,01 0,012225 leucemia simiana v-ral (ras relacionado) domínio 3 de dedo anelar e 2,01 0,0013797 repetição WD anexina AI 2,01 0,0173578 homólogo 2 de elaC (E. coli) 2,00 0,00266504 família 9 das aldeído 2,00 0,00911609 desidrogenases , membro AI tubulina, alfa 4a 2,00 0,0435427 proteína de interação com o -2,00 0,00111223 complexo poro nuclear oculomedina -2,01 0,00778869 semelhante a quinase relacionada -2,01 0,0356628 com Pl-3-quinase SMG-1 autoantigénio de golgi, -2,01 0,00770626 pseudogénio semelhante a subfamília a de golgin contendo repetição espectrina, -2,01 0,00438469 envelope nuclear 1 proteína de interaçao com o -2,01 0,00117582 complexo poro nuclear 131

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento' sushi, domínios nidogénio e semelhante a EGF 1 -2,01 0,00161129 integrina, alfa V (recetor da vitronectina, polipeptídeo alfa... -2,02 0,00252702 inibidor da quinase ciclina-dependente 2B (pl5, inibe CDK4) ** o cg 1 0,0150268 semelhante a lisil oxidase 4 -2,04 0,0120148 proteína de interação com o complexo poro nuclear -2,04 0,000213956 cálcio -2,04 0,00657494 calsintenina 3 -2,04 0,00300887 molécula de adesão cellular 1 -2,05 0,0261129 soluto portador família 22 (transportador de catiões orgânicos) -2,05 0,0137275 contendo domínio RUN e FYVE 3 -2,05 0,00387265 glucosidase, alfa; ácido (doença de Pompe, doença de armazenamento de glicogénio) -2,05 0,000418401 proteína de interação com o complexo poro nuclear -2,05 0,00988632 coativador 1 do recetor nuclear rico em prolina <x> o cg 1 0,0039587 132

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) membrana metalo-endopeptidase -2,06 0,0152684 proteína dedo PHD 21A -2,06 0,00980401 proteína ativadora da Rho GTPase -2,06 0,00705186 homeobox B6 -2,06 0,00301714 proteína de interação com o -2,07 0,00032839 complexo poro nuclear recetor 1 da fosfolipase A2, 180 Γ" o CN 1 0,00069343 kDa proteína de interação com o -2,08 0,000352007 complexo poro nuclear slit homolog 3 (Drosophila) 00 o CN 1 0,02844 proteína de interação com o -2,09 0,000414309 complexo poro nuclear quinase ciclina-dependente 6 -2,09 0,0456892 dinamina 1 -2,09 0,00139674 jumonji, domínio interactivo 1B -2,09 0,00861002 rico em AT ligação de cálcio e domínio em -2,09 0,00370041 espiral 1 recetor do fator de crescimento -2,09 0,00114467 1 semelhante à insulina proteína de interação com 0 -2,10 0,000377834 complexo poro nuclear 133

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) molécula CD82 -2,10 0,0175517 bromodomínio adjacente ao -2,10 9,88E-05 domínio dedo de zinco, 2B — -2,10 0,00666187 sinaptotagmina XI -2,11 0,0129428 KIAA 1546 -2,11 0,000255634 proto-oncogene jun B -2,12 0,0120169 CXXC dedo 6 -2,12 0,0277527 proteína de interação com o -2,14 0,00282604 complexo poro nuclear homólogo de Cdon (rato) -2,15 0,0350357 CLL de células B -2,15 0,00343507 proteína de interação com 0 -2,15 0,00263888 complexo poro nuclear homólogo 1 do oncogene virai da -2,16 0,0136688 leucemia murina de Abelson v-abl proteína de interaçao com o -2,16 0,00583397 complexo poro nuclear homólogo 1 do supressor tumoral -2,18 0,0158766 FAT (Drosophila) transformador-2 alfa -2,18 0,012256 quimerina (chimaerin) 1 -2,18 0,0287031 134

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) proteína fator 8 do glóbulo de gordura do leite - EGF -2,18 0,000987073 recetor da vitamina D (1,25-di-hidroxivitamina D3) -2,19 0,000192208 neuroblastoma, supressão da tumorigenicidade 1 -2,20 0,00090639 contendo domínio jumonji IA 1 IO IO o 0,0188513 lisina deficiente proteína quinase 1 WNK -2,21 1,57E-05 protocaderina beta 14 1 IO IO I-1 0,0103892 proteína de ligação à cortactina o -2,21 2,28E-05 /Li regulador de transcrição contendo domínio WW 1 1 IO IO IO 0,0379899 ciclina LI 1 IO IO IO 0,00831474 fator nuclear de células T ativadas, citoplásmico, calcina -2,22 0,00786451 homólogo de pellino 1 (Drosophila) -2,23 0,00939357 autoantigénio de golgi, pseudogénio semelhante a subfamília a de golgin -2,24 0,00603583 135

Quadro 5: Expressão génica em células Celllgen em comparação comcélulas Plurix (cont inuação)

Gene quadro 10 de leitura aberta do cromossoma 7 autoantigénio de golgi, pseudogénio semelhante a subfamília a de golgin ARN específico do corpo de Cajal pequeno 17 proteína 2 de ligação do fator beta de transformação do crescimento latente

Celllgen vs. Plurix (fold change) -2,26-2,27

Valor de p (tratamento) 0,00738442 0,00320764 2,272,29 0,0301336 4,08E-05 autoantigénio de golgi, -2,29 0,0111179 subfamília a de golgin, 8A inibina, beta A (activina A, -2,29 0,00877271 activina AB alfa polipeptídeo) família 41 do soluto portador, -2,30 0,00453672 membro 2 forkhead box PI -2,30 0,0463138 matriz metalopeptidase 14 -2,31 1.93E-05 (inserida na membrana) fator de transcrição 4 -2,31 0,0367869 oncogene jun -2,32 7,21E-05 gene de transf ormaçao das -2,33 0,0109689 células neuroepiteliais 1 136

Quadro 5: Expressão genica em células Celligen em comparação comcélulas Plurix (continuação)

Gene asponna homólogo do oncogene virai do osteosarcoma murino FBJ v-fos efrina B2 contendo repetição WD e SOCS box 1

Celligen vs. Plurix (fold change) -2,33 -2,35 -2,36-2,36 semelhante a dJ402H5.2 (nova proteína semelhante às proteínas da minhoca e da mosca) serina contendo domínio PX colagénio, tipo VII, alfa 1 (epidermólise bolhosa distrófica) proteína de ligação 1 AE homólogo da peroxidasina (Drosophila) canal de cálcio, dependente da voltagem, tipo L, subunidade alfa 1C região cromossómica da síndrome de Prader---W.illi 1 midline 1 (síndrome Optiz/BBB) -2,36 -2,38-2,38 -2,39-2,40 -2,41 -2,45 -2,45

Valor de p (tratamento) 0,000659873 0,0138624 0,00611474 0,0387851 0,00621503 0,000927628 0,00109233 0,000105628 0,00219049 0,0189661 0,0415526 0,00130803 137

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix (fold change) proteína de interação com o -2,45 complexo poro nuclear quadro 54 de leitura aberta do -2,47 cromossoma 1 proteína transmembrana 16A 00 ** cg 1 contendo domínio hélice-laço- -2,49 hélice básico, classe B, 2 proteína de interação com o -2,50 complexo poro nuclear fator de transcrição I -2,50

Valor de p (tratamento) 0,00354416 0,0186089 0,0481085 0,00270257 0,00316496 0,000607387 relacionado com runt (leucemia mieloide aguda) 0,029832 0,0135122 0,00283418 0,0244306 0,0310328 0,0287865 proteína dedo zinco 292 —2,50 proteína transmembrana 2 rica em —2,51 fibronectina leucina proteína de interação com o —2,51 complexo poro nuclear canal de potássio controlado por -2,54 voltagem, subfamília G, membro 1 interleucina 19 —2,54 fator de transformação do -2,54 crescimento, beta 3 138

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) semelhante a di-hidro-pirimidinase 3 -2,55 0,0165203 autoantigénio de golgi, subfamília a de golgin, 8B -2,56 0,0121417 proteína hipotética PR02012 -2,57 0,00756704 SATB homeobox 2 -2,57 0,039781 semelhante a complexo-t 11 (rato) 2 -2,57 0,0324227 proteína dedo anelar 122 -2,57 0,0236621 quadro 57 de leitura aberta do cromossoma 8 -2,59 0,00261522 ADAM metalopeptidase com motivo trombospondina tipo 1 -2,60 0,0113968 sushi, fator vom Willebrand tipo A, domínio EGF e pentraxina -2,63 2,23E-05 ST6 beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferase 2 -2, 64 0,0216987 recetor 2 contendo domínio VPS10 relacionado com sortilina -2,65 0,00936311 protocaderina beta 9 -2, 66 0,0285124 quadro 13 de leitura aberta do cromossoma 5 -2, 67 0,00410172 Enah -2,68 0,0077547 139

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) contendo domínio descarboxilase -2, 69 0,00683647 dependente do piridoxal 2 semelhante a proteína de o Γ" CN 1 0,0187322 interação com o complexo poro nuclear proteína de interaçao com o o cg 1 0,00368967 complexo poro nuclear proteína transmembrana 119 1 IO o 0,00801387 quadro 37 de leitura aberta do -2,70 0,0182453 cromossoma 14 proteína contendo sushi de -2,71 0,0253856 repetição, ligado ao X 2 dedo anelar 3 contendo domínio 1 to I-1 0,00931014 PDZ colagénio, tipo XII, alfa 1 1 to to 0,000204664 associado a remodelação da 1 to to 0,000317637 matriz 5 colagénio, tipo V, alfa 1 1 to to 0,0166427 proteína relacionada com 1 to to 0,0137557 distrofina 2 cassette de ligação ATP, -2,73 0,00131361 subfamília A (ABC1), membro 1 trofinina 1 to ^1 ^1 0,00298044 140

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) cornichon homolog 3 (Drosophila) 00 Cjl 0,0261738 semelhante a proteína de ligação à formina 1 00 Cjl 0,00290401 cérebro e leucemia aguda, citoplásmico 00 (N 1 0,0476919 proteína tirosina fosfatase, tipo recetor, U 1 IO «* 00 o 0,0270428 proteína hipotética MGC24103 1 IO «* 00 IO 0,0346673 interferão induzido com domínio helicase C 1 -2,83 0,0024839 proteína de transferência de fosfolípidos 00 CN 1 0,00999206 resposta precoce imediata 3 1 IO 00 0,0152127 resposta precoce imediata 3 1 IO 00 ^1 0,0152127 ADAM domínio metalopeptidase 12 (meltrina alfa) -2,87 0,000870288 glicoproteína da vesícula sináptica 2A 1 IO 00 00 0,00704212 quadro 3 de leitura aberta do cromossoma 9 1 IO 00 00 0,00410177 proteína de interação com a tiorredoxina -2, 90 0,0135494 141

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) resposta de crescimento 1 precoce -2,93 0,000425035 ARN nucleolar pequeno, C -2,94 0,00666866 ARN nucleolar pequeno, C -2,95 0,00765575 resposta precoce imediata 3 -2,99 0,0167309 proteína 1 relacionada com dS -2,99 4,26E-05 lipoproteínas de baixa 0. eris idade (alfa 2 macroglobulina) homólogo bicaudal C 1 -2,99 0,0347162 (Drosophila) homeobox B2 -3,03 0,00665994 ARN nucleolar pequeno, c -3,10 0,0274043 ARN nucleolar pequeno, c -3,10 0,0274043 metalopeptidase de matriz 2 -3,13 5,59E-05 (gelatinase A, 72 kDa) gelatinase, KIAA1641 -3,14 0,00659194 colagénio, tipo VI, alfa 3 -3,14 2,09E-06 homeobox A2 -3,15 0,0435423 domínios SH3 e PX 2B -3,15 0,0244357 colagénio, tipo VI, alfa 3 -3,16 0,0149554 quadro 3 de leitura aberta do -3,21 0,0233723 cromossoma 9 ARN nucleolar pequeno, C -3,24 0,0104491 142

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) ARN nucleolar pequeno, C -3,24 0,0104491 -3,27 0,00488845 UDP-N-acetil-alfa-D- -3,35 0,00964109 galactosamina: polipeptídeo N- acetil-galactosamina colesterol 25 hidroxilase -3,38 0,0445558 KIAA 1641 -3,40 0,013175 proteína dedo anelar 144 -3,40 0,0135334 versicano -3,41 0,023885 semelhante a angiopoietina 2 -3,42 0,0245161 KIAA 1641 -3,44 0,0170531 Homólogo B do oncogene virai do -3,54 0,00025573 osteosarcoma murino FBJ semelhante a RIKEN cDNA -3,59 0,00516476 110018M03 resposta de crescimento precoce -3,62 0,00821813 2 (Krox-20 homolog, Drosophila] ) dachsous 1 (Drosophila) -3,63 0,00697244 membro 26B da família da -3, 64 0,00363199 cinesina homeobox menos distai 5 -3,66 0,000640157 semelhante a proteína KIAA0220 -3,69 0,0302619 143

Quadro 5:

Expressão génica em células Celllgen em comparação com células Plurlx (continuação)

Celllgen Gene vs. Plurlx Valor de p (fold change) (tratamento) recetor do fator de crescimento -3,71 3,42E-05 semelhante à insulina 1 proteína tirosina fosfatase, -3,77 0,0294569 tipo recetor, N KIAA 1641 -3,85 0,0191782 proteína contendo sushi de -3,85 0,00370941 repetição, ligado ao X proteína 2 associada -3,91 0,0152901 m i c r o f i b r i 1 a r componente 1 do complemento, -3,97 0,0395863 subcomponente s molécula CD24 -3, 99 0,0340122 homeobox B3 -4,02 0,0354368 sindrome trico-rino-falângico -4,02 0,00557712 sequência do sindrome 1 de -4,04 0,000548703 Kallmann contendo repetição rica em -4,09 0,0263961 leucina 17 contendo domínio plexina 2 -4,32 0,031799 PTK7 proteína tirosina cinase 7 -4,42 0,000116114 supervilina -4,43 0,0412717 proteína dedo zinco 521 -4,58 0,00668815 144

Quadro 5:

Expressão génica em células Celligen em comparação com células Plurlx (continuação)

Celligen

Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) calbindina 2, 29 kDa -4,77 0,0290743 (calretinina) família do gene homólogo do ras, -4,79 0,00197982 membro J integrina, alfa 11 o 00 *3· 1 0,000390317 odz, odd Oz -5, 05 0,00172671 proteína F-box 32 -5,52 0,0212957 membro 2 da família da raftlina -5,72 0,0260454 clusterina -5,74 0,0303973 neurotrimina -5,79 3,78E-06 WNT 1 proteína de via de -5,86 0,000672342 sinalização indutível 1 proteína de ligação 5 ao fator -6,34 0,011614 de crescimento semelhante à insulina sulfatase 2 -6,34 5,88E-05 proteína 4 associada -6,93 0,00155578 mi cr o f ibr i1ar molécula de adesão juncional 2 -7,07 0,0306758 contendo domínio tipo III da -7,29 0,0334696 fibronectina 1 145

Quadro 5:

Expressão genica em células Celligen em comparação com células Plurix (continuação)

Celligen Gene vs. Plurix Valor de p (fold change) (tratamento) sarcoglicano, delta (35 kDa -7,37 0, 000881984 glicoproteína associada à distrofina) hefaestina -7,53 0,0123141 inibidor da serpina peptidase, -7,66 0,00362941 clade F (alfa 2-antiplasmina) cistatina SN -7, 96 0,0496433 hemicentina 1 -8,18 0,0461603 tenascina C (hexabraquion) -8,32 8,26E-05 biglicano -8,62 0,00161284 ARN induzido por androgénio -11,20 0,000100935 prostático transmembrana carboxipeptidase E -11,22 0,00738131

Expressão de marcadores celulares em células PLX-C - examinaram-se os antigénios de superfície expressos por PLX-C utilizando anticorpos monoclonais. Os resultados indicaram que as células PLX-C se caracterizavam pelos marcadores positivos CD73, CD29 e CD105 e os marcadores negativos CD34, CD45, CD 19, CD14 e HLA-DR (dados não apresentados) . As especificações do teste do fenótipo imune foram estabelecidas 146 do seguinte modo: ^90% para todos os marcadores positivos e <3% para todos os marcadores negativos.

Além disso, como mostram as Figuras 10A-B, as culturas de PLX-C não expressaram marcadores endoteliais como comprova a coloração negativa para os dois marcadores endoteliais CD31 e KDR. Contudo, a expressão por PLX-C de um marcador típico de fibroblastos foi evidente (expressão de D7-fib, Figura 10C).

Propriedades de imunogenicidade e imunomodulatórias das células PLX—C — uma vez que PLX-C é constituído por células aderentes provenientes da placenta, é de esperar que expresse HLA tipo I, que é expresso por todas as células do corpo e se sabe induzir uma resposta imune alorreactiva. A HLA tipo II e outras moléculas co-estimulantes são tipicamente expressas apenas na superfície de células apresentadoras de antigénio (CAA).

Para examinar a imunogenicidade das células PLX-C obtidas, efetuou-se a expressão de moléculas co-estimulantes na superfície destas membranas celulares. A análise FACS

demonstrou a ausência de CD80, CD86 e CD40 nas membranas das células PLX-C (Figuras 11A-C). Além disso, as PLX-C expressaram níveis baixos de HLA classe I conforme foi observado por coloração para determinação de HLA A/B/C (Figura 11D) . A expressão de moléculas estimulantes e co-estimulantes era semelhante às CEM derivadas da MO (como mostram as Figuras 11A-D).

Para investigar melhor as propriedades de imunogenicidade bem como de imunomodulação das células PLX-C, efetuaram-se testes 147 de Reação Mista de Linfócitos (RML). Como mostram as Figuras 12A-B, as células PLX-C escapam ao alorreconhecimento e reduzem ao mesmo tempo a resposta das células T, medida por incorporação de timidina. Além disso, a redução da proliferação de linfócitos (avaliada por medição CPM) era mais elevada à medida que aumentava o número de dcélulas PLX-C (de uma maneira dependente da dose). As PLX-C também reduziam a proliferação linfocitária após estímulos mitogénicos, como Concavalina A (Con A, Figura 12B) e Fito-hemaglutinina (PHA), e estimulação não especifica por anti-CD3, anti-CD28 (dados não apresentados).

Para investigar o mecanismo de acção pelo qual as PLX-C imunomodulam a proliferação linfocitária, e para verificar se esta ação é mediada por interação célula a célula ou secreção de citocinas, estimularam-se, por PHA, células mononucleares (CMN) provenientes do PB, utilizando o método transpoços (que impede o contacto célula a célula, mas permite a difusão de citocinas entre os dois compartimentos). Os resultados mostraram que a inibição da proliferação se mantinha mesmo quando o contacto célula a célula era inibido (dados não apresentados).

Secreção de citocinas - como se descreveu acima, as PLX-C reduzem a taxa de proliferação de linfócitos, provavelmente através de fatores solúveis. Efetuou-se mais investigação das citocinas segregadas por linfócitos em resposta às PLX-C para compreender o mecanismo de ação das PLX-C. Conforme mostram as Figuras 13A-B, a cultura de células mononucleares com PLX-C reduz ligeiramente a secreção da citocina pró-inflamatória INFy e reduz drasticamente a secreção de TNFa (mesmo na 148 presença de quantidades baixas de PLX-C). Além disso, na sequência de estimulação lipopolissacárida (ELP), a secreção de CMN provenientes de PB de IL-10 aumentou na presença de PLX-C, enquanto o nivel de secreção de TNFa diminuiu, de uma maneira dependente da dose (Figura 13C). EXAMPLO 5 BIODISTRIBUIÇÃO DE PLX-C Materiais e Métodos Experimentais

Transfeção de células PLX-C com vector de expressão de luciferase Células PLX-C foram estavelmente infetadas com construção lentiviral que expressa o gene luciferase sob controlo do promotor CMV (Figura 14) .

Produção virus infectores

Cultivaram-se células produtoras 293TN em meio DMEM (Gibco) suplementado cpm soro e antibióticos durante 2-3 dias (50-70% de confluência) antes da transfeção. Adicionou-se uma mistura de 10 pg do plasmídeo de empacotamento e 2 pg de construção de expressão e 20 pl de reagente Plus™ (Invitrogen) a 400 pl de DMEM sem suplementos. A mistura foi incubada durante 15 min à temperatura ambiente (TA) e adicionou-se Lipofectamine™ (30 pl diluída em 400 pl de DMEM) . A mistura foi incubada à TA durante 15 min. Células 293TN foram lavadas e transferidas para meio sérico a 2% e adicionou-se a mistura de tranfeção. 149

As células foram incubadas numa incubadora de CO2 a 3 7°C de um dia para o outro e o meio foi recolhido 24-60 horas após a infeção. O pico da produção de vírus foi atingido ao fim de 48 horas. O meio foi recolhido e centrifugado a 3000 rpm à temperatura ambiente durante 5 minutos para formar grãos de restos celulares. Após a centrifugação, filtrou-se o sobrenadante através de filtros Millex-HV 0,45 pm PVDF (Millipore, Cat. #SLHVR25LS).

Infeção de PLX-C

Semearam-se células PLX-C numa placa de 24 poços numa densidade de 0,6-lxl05 células por poço em meio completo 24 horas antes da infeção virai. Ao fim de 24 horas, adicionou-se 0,5 ml de suspensão virai (diluída em meio completo com polibreno numa concentração final de 5-8 pg/ml). As células foram incubadas durante 24 horas, depois o meio foi substituído por meio DMEM completo e as células foram incubadas a 37°C com C02 a 5% de um dia para o outro. No dia 4, a cultura atingiu confluência e foi dividida de 1:3 a 1:5, deixaram-se as células crescer durante 48 horas em DMEM completo e depois as células foram analisadas para determinar a expressão de luciferase.

As taxas de eficiência da infeção estavam próximas dos 100%. A avaliação da luminiscência em células vivas e em ratinhos vivos foi efetuada utilizando o sistema Lumina Imaging IVIS, que continha uma câmara CCD de alta sensibilidade que capturava o sinal de luminiscência da luciferase. 150

Duas semanas após a infeção, injetou-se IM ou IV 2xl06 células em ratinhos SCID/Bege, NOD/SCID, SCID e Balb/C. As células injetadas foram monitorizadas utilizando o referido sistema IVIS.

Resultados Experimentais

Como é evidente a partir dos resultados, as células CXL continuaram a dividir-se após a infeção, e os níveis de expressão da luciferase nas células em cultura permaneceram fortes e estáveis (Figura 15).

Uma vez injetadas as células PLX-C nos ratinhos Balb/C, examinou-se o padrão de biodistribuição. Os resultados mostram que as células desapareceram 72 horas após a injeção IM (dados não apresentados). Contudo, as células PLX-C mantiveram níveis elevados constantes de expressão da luciferase, in vitro, durante mais de três semanas (dados não apresentados).

Como mostram as Figuras 16A-D, as células injetadas IM em ratinhos SCID/Bege imunodeficientes foram mantidas até 5 dias no local da injeção e não foram observadas depois disso. As células CXL injetadas IV em ratinhos SCID/Bege migraram após 24 horas para os pulmões, e depois para o local da injeção (presumivelmente regressando ao sítio da lesão). Subsequentemente, as células desapareceram gradualmente e não foram observadas após 3-4 semanas. 151 EXEMPLO 6

CÉLULAS ADERENTES CONSEGUEM TRATAR ISQUEMIA DOS MEMBROS IN VIVO

Para determinar se o implante de células aderentes derivadas de placenta pode reduzir os danos isquémicos e melhorar as funções clinicas e motoras, o modelo de isquemia do membro posterior foi utilizado como se segue.

Materiais e Métodos Experimentais

Modelo de isquemia do membro posterior - Foi induzida isquemia dos membros posteriores a 20 ratinhos Balb/c machos, que não eram imunodeficientes, com idades entre 8 e 10 semanas, peso corporal aproximadamente de 25g±20%. A manipulação dos animais foi realizada segundo as normas do National Institute of Health (NIH) e da Association for Assessment and Accreditation of Laboratinhory Animal Care (AAALAC). Os animais foram alojados em condições laboratinhoriais normais. Os animais foram mantidos num ambiente climatizado. A variação de temperatura era de 20 a 24°C e a humidade relativa (HR) era de 30 a 70%, com um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade.

Os animais foram selecionados aleatoriamente através de um programa de aleatorização gerado por computador "Research Randomizer" e divididos em 2 grupos de 10 animais. Um grupo recebeu uma injeção intramuscular (IM) de lxlO6 células aderentes derivadas de placenta (PLX-C), e o outro serviu de controlo e foi injetado com PBS. 152 Técnicas cirúrgicas - Foi feita uma incisão de 1-1,5cm na pele da zona inguinal. A artéria femoral foi laqueada duas vezes com fio de seda 6-0 e transseccionada num ponto distai à laqueação. A ferida foi fechada com fio de seda 3-0, e os ratinhos foram deixados a recuperar. Cinco horas após excisão pós-operatória de uma artéria femoral, os ratinhos receberam uma injeção IM de lxlO6 células aderentes derivadas de placenta (PLX-C) , num volume total de 50μ1 em 2 locais de administração. Os animais do grupo de controlo foram injetados de forma idêntica com PBS (Gibco), ver Quadro 6 abaixo.

Quadro 6: Estudo piloto de PLX-C em Modelo de Isquemia do Membro Posterior do Ratinho

Grupo de teste Tratamento Ns. de ratinhos por grupo Dose de células Lote Momento de sacrifício após administração de 21 dias 1 PLX-C i.m n=l 0 tf lxl 0b C.G.13.0 n=l 0 cf 2 PBS i.m n=l 0 tf 0 N/A n=10<?

Acompanhamento — O fluxo sanguíneo nas patas dos dois lados foi medido 3 vezes consecutivas com um laser Doppler de não-contacto logo após a operação e nos dias 6, 9, 14 e 21 após a operação, e é expresso como a razão entre o fluxo no membro isquémico e o fluxo no membro normal [Tokai. J. et al]. 153

Avaliação macroscópica de gravidade isquémica — 0 membro isquémico foi avaliado macroscopicamente nos dias 1, 6, 9, 14, 21, até ao término do estudo com escalas morfológicas graduadas para medir zonas necróticas; grau 0: ausência de necrose, grau I: necrose limitada aos dedos (perda de dedos), grau II: necrose estende-se a um dorso do pé (perda de pé), grau III: a necrose estende-se a uma parte inferior da perna (perda de joelho), grau IV: a necrose estende-se a uma coxa (perda total do membro posterior) [Tokai. J. et al].

Avaliação in vivo de função do membro e de dano isquémico -

Foi realizada seriadamente uma avaliação semiquantitativa do uso deficiente do membro isquémico como se segue: 3 = arrastar de pés, 2 = sem arrastar mas sem flexão plantar, 1 = flexão plantar, e 0 = flexão dos dedos para resistir à tração suave da cauda (Rutherford et al., 1997).

Análise molecular e bioquímica - Além da avaliação clinica, foram obtidas amostras moleculares e bioquímicas no dia 21, que estão atualmente a ser analisadas, a fim de compreender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à melhoria de resposta no grupo injetado com células aderentes derivadas de placenta (PLX-C).

Resultados experimentais A implantação de células aderentes derivadas de placenta induz de forma significativa fluxo sanguíneo na anca e pé do modelo de isquemia do membro posterior - Para testar a eficácia das células aderentes in vivo, os ratinhos foram submetidos a laqueação arterial seguida de injeções 154 intramusculares de células aderentes derivadas de placenta, e o fluxo sanguineo foi medido nas ancas e pés (de ambos os lados do corpo) com um laser Doppler de não-contacto num periodo de tempo pré-determinado a seguir ao tratamento. Como indica a Figura 17, a injeção de PLX-C melhorou acentuadamente o fluxo sanguineo (BF) no membro degenerado, como determinado por avaliações do fluxo sanguineo, do aumento da função dos membros, do aumento da densidade capilar, da diminuição do stress oxidativo e do dano endotelial. Em termos de fluxo sanguineo, o efeito foi demonstrado 9 dias após a injeção e foi observado no decurso de todo o estudo. No grupo tratado com PLX-C, o fluxo sanguíneo aumentou de 24±2,3 para 80±4,7%, ao passo gue no grupo de controlo, tratado com o veículo, o fluxo sanguíneo variava entre 35±2 e 54±4,5% - na zona da anca/implante (dia 0 contra dia 21, respetivamente). De forma semelhante à zona da anca, mas a um nível menor, verificou-se igualmente um aumento de fluxo sanguíneo na zona da pata dos ratinhos tratados com PLX-C. Por conseguinte, no grupo tratado com o veículo, o fluxo sanguíneo aumentou de 12±0,6 para 46±4,9%, ao passo gue no grupo tratado com PLX-C o fluxo sanguíneo aumentou de 10±0, 7 para 52±5,5% (dia 0 contra dia 21 respetivamente), como indicado na Figura 17.

As células aderentes conseguem melhorar a função dos membros in vivo - Para avaliar melhor os efeitos in vivo das células aderentes derivadas de placenta, foram avaliadas as funções dos membros nos ratinhos tratados com o sistema de pontuações descrito acima em Materiais e Métodos Experimentais. Tal como indica a Figura 18, os ratinhos tratados com as células aderentes exibiram uma melhoria significativa da função dos 155 membros (2,5±0,2 contra 2,1±0,2, grupo de controlo contra grupo PLX-C, respetivamente. É de notar o efeito significativo no dia 21 após o tratamento) . Contudo, o grau de melhoria da função dos membros durante a observação de 21 dias foi comparável, o que sugere que as PLX-C, nas condições do presente estudo, não exibiram uma alteração importante da recuperação da função. A avaliação macroscópica da gravidade isquémica revelou que no grupo de controlo, tratado com o veiculo, foi observada necrose limitada aos dedos em dois animais no dia 6. No grupo tratado com PLX-C, a necrose limitada aos dedos foi demonstrada apenas num animal e somente após 14 dias. Análises imuno-histoquímicas post-mortem dos membros tratados com PLX-C indicaram um aumento significativo no número de novos capilares (vasos) que irrigam o membro, sugerindo que as PLX-C possuem a capacidade de promover a angiogénese (Figura 19).

Por fim, uma diminuição do stress oxidativo e uma redução da inflamação endotelial (que era um parâmetro alternativo para avaliar a melhoria de função endotelial) nos animais tratados foram observados nos ratinhos tratados com PLX-C (Figuras 20A-B). Isto deveu-se provavelmente a um aumento do fornecimento de oxigénio nos ratinhos tratados com células PLX-C, mas não nos ratinhos de controlo tratados com PBS.

Em conclusão, quando comparados com os ratinhos de controlo injetados com PBS, nenhum dos ratinhos injetados com PLX-C exibia quaisquer sintomas ou sinais clínicos adversos em resposta à administração intramuscular (i.m.) de células. Por 156 conseguinte, as PLX-C induzem um aumento do fluxo sanguíneo, provavelmente como resultado da angiogénese, comprovado por avaliação histológica do membro lesado. Para além disso, o atraso no desenvolvimento da necrose e a diferença de número de animais afetados sugerem uma resposta clínica.

Implantação de células aderentes derivadas de placenta

Outro estudo sobre a eficácia foi levado a cabo em ratinhos Balb/C com parâmetros de segurança (isto é, necropsia macroscópica e análise histopatológica de órgãos selecionados), conforme descrito na secção Materiais e Métodos, acima.

Neste estudo, sete grupos de ratinhos, cada um com 10 ratinhos Balb/c machos (membro posterior isquémico) foram usados como descrito no Quadro 7, abaixo. Apenas um grupo de 10 ratinhos não tinha isquemia induzida (para testar a segurança global e a capacidade de tolerância das células PLX-C em animais saudáveis e normais). Na sequência de indução de isquemia, foram administradas ao membro afetado células PLXC ou tampão de controlo por via intramuscular, e os ratinhos foram observados até um mês após a administração. Apenas um grupo de ratinhos recebeu duas injeções separadas no membro afetado, com uma semana de intervalo (dias 1 e 8) . O fluxo sanguíneo foi monitorizado por análise com laser Doppler, e a gravidade isquémica foi avaliada macroscopicamente e a nível comportamental até 30 dias após a administração, altura em que os ratinhos foram sacrificados e os tecidos armazenados para análise histológica. 157

Quadro 7; Estudo da eficácia das PLX-C em Modelo de Isquemia do Membro Posterior em Ratinhos

Grupo de teste N2 . Trata mento Quantidade de células (dose) Número de tratamentos Lote Momento do sacrifício após administração de 30 dias 1 PLX-C lxlOb 1 C.G.13,0 10 cT 2 PLX-C lxlOb 1 C.G.25,0 10 3 PLX-C lxlOb 2 C.G.25,0 10 4 PLX-C 0,5xlOb 1 C.G.13,0 10 C? 5 PLX-C 0,lxl0b 1 C.G.13,0 10 tf 6 Meio de congelação de controlo N/A 1 N/A 10 cf 7* PLX-C lxlOb 1 C.G.13,0 C.G.25,0 10 tf

Neste estudo, foram administrados diferentes lotes de PLX-C em três concentrações. Os resultados demonstraram que Ο,ΙχΙΟ6 e 0,5xl06 PLX-C possuíam um benefício terapêutico reduzido. 158

Foi observada uma melhoria acentuada no fluxo sanguineo no dia 29 (fim da experiência) em animais tratados com lxlO6. Esta melhoria no fluxo sanguineo foi significativa (p<0,05) no grupo 2M (lote G.C25) em comparação com os ratinhos de controlo, injetados com veículo. Para além disso, uma segunda injeção do mesmo lote de células melhorou de forma significativa o fluxo sanguíneo no dia 15, em comparação com a injeção única (55±24 em comparação com 31±12,9 e 27±12,5%, respetivamente). A avaliação macroscópica da gravidade isquémica revelou que existia uma tendência para a melhoria nos grupos que recebiam lxlO6 (1M & 2M) por comparação com o grupo tratado com o veículo de controlo (6M).

No global, estes resultados demonstram a eficácia das células aderentes na indução da vascularização (por exemplo, fluxo sanguíneo) e na melhoria da função dos membros no modelo do ratinho com isquemia do membro posterior e sugerem a utilização destas células (por exemplo, células aderentes derivadas de placenta) para tratar doenças isquémicas dos membros. EXEMPLO 7

PLX-C PARA O TRATAMENTO DE ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL 0 objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia terapêutica do transplante sistémico (intravenoso) de células aderentes humanas derivadas de placenta PLX-C no tratamento de acidente vascular cerebral. 159

Materiais e Métodos Experimentais Sujeitos, cirurgia e transplante

Foram utilizados ratos machos espontaneamente hipertensos, que sofriam de hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes e microangiopatias. Os animais foram mantidos em condições constantes a nível de temperatura, humidade do ar e ciclo luz/obscuridade. Os sujeitos foram selecionados aleatoriamente para grupos experimentais (ver Quadro 8, abaixo).

Quadro 8:

Grupos de tratamento de ratos para tratamento de acidente vascular cerebral

Grupo Na Tratamento Na. de animais 1 PLX-C, lote 1 administração única 1 3 II co 2 PLX-C, lote 1 administração dupla N=7 3 PLX-C, lote 2 administração única N=8 4 PLX-C, lote 2 administração dupla N=7 5 Solução de veiculo de controlo N=12

Os animais receberam uma dose única ou dupla de lxlO6 PLX-C de diferentes lotes. Todas as técnicas de transplante foram 160 conduzidas por via intravenosa. 0 grupo injetado duas vezes foi submetido ao transplante 10 e 24 horas na sequência de isquemia cerebral, ao passo que os transplantes únicos foram realizados 24 horas após o acidente vascular cerebral. Todas as células transplantadas foram previamente marcadas com o corante de fluorescência PKH26. A isquemia cerebral experimental foi levada a cabo via oclusão permanente da artéria cerebral direita. É de notar que um animal morreu na sequência da anestesia.

Investigação por ressonância magnética (IRM)

Obteve-se uma IRM de desenvolvimento da lesão nos dias 1, 8, 29 e 60 com um scanner 1.5T (Philips) . A volumetria do infarto e a atrofia cerebral foram medidas e calculadas como médias de valores obtidas por três investigadores cegos utilizando sequências T2 coronais.

Testes comportamentais

Mediram-se as alterações funcionais utilizando dois conjuntos de testes comportamentais dependentes. 0 teste "Beam Walk" [Passeio na Trave] é um teste vulgar utilizado para quantificar dificuldades sensoriais e motoras. Os ratos foram condicionados para correr ao longo de uma barra montada na horizontal, no fim da qual se encontrava a gaiola. 0 tempo de trânsito foi medido cinco vezes e documentado como valor médio diurno. A suspensão na barra foi avaliada com 20 segundos e a queda com 30 segundos. As medições realizaram-se 161 diariamente na primeira semana e todos os sétimos dias até ao final do período de observação. 0 segundo teste, a classificação da gravidade neurológica modificada (mNSS), continha outros itens sensoriais, motores e de reflexo. 0 resultado da mNSS foi expresso numa pontuação entre 1 e 18, em que os pontos de 1 a 6 indicavam uma lesão ligeira, de 7 a 12 uma lesão moderada e de 13 a 18 uma lesão grave. A avaliação da pontuação mNSS foi realizada nos dias 1, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 na sequência da isquemia cerebral.

Histologia

Após o final do período experimental, todos os ratos foram sacrificados e submetidos a perfusão transcardíaca com 4% solução a 4% de formalina. Os cérebros extraídos foram criopreservados e cortados em secções de 30ym de espessura. Para avaliar a reação glial, foi realizada uma investigação imuno-histoquímica com anticorpo primário contra GFAP. Uma área extensa de 750ym foi examinada (semiquantitativamente) perto da fronteira infartada para medir a densidade das células GFAP+. Para inspecionar a reatividade astroglial, foram incluídas 15 regiões com interespaços médios de 0,6mm.

Estatística

Todos os dados relativos a peso, análise IRM e exames histológicos foram investigados para determinar a distribuição gaussiana e analisados para encontrar diferenças 162 estatisticamente significativas, utilizando o teste ANOVA e segundo os niveis do ANOVA.

Os dados recolhidos nos testes Beam Walk e mNSS foram submetidos a análise estatística detalhada, tomando em consideração as medições repetidas dos sujeitos, bem como o desenvolvimento temporal dos sujeitos individualmente (análise estratificada). Para equilibrar as diferenças inter-indivíduos relativas ao grau de dano cerebral, foi utilizado um modelo de efeitos fixos. Os dados recolhidos no teste Beam Walk tiveram, por conseguinte, de ser transformados num sistema de categorias. Aqui, os valores de tempo inferiores a 5 segundos foram considerados como categoria (0), de 5 a 10 segundos como categoria (1), de 10 a 15 segundos como categoria (2), de 15 a 20 segundos como categoria (3), a suspensão como categoria (4) e a queda como categoria (5).

Resultados experimentais

Peso A pesagem periódica permitiu uma boa estimativa do estado de saúde geral do sujeito. Foi observada uma redução inicial de peso em todos os grupos devido à anestesia e à intervenção cirúrgica (dados não apresentados). Subsequentemente, foram observadas uma rápida normalização do peso e uma evolução estável até ao final da experiência, no dia 60 (dados não apresentados). Os grupos experimentais demonstraram uma progressão homóloga do peso corporal. 163

Teste Beam Walk

Todos os grupos experimentais demonstraram uma redução significativa das categorias do Beam Walk no decurso da experiência (dados não apresentados). Foi observada uma redução significativamente mais baixa das categorias do Beam Walk no grupo experimental 1 (administração única de PLX-C lote 1) comparativamente com o grupo de controlo (-0,01247 contra -0,02931, respetivamente). Não houve indícios de diferenças estatisticamente significativas entre o grupo experimental 3 (PLX-C lote 2 administração única) e o grupo de controlo (dados não apresentados).

Pontuação de gravidade neurológica modificada (mNss)

Todos os grupos experimentais exibiram uma redução significativa da pontuação neurológica (dados não apresentados). A comparação dos resultados da mNSS de sujeitos tratados com PLX-2 (administração dupla de PLX-C) revelou uma superioridade estatisticamente significativa comparativamente com o grupo de controlo. O transplante duplicado do lote 2 (grupo 3) demonstrou uma melhoria significativa no teste mNSS comparativamente com a injeção simples do mesmo lote (dados não apresentados).

Volumetria do infarto A ressonância magnética é um método altamente sofisticado para estimar o grau de lesão cerebral e de perda de tecido in vivo. Tomando em consideração as flutuações inter-indivíduos, o desenvolvimento do volume de infarto foi designado como 164 percentagem do volume de infarto no dia 1, individualmente. 0 volume de infarto no dia 1 não diferiu significativamente entre os grupos experimentais. 0 desenvolvimento geral do volume de infarto exibiu uma diminuição aproximada de 50% entre o dia 1 e o dia 8. Isto deveu-se maioritariamente a uma retrogressão do edema cerebral inicial. O exame do desenvolvimento da lesão in vivo com IRM revelou que os sujeitos do grupo 4 (PLX-C lote 2 administração dupla) exibiam um quociente de infarto significativamente reduzido no dia 60 (0,48±0,02 contra 0,60±0,03, respetivamente, resultados não apresentados).

No conjunto, estes resultados indicam que a administração intravascular de PLX-C resultou numa melhoria significativa da recuperação funcional em ambos os testes comportamentais no tratamento do acidente vascular cerebral. Para além disso, uma superioridade considerável e também estatisticamente significativa de transplantes duplos de PLX-C foi observada comparativamente com a injeção única análoga.

Uma confirmação das melhorias comportamentais medidas por IRM era evidente em sujeitos tratados duas vezes com PLXC. A acrescentar a isto, observou-se uma redução significativa do volume de infarto e da atrofia cerebral foi no final da experiência. Além disso, observou-se em ambos os testes funcionais uma melhoria estável da recuperação funcional na sequência do transplante de dose dupla de PLX-C, comparativamente com os controlos e efeitos não verificáveis das injeções únicas. 165 EXEMPLO 8

TRATAMENTO DE PATOLOGIAS QUE EXIGEM REGENERAÇÃO E/OU REPARAÇÃO DE TECIDOS CONJUNTIVOS

Tratamento de patologias que exigem a regeneração e/ou reparação óssea com células aderentes da invenção São utilizados modelos animais (por exemplo, coelhos Nova Zelândia brancos adultos) para examinar o efeito das células aderentes da invenção (que são derivadas de placenta ou de tecido adiposo e obtidas a partir de uma cultura 3D, por exemplo, células PLX-C) para curar defeitos segmentais de dimensões criticas do fémur. Os animais são distribuídos aleatoriamente por um de três grupos. Os animais do grupo A são injetados com 1-I0xl06 células aderentes (células PLX-C) na zona do defeito. Os animais do grupo B são injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito foi deixado sem tratamento. São realizadas radiografias imediatamente após a operação e a intervalos de uma semana. Às 12 semanas, os animais são sacrificados, os respetivos fémures removidos, e preparadas as secções histológicas descalcifiçadas dos defeitos e do osso adjacente. Realizam-se estudos mecânicos, histológicos e histomorfométricos para examinar a reação dos defeitos e a formação de osso dentro e à volta do local lesionado. Além disso, uma reação em cadeia da polimerase com transcrição inversa (RT-PCR) é realizada para detetar mRNA de colagénio tipo-I e tipo-II.

Tratamento de patologias que exigem regeneração e/ou reparação de tendão com as células aderentes da invenção 166 São utilizados modelos animais (por exemplo, coelhos Nova Zelândia brancos esqueleticamente maduros) para examinar os efeitos das células aderentes da invenção (por exemplo, células PLX-C) na cura de tendões. Os tendões longo do hálux são transferidos para túneis ósseos do calcâneo com 2,5mm de diâmetro. Os túneis ósseos são tratados com ou sem PLX-C. Os animais são selecionados aleatoriamente para um de três grupos. Os animais do grupo A são injetados com 1-I0xl06 células PLX-C no local do defeito ou por via intravenosa. Os animais do grupo B são injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito é deixado por tratar. Três exemplares de cada grupo são recolhidos às 2, 4, e 6 semanas após a operação e é realizada uma avaliação para determinar as caracteristicas morfológicas da interface tendão tratado-osso utilizando histologia convencional e localização imuno-histoquímica de colagénio Tipo I, II, e III.

Tratamento de patologias que exigem regeneração e/ou reparação da cartilagem com células aderentes da invenção São utilizados modelos animais por exemplo, coelhos Nova Zelândia brancos esqueleticamente maduros) para examinar os efeitos das células aderentes da invenção (por exemplo, células PLX-C) na cura da cartilagem. É criado um defeito de espessura total da cartilagem articular do sulco patelar do fémur distai esquerdo. Um fragmento de cerca de 6 mm da fáscia que cobre o quadríceps é removido e suturado à orla periférica do defeito artificial com catgut 6-0. Os animais são selecionados aleatoriamente para um de três grupos. Os animais do grupo A são injetados com 1-I0xl06 células PLX-C no local do defeito ou por via intravenosa. Os animais do 167 grupo B são injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito é deixado por tratar. Os animais são sacrificados. Catorze semanas após o implante das células PLX-C no defeito osteocondral, os fémures distais são ressecados e é realizada uma avaliação histológica e os exemplares são classificados semiquantitativamente com base na natureza predominante do tecido reparado, na coloração da matriz, na regularidade da superfície, na integridade estrutural, na espessura do reparo, na aposição entre a cartilagem reparada e a cartilagem normal circundante, na ausência de sinais degenerativos no tecido reparado, e na ausência de alterações degenerativas na cartilagem normal circundante.

Tratamento de patologias que exigem regeneração e/ou reparação do ligamento com células aderentes da invenção São utilizados modelos animais (por exemplo, coelhos Nova Zelândia brancos esqueleticamente maduros) para examinar os efeitos das células aderentes da invenção (por exemplo, células PLX-C) na cura de ligamentos. Serão realizados defeitos unicorticais circulares com 8mm de diâmetro. Os animais são selecionados aleatoriamente para um de três grupos. Os animais do grupo A são injetados com 1-I0xl06 células PLX-C no local danificado ou por via intravenosa. Os animais do grupo B são injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito é deixado por tratar. Os animais são sacrificados catorze semanas após o implante das células PLX-C no defeito oligamental. São realizadas avaliações histológicas e os exemplares são classificados semiquantitativamente com base na natureza predominante do tecido reparado. 168 É de assinalar que certas características da invenção, que são, por razões de clareza, descritas no contexto de formas de realização separadas, podem igualmente ser fornecidas em combinação numa única forma de realização. Inversamente, vários aspetos da invenção, que são, por razões de brevidade, descritos no contexto de uma única forma de realização, podem igualmente ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com formas de realização especificas da mesma, é óbvio que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para o perito.

REFERENCIAS (Referências adicionais são citadas no texto)

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Bruder SP, et al. 1998 The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmentai bone defects. J Bone Joint Surg Am. 80(7):985-96 169

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Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Células aderentes placentárias ou adiposas para utilização no tratamento de uma situação selecionada de entre o grupo formado por isquemia, uma situação exigindo a regeneração de tecido conjuntivo e uma situação exigindo a reparação de tecido conjuntivo.
2. 2. Artigo de fabrico compreendendo um material de embalagem que compreende uma etiqueta para utilização no tratamento de uma situação selecionada de entre o grupo formado por isquemia, uma situação exigindo regeneração de tecido conjuntivo e uma situação exigindo a reparação de tecido conjuntivo, em que o referido material de embalagem embala uma quantidade farmaceuticamente eficaz de células aderentes placentárias ou adiposas.
3. 3. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 nas quais as referidas células são capazes de suprimir a reação imunitária no indivíduo.
4. 4. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 nas quais pelo menos 10% das referidas células aderentes estão numa fase proliferativa.
5. 5. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 nas quais as referidas células são propagadas utilizando uma cultura em três dimensões (3D).
6. 6. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 nas quais as referidas células são propagadas utilizando uma cultura em duas dimensões (2D). 1
7. 7. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com a reivindicação 5 nas quais a referida cultura em três dimensões (3D) compreende um biorreator 3D.
8. 8. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 5 ou 7 nas quais a cultura das referidas células na referida cultura 3D é efectuada sob perfusão.
9. 9. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com a reivindicação 8 nas quais a velocidade da referida perfusão é ajustada para manter uma concentração de glucose constante no seio do meio de cultura.
10. 10. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com a reivindicação 9 nas quais a referida concentração de glucose constante é de cerca de 550 mg/1.
11. 11. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com uma das reivindicações 5 e 7 a 10, nas quais as condições de cultura da referida cultura em três dimensões compreendem um material aderente selecionado de entre o grupo constituído por um poliéster e um polipropileno.
12. 12. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com uma das reivindicações 5 a 11, nas quais as referidas células compreendem uma expressão de marcador positiva selecionada de entre o grupo constituído por CD73, CD90, CD29 e CD105.
13. 13. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com uma das reivindicações 5 a 12, nas quais as referidas células compreendem uma expressão de marcador negativa 2 selecionada de entre o grupo constituído por CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, CD34 e CD79.
14. 14. Célul as ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, nas quais as referidas células aderentes compreendem um fenótipo de células estaminais estromais.
15. 15. Células ou artigo de fabrico para utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, nas quais a referida isquemia é selecionada de entre o grupo constituído pela doença arterial periférica (DAP) e a isquemia do sistema nervoso central (SNC). 26-10-2012 3