KR20210143721A - 미적 및 화장 치료 및 모발 성장의 자극을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

미적 및 화장 치료 및 모발 성장의 자극을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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리오르 라비브
무리엘르 아가시
사기 모란
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Abstract

본원에서는 피부 상태(예, 손상된 피부 장벽, 여드름, 주름, 과다색소침착/색소침착저하, 건조, 탄력섬유증)를 치료하고; 피부 부피를 증가시키고, 탈모증 및 관련된 병태를 예방 및 치료하기 위한, 태반 유착 간질 세포, 배양된 태반 ASC로부터 유래된 적응용 배지, 이의 용해물, 및 이의 분획을 포함하는 방법 및 조성물을 개시하고 있다.

Description

미적 및 화장 치료 및 모발 성장의 자극을 위한 방법 및 조성물
본원에서는 태반 유래된 유착 간질 세포 및 이로부터 유래된 인자를 포함하는 모발 성장의 자극 및 미적 및 화장 치료를 위한 방법 및 조성물을 개시하고 있다.
피부 노화는 피부 및 피부 지지 시스템(skin support system)과 연루되는 다중 시스템 퇴행성 과정(multisystem degenerative process)이다(Sjerobabski & Poduje, 2008). 피부 노화의 과정은 내인성 및 외인성 노화로 구분될 수 있다. 이것은 몇 가지 인자, 예컨대, UV 조사, 스트레스, ROS 생성 또는 흡연에 의해서 유발될 수 있다. 주름 형성은 광-노화 피부를 특징으로 하고, 콜라겐 피브릴 및 젤라틴 섬유의 분해에 의해 유발될 수 있다. 추가로, 증가된 멜라닌 합성 때문에, 과-착색 피부가 다양한 피부학적 장애, 즉, 기미(melasma), 일광 흑색증(solar lentigines) 및 주근깨(ephelides)에서 관찰된다. 이들 임상 병태(condition)는 UV 선 및 특정의 약물 및 화학약품에 대한 빈번한 노출에 기인되어 피부 다크닝(skin darkening)을 발생시킨다. 탈색소 제제(depigmenting agent)가 일반적으로는 이러한 장애를 치료하기 위해서 처방된다. 상업적으로 구입 가능한 피부 라이트닝 및 탈색소 작용제는 마그네슘-1-아스코르빌-2-포스페이트 (MAP), 하이드록시아니솔, N-아세틸-4-시스테아미닐페놀, 아르부틴(하이드로퀴논-베타-d-글루코피라노사이드) 및 하이드로퀴논(HQ)(Parvez S et al, 2006)를 포함한다. 이들 합성 화합물의 일부 부작용은 비가역적인 피부 손상, 갈색증(ochronosis) 등이다. 이들 부작용은 대안적인 화장료 제형에 대한 조사를 유도하였다.
손상된 피부 장벽(compromised skin barrier)
경피 수분 손실(transepidermal water loss: TEWL)은 외피 층(피부)를 통해 체내로부터 확산 및 증발 과정을 통해 주변 대기로 통과하는 물의 손실을 특성화하기 위해 피부학에서 사용되는 용어이다. TWEL는 또한 손상된 피부 장벽 기능을 분석하기 위해서 사용된다.
TEWL는 유전적 및/또는 환경적 병인을 가질 수 있다. 이것은 보호 단백질 발현의 감소 및 이에 따른 손상된 피부 장벽을 유도하는 유전적 다형성(genetic polymorphism)의 결과일 수 있다. 외부 자극물에 의해서 주로 유발되는 피부 염증화가 또한 수분 손실을 유도할 수 있다. 유전적 및 환경적 구성요소 둘 모두는 함께 또는 별도로 과도한 TEWL를 유도할 수 있고, 궁극적으로는 건조한 피부로부터 더 심각한 병태, 예컨대, 습진(eczema)의 범위에 있는 상이한 TEWL-연관된 피부 질환을 촉발시킬 수 있다.
TEWL은 건조한 피부 또는 반응성 피부 또는 습진을 유발시킬 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어, 피부를 통한 알레르겐(allergen)에 대한 노출과 연관되는 때에, 이는 알레르기성 습진/아토피 피부염, 즉, 알레르기성 예민화(allergic sensitization)를 수반하는 습진을 유도할 수 있다.
TEWL-연관된 질환에서, 정상의 수분 손실율은 피부의 감소된 장벽 기능으로 인해서 증가되어 탈수된 표피를 유발시키며, 이는 때로는 자극 및/또는 건조 피부 또는 비늘 모양 피부(scaly skin)로 나타나며, 종종 아토피 피부염(습진으로도 알려짐) 반응성 피부(예, 겨울 발진(winter rashes)) 및/또는 감염에 대한 취약성과 연관된다. TEWL 및 피부 염증화를 증가시키는 다른 질환은 자연 노화(chronological aging)를 포함한다. 증가된 TEWL는 또한 창상(injury), 감염증, 화상, 건선 및 염증성 피부 병태, 예컨대, 주사비(rosacea)에서의 아토피 소질(atopic diathesis) 및 구위 피부염(perioral dermatitis)에 대해서 이차적일 수 있다.
탈모증
안드로겐성 탈모증(남성형 탈모 또는 여성형 탈모로로 일컬어짐), 급성 탈모증, 및 전두 탈모증 및 전신 탈모증를 포함한 원형 탈모증을 포함한 다양한 유형의 탈모증이 있다.
안드로겐성 탈모증이 탈모증의 가장 일반적인 형태이다. 안드로겐성 탈모증은, 예를 들어, 백인 또는 아시아계의 남성 및 여성에게 영향을 주고 있는 유전적 탈모 병태이다. 안드로겐성 탈모증은 모발 부피의 점진적인 감소 또는 대머리를 특징으로 한다. 치료 없이는, 안드로겐성 탈모증의 환자의 모발의 수는 개시 후 매년 대략 5%의 비율로 감소할 것이다(예, 문헌[Ellis et al, Expert Reviews in Molecular Medicine, 4:1-11, 2002]). 안드로겐성 탈모증은 일반적인 집단의 70%까지 영향을 주는 것으로 보고되고 있으며, 남성의 대략 30%에서 30세에 이르기까지 안드로겐성 탈모증이 발생하고, 남성의 50%가 50세에 이르기까지 영향을 받는다(Sinclair R, JMHG, 1(4):319-327, 2004; Lee and Lee, Ann. Dermatol., 24(3):243-252, 2012). 10% 만큼의 폐경전 여성이 여성형 탈모의 징후를 나타내는 것으로 보고되어 있고, 발병률은 여성이 폐경기에 들어섬에 따라서 유의하게 증가하고, 65세 이상의 여성 50-75% 만큼이 영향을 받는다(Norwood OT, Dermatol Surg., 27(1):53-4, 2001)
본원에서는 태반 유착 간질 세포(placental adherent stromal cell), 이들의 용해물 또는 적응용 배지(conditioned medium), 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 미적, 화장적 및 미용적 치료 및 모발 성장의 자극을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
태반 유착 간질 세포(ASC)는 태반 조직으로부터의 유착 간질 세포를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어, 적응용 배지들/배지/CM은 세포 배양물을 인큐베이션(incubation)하기 위해서 사용되는 성장 배지를 나타낸다. 본 개시는 특정의 배지 제형으로 제한하는 것으로 의도되지 않으며; 오히려, 태반 ASC의 인큐베이션에 적합한 어떠한 배지가 포함된다. 본원에서 "배양된" 태반 ASC에 대한 언급은 본원에서 언급된 방법에 따라서 팽창된 ASC를 나타내며, 이들의 각각은 별도의 구현예를 나타낸다.
특정의 구현예에서, 기재된 태반 ASC는 2 차원(2D) 기질, 3 차원(3D) 기질 또는 이들의 조합물 상에서 배양되었다. 2D 및 3D 배양 조건의 비-제한 예는 상세한 설명 및 실시예에서 제공된다.
대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이거나; 다른 구현예에서, 이종이다.
본원에서 세포의 집단의 "성장"에 대한 언급은 세포 집단의 팽창과 동의어인 것으로 의도된다. 특정의 구현예에서, ASC(이는, 특정의 구현예에서, 태반 ASC일 수 있다)는 실질적인 분화 없이 팽창된다. 다양한 구현예에서, 기재된 팽창은 2D 기질 상에서, 3D 기질 상에서, 또는 2D 기질 후에 3D 기질 상에서 수행된다.
다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 본원에서 언급된 모든 범위는 포괄적이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해서 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록, 본원에서 기재된 것들과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 이하 기재된다.
상충되는 경우에, 정의를 포함한 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명이 첨부된 도면을 참조로 하여 단지 예로서 본원에서 기재된다. 이제 상세하게 도면에 대한 구체적인 참조에 의하면, 도시된 특정사항은 단지 예를 들어 그리고 본 발명의 구현예를 예시적으로 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양태의 설명을 가장 유용하고 용이하게 이해되도록 하는 것으로 여겨지는 것을 제공하는 과정에서 제시됨이 강조되어야 한다. 이와 관련하여, 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 이상으로 더욱 상세하게 본 발명의 구조적 상세사항을 나타내려 시도하지 않으며, 도면과 함께 주어진 설명은 본 발명의 몇 가지 형태가 실제 어떻게 구현되는지를 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게 자명하게 한다.
도면에서,
도 1은 세포를 제조하기 위해서 사용될 수 있는 생물 반응 장치(bioreactor)의 다이어그램이다.
도 2는 지방형성 분석 후의 골수(BM) 유래된 MSC(맨 위의 줄) 또는 태반 세포의 사진을 함유하고 있다. 세포는 분화 배지와 함께(좌측 컬럼) 또는 분화 배지 없이(우측 컬럼) 인큐베이션되었다. 태반 ASC는 SRM(중간 3개의 줄은 3 가지의 상이한 배치를 도시하고 있다)에서 또는 전체 DMEM(맨 아래의 줄)에서 팽창되었다.
도 3은 골형성 분석 후의 BM 유래된 MSC(맨 위의 줄) 또는 태반 세포의 사진을 함유하고 있다. 세포는 분화 배지와 함께(좌측 컬럼) 또는 분화 배지 없이(우측 컬럼) 인큐베이션되었다. 태반 ASC는 SRM(중간 3개의 줄은 3 가지의 상이한 배치를 도시하고 있다)에서 또는 전체 DMEM(맨 아래의 줄)에서 팽창되었다.
도 4는 StageTips 장치를 예시하고 있다.
도 5a 내지 도 5j는 IL-1-ra, 콜라겐 IV-1a, 피브로넥틴, IL-13, HGF, VEGF-A, IL-4, PDGF-AA, TIMP-1, TGFb2, 및 TGFb1(각각 도 5a 내지 도 5j에서)에 대한 농도(수직 축)를 반영하는 Luminex® 비드의 발광을 나타내는 플롯(plot)이다. P250416 R21 및 P150518 R02는 모체 배치(maternal batch)이고; R090418 R01 및 R170216 R19는 태아/혈청 배치이고; PD060918S2 437BR01; PD030316 441BR09는 태아 SF 배치이다. 다양한 배치(수평 축)로부터의 생물 반응 장치 CM이 비치료(BR; 좌측으로부터 레인(lane) 1-6), 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)(TFF; Pall Corporation; 레인 7-12), 또는 동결건조 (LYP; 레인 13-18) 상부 패널(panel)에 주어졌다. 하부 패널은 더 높은 세포/배지 비율로 플레이트(plate)에서 생성된 적응용 배지의 분석을 도시하고 있다.
도 6a 내지 도 6b는 Luminex® (도 6a) 또는 ELISA (도 6b)에 의해서 분석된 혈관 형성 인자(수평 축)의 발현을 나타내는 플롯이다. 형광 세기에 의해서 측정된 발현은 수직 축에 나타내어져 있다. ASC는 정상 또는 저산소 조건(각 시리즈에서 좌측 및 우측 바(bar)) 하에 인큐베이션되었다.
도 7은 성장 배지(레인 1, 3, 5, 및 7) 또는 재현탁된 ASC-CM와 혼합된 배지(레인 2, 4, 6, 및 8)에서 배양 72 시간 후의 섬유아세포 집단 배증(doubling)(수직 축)의 플롯이다. 레인 1-2, 3-4, 5-6, 및 7-8은 각각 섬유아세포 노화된 0, 2.1, 8.6, 및 12.3 PD를 도시하고 있다.
도 8은 H2O2에 대한 노출 및 성장 배지(실선) 또는 ASC-CM(점선)와 함께 인큐베이션 후의 섬유아세포 생존률(수직 축: H2O2에 대한 노출 직후의 세포 수 중 생존 세포의 백분율로서 표현됨)의 플롯이다.
도 9a 및 도 9b는, SF-DMEM(더 밝은 선) 또는 동결 건조되고 SF DMEM 중에서 재현탁된 태아 태반 ASC-CM(더 어두운 선)에서, 스크레치 창상 분석에서의 창상 면적(수직 축) 내의 세포 밀도에 의해서 분석된 어린(도 9a) 및 늙은(도 9b) 섬유아세포의 이동의 플롯이다. 도 9c 및 도 9d는, SF-DMEM(더 밝은 선) 또는 직선형 태아 태반 ASC-CM(더 어두운 선)에서, 동일한 방식으로 분석되고 플롯팅된 어린(도 9c) 및 늙은(도 9d) 섬유아세포의 이동의 플롯이다.
도 10은, 성장 배지(레인 1, 3, 5, 및 7) 또는 재현탁된 ASC-CM와 혼합된 배지(레인 2, 4, 6, 및 8)에서, 배양 72 시간 후의 DP 집단 배증(수직 축)의 플롯이다. 레인 1-2, 3-4, 5-6, 및 7-8은 각각 섬유아세포 노화된 0, 2.1, 8.6, 및 12.3 PD를 도시하고 있다.
도 11a 내지 도 11c는 혈류(도 11a; 수직 축), 또는 1-4(도 11b) 또는 4-8(도 11c) 마이크론 직경의 기능적인 새로운 혈관의 형성(수직 축)을 나타내는 플롯이다. CD34 염색은 새로운 혈관을 나타내며, FITC 덱스트란은 혈관 기능성을 나타낸다. 도 11a에서, 상부 실선 및 점선은 수술한 다리와 반대쪽 다리에서 처리된 동물로부터의 데이터를 나타내고; 하부 검은선 및 회색선은 수술한 다리와 반대쪽 다리의 위약 처리에 주어진 동물을 나타낸다. 도 11b 및 도 11c에서, 각 시리즈에서의 첫 번째 및 두 번째 바(bar)는 수술한 다리에서의 위약- 및 ASC-처리에 주어진 동물을 나타낸다.
도 12는 치료 전(좌측 패널) 및 치료 후(우측 패널)의 버거병(Buerger's disease)을 앓고 있는 환자의 영향 받은 발가락의 사진을 나타낸다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용이 이하 설명에 기재되었거나 실시예에 의해서 예시된 상세사항으로 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구현예이거나 다양한 방식으로 실행 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 어법 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한하는 것으로 여겨지지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 양태는 태반 유착 간질 세포(ASC), 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 및 이로부터 유래된 분획을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, ASC는 인간 ASC일 수 있거나, 다른 구현예에서, 동물 ASC일 수 있다.
일 구현예에서, 배양된 태반 ASC를 포함하는 조성물을 투여하여 피부 상태(skin condition)의 중증도를 치료하거나, 예방하거나, 완화시킴을 포함하여, 대상체의 피부 상태를 치료하거나, 또 다른 구현예에서, 예방하거나, 또 다른 구현예에서 개선시키기 위한 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물은 다양한 피부 상태를 개선시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC(태반의 모체 부분으로부터의 ASC); 태아 조직 유래된 ASC(태반의 태아 부분으로부터의 ASC); 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이거나; 다른 구현예에서, 이종이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다.
일 구현예에서, 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM), 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 조성물을 투여하여 피부 상태의 중증도를 치료하거나, 예방하거나, 완화시킴을 포함하여, 대상체의 피부 상태를 치료하거나, 또 다른 구현예에서, 예방하거나, 또 다른 구현예에서 개선시키기 위한 방법이 제공된다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC(태반의 모체 부분으로부터의 ASC); 태아 조직 유래된 ASC(태반의 태아 부분으로부터의 ASC); 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이거나; 다른 구현예에서, 이종이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는, 대상체에서 피부 상태를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 조성물이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
기재된 피부 상태는, 다양한 구현예에서, 안면 치료의 부작용일 수 있고, 이의 비-제한 예는 레이저 박피 및 화학적 박피 치료이다. 부작용의 더욱 특이적 구현예는 손상된 피부 장벽이다. 다른 구현예에서, 병태는 미세침 치료 후 부작용(post micro-needling treatment side effect), 메조테라피 부작용(mesotherapy side effect); 여드름(acne); 주름 형성; 피부 노화(이의 더욱 특이적 예는 피부 광 노화이다); 손상된 피부 탄력성; 피부 열상(skin laceration); 과다색소침착 블레미쉬(hyperpigmentation blemish); 피부 건조; 표피의 박화(thinning of the epidermis); 또는 탄력섬유증(elastosis)이다. 또 다른 구현예에서, 피부 병태는 아토피 피부염이다. 각각의 병태는 별도의 구현예를 나타낸다. 본원에서 일부의 구현예에서 열거한 것들을 포함한, 다양한 창상으로부터의 피부의 재생을 향상시키는 것은 추가의 구현예이다. 레이저 박피는, 다양한 구현예에서, 절제적(ablative) 또는 비-절제적일 수 있다.
본원에서 사용된 용어, 화학적 박피는 안면, 목 또는 손의 피부의 외관을 개선시키기 위해서 사용되는 기술을 나타낸다. 화학 용액이 피부에 적용되고, 이것은 피부가 박리되게 하고 결국에는 박리시켜, 일반적으로 더 부드럽고 주름이 덜한 재생된 피부를 생성시킨다.
다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 조성물을 투여하여 경피 수분 손실(TEWL)을 감소시킴을 포함하여, 대상체에서 TEWL을 감소시키는 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 바와 같이, 기재된 ASC는 인자, 예컨대, SOD1 및 SOD2(수퍼옥사이드 디스뮤타제 1 및 2; 각각 Uniprot 번호 P00441 및 P04179)를 분비하고, 이는 피부 장벽 완전성에서 역할을 하고, 이들은 피부 섬유아세포의 증식을 자극하고 이들을 산화성 손상으로부터 보호한다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC은 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이거나; 다른 구현예에서, 이종이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다. 특정의 구현예에서, TEWL은 창상, 감염증, 화상, 아토피 피부염, 또는 건선에 이차적이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 조성물을 포함하는, 대상체에서 TEWL을 감소시키기 위한 조성물이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 특정의 구현예에서, TEWL는 창상, 감염증, 화상, 아토피 피부염, 또는 건선에 대해 이차적이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 조성물을 투여하여 피부 염증화를 감소시키거나 개선시킴을 포함하여, 대상체에서 피부 염증화를 감소시키거나, 또 다른 구현예에서, 개선하는 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물은 피부 염증화를 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이거나; 다른 구현예에서, 이종이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다. 특정의 구현예에서, 피부 염증화는 주사비에서의 아토피 소질에 이차적이거나, 다른 구현예에서, 구위 피부염. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는, 대상체에서 피부 염증화를 감소시키거나 개선시키기 위한 조성물이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 주사용 조성물이다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 특정의 구현예에서, 피부 염증화는 주사비의 아토피 소질, 또는 다른 구현예에서, 구위 피부염(perioral dermatitis)에 이차적이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC(또는 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC의 집단)을 포함하는 조성물을 투여하여 탈모의 중등도를 치료하거나, 예방하거나, 감소시킴을 포함하여, 대상체에서 탈모를 치료하거나, 다른 구현예에서, 예방하거나, 다른 구현예에서, 개선시키는 방법이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 국소 조성물이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 폼(foam)이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 수용액이거나, 다른 구현예에서, 현탁액이다. 다른 구현예에서, 조성물은 CM, 용해물, 또는 태반 ASC로부터 유래된 분획을 포함하는 샴푸이다. 다른 구현예에서, 조성물은 주사용 제형이다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물은 탈모를 개선시키고, 다른 구현예에서, 모발 성장을 증대시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다. 본원에서 제공된 바와 같이, 기재된 ASC는 HGF, PDGF, MMP-2, 및/또는 VEGF를 분비하며, 이들은 모발 난포 건강에 역할을 하고, 이들은 진피 유두 세포의 복제를 자극한다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC(또는 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC의 집단)의 CM 또는 용해물, 또는 다른 구현예에서 CM으로부터 유래된 분획을 포함하는 조성물을 투여하여 탈모의 중등도를 치료하거나, 예방하거나, 완화시킴을 포함하여, 대상체에서 탈모를 치료하거나, 다른 구현예에서, 예방하거나, 다른 구현예에서, 개선시키는 방법이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 국소 조성물이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 폼이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 수용액이거나, 다른 구현예에서, 현탁액이다. 다른 구현예에서, 조성물은 배지, 용해물, 또는 태반 ASC로부터 유래된 분획을 포함하는 샴푸이다. 다른 구현예에서, 조성물은 주사 가능한 제형이다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물은 탈모를 개선시키고, 다른 구현예에서, 모발 성장을 증대시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 태반 ASC 용해물, ASC-CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 CM, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는, 대상체에서 탈모를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 조성물이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 폼이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 수용액이거나, 다른 구현예에서, 현탁액이고, 이는, 일부 구현예에서, 주사 가능한 제형일 수 있다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 CM, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 국소 조성물을 투여하여 탈모증의 중증도를 치료하거나, 예방하거나, 완화시킴을 포함하여, 대상체에서 탈모증을 치로하거나, 다른 구현예에서, 예방하거나, 다른 구현예에서, 개선시키는 방법이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 폼이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 수용액이거나, 다른 구현예에서, 현탁액이다. 다른 구현예에서, 조성물은 CM, 용해물, 또는 태반 ASC로부터 유래된 분획을 포함하는 샴푸이다. 다른 구현예에서, 조성물은 주사 가능한 제형이다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물은 탈모증을 개선시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 일부 구현예에서, 탈모증은 자가면역에 의해서 매개되지 않는다. 일부 구현예에서, 탈모증은 자가면역에 의해서 매개되지 않는다. 특정의 구현예에서, 탈모증은 안드로겐성 탈모증이고, 이는, 다양한 구현예에서, 남성 또는 여성 안드로겐성 탈모증일 수 있다. 동물 모델에서 모발 재생을 분석하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Bak DH et al] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있고, 세포 배양 모델에서의 모발 재생을 분석하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Madaan A et al., Rajendran RL et al., Hwang I et al.] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 적응용 배지, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는, 대상체에서 탈모증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 국소 조성물이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 폼이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 수용액이거나, 다른 구현예에서, 현탁액이다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC(또는, 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC의 집단), 이들의 용해물 또는 CM, 또는 이로부터 유래된 분획의 투여를 포함하는, 피부 톤(skin tone)을 개선시키는 방법이 제공된다. ASC 유래된 인자로 피부를 치료하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 문헌[Kim ES et al.] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 CM, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 충전제 조성물(filler composition)을 주사하여 피부 아래의 부피를 증가시킴을 포함하여, 대상체의 피부 아래의 부피를 증가시키는 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 바와 같이, 유효량의 기재된 조성물 대상체의 피부 아래의 부피를 증가시키거나; 다른 구현예에서, 대상체의 피부 부피를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 특정의 구현예에서, 태반 ASC는 살아있다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 충전제 조성물은 주사 가능한 충전제 조성물이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC, 이들의 용해물 또는 CM, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함하는 주사 가능한 충전제 조성물이 제공된다. 다양한 구현예에서, 태반 ASC는 모체 조직 유래된 ASC; 태아 조직 유래된 ASC; 또는 이들의 혼합물이다. 대안적으로 또는 추가로, 태반 ASC는 대상체에 대해 동종이계이거나; 다른 구현예에서, 자기 조직이다. 태반 ASC, 용해물 및 이의 CM, 및 이로부터 유래된 분획은 각각 별도의 구현예를 나타낸다.
특정의 구현예에서, 기재된 충전제 방법 및 조성물은 볼륨이 부족한 피부 영역을 표적으로 한다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 이러한 영역이 미용사에 의해서 확인될 수 있다는 것을 알 것이다.
대안적으로 또는 추가로, 기재된 충전제 조성물은 태반 ASC의 현탁액을 포함하고; 이는, 추가의 구현예에서, 반-고체 또는 겔 담체 조성물과 함께 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 충전제 조성물은 스캐폴드(scaffold) 상에 씨딩(seeding)되는 태반 ASC를 포함한다. 다른 구현예에서, 충전제 조성물은 추가로 충전제 조성물의 활성을 향상시키는 물질을 포함하고, 이의 비-제한 예는 히알루론산이다.
세포 용해물
특정의 구현예에서, 치료학적 제제는 배양된 태반 ASC로부터 유래되는 용해물이다. 본원에서 사용된 용어 "용해물"은 세포 집단을 세포막을 파괴하는 작용제로 처리한 후에 생성되는 조성물을 나타낸다. 본원에서 배양된 태반 ASC가 참조되는 경우에는, 다른 구현예에서는, 배양된 태반 ASC의 집단이 사용될 수 있다.
CM 및 세포 용해물의 분획
언급된 바와 같이, 기재된 방법 및 조성물은, 태반 ASC-CM의 분획을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법 및 조성물은 태반 ASC 용해물의 분획을 포함한다. 각각의 가능성은 별도의 구현예를 나타내고, 각각은 각각의 분별화 방법과 자유롭게 조합될 수 있다.
기재된 분획은, 특정의 구현예에서, 태반 ASC의 CM("태반 ASC-CM")이거나, 다른 구현예에서, 태반 ASC 용해물의 CM이다. 용어 태반 ASC-CM은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 태반 ASC가 인큐베이션된 성장 배지를 나타낸다. 특정의 구현예에서, CM은 후속적으로 ASC로부터 분리되었다. 더욱 특이적 구현예에서, 태반 ASC는 세포 성장과 상용성인 조건 하에 CM에서 6-150 시간 동안; 또는, 다른 구현예에서, 6-144 시간; 6-120 시간; 6-96 시간; 6-72 시간; 6-48 시간; 6-36 시간; 6-24 시간; 12-150 시간; 12-144 시간; 12-120 시간; 12-96 시간; 12-72 시간; 12-48 시간; 12-36 시간; 12-24 시간; 24-150 시간; 24-144 시간; 24-120 시간; 24-96 시간; 24-72 시간; 24-48 시간; 또는 24-36 시간 동안 인큐베이션되었다.
다른 구현예에서, 기재된 태반 ASC 용해물 또는 ASC-CM은 동결 건조에 주어지며, 이는, 더욱 특이적 구현예에서, 동결 건조 또는 스프레이 건조될 수 있다. 특정의 구현예에서, 동결 건조물은 캡슐화(encapsulation)에 주어지고/거나, 다른 구현예에서, 에멀젼 내로 통합된다. 동결건조, 캡슐화, 및 에멀젼의 각각의 구현예는 자유롭게 조합될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 태반 ASC 용해물 또는 ASC-CM은 투석에 주어진다. 더욱 특이적 구현예에서. 더욱 특이적 구현예에서, 투석 막은 2-50 Kda(킬로달톤)의 컷오프 값(cutoff value)을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 컷오프는 2-100, 2-70, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 3-100, 3-70, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 5-100, 5-70, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 7-100, 7-70, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 7-10, 10-100, 10-70, 10-40, 10-30, 10-20, 또는 10-15 kDa이다. 특정의 구현예에서, 투석물은 캡슐화에 주어지고/거나, 다른 구현예에서, 에멀젼 내로 통합된다. 투석, 캡슐화, 및 에멀젼의 각각의 구현예는 자류롭게 조합될 수 있다.
더욱 특이적 구현예에서, 분획은 분비된 단백질이 풍부할 수 있다. 분비된 단백질이 풍부한 분획의 비-제한 예는 단백질 추출물이다.
다른 구현예에서, 분획은 펩티드가 풍부하다. 본원에서 사용된 펩티드는 길이 50 개 이하의 아미노산 잔기의 단백질 또는 단백질 단편을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 분획은 분비된 지질이 풍부하다.
또 다른 구현예에서, 베지클 성분(vesicular component)은 엑소좀(exosome)일 수 있는 세포외 베지클; 또는 다른 구현예에서, 마이크로베지클(microvesicle); 또는 다른 구현예에서, 엑소머(exomer)가 풍부하다. 또 다른 구현예에서, 베지클 성분은 엑소좀일 수 있는 세포외 베지클; 또는 다른 구현예에서, 마이크로베지클; 또는 다른 구현예에서, 엑소머를 필수로 하여 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 베지클 성분은 엑소좀일 수 있는 세포외 베지클; 또는 다른 구현예에서, 마이크로베지클로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 베지클 성분은 엑소좀일 수 있는 세포외 베지클; 또는 다른 구현예에서, 마이크로베지클; 또는 다른 구현예에서, 엑소머를 포함한다.
마이크로베지클(본원에서 마이크로입자로도 일컬어짐)은, 다양한 구현예에서, 이들의 크기(예, 100 nm 내지 1 μm), 표면 마커(marker), 또는 외부 막에서의 음으로 하전된 포스파티딜세린의 노출을 기준으로 하여 확인된다(Johnstone et al and Pan et al). 마이크로베지클을 분리하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Hugel et al and VanWijk et al]에 기재되어 있다.
엑소머는, 특정의 구현예에서, 크기가 평균 약 35 nm(나노미터)인 비막성 분비된 나노입자를 나타낸다. 다른 구현예에서, 엑소머는 50 nm(예, 1-50 nm) 이하의 크기 및 140-820 메가파스칼(Mpa)의 범위의 강성을 갖는 분비된 나노입자이다. 엑소머는 문헌[Zhang H et al]에 기재되어 있다.
특정의 구현예에서, 기재된 방법은, 예를 들어, 문헌[Burger D et al] 또는 이에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같은, 원심분리 및 임의의 유세포 분석(flow cytometry)에 의한 마이크로입자의 분리를 포함한다. 단지 예시 목적으로 제공된 한 가지 이러한 원안은, 큰 세포 부스러기(cellular debris)를 제거하기 위한 저속 원심분리, 표면 단백질의 형광 표지화 및 혈구 계산-기반 분류를 포함한다. 저속 원심분리는, 예를 들어, 1500 x g에서 15분 동안 수행된다. 특정의 구현예에서, 이러한 원심분리로부터의 상청액은 다시 펠릿화되어 큰 부스러기의 제거를 확실히 한다. 이어서, 마이크로입자는, 예를 들어, 20분 동안의 20,000 x g에서의 원심분리에 의해서 펠릿화될 수 있다. 이어서, 펠릿은 재현탁되고, 이어서, 고순도 제제를 얻기 위해서, 마이크로입자 표면 마커(예, Annexin)으로 염색될 수 있으며, 유세포 분석에 주어지질 수 있다. 크기 상한(예, 1 마이크론)은, 유세포 분석의 분야에서의 통상의 기술자에 의해서 이해되는 바와 같이, 포워드 스캐터 및 사이드 스캐터 파라미터(forward scatter and side scatter parameters)를 사용하여 확립될 수 있다.
다른 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 문헌[Braga-Lagache et al] 또는 이에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이, 원심분리에 의한 마이크로입자의 분리를 포함한다. 단지 예시 목적으로 제공된 한 가지 이러한 원안은 RT에서의 16,000 x g에서 2분 동안의 전-세정 원심분리를 포함한다. 이어서, 상청액이 16000 x g 및 RT에서 20-40분 동안 원심분리된다. 이어서, 상청액은 흡출되고, 펠릿은 완충된 용액에서 재구성된다. MP는 임의로 16,000 x g 및 RT에서 20분 동안의 원심분리 후의 1-2회 이상의 임의의 세척 단계에 의해서 다시 펠릿화된다.
또 다른 구현예에서, 분획은 엑소좀이 풍부하다(예, 초원심분리에 의해서). 더욱 특이적 구현예에서, 분획은 엑소좀 안정화제를 포함할 수 있다. 엑소좀을 제조하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Mincheva-Nilsson L et al. (Isolation and Characterization of Exosomes from Cultures of Tissue Explants and Cell Lines. Curr Protoc Immunol. 2016 Nov 1;115:14.42.1-14.42.21); Al-Nedawi K et al. (Analysis of Extracellular Vesicles in the Tumor Microenvironment. Methods Mol Biol. 2016;1458:195-202. doi: 10.1007/978-1-4939-3801-8_14); Pin Li et al (Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 2017; 7(3): 789-804. doi: 10.7150/thno.18133); and Ban JJ et al. (Low pH increases the yield of exosome isolation. Biochem Biophys Res Commun. 2015 May 22;461(1):76-9. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.03.172)]에 기재되어 있다. 또 다른 구현예에서, 엑소좀은 세포를 제거하기 위한 전-세정 배지, 세포 부스러기를 제거하기 위한 15,000 g에서 30분 동안의 원심분리, 및 150,000 g에서 90분 동안의 초원심분리에 의한 상청액으로부터의 엑소좀의 펠릿화에 의해서 분리될 수 있다[Jethwa SA et al., Exosomes bind to autotaxin and act as a physiological delivery mechanism to stimulate LPA receptor signalling in cells. J Cell Sci. 2016 Oct 15;129(20):3948-3957].
또 다른 구현예에서, 분획은 가용성 분획(soluble fraction)이다. 다른 구현예에서, 분획은 펠릿화 가능한 분획(pelletable fraction)이다. 고체의 펠릿화 가능한 분획을 제조하는 방법의 비-제한 예는 문헌[Bach FC et al. (Soluble and pelletable factors in porcine, canine and human notochordal cell-conditioned medium: implications for IVD regeneration. Eur Cell Mater. 2016 Aug 30;32:163-80)]에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 분획은 크기 배제 크로마토그래피(예, Sephadex™ 컬럼)을 사용하여 생산된다.
CM 및 세포 용해물을 분별하기 위한 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 전기 영동 이동성에 따른 분석물의 제조 규모 분별을 가능하게 하는, GELFREE® 8100 분별화 시스템(Expedeon, San Diego, CA)에 대한 제품 문헌 및 문헌[Weng Y et al. (In-Depth Proteomic Quantification of Cell Secretome in Serum-Containing Conditioned Medium. Anal Chem. 2016 May 3;88(9):4971-8. doi: 10.1021/acs.analchem.6b00910)]에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 분획은 수성 2-상 시스템(ATPS)을 사용하여 생산된다. 이러한 시스템은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Mujahid Iqbal et al. (Aqueous two-phase system (ATPS): an overview and advances in its applications. Biol Proced Online. 2016; 18: 18. doi: 10.1186/s12575-016-0048-8)]에 기재되어 있다. 특정의 더욱 특이적 구현예에서, 시스템은 두 폴리머(이는, 특정의 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜[PEG] 및 덱스트란이다)에 의해서 형성된 이상 시스템이다. 다른 구현예에서, 시스템은 폴리머와 염(이의 비-제한 구현예는 포스페이트, 설페이트 또는 시트레이트이다)에 의해서 형성된다. 다른 구현예에서, 이온성 액체 및 단쇄 알코올이 사용된다(Grilo AL et al; Van Berlo M et al). 다른 구현예에서, 이온성 및/또는 비-이온성 계면활성제가 미셀 및 역 미셀 ATPS(micellar and reverse micellar ATPS)의 형성을 위해서 사용된다(Liu C et al; and Xiao JX et al). 또 다른 구현예에서, 시스템은 폴리머/폴리머 시스템이거나, 다른 구현예에서, 폴리머/염 시스템(Albertsson PA)이다. 또 다른 구현예에서, 시스템은 알코올 - 염 ATPS(Louwrier A; and Jiang B et al.)이다. 또 다른 구현예에서, 시스템은 수성 미셀 2-상 시스템(Bordier C. 1981)이고; 혼합된 미셀 시스템 (Lye GJ et al); 이온성 액체(ILs)-기반 ATPS(Berthod A et al.); 또는 다중-상 시스템 (예, 세 가지 또는 네 가지의 폴리머 상)이 또한 바이오분자의 분리를 위해서 구성되었다(Hatti-Kaul R 2001).
다른 구현예에서, 시스템은 1-폴리머 ATPS이고, 이는 물 중의 ATPS의 형성을 위한 단지 1 가지의 폴리머를 사용한다(Johansson H-O et al).
예를 들어, StageTips(도 4)가 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다(Yanbao Yu et al., A spinnable and automatable StageTip for high throughput peptide desalting and proteomics. Protocol Exchange (2014) doi:10.1038/protex.2014.033; Rappsilber J et al., Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2007;2(8):1896-906).
단지 예시 목적으로 제공된 비-제한 StageTip 원안은 하기 완충액 및 시약을 사용한다:
· 완충액 A: 100% 메탄올; · 완충액 B: 0.5% 아세트산 in H2O; · 완충액 C: 0.5% 아세트산, 60% 아세토니트릴 및 40% H2O; · 완충액 D: 0.5% 아세트산, 80% 아세토니트릴 및 20% H2O.
· 어뎁터(Adaptor)(MiniSpin Column Collar, come with MicroSpin columns; The Nest Group, Inc., MA; cat. no. SUM SS18V).
· Empore C18 추출 디스크(3M, MN; cat. No. 2215).
원안 단계:
1. C18 추출 디스크의 단일 또는 다중 층을 필요한 만큼 팁(tip) 내로 충진한다.
2) 충진된 팁을 어뎁터(adaptor)로 2.0 mL 마이크로튜브 내로 넣는다(도 4에 도시됨).
3) 컨디셔닝 I: 200 μL 완충액 A(메탄올)을 팁 내로 충전하고; 4000 rpm에서 약 1분 동안 스피닝(spinning)하고;
컨디셔닝 II: 200 μL 완충액 D(0.5% 아세트산, 80% 아세토니트릴 및 20% H2O)을 팁내로 충전하고, 4000 rpm에서 약 1분 동안 스피닝한다.
4) 평형화: 200 μL 완충액 B(H2O 중의 0.5% 아세트산)를 팁내로 충전하고, 4000 rpm에서 약 1분 동안 스피닝한다.
5) 건조된 펩티드 샘플을 100 μL의 완충액 B 내로 재현탁시키고, 약 10분 동안 와동(vortexing)시킨다. 펩티드는 겔내 소화, 용액내 소화, 필터 보조된 샘플 제제(FASP) 또는 96FASP 16로부터의 것일 수 있다.
6) 결합: 100 μL 용액을 팁에 충전하고, 4000 rpm에서 약 1.5분 동안 스피닝하였다. 관류액(flow-through)을 팁내로 재충전하고, 다시 스피닝한다. 이러한 결합 단계를 2 내지 3회 반복한다.
7) 세척: 200 μL 완충액 B를 충전하고, 4000 rpm에서 2 내지 3분 동안 스피닝한다. 관류액을 버린다.
8) 용리: StageTips을 새로운 수거 튜브 내로 넣고; 200 μL 완충액 C를 충전하고, 4000 rpm에서 약 2분 동안 스피닝하고; 200 μL 완충액 D을 충전하고,4000 rpm에서 약 2분 동안 스피닝하고, 완충액 D으로 한번 더 용리를 반복한다. 용리의 전체 부피는 약 600 μL이다.
9) 펩티드 용리물을 Speed-Vac에서 건조시키고, 즉각적인 분석을 위한 HPLC 완충액으로 재현탁시키거나, 추가의 사용까지 -80 ℃에서 저장한다.
또 다른 구현예에서, 기재된 분획은 생물 반응 장치에서 배양된 태반 ASC로부터의 세포외 매트릭스(ECM)이다. 또 다른 구현예에서, 기재된 분획은 생물 반응 장치에서 배양된 태반 ASC로부터의 ECM의 분획이다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 ECM이 세포에 의해서 분비된 단백질 및 다른 분자를 나타냄을 인지할 것이다.
엑소좀을 포함하는 조성물
또 다른 구현예에서, 배양된 태반 ASC로부터 유래된 엑소좀 또는 다른 세포외 베지클을 포함하는 조성물을 사용하여 본원에 기재된 처방을 위한 방법이 제공된다. 특정의 구현예에서, 조성물은 본원에서 기재된 바와 같이 제조된다.
미세침 방법 및 조성물
다른 구현예에서, 대상체의 피부를 미세침 처리(micro-needling)하고, 후속하여 본원에 기재된 조성물을 적용함으로 포함하는, 예를 들어, 본원에 기재된 처방을 위한, 화장적 또는 미적 치료가 제공된다. 조성물은, 다양한 구현예에서, 로션, 폼, 겔, 용액, 또는 현탁액일 수 있거나, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어떠한 다른 조성물일 수 있다. 특정의 구현예에서, 조성물은 태반 ASC를 포함하거나, 다른 구현예에서, 이의 용해물, ASC-CM, 또는 이로부터 유래된 분획을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 치료는 노화 피부를 회복시키거나, 건조한 피부를 회복시키거나, 손상된 피부 장벽을 회복시키거나, 모발 성장을 자극하기 위한 것이다.
다른 구현예에서, 미세침 장치(micro-needling apparatus) 및 본원에 기재된 조성물을 포함하는, 예를 들어, 본원에 기재된 처방을 위한 화장적 또는 미적 치료 키트가 제공된다. 조성물은, 다양한 구현예에서, 로션, 폼, 겔, 용액, 또는 현탁액이거나, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어떠한 다른 조성물일 수 있다. 특정의 구현예에서, 조성물은 태반 ASC을 포함하거나, 다른 구현예에서, 이의 용해물, ASC-CM, 또는 이의 분획을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 치료는 노화 피부를 회복시키거나, 건조한 피부를 회복시키거나, 손상된 피부 장벽을 회복시키거나, 모발 성장을 자극하기 위한 것이다.
미세침 장치는 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, Dermaroller® (Vancouver, Canada)로부터 구입 가능하다.
ASC를 팽창시키는 방법
본 기술분야에서의 통상의 기술자는 성장 배지가 본원에 기재된 태반 ASC를 팽창시키고/거나 본원에 기재된 조성물 및 방법을 위해 기재된 CM을 생성시키기 위해서 사용된다는 것을 알 수 있을 것이다. 2D 및 3D 배양에 유용한 기본 배지의 비-제한 예는, 많은 것들 중에서도, 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM(소 혈청 알부민-비함유), F10(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(Fitton-Jackson 변형이 있거나 없음), 기본 배지 이글(Basal Medium Eagle)(BME - Earle의 염 베이스가 첨가됨), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM-혈청 없음), Yamane, IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지(Glasgow Modification Eagle Medium)(GMEM), Leibovitz L-15 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A Medium), 배지 M199(M199E - Earle 스케일 베이스를 함유함), 배지 M199 (M199H - Hank 염 베이스를 함유함), 최소 필수 배지 이글(MEM-E - Earle 염 베이스를 함유함), 최소 필수 배지 이글(MEM-H - Hank 염 베이스를 함유함) 및 최소 필수 배지 이글(MEM-NAA 비필수 아미노산을 함유함)을 포함하고, 또한, 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153, 및 어떠한 비율로의 이들의 혼합물을 포함한다. 특정의 구현예에서, DMEM이 사용된다. 다른 것들 중에서도, 이들 및 다른 유용한 배지가 문헌[GIBCO, Grand Island, N.Y., USA and Biological Industries, Bet HaEmek, Israel]으로부터 구입 가능하다.
일부 구현예에서, 배지는 추가의 물질로 보충될 수 있다. 이러한 물질의 비-제한 예는 혈청이고, 이는, 일부 구현예에서, 소 또는 다른 종의 태아 혈청이고, 이는, 일부 구현예에서, 배지 부피의 5-15%이다. 특정의 구현예에서, 배지는 1-5%, 2-5%, 3-5%, 1-10%, 2-10%, 3-10%, 4-15%, 5-14%, 6-14%, 6-13%, 7-13%, 8-12%, 8-13%, 9-12%, 9-11%, 또는 9.5-10.5%의 혈청을 함유하고, 이는 FBS, 또는 다른 구현예에서, 또 다른 동물 혈청일 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 배지는 성장 인자, 비타민(예, 아스코르브산), 시토카인, 염(예, B-글리세로포스페이트), 스테로이드(예, 덱사메타손) 및 호르몬, 예를 들어, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 인터류킨 3, 인터류킨 7, 대식세포 증식 자극 인자(macrophage colony stimulating factor), c-키트 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), 혈소판유래된 성장 인자, 및 뼈 형성 단백질에 의해서 보충될 수 있다.
추가의 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이러한 성분은 항생제, 항진균제, 알부민, 아미노산, 및 세포의 배양을 위한 본 기술분야에서 공지된 이 밖의 성분일 수 있다.
본원에서 기재된 다양한 배지, 즉, 2D 성장 배지 및 3D 성장 배지는 배지 조성물과 관련하여 기재된 구현예의 각각으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 다양한 구현예에서, 표준 조직 장치 및/또는 생물 반응 장치에서의 세포의 성장에 적합한 어떠한 배지가 사용될 수 있다.
특정의 구현예에서, 기재된 ASC가 인간 대상체에 투여를 위해서 의도되는 때에, 배양 배지(예, 상기 기재된 배지 첨가제를 함유함)는 실질적으로 이종-비함유, 즉, 어떠한 동물 오염물, 예를 들어, 마이코플라즈마(mycoplasma)를 함유하지 않음이 또한 인지될 것이다. 예를 들어, 배양 배지는 혈청-대체물, 인간 혈청 및/또는 합성 또는 재조합 생산된 인자로 보충될 수 있다.
ASC 및 이의 공급원
특정의 구현예에서, 기재된 ASC(자체로 사용되거나, 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 생성물을 생성시키기 위해서 사용됨)는 태반 유래된다. 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 본원에서 사용된 용어 "태반", 및 "태반 조직" 등은 태반의 어떠한 부분을 나타낸다. 태반 유래된 ASC는, 다양한 구현예에서, 태아, 또는 다른 구현예에서, 태반의 모체 영역, 또는 다른 구현예에서, 둘 모두의 영역으로부터 얻어질 수 있다. 모체 공급원의 더욱 특이적 구현예는 기저 탈락막(decidua basalis) 및 진성 탈락막(decidua parietalis)이다. 태아 공급원의 더욱 특이적 구현예는 양막(amnion), 융모막(chorion), 및 융모(villi)이다. 특정의 구현예에서, 조직 표본은 생리학적 완충액에서 세척되고, 이의 비-제한 예는 포스페이트-완충된 염수(PBS) 및 Hank 완충액이다. 특정의 구현예에서, ASC가 수거되는 태반 조직은 태반의 융모막 영역 및 탈락막 영역 중 적어도 하나, 또는 또 다른 구현예에서, 태반의 융모막 영역 및 탈락막 영역 둘 모두로부터 선택된다. 융모막 영역의 더욱 특이적 구현예는 융모막 중간염 및 융모막 영양막 조직이다. 탈락막의 더욱 특이적 구현예는 기저 탈락막, 피포 탈락막(decidua capsularis), 및 진성 탈락막이다. 비-제한 구현예에서, 모체 및 태아 태반 세포의 혼합물은 전체 태반, 또는 다른 구현예에서, 이의 일부; 또는 또 다른 구현예에서, 양막, 융모막 및/또는 탯줄을 제외한 전체 태반을 민싱(mincing)함으로써 얻어질 수 있다.
태반 세포는, 다양한 구현예에서, 만기 또는 조기 태반으로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 태반 조직은 임의으로 민싱된 후에, 효소 소화에 주어진다. 단일-세포 현탁액은 조직을 소화 효소(이하 참조) 및/또는 물리적인 파괴에 의해서 처리함으로써 또는 세척 배지로 가볍게 피펫팅(pipetting)(예, Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)함으로써 제조될 수 있고, 이의 비-제한 예는 조직 부분을 나일론 필터를 통해 민싱 및 플러싱(flushing)한다. 일부 구현예에서, 조직 처리는 DNAse의 사용을 포함하고, 이의 비-제한 예는 Merck로부터의 Benzonase이다.
임의로, 잔류 혈액이 세포 수거 전에 태반으로부터 제거된다. 이는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 관류에 의해서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "관류하다" 또는 "관류"는 유체를 기관 또는 조직 상에 또는 이를 통해서 붓거나 이에 통과시키는 행위를 나타낸다. 특정의 구현예에서, 태반 조직은 어떠한 포유동물로부터의 조직일 수 있는 반면에, 다른 구현예에서, 태반 조직은 인간이다. 태반 조직의 편리한 공급원은 산후 태반(예, 출생 후 10 시간 이하)이지만, 태반 조직 또는 세포의 다양한 공급원이 통상의 기술자에 의해서 고려될 수 있다. 다른 구현예에서, 태반은 출생 후 8 시간 이내에, 6 시간 이내에, 5 시간 이내에, 4 시간 이내에, 3 시간 이내에, 2 시간 이내, 또는 1 이내에 사용된다. 특정의 구현예에서, 태반은 세포의 수거 전에 냉장 유지된다. 다른 구현예에서, 산전 태반 조직이 사용된다. 이러한 조직은, 예를 들어, 융모막 융모 샘플 채취로부터 또는 본 기술분야에서 공지된 다른 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 태반 세포가 얻어지면, 이들은, 특정의 구현예에서, 유착 재료(예, 표면으로 구성됨)에 유착되어 유착 세포를 분리되게 한다. 일부 구현예에서, 공여자는 35세 전후인 반면에, 다른 구현예에서, 공여자는 가임 연령의 어떠한 여성일 수 있다.
태반-유래된 세포는, 일부 구현예에서, 2D 및 3D 배양 조건의 조합을 이용함으로써 전파될 수 있다. 2D 및 3D 배양으로 유착 세포를 전파하는 조건은 이하 본원에서 그리고 이하 실시예 부분에서 추가로 기재된다.
본 기술분야에서의 통상의 기술자는, 본 개시를 고려하여, 세포가, 일부 구현예에서, 예를 들어, 물리적 및/또는 효소적 조직 파괴 후에, 마커-기반 세포 분류를 사용하여, 태반으로부터 추출될 수 있고, 이어서, 본원에 기재된 배양 방법에 주어질 수 있음을 인지할 것이다.
전-염증성 시토카인에 의한 세포의 처리
기재된 방법 및 조성물의 특정의 구현예에서, 배지의 조성은 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 태반 ASC을 팽창시키기 위해서 및/또는 기재된 CM, 분획, 또는 이의 용해물을 생산하기 위해서 사용되는 배양 공정의 과정 동안에 변하지 않는다. 다르게 설명하면, 인자를 첨가하거나 제거하거나, 이전의 배지와 다른 조성을 갖는 신선한 배지를 첨가함으로써 배지 조성을 의도적으로 변화시키기 위한 어떠한 시도가 이루어지지 않는다. 배지 조성의 변화에 대한 언급은, 본 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 인지될 수 있는 바와 같이, 장기간 배양의 결과로서, 예를 들어, 이 안에 있는 세포에 의한 영양물의 흡수 및 대사물의 분비로 인해서, 자동적으로 발생하는 배지 조성의 변화를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 단계를 확장시키기 위해서 사용되는 방법은 2D 배양 후의 3D 배양를 포함한다. 특정의 구현예에서, 3D 배양 방법은, (a) ASC를 3D 배양 장치에서 제1 성장 배지 내에서 인큐베이션하는 단계로서, 염증성 시토카인이 제1 성장 배지에 첨가되지 않는 단계; 및 (b) 후속하여, ASC를 3D 배양 장치에서 제2 성장 배지 내에서 인큐베이션하는 단계로서, 하나 이상의 전-염증성 시토카인이 제2 성장 배지에 첨가되는 단계의 서브-단계를 포함한다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는, 본 개시를 고려하여, 동일한 3D 배양 장치가, 단순히 시토카인을 배양 장치 내의 배지에 첨가하거나, 다른 구현예에서, 배지를 배양 장치로부터 제거하고, 이를 시토카인을 함유하는 배지로 대체함으로써, 제1 및 제2 성장 배지에서의 인큐베이션을 위해서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 다른 구현예에서, 상이한 3D 배양 장치가, 예를 들어, 시토카인-함유 배지를 첨가하기 전에, 세포를 상이한 인큐베이터에 이동(통과)시킴으로써, 시토카인의 존재 하에 인큐베이션을 위해서 사용될 수 있다.
전-염증성 시토카인의 다른 구현예 및 이를 포함하는 방법은, 본원에서 참고로 통합되는 Zami Aberman 등에 의한 Pluristem Ltd의 WO 2017/141181호에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 기재된 세포(이하, 이는 기재된 방법 및 조성물에서, 또는 다른 구현예에서, 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 CM, 또는 이의 분획을 생산하기 위해서 사용되는 세포를 나타낸다)는 태아 유래된 태반 ASC("태아 ASC" 또는 "태아 세포"로도 일컬어짐) 및 모체 유래된 태반 ASC("모체 ASC" 또는 "모체 세포"로도 일컬어짐)의 혼합물이고, 주로 모체 세포를 함유한다. 더욱 특이적 구현예에서, 혼합물은 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 적어도 99.92%, 적어도 99.95%, 적어도 99.96%, 적어도 99.97%, 적어도 99.98%, 또는 적어도 99.99%의 모체 세포를 함유하거나, 90-99%, 91-99%, 92-99%, 93-99%, 94-99%, 95-99%, 96-99%, 97-99%, 98-99%, 90-99.5%, 91-99.5%, 92-99.5%, 93-99.5%, 94-99.5%, 95-99.5%, 96-99.5%, 97-99.5%, 98-99.5%, 90-99.9%, 91-99.9%, 92-99.9%, 93-99.9%, 94-99.9%, 95-99.9%, 96-99.9%, 97-99.9%, 98-99.9%, 99-99.9%, 99.2-99.9%, 99.5-99.9%, 99.6-99.9%, 99.7-99.9%, 또는 99.8-99.9%의 모체 세포를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 기재된 세포는 주로 또는 완전한 모체 세포 제제이거나, 주로 또는 완전한 태아 세포 제제이고, 이들의 각각은 별도의 구현예를 나타낸다. 주로 또는 완전한 모체 세포 제제는, 실시예 1에서 상세된 원안 및 PCT 공보 WO 2007/108003호, WO 2009/037690호, WO 2009/144720호, WO 2010/026575호, WO 2011/064669호, 및 WO 2011/132087호에 상세된 원안을 포함한, 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지된 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 이들 공보의 각각의 내용은 본원에서 참고로 통합된다. 주로 또는 완전한 태아 세포 제제는, 이들의 마커(예, 남성 태아의 경우의 Y 염색체)를 통해서 태아 세포를 선택하고, 세포를 팽창시킴을 포함한, 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지된 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 특정의 구현예에서, 모체 세포 집단이 기재된 방법 및 조성물에서 사용된다. 다른 구현예에서, 태아 세포가 사용된다.
다른 구현예에서, 기재된 세포는 검출 가능한 양의 모체 세포를 함유하지 않고, 이에 따라서 전적으로 태아 세포인 집단이다. 검출 가능한 양은, 본원에서 기재된 바와 같이, 모체 세포에 존재하지만 태아 세포에는 존재하지 않는 마커 또는 마커의 조합물을 상용한 FACS에 의해서 검출 가능한 세포의 양을 나타낸다. 특정의 구현예에서, "검출 가능한 양"은 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 또는 적어도 1%를 나타낼 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제제는 태아 및 모체 세포의 혼합물이고, 태아 세포가 풍부하다. 더욱 특이적 구현예에서, 혼합물은 적어도 70% 태아 세포를 함유한다. 더욱 특이적 구현예에서, 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 세포가 태아 세포이다. 음성 발현을 정의하기 위한 동형 대조군을 사용한, 유세포 분석에 의해서 측정된 CD200의 발현이 일부 조건 하에 태아 세포의 마커로서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9%의 기재된 세포가 태아 세포이다.
더욱 특이적 구현예에서, 혼합물은 20-80%의 태아 세포; 30-80%의 태아 세포; 40-80%의 태아 세포; 50-80%의 태아 세포; 60-80%의 태아 세포; 20-90%의 태아 세포; 30-90%의 태아 세포; 40-90%의 태아 세포; 50-90%의 태아 세포; 60-90%의 태아 세포; 20-80%의 모체 세포; 30-80%의 모체 세포; 40-80%의 모체 세포; 50-80%의 모체 세포; 60-80%의 모체 세포; 20-90%의 모체 세포; 30-90%의 모체 세포; 40-90%의 모체 세포; 50-90%의 모체 세포; 또는 60-90%의 모체 세포를 함유한다.
특정의 구현예에서, 기재된 ASC는 중간엽 간질 세포(mesenchymal stromal cell: MSC)와는 구별 가능하고, 이는, 일부 구현예에서, 골수로부터 분리될 수 있다. 추가의 구현예에서, 세포는 이하 3개의 기준을 기반으로 문헌[The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy (Dominici et al., 2006)]에 의해서 정의되는 인간 MSC이다: 1. 표준 배양 조건(α 최소 필수 배지 + 20% 태아 소 혈청(FBS))에서 유지되는 때의 플라스틱-유착. 2. 표면 분자 CD105, CD73 및 CD90의 발현, 및 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19 및 HLA-DR의 발현의 결여. 3. 시험관내에서 조골세포, 지방세포 및 연골아세포로 분화하는 능력. 이와는 대조적으로, 기재된 태반 세포는, 특정의 구현예에서, 본원에서 추가로 예시되고 기재된 바와 같이, 감소된 분화 잠재성을 특징으로 한다.
혈청-비함유 및 혈청 대체 배지
다른 구현예에서, 기재된 세포 집단은 5% 이하의 동물 혈청을 함유하는 배지에서의 태반 ASC의 집단을 팽창시킴으로써 생산된다. 특정의 구현예에서, 세포 집단은 적어도 주로 태아 세포("태아 세포 집단"으로도 일컬어짐)를 함유하거나, 다른 구현예에서, 적어도 주로 모체 세포("모체 세포 집단")을 함유한다. 다른 구현예에서, 모체, 또는 다른 구현예에서, 태아 세포로부터 얻은 인자가 기재된 방법 및 조성물에서 사용된다.
특정의 구현예에서, 상기 언급된 배지는 4% 이하; 3% 이하; 2% 이하; 1% 이하; 0.5% 이하; 0.3% 이하; 0.2% 이하; 또는 0.1% 이하의 동물 혈청을 함유한다. 다른 구현예에서, 배지는 동물 혈청을 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, 배지는 혈청이 첨가되지 않은 한정된 배지이다. 저-혈청 및 혈청-비함유 배지는 총체적으로 "혈청-부족 배지/배지들"로 일컬어진다.
본 기술분야에서의 통상의 기술자는 동물 혈청에 대한 본원에서의 언급이 다양한 종으로부터의 혈청을 포함하지만, 단, 혈청이 ASC 집단의 팽창을 자극함을 단서로 함을 인지할 것이다. 특정의 구현예에서, 혈청은 포유동물 혈청이고, 이의 비-제한 예는 인간 혈청, 소 혈청(예, 태아 소 혈청 및 소 태아 혈청), 말 혈청, 염소 혈청, 및 돼지 혈청이다.
다른 구현예에서, 기재된 세포 집단은 a. ASC 집단을 제1 배지에서 인큐베이션하는데, 제1 배지가 5% 이하의 동물 혈청을 함유하게 하여 인큐베이션하여, 제1 팽창된 세포 집단을 얻고; b. 제1 팽창된 세포 집단을 제2 배지에서 인큐베이션하는데, 제2 배지가 또한 5% 이하의 동물 혈청을 함유하고, 하나 이상의 활성화 성분이 제2 배지에 첨가되게 하여 인큐베이션함을 포함하는 공정에 의해서 생산된다. 제2 배지는 또한 본원에서 활성화 배지로서 일컬어질 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 또는 제2 배지, 또는 다른 구현예에서, 제1 및 제2 배지 둘 모두는 혈청을 함유하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 제1 배지는 총체적으로 "제1 팽창 배지"(이에 소량의 동물 혈청이 임의로 첨가된다)로 일컬어지는, 하나 이상의 성장 인자가 첨가된 제1 기본 배지를 함유하고; 활성화 배지는 활성화 성분(들)이 첨가되는, 하나 이상의 성장 인자가 첨가된 제2 기본 배지("제2 팽창 배지")를 함유한다. 더욱 특이적 구현예에서, 제2 팽창 배지는 제1 팽창 배지와 동일한 반면에; 다른 구현예에서, 제2 팽창 배지는 제1 팽창 배지와 하나 이상의 성분에서 상이하다.
특정의 구현예에서, ASC 집단을 제1 배지에서 인큐베이션하는 상기 언급된 단계는 적어도 17 배증, 또는 다른 구현예에서, 적어도 6, 8, 12, 15, 또는 적어도 18 배증; 또는 12-30, 12-25, 15-30, 15-25, 16-25, 17-25, 또는 18-25 배증 동안 수행된다.
다른 구현예에서, ASC 집단은 상기 언급된 제1 배지에서 한정된 계대 수 동안, 예를 들어, 2-3, 또는 다른 구현예에서, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 2-4; 또는 한정된 수의 집단 배증 동안, 예를 들어, 4-7, 또는 다른 구현예에서, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 4-10, 4-9, 4-8, 5-10, 5-9, 또는 5-8 동안 인큐베이션된다. 이어서, 세포는 저온 보존되고, 이어서, 제1 배지에서의 추가의 배양에 주어진다. 일부 구현예에서, 제1 배지에서의 추가의 배양은 6-10 집단 배증, 또는 다른 구현예에서, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 6-20, 7-20, 8-20, 9-20, 10-20, 6-15, 7-15, 8-15, 9-15, 또는 10-15 집단 배증 동안 수행된다. 대안적으로는, 제1 배지에서의 추가의 배양은 2-3 계대, 또는 다른 구현예에서, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 1-5, 1-4, 1-3, 2-5, 또는 2-4 계대 동안 수행된다.
또 다른 구현예에서, 제2 배지에서 제1 팽창된 세포 집단을 인큐베이션하는 단계는 한정된 수의 전체 계대 동안, 예를 들어, 3-5 계대, 또는 다른 구현예에서, 1-4, 1-3, 2-3, 2-5, 또는 2-4; 또는 한정된 수의 전체 집단 배증 동안, 예를 들어, 12-20, 또는 다른 구현예에서, 12-15, 또는 다른 구현예에서, 15-20, 12-18, 12-16, 14-20, 또는 14-18 배증 동안 수행된다.
다른 구현예에서, ASC 집단은 제2 배지에서 한정된 날 수 동안, 예를 들어, 4-10, 5-10, 6-10, 4-9, 4-8, 4-7, 5-9, 5-8, 5-7, 6-10, 6-9, 또는 6-8; 또는 한정된 집단 배증의 수 동안, 예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 3-10, 3-9, 3-8, 4-10, 4-9, 또는 4-8 동안 인큐베이션된다. 이어서, 세포는 생물 반응 장치 내의 제2 배지에서 추가의 배양에 주어진다. 일부 구현예에서, 생물 반응 장치 배양은 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 4-10, 4-9, 4-8, 5 10, 5-9, 5-8, 6-10, 6-9, 또는 6-8 집단 배증; 또는 다른 구현예에서, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 4-15, 4-12, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-15, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 6-15, 6 12, 6-10, 6-9, 6-8, 또는 6-7 일(day) 동안 수행된다. 특정의 구현예에서, 생물 반응 장치는 3D 캐리어를 함유하고, 이 위에서 세포가 배양된다.
특정의 구현예에서, 상기 언급된 2-스테이지 인큐베이션은 5% 이상의 동물 혈청(예, 본원에서 기재됨)을 함유하는 배지에서 배양함으로써 수행된다. 일반적으로는, 이러한 구현예의 경우에, 상기 언급된 단계들의 명명법이 유지된다. 따라서, 제1 배지(5% 이하의 동물 혈청을 함유함)는 "제1 배지"로의 이의 지정을 여전히 유지하고 활성화 배지는 "제2 [또는 활성화] 배지"로의 이의 지정을 유지한다.
특정의 구현예에서, 기재된 혈청-부족 배지는 혈청의 부재하에 세포 팽창을 자극하기 위한 것으로 의도된 인자로 보충된다. 이러한 배지는 본원에서 형청-대체 배지 또는 SRM으로 일컬어지며, 이의 사용, 예를 들어, 세포 배양 및 팽창에서의 이의 사용이 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Kinzebach et al]에서 기재되어 있다.
SRM 제형은 MSC Nutristem® XF 완전 배지(보충제를 포함함) 및 MSC Nutristem® XF 기본 배지(Biological Industries); Stempro® SFM 및 Stempro® SFM-XF(Thermo Fisher Scientific); PPRF-msc6; D-hESF10; TheraPEAK™ MSCGM-CDTM(Lonza, cat. no. 190632); 및 MesenCult-XF(Stem Cell Technologies, cat. no. 5429)를 포함한다. StemPro® 배지는 PDGF-BB, bFGF, 및 TGF-β, 및 인슐린을 함유한다(Chase et al.). PPRF-msc6의 조성물은 본원에서 참고로 통합되는 US 2010/0015710호에 기재되어 있다. D-hESF10는 인슐린(10 mcg/ml); 트랜스페린(5 mcg/ml); 소 알부민과 컨주게이션(conjugation)된 올레산(9.4 mcg/ml); FGF-2(10 ng/ml); 및 TGF-β1(5 ng/ml) 뿐만 아니라, 헤파린(1 mg/ml) 및 표준 배지 성분(Mimura et al.)을 함유한다.
또 다른 구현예에서, 화학적으로 정의된 배지가 사용된다. 화학적으로 정의된 배지의 비-제한 예는 50 ng/ml PDGF-BB, 15 ng/ml bFGF, 및 2 ng/ml TGF-β으로 보충된 DMEM/F-12을 함유한다. 이러한 배지는 Stempro® SFM-XF와 유사한 결과를 생성시킨다. DMEM/F-12는 Thermo Fisher Scientific(cat. no. 10565018)로부터 상업적으로 구입 가능한 공지된 기본 배지이다.
특정의 구현예에서, 기재된 SRM은 bFGF(염긱성 섬유아세포 성장 인자, FGF-2로도 일컬어짐), TGF-β(모든 동형, 예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3을 포함한 TGF-β), 또는 이들의 조합물을 포함한다. 다른 구현예에서, SRM은 bFGF, TGF-β, 및 PDGF를 포함한다. 또 다른 구현예에서, SRM은 bFGF 및 TGF-β를 포함하고 PDGF-BB가 결여된다. 대안적으로 또는 추가로, 인슐린이 또한 존재한다. 또 다른 구현예에서, 아스코르브산, 하이드로코르티손 및 페투인으로부터 선태된 추가의 성분이 존재하거나; 아스코르브산, 하이드로코르티손 및 페투인으로부터 선택된 2가지 성분이 존재하거나; 아스코르브산, 하이드로코르티손 및 페투인이 모두 존재한다.
다른 구현예에서, 기재된 SRM은 bFGF, TGF-β, 및 인슐린을 포함한다. 추가의 구현예에서, 트랜스페린(5 마이크로그램/밀리리터[mcg/ml]) 및 올레산으로부터 선택된 성분이 존재하거나; 트랜스페린 및 올레산 둘 모두가 존재한다. 올레산은, 일부 구현예에서, 단백질과 컨주게이션될 수 있고, 이의 비-제한 예는 알부민이다. 일부 구현예에서, SRM은 5-20 ng/ml bFGF, 2-10 ng/ml TGF-β, 및 5-20 ng/ml 인슐린, 또는 다른 구현예에서, 7-15 ng/ml bFGF, 3-8 ng/ml TGF-β, 및 7-15 ng/ml 인슐린을 포함한다. 더욱 특이적 구현예에서, 2-10 mcg/ml 트랜스페린 및 5-20 mcg/ml 올레산으로부터 선택된 성분, 또는 다른 구현예에서, 3-8 mcg/ml 트랜스페린 및 6-15 mcg/ml 올레산으로부터 선택된 성분, 또는 다른 구현예에서, 성분(트랜스페린 및 올레산) 둘 모두의 상기 언급된 양이 또한 존재한다.
또 다른 구현예에서, SRM은 추가로 에탄올아민, 글루타티온, 아스코르브산, 및 알부민으로부터 선택된 성분, 또는 다른 구현예에서, 2, 3, 또는 4 가지의 성분을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, SRM은 추가로 미량 원소, 또는 다른 구현예에서, 2, 3, 4, 또는 4 이상의 미량 원소를 포함한다. 일부 구현예에서, 미량 원소(들)은 셀레나이트, 바나듐, 구리, 및 망간으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 기재된 SRM은 bFGF 및 EGFff을 포함한다. 더욱 특이적 구현예에서, bFGF 및 EGF는 5-40, 5-30, 5-25, 6-40, 6-30, 6-25, 7-40, 7-30, 7-25, 7-20, 8- , 8-17, 8-15, 8-13, 9-20, 9-17, 9-15, 10-15, 5-20, 5-10, 7-13, 8-12, 9-11, 또는 10 ng/ml로부터 독립적으로 선택된 농도로 존재한다. 특정의 구현예에서, 인슐린; 및/또는 트랜스페린이 또한 존재한다. 더욱 특이적 구현예에서, 인슐린 및 트랜스페린은 5-20 및 2-10; 6-18 및 3-8; 또는 8-15 및 4-7 mcg/ml의 각각의 농도로 존재한다. 대안적으로 또는 추가로, SRM은 추가로 BSA, 셀레나이트(예, 나트륨 셀레나이트), 피루베이트(예, 나트륨 피루베이트); 헤파린, 및 리놀렌산으로부터 선택된 추가의 성분을 포함한다. 다른 구현예에서, 2 이상, 또는 다른 구현예에서, 3 이상, 다른 구현예에서, 4 이상, 또는 다른 구현예에서, 5 가지 모두의 BSA, 셀레나이트, 피루베이트, 헤파린, 및 리놀렌산이 존재한다. 더욱 특이적 구현예에서, BSA, 셀레나이트, 피루베이트, 헤파린, 및 리놀렌산은 0.1-5%, 2-30 ng/mL, 5-25 mcg/ml, 0.05-0.2 mg/ml, 및 5-20 nM의 각각의 농도로; 또는 다른 구현예에서, 0.2-2%, 4-10 ng/mL, 7-17 mcg/ml, 0.07-0.15 mg/ml, 및 7-15 nM의 각각의 농도로 존재하거나; 다른 구현예에서, 상기 언급된 양 또는 2 이상, 또는 다른 구현예에서, 3 이상, 다른 구현예에서, 4 이상, 또는 다른 구현예에서, 5 가지 모두의 BSA, 셀레나이트, 피루베이트, 헤파린, 및 리놀렌산이 존재한다.
다른 구현예에서, bFGF는, 존재하는 경우, 밀리리터당 1-40, 1-30, 1-20, 2-40, 2-30, 2-20, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 4-30, 4-20, 4-15, 5-30, 5-20, 5-15, 6-14, 7-14, 8-13, 8-12, 9-11, 9-12, 약 10, 또는 10 나노그램(ng/ml)의 농도로 존재한다.
다른 구현예에서, EGF는, 존재하는 경우, 1-40, 1-30, 1-20, 2-40, 2-30, 2-20, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 4-30, 4-20, 4-15, 5-30, 5-20, 5-15, 6-14, 7-14, 7-25, 7-22, 8-25, 8-22, 9-21, 10-20, 8-13, 8-12, 9-11, 9-12, 약 10, 또는 10 ng/ml의 농도로 존재한다.
다른 구현예에서, TGF-β는, 존재하는 경우, 1-25, 2-25, 3-25, 4-25, 5-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 2-20, 2-15, 2-10, 3-20, 3-15, 3-10, 3-8, 3-7, 4-8, 4-7, 4-6, 4.5-5.5, 약 5, 또는 5 ng/ml의 농도로 존재한다.
다른 구현예에서, PDGF는, 존재하는 경우, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-40, 4-30, 4-20, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 10-20, 10-18, 10-16, 또는 10-15, 2-20, 약 2, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 2, 3, 5, 10, 15, 또는 20 ng/mL의 농도로 존재한다.
또 다른 구현예에서, ASC는 태반으로부터 혈청-함유 배지 내로 추출된다. 비-제한 추출 원안은 본원에서 그 전체가 참고로 통합되는 2016년 6월 23일자 공개된 Esther Lukasiewicz Hagai 등의 명칭의 국제특허출원 WO 2016/098061호의 실시예 1에 기재되어 있다. 초기 추출 후에, 세포는, 추가의 구현예에서, SRM에서, 일부 구현예에서, 약 2-3 계대 동안, 또는 전형적으로는 제1 계대 후에 약 4-12 집단 배증 동안 팽창된다. 또 다른 추가의 구현예에서, 배양에는 임의로 세포 농축, 제형화 및 냉동 보존, 및 임의의 해동 및 추가의 배양이 뒤따른다. 특정의 구현예에서, 초기 배양는 모두 2D 기질 상에서 수행된다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 냉동 보존 부형제의 비-제한 예가 DMSO 및 혈청을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 냉동 보존의 다른 구현예가 본원에서 기재되어 있다.
특정의 구현예에서, 상기 언급된 배양 단계에는 생물 반응 장치에서의 배양이 뒤따르고, 이는, 일부 구현예에서, SRM에서 수행된다. 다른 구현예에서, 생물 반응 장치는 혈청-함유 배지를 함유한다. 더욱 특정의 구현예에서, 생물 반응 장치 배양은 2-5 추가의 배증, 또는 다른 구현예에서, 최대 10 추가의 배증 동안 수행된다. 특정의 구현예에서, 생물 반응 장치는 3D 기질을 함유한다. 다른 구현예에서, 혈소판 용해물이 혈청 대신에 사용되고, 혈소판 용해물의 비-제한 예는 인간 혈소판 용해물이다. 또 다른 구현예에서, 시토카인-함유 배지가 혈청-함유 배지 대신에 사용된다.
임의로, 생물 반응 장치 성장에는 어떠한 또는 모든 수거, 세포 농축, 세척, 제형화, 및/또는 냉동 보존이 뒤따를 수 있다.
다른 구현예에서, SFM/SPM에서 ASC 집단를 인큐베이션하는 단계는 배치 배양(batch culture)으로 수행되고, 후속 단계의 적어도 일부가 관류 하에 수행된다. 또 다른 구현예에서, 상기 언급된 후속 단계는, 관류 하에 혈청-함유 배지에서 추가의 팽창을 수행하기 전에, 2-6, 또는 다른 구현예에서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 1-5, 2-5, 3-5, 1-2, 1-3, 또는 1-5-세포 배증의 기간 동안 배치 배양으로 개시된다.
다른 SFM 및 SRM 구현예는 본원에서 참고로 통합되는 Lior Raviv 등의 명칭의 2019년 3월 28일자 출원된 국제특허출원 공보 WO 2019/186471호에 개시되어 있다.
ASC의 표면 마커 및 추가의 특성
대안적으로 또는 추가적으로, 기재된 ASC(이는 기재된 방법 및 조성물에서 사용되거나, CM, 용해물, 또는 이의 분획을 생성시키기 위해서 사용된다)는 MSC 또는 중간엽-유사 간질 세포에 특징인 마커 또는 마커들(예, 표면 마커)의 집단을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, ASC는 일부 또는 모든 이하 마커: CD105(UniProtKB Accession No. P17813), CD29(UniProtKB Accession No. P05556), CD44(UniProtKB Accession No. P16070), CD73(UniProtKB Accession No. P21589), 및 CD90(UniProtKB Accession No. P04216)를 발현한다. 일부 구현예에서, ASC는 일부 또는 모든 이하 마커: CD3(예, UniProtKB Accession Nos. P09693[감마 사슬] P04234[델타 사슬], P07766[엡실론 사슬], 및 P20963[제타 사슬]), CD4(UniProtKB Accession No. P01730), CD11b(UniProtKB Accession No. P11215), CD14(UniProtKB Accession No. P08571), CD19(UniProtKB Accession No. P15391), 및/또는 CD34 (UniProtKB Accession No. P28906)를 발현한다. 더욱 특이적 구현예에서, ASC는 또한 CD5(UniProtKB Accession No. P06127), CD20(UniProtKB Accession No. P11836), CD45(UniProtKB Accession No. P08575), CD79-알파(UniProtKB Accession No. B5QTD1), CD80(UniProtKB Accession No. P33681), 및/또는 HLA-DR(예, UniProtKB Accession Nos. P04233[감마 사슬], P01903[알파 사슬], 및 P01911[베타 사슬])의 발현이 결여되어 있다. 상기 언급된, 비-제한 마커 발현 패턴은 3D 기질 상에서 팽창되는 특정의 모체 태반 세포 집단에서 밝혀졌다. 본 단락에서 언급된 모든 UniProtKB 항목은 2014년 7월 7일에 액세스(accessed)되었다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 복합 합원, 예컨대, CD3 및 HLA-DR의 존재가 이들의 성분 부분, 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 기재된 것들 중 어떠한 것을 인식하는 항체에 의해서 검출될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구현예에서, ASC는 골수 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)와는 구별되는 마커 표현형을 보유한다. 특정의 구현예에서, ASC는 CD10의 발현(이는, 일부 구현예에서, 모체 및 태아 ASC 둘 모두에서 발생한다)에 양성이고; CD49d의 발현(이는, 일부 구현예에서, 적어도 모체 ASC에서 발생한다)에 양성이고; CD54의 발현(이는, 일부 구현예에서, 모체 및 태아 ASC 둘 모두에서 발생한다)에 양성이고; 이봉(bimodal)이거나, 다른 구현예에서, CD56의 발현(이는, 일부 구현예에서, 모체 ASC에서 발생한다)에 양성이고/거나; CD106의 발현에 음성이다. 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 이봉은 세포의 집단의 유의한 백분율(예, 적어도 20%)이 관심 마커를 발현하고 유의한 백분율이 마커를 발현하지 않는 상황을 나타낸다.
마커의 "양성" 발현은 동형 대조 히스토그램(isotype control histogram)의 주요 피크의 범위보다 더 높은 값을 나타내고; 이러한 용어는 본원에서 세포를 마커를 "발현한다"/"발현하는"으로 특성화하는 것과 동의어이다. 마커의 "음성" 발현은 동형 대조 히스토그램의 주요 피크의 범위 내에 있는 값을 나타내고; 이러한 용어는 본원에서 세포를 마커를 "발현하지 않는다"/"발현하지 않는"으로 특성화하는 것과 동의어이다. 마커의 "높은" 발현 및 용어 "고도로 발현한다"는 동형 대조 히스토그램의 발현 피크보다 높은 2 이상의 표준 편차이거나, 동형 대조 히스토그램에 매칭되는 벨-모양 곡선인 발현 수준을 나타낸다.
세포는, 단백질 또는 인자의 존재가 표준 방법에 의해서 검출 가능한 경우에, 단백질 또는 인자를 발현하는 것으로 알려져 있고, 이의 예는 동형 대조에 비해서 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 검출 가능한 신호이다. "분비한다"/"분비하는"/"분비"에 대한 본원에서의 언급은 표준 분석에서의 배경 수준 이상의 표시된 인자의 검출 가능한 분비와 관련이 있다. 예를 들어, 0.5 x 106 태아 또는 모체 ASC는 4 ml 배지 (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-글루타민)에 현탁되고, 6웰-플레이트의 각각의 웰에 첨가되고, 가습된 인큐베이트(37℃에서 5% CO2)에서 24 시간 동안 배양될 수 있다. 2 시간 후에, DMEM이 제거되고, 세포가 1 ml RPMI 1640 배지 + 2 mM L-글루타민 + 0.5% HSA에서 추가의 24 시간 동안 배양된다. CM이 플레이트로부터 수거되고, 세포 부스러기(cell debris)가 원심분리에 의해서 제거된다.
일부 구현예에 따르면, 기재된 ASC는 대상체에서 면역 반응을 억제할 수 있다. 세포 집단의 면역억제 능력을 측정하기 위한 방법은 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 잘 공지되어 있고, 예시적인 방법은 본원에서 그 전체가 참고로 통합되는 PCT 공보 WO 2009/144720호의 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 혼합된 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction: MLR)이 수행될 수 있다. 예시적인 비-제한 MLR 분석에서, 조사된 제대혈(irradiated cord blood: iCB) 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 또 다른 종으로부터의 세포가, 시험되는 세포 집단의 존재 또는 부재 하에, 말초 혈액 유래된 단핵구(PBMC; 예를 들어, 인간 PBMC 또는 또 다른 종으로부터의 PBMC)와 함께 인큐베이션된다. 면역 반응의 세기와 관련되는 PBMC 세포 복제가 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 3H-티미딘 흡수에 의해서 측정될 수 있다. 시험 세포와 공동-인큐베이션되는 때의 PBMC 세포 복제의 감소는 면역억제 능력을 나타낸다. 대안적으로는, 유사한 분석이 CB 세포 대신에 말초 혈액(PB) 유래된 MNC로 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 혈액 세포 집단(예컨대, CB 세포 또는 PBMC)에 의한 전-염증성 및 항-염증성 시토카인의 분비는, ASC의 존재 또는 부재 하에, 자극되는 때에(예를 들어, 비-매칭된 세포 또는 비-특이적 자극제, 예컨대, PHA와의 인큐베이션에 의해서) 측정될 수 있다. 특정의 구현예에서, 예를 들어, 인간 ASC의 경우에, WO 2009/144720호에 제공된 바와 같이, 150,000 ASC가 48 시간 동안 50,000 동종이계 PBMC와 공동-인큐베이션된 후에, 1.5 mcg/ml의 LPS에 의한 5-시간 자극이 수행되는 때에, PBMC에 의한 IL-10 분비의 양은 ASC의 부재 하의 LPS 자극에 의해서 관찰된 양의 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 150%, 적어도 170%, 적어도 200%, 또는 적어도 300%이다.
다른 구현예에서, ASC는 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 인자(들)을 분비한다. 특정의 구현예에서, ASC는 VEGF (혈관 내피 성장 인자), 안지오게닌, 안지오포이에틴 1, MCP-1, IL-8, Serpin E1, 및 GCP2/CXCL6로부터 선택된 인자를 분비한다. 다른 구현예에서, ASC는 VEGF, 안지오게닌, 안지오포이에틴 1, MCP-1, IL-8, 및 Serpin E1를 분비하고, 이들은 모체 세포에 의해서 분비되는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 구현예에서, ASC는 VEGF, 안지오게닌, 안지오포이에틴 1, MCP-1, IL-8, Serpin E1, 및 GCP2/CXCL6를 분비하며, 이들은 태아 세포에 의해서 분비되는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 구현예에서, ASC는 항-섬유화 인자(들)를 분비한다. 특정의 구현예에서, ASC는 Serpin E1(플라스미노겐 활성화제 억제제 1; Uniprot Accession No. P05121) 및 uPAR(유로키나아제 플라스미노겐 활성화제 표면 수용체; Uniprot Accession No. Q03405)로부터 선택된 인자를 분비한다. 다른 구현예에서, ASC는 가능하게 하는 인자를 분비한다. 또 다른 구현예에서, ASC는 Serpin E1 및 uPAR를 분비하고, 이들은 모체 및 태아 세포에 의해서 분비되는 것으로 밝혀졌다. 본 단락에서의 모든 UniProt 목록은 2017년 4월 3일에 액세스되었다.
다른 구현예에서, ASC는 세포외 매트릭스(ECM) 리모델링(remodeling)을 촉진하는 인자(들)을 분비한다. 특정의 구현예에서, ASC는 TIMP1, TIMP2, MMP-1, MMP-2, 및 MMP-10으로부터 선택된 인자를 분비한다. 다른 구현예에서, ASC는 TIMP1, TIMP2, MMP-1, MMP-2, 및 MMP-10을 분비하며, 이들은 모체 세포에 의해서 분비되는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 구현예에서, ASC는 TIMP1, TIMP2, MMP-1, 및 MMP-10을 분비하고, 이들은 태아 세포에서 분비되는 것으로 밝혀졌다.
다른 구현예에서, 기재된 ASC는 2D 조건 하에 배양되는 때에 방추형(spindle shape)을 나타낸다
일부 구현예에 따르면, ASC는 CD200을 발현하는 반면에, 다른 구현예에서, ASC는 CD200의 발현이 결여되어 있다. 또 다른 구현예에서, 유착 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 또는 2%, 1%, 또는 0.5% 이하가 CD200을 발현한다. 또 다른 구현예에서, 유착 세포의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상이 CD200을 발현한다.
또 다른 구현예에서, 기재된 ASC는, 본원에서 참고로 통합되는 Zami Aberman 등의 2019년 6월 10일자 출원된 국제특허출원 공보 WO 2019/239295호에서 언급된, 어떠한 다른 마커 표현형, 다른 특성(예, 인자(들)의 분비, 분화 능력, 분화에 대한 내성, T-세포 증식의 억제, 또는 근아세포 증식의 자극), 또는 이들의 조합을 보유한다.
또 다른 구현예에서, 세포는 동종이계일 수 있거나, 다른 구현예에서, 세포는 자기 조직일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 신선한 세포일 수 있거나, 다른 구현예에서, 동결된 세포(예를 들어, 동결-보존된)일 수 있다.
특정의 구현예에서, 상기 언급된 ASC 집단 중 어떠한 집단이 기재된 방법 및 조성물에서 사용된다. 다른 구현예에서, 세포로부터 얻은 용해물 또는 CM, 또는 이의 분획이 기재된 방법 및 조성물에서 사용된다. 각각의 집단은 기재된 미적 처리의 각각과 자유롭게 조합될 수 있으며, 각각의 조합은 별도의 구현예를 나타낸다. 더욱이, CD를 생성시키기 위해서 사용된 또는 조성물에 함유된 세포는, 다양한 구현예에서, 처리되는 대상체에 대해서 자기 조직, 동종이계, 또는 이종일 수 있다. 각각의 세포 유형은 본원에서 언급된 치료학적 구현예와 자유롭게 조합될 수 있다.
ASC 및 용해물, CM, 및 이로부터 유래된 분획의 제조를 위한 추가의 방법 특성
일부 구현예에서, 기재된 태반 ASC를 3D 생물 반응 장치에서 인큐베이션하였다. 일부 구현예에서, 기재된 분획(예, 엑소좀)은 ASC가 인큐베이션된 3D 생물 반응 장치-생성된 CM으로부터 분리된다. 세포 팽창에 대해 각각 기재된 구현예는 이로부터 유래된 ASC, CM, 용해물, 또는 엑소좀의 치료학적 사용에 대한 기재된 구현예 중 어떠한 구현예와 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 기재된 ASC 또는 CM은 ASC가 인큐베이션된 3D 생물 반응 장치로부터 수거된다. 대안적으로 또는 추가로, 세포는 냉동 보존되고, 이어서, 해동되고, 그 후에, 세포가 추가로 팽창되고/거나, CM, 분획, 용해물, 또는 엑소좀이 이로부터 분리된다. 다른 구현예에서, 해동 후에, 세포는 2D 배양으로 배양되고, 이로부터 ASC, CM, 분획, 용해물, 또는 엑소좀이 분리된다.
특정의 구현예에서, 기재된 ASC는, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 3D 인큐베이션에 주어지거나 주어졌다. 더욱 특이적 구현예에서, ASC는, 3D 배양의 단계 전에, 2D 유착-세포 배양 장치에서 인큐베이션되었다. 일부 구현예에서, ASC는 2D 유착-세포 배양 장치에서의 이전의 인큐베이션 단계에 주어진 후에, 기재된 3D 배양 단계가 수행된다.
용어 "이차원 배양" 및 "2D 배양"은 세포가 세포 성장과 상용성이고 세포를 단일층으로 성장하게 하는 조건에 노출되는 배양을 나타낸다. 이러한 성장에 적합한 장치는 "2D 배양 장치"로 일컬어진다. 이러한 장치는 전형적으로는 평탄 성장 표면("이차원 기질(들)" 또는 "2D 기질(들)"로도 일컬어짐)를 가질 것이며, 일부 구현예에서, 평탄하거나 굽을 수 있는 유착 재료를 포함한다. 2D 배양을 위한 장치의 비-제한 예는 세포 배양 디쉬 및 플레이트이다. 다중-층 트레이, 예컨대, Nunc™에 의해서 제조된 Cell Factory™가 본 정의에 포함되고, 단, 각각의 층은 단일층 배양을 지지함을 단서로 한다. 2D 장치에서도, 세포는 과잉-합류(over-confluent)되게 허용되는 때에 또 다른 것 위에 성장할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 이는 "이차원"으로서의 장치의 분류에 영향을 주지 않는다.
용어 "삼차원 배양" 및 "3D 배양"은 세포가 세포 성장과 상용성이고 세포가 서로에 대해서 3D 배향으로 성장하게 하는 조건에 노출되는 배양을 나타낸다. 용어 "삼차원[또는 3D] 배양 장치"는 세포 성장과 상용성이고 세포가 서로에 대해서 3D 배향으로 성장하게 하는 조건 하에 세포를 배양하는 장치를 나타낸다. 이러한 장치는 전형적으로는 3D 성장 표면("삼차원 기질" 또는 "3D 기질"로도 일컬어짐)을 가질 것이며, 일부 구현예에서, 3D 배양 장치, 예를 들어, 생물 반응 장치에 존재하는 유착 재료를 포함한다. 유착 간질 세포의 팽창에 적합한 3D 배양 조건의 특정의 비-제한 구현예는 본원에서 그 전체가 참고로 통합되는 PCT 출원 공보 WO/2007/108003호에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, "유착 재료"는 합성, 또는 다른 구현예에서, 천연, 또는 다른 구현예에서, 이들의 조합인 재료를 나타낸다. 특정의 구현예에서, 재료는 비-세포독성이다(또는, 다른 구현예에서, 생물학적 상용성이다). 대안적으로 또는 추가로, 재료는 섬유성이고, 이는, 더욱 특이적 구현예에서, 직포 섬유 매트릭스, 부직포 섬유 매트릭스, 또는 어떠한 유형의 섬유 매트릭스일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 기재된 ASC는, 본원에서 참고로 통합되는 Zami Aberman 등의 2019년 6월 10일자 출원된 국제특허출원 공보 WO 2019/239295호에서 언급된 배양 조건(예, 성장 기질, 인큐베이션 시간, 생물 반응 장치, 씨딩 밀도(seeding density), 또는 수거 밀도)에 주어지거나 주어졌다.
다른 구현예에서, 3D 배양의 길이는 적어도 4 일(day); 4-12 일; 다른 구현예에서, 4-11 일; 다른 구현예에서, 4-10 일; 다른 구현예에서, 4-9 일; 다른 구현예에서, 5-9 일; 다른 구현예에서, 5-8 일; 다른 구현예에서, 6-8 일; 또는 다른 구현예에서, 5-7 일이다. 다른 구현예에서, 3D 배양은 5-15 세포 배증, 다른 구현예에서, 5-14 배증, 다른 구현예에서, 5-13 배증, 다른 구현예에서, 5-12 배증, 다른 구현예에서, 5-11 배증, 다른 구현예에서, 5-10 배증, 다른 구현예에서, 6-15 세포 배증, 다른 구현예에서, 6-14 배증, 다른 구현예에서, 6-13 배증, 또는 다른 구현예에서, 6-12 배증, 다른 구현예에서, 6-11 배증, 또는 다른 구현예에서, 6-10 배증 동안 수행된다.
특정의 구현예에서, 3D 배양은 3D 생물 반응 장치에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 생물 반응 장치는 안에 위치된 배지 및 3D 부착 기질을 보유하는 용기, 및 pH, 온도 및 산소 수준 및 임의로 다른 파라미터를 제어하기 위한 제어 장치를 포함한다. 용어 부착 기질 및 성장 기질은 상호 대체적이다.
또 다른 예시적인 비-제한 생물 반응 장치, Celligen 310 생물 반응 장치가 도 1에 도시되어 있다. 섬유상 바스켓(Fibrous-Bed Basket: 16)에는 폴리에스테르 디스크(10)가 적재된다. 일부 구현예에서, 용기는 외부 포트(1[본 포트는, 다른 구현예에서, 세포 수거를 위한 또한 사용될 수 있다])를 통해서 탈이온수 또는 등장성 완충액로 충전되고, 이어서 임의로 오토클레이브(autoclave)된다. 다른 구현예에서, 살균 후에, 액체는 성장 배지로 대체되며, 이러한 성장 배지는 (9)로 도시된 디스크 층(disk bed)을 포화시킨다. 또 다른 추가의 구현예에서, 온도, pH, 용존 산소 농도 등이 접종 전에 설정된다. 또 다른 추가의 구현예에서, 완만한 초기 교반 속도가 이용되어 세포 부착을 촉진시키고, 이어서, 진탕이 증가된다. 대안적으로 또는 추가로, 관류가 외부 포트(2)를 통해서 새로운 배지를 첨가함으로써 시작된다. 요구되는 경우에, 대사 생성물이 바스켓(8) 위의 세포-비함유 배지로부터 수거될 수 있다. 일부 구현예에서, 임펠러의 회전이 흡출관(draft-tube: 18)에서의 음압을 생성시키고, 이는 흡출관을 통해, 이어서, 임펠러 포트(impeller port: 19)를 통해 저장소(15)로부터의 세포-비함유 유출물을 당겨서, 배지가 연속 루프로 균일하게 순환(12)되게 한다. 또 다른 추가의 구현예에서, 튜브(6)의 조절은 액체 수준을 제어하고; 이러한 튜브의 외부 개구(4)는, 일부 구현예에서, 수거를 위해서 사용된다. 다른 구현예에서, 링 스파저(ring sparger)(보이지 않음)가, 스파저 라인(7) 및, 하우징(5) 내부에 유지될 수 있는, 외부 포트(3)로부터 첨가된 가스를 통해서, 임펠러를 통해 흐르는 배지에 산소 첨가하기 위해 임펠러 통기 챔버(impeller aeration chamber: 11) 내부에 위치된다. 대안적으로 또는 추가로, 원격 챔버에 한정된 스파징(sparging)된 가스가 고정된 세포를 세척하고 지나가는 영양 배지에 의해서 흡수된다. 또 다른 구현예에서, 워터 재킷(water jacket: 17)이존재하며, 재킷 물을 안(13) 및 밖(14)으로 이동시키기 위한 포트가 존재한다.
또 다른 구현예에서, 매트릭스는 Celligen™ Plug Flow 생물 반응 장치와 유사하고, 이는, 특정의 구현예에서, Fibra cel® 캐리어(또는 다른 구현예에서, 다른 캐리어)로 충진된다.
특정의 구현예에서, ASC의 정제 또는 농축을 위한 추가의 단계가 수행될 수 있다. 이러한 방법은, 이로 한정되는 것은 아니지만, ASC 및/또는, 다양한 구현예에서, 중간엽 간질 세포 또는 중간엽-유사 ASC에 대한 마커를 사용한 세포 분류를 포함한다.
본 문맥에서 세포 분류는, 하나 이상의 마커의 이들의 발현, 하나 이상의 마커의 이들의 발명의 결여, 또는 이들의 조합을 기반으로 하여 세포를 선택하는, 수동 또는 자동 등의 어떠한 절차를 나타낸다. 본 기술분야에서의 통상의 기술자는 하나 이상의 마커로부터의 데이터가 분류 공정에서 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
더욱 특정의 구현예에서, 세포가 3D 매트릭스로부터 제거될 수 있는 반면에, 매트릭스는 생물 반응 장치 내에 유지된다. 특정의 구현예에서, 세포의 적어도 약 10%, 20%, 또는 30%는 생물 반응 장치로부터의 수거 시에 S 및 G2/M 상(집합적으로)에 있다.
특정의 구현예에서, 수거 공정은, 예를 들어, 본원에서 참고로 통합되는 PCT 국제출원 공보 WO 2012/140519호에 기재된 바와 같은, 진동 또는 진탕을 포함한다. 특정의 구현예에서, 수거 동안에, 세포는 칼슘 킬레이터(chelator)를 또한 임의로 포함하는 프로테아제에 의한 치료 동안에, 또는 다른 구현예에서 그 동안 및 그 후에, 0.7-6 Hertz, 또는 다른 구현예에서, 1-3 Hertz에서 진탕된다. 특정의 구현예에서, 세포를 함유하는 캐리어는 프로테아제를 포함하고 칼슘 킬레이터를 또한 임의로 포함하는 용액 또는 배지에 침지되는 동안에 0.7-6 Hertz, 또는 다른 구현예에서, 1-3 Hertz에서 진탕된다.
본 기술분야에서의 통상의 기술자는 다양한 등장성 완충액이 세포를 세척하기 위해서 그리고 유사한 용도로 사용될 수 있음이 인지될 것이다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS; Life Technologies)은 사용될 수 있는 많은 완충액 중 단지 하나이다.
기재된 방법에서 사용되는 어떠한 제제의 경우에, 치료 유효량 또는 투여량은 시험관내 및 세포 배양 분석으로부터 먼저 산정될 수 있다. 흔히, 투여량은 요망되는 농도 또는 역가를 달성하도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 투여량을 더욱 정확하게 측정하기 위해서 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 시험관내, 세포 배양물에서 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해서 측정될 수 있다.
시험관내 및 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 이들로부터 얻은 데이터는 인간에서의 사용을 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여형 및 이용되는 투여 경로에 따라서 다양할 수 있다. 정확한 제형화, 투여 경로 및 투여량은, 일부 구현예에서, 환자의 상태를 고려하여 개별적인 의사에 의해서 선택될 수 있다.
치료되는 병태의 중증도 및 반응성에 따라서, 투여는 단일투여이거나, 다른 구현예에서, 복수의 투여일 수 있으며, 치료의 과정이 2 일 내지 3주일, 또는 다른 구현예에서, 3 주일 내지 3 개월, 또는 다른 구현예에서, 질환 상태의 개선이 달성되는 때까지 지속될 수 있다.
특정의 구현예에서, 투여 후에, 대부분의 세포, 다른 구현예에서, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 세포가 투여 1개월 후의 대상체 내에서 더 이상 검출 가능하지 않다.
제형
특정의 구현예에서, 기재된 조성물은 희석되지 않은 용해물, CM 또는 이의 분획에 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 안정화제 및 침투-향상 물질을 첨가함으로써 제조되는 국소 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 농축된 용해물, CM 또는 이의 분획에 하나 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 국소 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 희석된 용해물, CM 또는 이의 분획에 하나 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 국소 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 농축된 엑소좀 제제에 하나 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 국소 조성물이다.
다른 구현예에서, 기재된 조성물은 1 이상의 부형제, 예를 들어, 안정화제 및 수성 완충액를 태반 ASC, 용해물, CM(예, 희석되지 않은 CM) 또는 이의 분획에 첨가함으로써 제조되는 주사 가능한 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 농축된 용해물, CM, 또는 이의 분획에 1 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 주사 가능한 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 묽은 용해물, CM 또는 이의 분획에 1 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 주사 가능한 조성물이다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 농축된 엑소좀 제제에 하나 이상의 부형제를 첨가함으로써 제조되는 주사 가능한 조성물이다.
다른 구현예에서, ASC는 이와 함께 존재하는 혈청을 제거하기 위해서 세척된다. 더욱 특이적 구현예에서, 이종 혈청 성분은 적어도 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9%까지 감소될 수 있거나, 다른 구현예에서, 표준 방법, 예를 들어, 질량 분광분석에 의해서 검출 가능하지 않을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 기재된 용해물 또는 CM은 이의 최초 농도로 존재한다. 다른 구현예에서, 용해물 또는 CM은 최초 농도의 5-7%, 7-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95-100%로 희석된다. 다른 구현예에서, 용해물 또는 CM은 초기 농도의 150-300%, 150-400%, 150-500%, 150-200%, 120-150%, 120-300%, 또는 120-200%로 농축된다.
다른 구현예에서, 용해물, CM, 또는 분획은 이와 함께 존재하는 혈청을 제거하기 위해서 처리된다. 더욱 특이적 구현예에서, 이종 혈청 성분은 적어도 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9%까지 감소될 수 있거나, 다른 구현예에서, 표준 방법, 예를 들어, 질량 분광분석에 의해서 검출 가능하지 않을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 기재된 조성물의 캐리어는 현탁액 및 에멀젼으로부터 선택되거나, 다른 구현예에서, 캐리어는 크림, 연고, 폼, 페이스트, 화장료, 화장용 세럼(serum) 제형, 또는 흡수 베이스 조성물로부터 선택되고, 이들의 각각은 별도의 구현예를 나타낸다.
폼
다른 구현예에서, 기재된 조성물은 폼으로 제형화된다. 폼은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 가스 버블의 형태로 큰 부피 비율의 가스가 액체, 고체 또는 겔에 분산된 분산물을 나타낸다. 버블의 직경은 일반적으로는 1 마이크론 이상이지만, 버블들 사이의 라멜라(lamellae)의 두께는 흔히 1 나노미터 내지 1 마이크로미터인 일반적인 콜로이드 크기 범위이다. 특정의 구현예에서, 폼은 기재된 용해물, CM, 또는 분획에 대해서 사용된다.
화장용 세럼 제형
본 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 인지되는 바와 같이, 화장용 세럼 제형(화장용 세럼들/세럼으로도 일컬어짐)은 물이 증발되는 것을 방지하는 폐쇄성 가습 성분(occlusive moisturizing ingredient)을 함유하지 않는 국소 제형이다. 이들은 또한 크림보다 더 적은 윤화제 및 증량제를 함유한다. 특정의 구현예에서, 화장용 세럼은 물-기반이어서, 오일을 모두 함께 제거한다. 바람직한 구현예에서, 화장용 세럼은 신속한 흡수를 나타내며, 매우 높은 농도의 활성 물질을 함유한 비-그리스성의 마감 및 인텐시브 포뮬라(intensive formula)와 함께, 투피의 깊숙한 층으로 관통하는 능력을 나타낸다. 특정의 구현예에서, 화장용 세럼은 중량을 기준으로 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 활성 성분을 함유한다. 특정의 구현예에서, 화장용 세럼 제형은 기재된 용해물, CM, 또는 분획을 위해서 사용된다.
겔
다른 구현예에서, 조성물은 겔이다. 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 겔은 유체에 의해서 그 전체 부피를 통해 팽창되는 비-유체 콜로이드 네트워크 또는 폴리머 네트워크를 나타낸다. 특정의 구현예에서, ASC 용해물, CM, 또는 이의 분획이 겔에 분산된다.
크림
특정의 구현예에서, 기재된 조성물은 크림이다. 더욱 특이적 구현예에서, 크림은 표피-침투제를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 크림은 표피-침투제를 추가로 포함하지 않는다. 특정의 구현예에서, 크림은 적어도 2000 센티포이즈, 또는 다른 구현예에서, 적어도 3000 센티포이즈, 또는 다른 구현예에서, 적어도 5000 센티포이즈, 또는 다른 구현예에서, 적어도 10,000 센티포이즈의 점도를 갖는다. 크림의 IUPAC 정의는 묽은 에멀젼의 크림화에 의해서 형성되는 고도로 농축된 에멀젼이고, 여기에서, 크림화는, 중력장 또는 원심력장의 작용 하에, 구체 간의 접촉이 중요한 고도로 농축된 에멀젼 및 연속상으로의 묽은 에멀젼의 거시적 분리를 나타낸다. 이러한 분리는 일반적으로는 위쪽을 발생하지만, 이러한 용어는, 분산된 연속 상의 상대적인 밀도가 농축된 에멀젼이 아래로 침강하게 하면, 여전히 적용될 수 있다. 특정의 구현예에서, ASC 용해물, CM, 또는 이의 분획이 크림에 분산된다.
본원에서 점도에 대한 언급은 표준 대기 조건(25℃ 및 1 기압) 하에 측정된 점도를 나타낸다.
표피-침투제
용어 표피-침투제는, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 작용제 또는 물질의 부재 하의 수송에 비해서 두피 내로의 약제학적 작용제 또는 다른 유익한 물질의 수송을 증가시키는 작용제를 나타낸다. 침투제의 비-제한 예는 올레오레진 캡시컴(oleoresin capsicum) 또는 이의 구성요소 또는 탄화수소 사슬이 결합되는 헤테로사이클릭 고리를 함유하는 특정의 분자를 포함한다. 특정의 구현예에서, 표피-침투제는 기재된 용해물, CM, 또는 분획을 포함하는 제형과 함께 사용된다.
표피-침투제의 추가의 비-제한 예는 양이온성, 음이온성, 또는 비이온성 계면활성제(예, 나트륨 도데실 설페이트, 폴리옥사머 등); 지방산 및 알코올(예, 에탄올, 올레산, 라우르산, 리포솜 등); 항콜린제(anticholinergic agent)(예, 벤질로늄 브로마이드(benzilonium bromide), 옥시페노늄 브로마이드(oxyphenonium bromide)); 알카논(예, n-헵탄); 아미드아미드(예, 우레아, N,N-디메틸-m-톨루아미드); 지방산 에스테르(예, n-부티레이트); 유기산(예, 시트르산); 폴리올(예, 에틸렌 글리콜, 글리세롤); 설폭사이드(예, 디메틸설폭사이드); 테르펜(예, 사이클로헥센); 우레아; 당(sugar); 탄수화물 또는 이 밖의 작용제를 포함한다.
또 다른 표피-침투제는 본원에서 참조로 통합되는 Arnaud Grenier, Dario Norberto R Carrara, 및 Celine Besse의 미국특허 제7,425,340호에 기재되어 있다.
연고
다른 구현예에서, 기재된 활성 성분은 연고로 제형화된다. 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 연고는, 예를 들어, 문헌[Jeannine M. Conway et al]; 및 US 약전에 기재된 바와 같은, 다양한 부류 또는 유형의 연고 베이스일 수 있다. 더욱 특이적 구현예에서, 연고는 탄화수소 베이스(예, 유지성 베이스(oleaginous base))를 포함하고, 이의 비-제한 예는 경질 파라핀, 연질 파라핀, 미세결정상 왁스 및 세레신이다. 다른 구현예에서, 연고는 흡수 베이스를 포함하고, 이의 비-제한 예는 양모지(wool fat), 밀랍, 친수성 바셀린, 및 라놀린이다. 다른 구현예에서, 흡수 베이스 유중수 에멀젼이다. 또 다른 구현예에서, 연고는 수중유 에멀젼 베이스(예, 친수성 연고 또는 크림)을 포함한다. 특정의 구현예에서, 수중유 에멀젼 베이스는 용이하게 물-제거 가능하다. 또 다른 구현예에서, 연고는 수용성 베이스(예, 물-혼화성 베이스)를 포함하고, 이의 비-제한 예는 마크로골스(macrogols) 200, 300, 및 400, 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 특정의 구현예에서, 연고는 수-불용성 물질, 예컨대, 바셀린, 무수 라놀린, 또는 왁스가 결여되어 있다. 또 다른 구현예에서, 연고는 유화 베이스를 포함하고, 이의 비-제한 예는 유화 왁스 및 세트리미드(cetrimide)이다. 또 다른 구현예에서, 연고는 식물성 오일이고, 이의 비-제한 예는 올리브 오일, 코코넛 오일, 참기름, 아몬드유 및 낙화생유이다. 특정의 구현예에서, 연고는 적어도 1000 센티포이즈의 점도를 갖는다. 특정의 구현예에서, ASC 용해물, CM, 또는 이의 분획은 연고에 분산된다.
로션
다른 구현예에서, 기재된 활성 성분은 로션으로 제형화된다. 본원에서 로션에 대한 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 두피로의 적용을 위해서 의도된 저-점도 국소 제제를 나타낸다. 특정의 구현예에서, 로션은 유중수 에멀젼이다. 다른 구현예에서, 로션은 수중유 에멀젼이다. 특정의 구현예에서, 로션은 2000-10,000, 2000-8000, 3000-8000, 4000-7000, 5000-10,000, 5000-15,000, 또는 5000-20,000 센티포이즈의 점도를 갖는다. 특정의 구현예에서, ASC 용해물, CM, 또는 이의 분획은 로션에 분산된다.
에멀젼
다른 구현예에서, 기재된 활성 성분(예, 용해물, CM, 또는 이의 분획)은 에멀젼으로서 제형화된다. 본원에서 에멀젼에 대한 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 액적이 다른 액체 내에 분산되는 유체 시스템을 나타낸다. 전형적으로는, (a) 하나의 액체가 수성이면서, 다른 액체가 유기성이고; (b) 하나의 액체(분산 상)가 다른 액체(연속 상)에 분산된다. 일부 구현예에서, 기재된 에멀젼은 오일/물(o/w) 에멀젼이고, 여기에서 분산 상은 유기 재료이고, 연속 상은 물 또는 수용액이다. 다른 구현예에서, 에멀젼은 물/오일(w/o) 에멀젼이고, 여기에서, 분산 상은 물 또는 수용액이고, 연속 상은 유기 액체("오일")이다. 또 다른 구현예에서, 에멀젼은 물 중의 유중수(water-in-oil-in-water) 에멀젼이거나, 다른 구현예에서, 오일 중의 수중유(oil-in-water-in-oil) 에멀젼이다. 에멀젼은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Khan et al] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다. 일반적으로는, 에멀젼은, 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같은, 유화제를 함유한다.
다양한 구현예에서, 분산 상의 액적은 비정질, 액정, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 분산 상을 구성하는 액적의 직경은 10 nm(나노미터) 내지 100 mcm(마이크론)의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 직경은 10-1000 nm, 또는 다른 구현예에서, 10-700, 10-500, 10-300, 10-200, 10-150, 10-100, 10-80, 10-60, 10-50, 10-40, 20-1000, 20-700, 20-500, 20-300, 20-200, 20-150, 20-100, 20-80, 20-60, 20-50, 20-40, 30-1000, 30-700, 30-500, 30-300, 30-200, 30-150, 30-100, 30-80, 30-60, 30-50, 30-40, 50-1000, 50-700, 50-500, 50-300, 50-200, 50-150, 50-100, 50-80, 70-1000, 70-700, 70-500, 70-300, 70-200, 70-150, 70-100, 70-80, 100-1000, 100-700, 100-500, 100-300, 100-200, 100-150, 100-120, 150-1000, 150-700, 150-500, 150-300, 150-200, 200-2000, 200-1500, 200-1000, 200-700, 200-500, 200-300, 300-2000, 300-1500, 300-1000, 300-700, 300-500, 500-2000, 500-1500, 500-1000, 500-700, 700-3000, 700-2000, 700-1500, 700-1000, 1000-5000, 1000-3000, 1000-2000 nm, 또는 1000-1500 nm의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 직경은 1-100 mcm, 또는 다른 구현예에서, 1-70, 1-50, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 2-100, 2-70, 2-50, 2-30, 2-20, 2-15, 3-10, 3-100, 3-70, 3-50, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 3-100, 3-70, 3-50, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 5-100, 5-70, 5-50, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 7-100, 7-70, 7-50, 7-30, 7-20, 7-15, 7-10, 10-100, 10-70, 10-50, 10-30, 10-20, 10-15, 15-100, 15-70, 15-50, 15-30, 15-20, 20-100, 20-70, 20-50, 20-30, 30-100, 30-70, 30-50, 50-100, 50-70, 또는 70-100 mcm 범위이다.
특정의 구현예에서, 기재된 에멀젼은 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼이다. 마이크로에멀젼 및 나노에멀젼은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Mason TG et al] 및 이에 인용된 참고문헌 및 본원에서 참고로 통합되는 Thomas Doering의 US 2019/0060185호에 기재되어 있다.
본원에서 마이크로에멀젼의 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 물, 오일 및 계면활성제(들)을 포함하는 분산액을 의미하며, 이것은, 성분들을 단순히 혼합할 때에 그리고 높은 전단 조건을 필요로 하지 않으면서, 자가-조립에 의해서 자발적으로 형성될 수 있는 1-100 nm, 일반적으로는 10-50 nm의 분산된 도메인 직경을 갖는 등방성 및 열역학적 안정성 시스템이다. 다양한 구현예에서, 마이크로에멀젼은 물 중에 분산된 오일, 오일 중에 분산된 물, 및 복연속성(상호 연결된) 에멀젼으로부터 선택된다. 마이크로에멀젼의 더욱 특이적 구현예는 계면활성제 및/또는 계면활성제-공계면활성제(예, 지방족 알코올) 시스템에 의해서 안정화되고, 이는, 일부 구현예에서, 충분한 양으로 존재하여 열력학적 안정성을 부여한다.
다른 구현예에서, 기재된 에멀젼은 나노에멀젼이다. 본원에서 나노에멀젼에 대한 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 분산된 액적이 20-500 nm 범위, 더욱 바람직하게는 20-200 nm에 있고, 열역학적으로는 아니지만 운동학적으로 안정한 에멀젼을 나타낸다. 전형적으로는, 나노에멀젼은 형성시키기에 기계적인 전단력의 적용을 필요로 한다. 특정의 구현예에서, 액적은 고형 구체이고, 이들의 표면은 무정형 및 친지성이고 음전하를 갖는다. 다른 구현예에서, 나노에멀젼은 (a) 연속적인 수성 상의 수중유 나노에멀젼, (b) 연속적인 오일 상의 유중수 나노에멀젼, 및 (c) 복연속성 나노에멀젼으로부터 선택된다.
유화제
본 기술분야에서의 통상의 기술자는 로션, 겔, 에멀젼, 및 본원에서 기재된 다른 유형의 제형이 하나 이상의 유화제를 필요로 할 수 있음을 인지할 것이다. 본원에서 유화제에 대한 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 에멀젼의 운동학적 안정성을 증가시킴으로써 이것을 안정화시키는 물질을 나타낸다. 전형적으로는, 유화제는 극성 또는 친수성 (수용성) 부분 및 비-극성(소수성 또는 친지성) 부분을 함유한다. 유화제는 물 또는 오일 중 어느 하나에 우선적인 용해도를 갖는 경향이 있다. 오일보다 물에 더 가용성인 유화제는 일반적으로는 수중유 에멀젼의 형성을 촉진하는 반면에, 오일에 더 가용성인 유화제는 일반적으로는 유중수 에멀젼을 선호한다. 특정의 구현예에서, 기재된 유화제는 에멀젼의 표면 장력을 10 dynes/cm 이하로 감소시킨다. 유화제, 및 에멀젼의 형성을 촉진하는데 있어서의 이들의 사용은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Manjit Jaiswal et al] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다. 특정의 구현예에서, GRAS(일반적으로는 안전한으로 인식됨) 유화제가 사용된다. GRAS 물질의 목록은 USFDA's SCOGS (Select Committee on GRAS Substances)로부터 이용 가능하다.
특정의 구현예에서, 기재된 유화제는 표면 활성제, 또는 계면활성제이고, 이는, 더욱 특이적 구현예에서, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성이온성 계면활성제(zwitterionic surfactant), 및 양쪽성 계면활성제(amphoteric surfactant)로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 유화제는 양이온성 계면활성제이다. 양이온성 계면활성제는, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 수용액에 해리되어 유화 특성을 보이는 양으로 하전된 양이온을 형성시키는 물질을 나타낸다. 양이온성 계면활성제의 비-제한 예는 벤즈알코늄 염, 폴리쿼터늄 화합물, 폴리(비닐 피리딘), 및 공-N,N 디메틸 에틸 메타크릴레이트이다. 특정의 구현예에서, 양이온성 계면활성제는 비이온성 배출촉진제(non-ionic emulgent)와 함께 사용된다.
다른 구현예에서, 유화제는 음이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제는, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 수용액에서 해리되어 유화 특성을 보이는 음으로 하전된 양이옴을 형성시키는 물질을 나타낸다. 음이온성 계면활성제의 비-제한 예는 나트륨 스테아레이트, 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우릴 벤젠 설포네이트, 폴리아크릴산, 음이온성 설페이트-기반 계면활성제, 및 음이온성 설포네이트-기반 계면활성제이다.
다른 구현예에서, 유화제는 양쪽성 계면활성제이다. 양쪽성 계면활성제는, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 시스템의 pH에 따라서 양으로 및 음으로 하전된 기 둘 모두를 보유하는 물질을 나타낸다. 이들은 낮은 pH에서 양이온성이고 높은 pH에서 음이온성이다. 양쪽성 계면활성제의 비-제한 예는 레시틴이다.
또 다른 구현예에서, 유화제는 비이온성 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제의 비-제한 예는 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드-b-부틸렌 옥사이드), 지방산의 소르비톨 에스테르, 및 에톡실화된 지방 알코올, 및 폴리소르베이트-유형 비이온성 계면활성제를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 유화제는 친수성 콜로이드이고, 이의 비-제한 예는 아카시아, 알기네이트, 키토산, 카르복스메틸셀룰로오스, 크로스카르멜로스(croscarmellose), 미세결정상 셀룰로오스, 및 잔탄검(xanthan gum)이다.
다른 구현예에서, 유화제는 미세하게 분쇄된 고체이고, 이의 비-제한 예는 벤토나이트 및 비검(veegum)이다.
다른 구현예에서, 유화제는 세정제(detergent)이고, 이의 비-제한 예는 시트르산; 이염기성(dibasic) 암모늄 시트레이트; 칼슘 시트레이트; 칼륨 시트레이트; 나트륨 시트레이트; 이소프로필 시트레이트; 트리에틸 시트레이트; 스테아릴 시트레이트; 타르타르산, 글루카르산(glucaric acid), 뮤신산(mucic acid), 글루콘산(gluconic acid), 아스코르브산, 및 이들의 염이다. 다른 구현예는 이미도디아세트산 (IDA) 유도체, 예를 들어, nor-NTA 및 N-메틸 디칼륨 IDA를 포함한다.
계면활성제의 다른 구현예는 알킬 폴리글루코사이드("APG") 계면활성제를 포함하고, 이의 비-제한 예는 본원에서 모두 참고로 통합되는 Giret 등의 미국특허 제5,776,872호; Furman 등의 미국특허 제5,883,059호; Addison 등의 미국특허 제5,883,062로; 및 Ouzounis 등의 미국특허 제5,906,973호에 개시되어 있는 알킬폴리사카라이드이다. 본원에서 사용하기에 적합한 알킬 폴리글루코사이드는 약 6 내지 약 30개 탄소 원자, 또는 약 10 내지 약 16개 탄소 원자를 함유하는 소수성 기를 갖는 알킬폴리글루코사이드 및 약 1.3 내지 약 10, 또는 약 1.3 내지 약 3, 또는 약 1.3 내지 약 2.7 개의 사카라이드 단위를 함유하는 친수성 기를 갖는 폴리사카라이드, 예를 들어, 폴리글리코사이드를 기재하고 있는 Llenado의 미국특허 제4,565,647호에 또한 개시되어 있다. 임의로, 수소성 모이어티와 폴리사카라이드 모이어티를 연결시키는 폴리알킬렌옥사이드 사슬이 있을 수 있다. 적합한 알킬렌옥사이드는 에틸렌 옥사이드이다. 전형적인 소수성 기는 약 8-18, 또는 약 10-16 개의 탄소 원자를 함유하는 포화되거나 포화되지 않은, 분지형 또는 비분지형 알킬기를 포함한다. 적합하게는, 알킬기는 최대 약 3 개의 하이드록시기를 함유할 수 있고/거나, 폴리알킬렌옥사이드 사슬은 최대 약 10, 또는 약 5 개 이하의 알킬렌옥사이드 모이어티를 함유한다. 적합한 알킬 폴리사카라이드는 옥틸, 노닐데실, 운데실도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 및 옥타데실, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 및 헥사글루코사이드, 갈락토사이드, 락토사이드, 글루코오스, 프룩토사이드, 프룩토오스 및/또는 가락토오스이다. 적합한 혼합물은 코코넛 알킬, 디-, 트리-, 테트라-, 및 펜타글루코사이드 및 탈로(tallow) 알킬 테트라-, 펜타-, 및 헥사글루코사이드를 포함한다.
다른 계면활성제는 본원에서 참고로 통합되는 Maria Ochomogo 등의 US 2008/0318822호에 기재되어 있다.
본 기술분야에서의 통상의 기술자는, 일부 구현예에서, 로션 및 크림이 하기 2-스테이지 공정으로 제조될 수 있음을 인지할 것이다: 1) 피부연화제(모이스처라이저) 및 윤활제가 배합제 및 증량제와 함게 오일에 분산되고; 2) 향수, 착색제 및 보존제(모두 임의적)가 물 순환에서 분산된다. 활성 성분은 관련된 원료 및 요망되는 로션 또는 크림의 특성에 따라서 둘 모두의 순환에서 파괴된다.
다른 구현예에서, 수중유 에멀젼은 하기 공정에 의해서 제조된다: 1). 플레이크/분말 성분을 사용되는 오일에 첨가하여 오일 상을 제조하고; 2) 활성 성분을 분산시키고; 3) 유화제 및 안정화제를 함유하는 물 상을 제조하고; 4) 오일과 물을 혼합하여 에멀젼을 형성시키되, 일부의 경우에, (45-85℃)로 가열하면서 에멀젼을 형성시키고; 5) 최종 제품이 얻어질 때까지 계속 혼합한다.
현탁액 및 콜로이드
일부 구현예에서, 기재된 ASC(또는, 다른 구현예에서, 용해물 또는 CM의 미립자 분획)가 현탁액으로서 제형화된다. 본원에서, 현탁액에 대한 언급은, 다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 액체 중의 고체 입자의 분산액을 나타낸다. 현탁액은 침강하기에 충분히 큰 고체 입자를 함유하는 이질적 혼합물이다. 더욱 특이적 구현예에서, 입자는 태반 ASC일 수 있거나, 다른 구현예에서, 이로부터 유래된 물질의 응집체일 수 있다.
다른 구현예에서, 기재된 ASC는 현탁된 입자가 더 작고 침강되지 않는 콜로이드로서 제형화된다. 더욱 특이적 구현예에서, 입자는 베지클, 또는 태반 ASC로부터의 물질의 응집체일 수 있다.
나노캡슐화
또 다른 구현예에서, 기재된 태반 ASC, 용해물, CM, 또는 이의 분획은 나노 캡슐화에 주어진다. 나노캡슐화를 위한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에서 모두 참조로 통합되는 Khoee, Sepideh 등의 미국 특허 출원 공보 제2015/0307649호; Abbasi, Soleiman 등의 제2015/0147367호; 및 Natura Cosmeticos S.A의 명칭의 제2019/0031937호; 및 문헌[Nanoencapsulation Technologies for the Food and Nutraceutical Industries (Academic Press), edited by Seid Mahdi Jafari]에 기재되어 있다. 나노캡슐화 기술의 비-제한 예는, 예를 들어, 모노 에폭시 화합물, 다가 에폭시 화합물, 또는 이들의 혼합물(예, US 2015/0307649호에 기재된 바와 같이); 음이온성 고분자 전해질과의 양이온성 고분자 전해질의 코아세르베이션(coacervation)에 의해서 생성된 폴리머(예, US 2015/0147367호에 기재된 바와 같이); 시아노아크릴레이트 유형 모노머의 폴리머(예, US 2019/0031937호에 기재된 바와 같이)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 폴리머 재료에의 캡슐화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, ASC 또는 다른 활성 성분은 나노지질 입자에 캡슐화되고, 이의 비-제한 예는 본원에서 모두 참조로 통합되는 모두 Michael W. Fountain의 미국 특허 출원 공보 제2017/0042826호, 제20150342226호, 및 제2012/0195940호에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 기재된 ASC 활성 성분(예, 용해물, CM, 또는 이의 분획)은 나노 구체로 제형화된다. 나노구체는 일반적으로는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지되어 있고, 예를 들어, Dermazone Solutions(St. Petersburg, FL)로부터 구입 가능하다. 특정의 구현예에서, 나노구체는 포스포리피드 모이어티를 포함하고, 이의 비-제한 예는 Lyphazome® 나노구체 (Dermazone)이고, 이는 직경이 평균 125-150 나노미터이고, Dermazone으로부터 이용 가능하다.
추가의 약제학적 담체
특정의 구현예에서, 기재된 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 담체 또는 희석제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 대상체에 유의한 자극을 유발시키기 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 투여된 세포의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는다. 담체의 비-제한 예는 프로필렌 글리콜, 염수, 에멀젼, 및 물과의 유기 용매의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 약제학적 담체는 염수의 수용액이다.
다른 구현예에서, 조성물은 추가로 조성물의 제형화, 안정화 및/또는 국소 적용을 촉진하는 적어도 하나의 구성요소를 포함한다. 더욱 특이적 구현예에서, 구성요소는 흐름조절제, 충전제, 부형제, 알코올, 보존제, 현탁제, 안정화제, 계면활성제, 오일 상, 수성 상, 보습제(humectant), 또는 증량제를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 구성요소는 콜로이드성 실리카, 티타늄 디옥사이드, 이소프로필 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드, 스테아르산, 세틸 알코올, 이소프로필 팔미테이트, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비톨, 폴리소르베이트, 밀크, 코코넛 오일, 아몬드유, 라놀린, 레시틴, 또는 밀랍을 포함한다. 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 겔이다. 다른 구현예에서, 조성물은 로션이다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 태반 ASC를 삼투 억제제 또는 항냉동제, 동결 및 얼음 형성의 손상 효과로부터 세포를 보호하는 작용제로부터 선택된 부형제와 함께 포함한다. 특정의 구현예에서, 항냉동제는 침투 화합물이고, 이의 비-제한 예는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 프로판디올, 폴리-에틸렌 글리콜, 아세트아미드, 프로필렌 글리콜, 및 아도니톨(adonitol)이거나; 다른 구현예에서, 비-침투 화합물이고, 이의 비-제한 예는 락토오스, 라피노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 및 d-만니톨이다. 다른 구현예에서, 침투 항냉동제 및 비-침투 항냉동제 둘 모두가 존재한다. 다른 구현예에서, 부형제는 운반 단백질이고, 이의 비-제한 예는 알부민이다. 또 다른 구현예에서, 삼투 억제제 및 운반 단백질 모두가 존재하고; 특정의 구현예에서, 삼투 억제제 및 운반 단백질은 동일한 화합물일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 동결된다. 세포는 상기 언급된 ASC의 어떠한 구현예일 수 있고, 이들의 각각은 별도의 구현예로 여겨진다. 더욱 특이적 구현예에서, DMSO는 2-5%; 또는 다른 구현예에서, 5-10%; 또는 다른 구현예에서, 2-10%, 3-5%, 4-6%; 5-7%, 6-8%, 7-9%, 8-10%의 농도로 존재한다. DMSO는, 다른 구현예에서, 운반 단백질과 함께 존재하고, 이의 비-제한 예는 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민이다.
다른 구현예에서, 주사를 위해서, 기재된 ASC 또는 다른 활성 성분은 수용액으로, 예를 들어, 생리학적 상용성 완충액으로 제형화될 수 있고, 이의 비-제한 예는 행크 용액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 및 생리학적 염 완충액이다.
경로
특정의 구현예에서, 기재된 방법 및 조성물은 표피 경로에 의해서 투여되고, 이의 비-제한 예는 국소 조성물이다. 다른 구현예에서, 방법 및 조성물은 피내 경로에 의해서 투여되고, 이의 비-제한 예는 주사용 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 방법 및 조성물은 피부 아래 투여되고, 이의 비-제한 예는 주사용 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 방법 및 조성물은 피하 투여되고, 이의 비-제한 예는 주사용 조성물이다.
다양한 구현예에서, 기재된 ASC는 피부 창상, 또는 다른 구현예에서, 레이저 치료 1 시간 이내에, 2 시간 이내에, 3 시간 이내에, 4 시간 이내에, 6 시간 이내에, 8 시간 이내에, 10 시간 이내에, 12 시간 이내에, 15 시간 이내에, 18 시간 이내에, 24 시간 이내에, 30 시간 이내에, 36 시간 이내에, 48 시간 이내에, 3 일 이내에, 4 일 이내에, 5 일 이내에, 6 일 이내에, 8 일 이내에, 10 일 이내에, 12 일 이내에, 또는 20 일 이내에 대상체에 투여된다. 더욱 특이적 구현예에서, 기재된 조성물은 피부 창상, 또는 다른 구현예에서, 레이저 치료 후 1-24, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 8-24, 10-24, 12-48, 1-48, 2-48, 3-48, 4-48, 5-48, 6-48, 8-48, 10-48, 12-48, 18-48, 24-48, 1-72, 2-72, 3-72, 4-72, 5-72, 6-72, 8-72, 10-72, 12-72, 18-72, 24-72, 또는 36-72 시간 후에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 기재된 조성물은 피부 창상, 또는 다른 구현예에서, 레이저 치료 후 3-48, 4-48, 5-48, 또는 6-48 시간 후에 투여된다.
다양한 구현예에서, 태반 ASC가 투여되는 때에, 숙주에서의 기재된 세포의 이식은 세포가 기재된 치료 효과를 발휘하는 것을 필요로 하지 않으며, 이들의 각각은 별도의 구현예로 여겨진다. 다른 구현예에서, 이식은 세포가 효과(들)를 발휘하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 세포는, 다양한 구현예에서, 자체가 투여 후 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 또는 14 일 이상 동안 생존함이 없이 치료 효과를 발휘할 수 있다.
상용성 약제학적 담체에 제형화된 기재된 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조되고, 적절한 용기에 담기고, 표시된 병태의 치료를 위해서 표지될 수 있다.
기재된 조성물은, 요구되는 경우, 투여를 위한 설명서를 수반한 용기에 포장될 수 있다.
기재된 ASC, 용해물, CM, 및 분획의 각각의 구현예가 치료학적 방법 또는 약제학적 조성물과 관련된 각각의 구현예와 자유롭게 조합될 수 있음이 명확하다.
대상체
특정의 구현예에서, 기재된 방법 및 조성물에 의해서 치료되는 대상체는 피부 자극, 열상, 손상된 피부 장벽, 또는 노화된, 주름이 있는, 또는 다르게 손상된 피부를 갖고 있는 인간이다. 대안적으로 또는 추가로, 대상체는 레이저 모발 제거, 미세침 치료, 메조테라피, 또는 또 다른 피부 치료를 진행중인 대상체이다. 다른 구현예에서, 대상체는 탈모증을 앓고 있는 대상체이다. 다른 구현예에서, 대상체는 과도한 경피 수분 손실을 나타내는 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 남성이다. 다른 구현예에서, 대상체는 여성이다. 특정의 구현예에서, 대상체는 노인 대상체, 예를 들어, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상, 80세 이상, 60-85세, 65-85세, 또는 70-85세의 대상체이거나, 소아 대상체, 예를 들어, 18세 이하, 15세 이하, 12세 이하, 10세 이하, 8세 이하, 6세 이하, 5세 이하, 4세 이하, 3세 이하, 또는 2세 이하, 또는 18, 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개월의 대상체이거나; 또는 성인 대상체, 예를 들어 연령 18-60, 18-55, 18-50, 20-60, 20-55, 20-50, 20-45, 20-40, 20-35, 20-30, 25-60, 30-60, 40-60, 또는 50-60세 성인 대상체이다. 다른 구현예에서, 대상체는 동물이다. 일부 구현예에서, 치료되는 동물은 가축 및 실험실 동물, 예를 들어, 비-포유동물 및 포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 설치류, 피그, 개, 및 고양이를 포함한다. 특정의 구현예에서, 대상체는 추가의 치료제 또는 세포와 함께 투여된다.
또한, 본원에서는, 본원에서 개시된 방법을 실행하는데 사용될 수 있는 시약이 포함된 키트 및 제조 물품이 개시된다. 키트 및 제조 물품은, ASC를 포함한, 어떠한 시약 또는 본원에서 논의된 시약의 조합물 또는 개시된 방법의 실행에서 필요하거나 유리한 것으로 이해될 수 있는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 키트 및 제조 물품은, 예를 들어, 본원에서 언급된 장애 또는 치료학적 처방증을 치료하기 위한, 라벨, 설명서, 및 포장 재료를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적, 이점, 및 신규한 특징은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 다음의 실시예의 시험 하에 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 추가로, 상기 설명되고 이하 청구의 범위에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 양태의 각각이 이하 실시예에서 실험적으로 지지된다.
실시예
상기 설명과 함께 특정의 구현예를 비-제한 양상(fashion)으로 예시하고 있는 이하 실시예를 이제 참조한다.
실시예 1: 유착 태반 세포의 배양 및 생산
90% 이상의 모체 조직-유래된 세포를 함유하는 태반 유래된 세포 집단을 본원에서 그 전체 내용이 참고로 통합되는 국제특허출원 WO 2016/098061호의 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
골형성 및 지방형성 분석을 앞선 문단에서 기재된 바와 같이 제조된 태반 세포 및 BM 유착 세포에 대해서 수행하였다. 골형성 분석에서, 50% 이상의 BM 세포가 골세포로 분화된 반면에, 태반-유래된 세포의 어느 것도 골형성 분화의 신호를 나타내지 않았다. 지방형성 분석에서, 50% 이상의 BM-유래된 세포가 지방세포로 분화되었다. 대조적으로, 태반-유래된 세포의 어느 것도 지방세포에 전형적인 형태학적 변화를 나타내지 않았다. 이들 실험은 본원에서 참고로 통합되는 WO 2016/098061호의 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.
실시예 2: 혈청-FREE 배지(SFM)에서의 태반 세포의 배양
방법
3 스테이지로 이루어진 세포 수거 및 팽창 후, 하류 저리 단계: 스테이지 1, 중간 세포 원액(ICS) 생산; 스테이지 2, ICS의 해동 및 초기 추가의 배양 단계; 및 스테이지 3, 혈청의 존재 하의 추가의 배양 단계. 하류 처리 단계는 플라스크 또는 생물 반응 장치/들로부터의 수거, 세포 농축, 세척, 제형화, 충전 및 냉동 보존을 포함하였다. 절차는, 모두 본원에서 참고로 통합되는 국제특허출원 공보 WO 2019/239295호에 기재된 바와 같이, 살균 및 오염에 대한 성장 배지의 주기적인 시험을 포함하였다. 골수 이동 분석을 또한 WO 2019/239295호에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
태반 세포를 추출하고, 혈청-비함유(SF) 배치(batch)에서 3 계대 동안 팽창시켰다. 8개의 배치의 세포 특성을 분석하였고, 표 1에 각각의 배치에 대해서 나타낸 바와 같이, 세포 크기 및 PDL(계대 1 이래로 집단 배증 수준)의 유사한 패턴을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 세포는 또한 골수 이동 (BMM) 분석에서 혈액 생성을 유의하게 향상시켰다.
[표 1] SF 배지에서 팽창된 태반 세포의 특성.
Figure pct00001
실시예 3: 골세포 및 지방세포 분화 분석
ASC를 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조하였다. BM 유착 세포를, 본원에서 그 전체 내용을 참고로 통합하는, Esther Lukasiewicz Hagai 및 Rachel Ofir의 WO 2016/098061호에 기재된 바와 같이 얻었다. 골형성 및 지방형성 분석을 WO 2016/098061호에 기재된 바와 같이 수행하였다.
골세포 유도 . 골형성 유도 배지에서의 BM 유래된 유착 세포의 인큐베이션은, 양성 알리자린 레드 염색(positive alizarin red staining)에 의해서 입증되는 바와 같이, BM 세포의 50% 이상의 분화를 생성시켰다. 이에 반하여, 태반-유래된 세포의 어느 것도 골형성 분화의 신호를 나타내지 않았다.
다음으로, 비타민 D 및 더 높은 농도의 덱사메타손을 포함하는 변형된 골형성 배지를 사용하였다. BM 세포의 50% 이상이 골세포로 분화된 반면에, 태반-유래된 세포의 어느 것도 골형성 분화의 신호를 나타내지 않았다.
지방세포 유도 . 지방세포 유도 배지에서의 태반- 또는 BM 유래된 유착 세포의 지방세포 분화는, 양성 오일 레드 염색(positive oil red staining)에 의해서 그리고 전형적인 형태학적 변화(예, 세포질에서의 오일 점적의 축적)에 의해서 입증되는 바와 같이, BM 세포의 50% 이상의 분화를 생성시켰다. 대조적으로, 태반-유래된 세포의 어느 것도 지방세포로 분화되지 않았다.
다음으로, 더 높은 인도메타신 농도를 함유하는 변형된 배지를 사용하였다. BM 세포의 50% 이상이 지방세포로 분화되었다. 대조적으로, 태반-유래된 세포의 어느 것도 지방세포에 전형적인 형태학적 변화를 나타내지 않았다.
실시예 4: 추가의 골세포 및 지방세포 분화 분석
ASC를 실시예 2에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 지방형성 및 골형성을 각각 STEMPRO® 지방형성 분화 키트(GIBCO, Cat# A1007001) 및 STEMPRO® 골형성 분화 키트(GIBCO, Cat# A1007201)를 사용하여 분석하였다.
결과
SRM 또는 완전 DMEM에서 성장한 태반 세포의 지방형성 및 골형성을 시험하였다. 실험군을 표 2에 나타낸다.
[표 2] 실험군
Figure pct00002
지방형성 분석에서, 분화 배지로 처리된 BM-MSC를 오일 레드 O(Oil Red O)로 양성으로 염색시켰다(도 2). 대조적으로, SRM 배치이 2/3은 무시할만한 염색을 나타냈고, 다른 SRM 배치, 뿐만 아니라, 완전 DMEM-성장 세포는 어떠한 염색을 전혀 나타내지 않아서, 이들이 유의한 지방형성 가능성이 결여되었음을 나타냈다.
골형성 분석에서, 분화 배지로 처리된 BM-MSC를 알리자린 레드 S로 양성으로 염색시켰다(도 3). 대조적으로, SRM 또는 완전 DMEM에서 성장한 태반 세포 배치의 어느 것도 염색을 나타내지 않아, 유의한 골형성 가능성이 결여됨을 나타냈다.
실시예 5: 태반 ASC에 의해서 분비된 인자의 연구
하루에 한번 배지를 변경시키면서, 6-일 생물 반응 장치 인큐베이션; 또는 플레이트에서의 2-일 인큐베이션 후에, CM을 모체 ASC, 혈청-함유 배지에서 팽창된 태아 ASC, 및 SFM에서 팽창된 태아 ASC의 각각의 두 배치로부터 제조하였다.
분비된 단백질 발현을 Luminex®에 의해서 측정하였다. 콜라겐 1-알파는 모든 샘플에서 고도로 발현되었다. IL-1-ra, 콜라겐 IV-1a, 피브로넥틴, IL-13, HGF, VEGF-A, IL-4, PDGF-AA, TIMP-1, TGFb2, TGFb1은 적어도 일부 샘플에서 모두 유의하게 발현된 반면에, IL-16은 무시할만한 수준으로 발현되거나 발현되지 않았다(도 5a 내지 도 5j 및 표 3 및 표 4).
[표 3] 생물 반응 장치 배지에서 나타낸 단백질의 단백질 발현을 요약함. -, +, ++, 및 +++는 각각 < 10, 10-100, 100-1000, 및 >1000 pg/ml을 나타냄.
요약
Figure pct00003
질량 분광분석을 생물 반응 장치 인큐베이션으로부터의 태아/태반 ASC-CM에 대해서 수행하였고, 인간 기원의 트립신 펩티드를 이들의 서열에 의해서 확인하였다. 펩티드를 표 4에 나타낸다.
[표 4] 태반 ASC-CM로부터의 트립신 펩티드. "HS"는 호모 사피엔스를 나타냄.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 6: 태반 ASC의 농도, 동결건조, 및 단백질 어레이 연구
앞선 실시예로부터의 CM을 비처리(BR), 10KDa 컷오프 막(TFF; Pall Corporation)을 통한 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration), 또는 동결건조(LYP)에 가하였다. 표 5 내지 6은 TFF 및 LYP로부터의 농도 데이터를 나타내고 있다.
[표 5] 출발 샘플 부피 및 TFF에 대한 농도 인자
Figure pct00011
[표 6] 출발 샘플 단백질 농도 및 LYP에 대한 농도 인자.
Figure pct00012
[표 7] 농축 공정과 함께 또는 공정 없이 태아/SF 배치에서의 발현 수준 (pg/ml)의 요약. +++는 키트 검출 한계를 넘어선 값을 나타냄.
Figure pct00013
실시예 7: 태반 ASC에 의한 전-혈관 형성 인자의 분비
모체 태반 ASC를 정상 또는 저산소 조건 하에 인큐베이션하고, 전-혈관 형성 인자의 분비를 Luminex®에 의해서 측정하였다. 많은 인자가 발현되었다(도 6a). 선택된 인자의 발현을 ELISA에 의해서 측정하였다(도 6b). 따라서, 태반 ASC는 전-혈관 형성 인자를 분비한다.
실시예 8: 태반 ASC-CM은 피부 섬유아세포의 증식을 증가시킴
HDFa(성인 일차 인간 피부 섬유아세포; ATCC cat. #PCS-201-012) 세포를 배양으로 팽창시키고, 인간 피부 내의 어린 및 늙은 섬유아세포 모델에 대해서, 상이한 스테이지에서, 즉, 배양 1, 10 및 22일(각각, 2.1, 8.6, 또는 12.3 집단 배증 [PD])에서 동결 보존하였다. 세포를 해동하고, (a) 재증류수(double-distilled water: DDW)(음성 대조군); 또는 (b) 태아 태반 ASCd로부터의 동결 건조되고 재현탁된(DDW로 30 mg./ml으로) CM (태반 ASC-CM)과 함께 X2 희석된 섬유 아세포 성장 배지(GM; ATCC로부터)에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다. ASC-CM은 모든 연령의 섬유 아세포의 증식을 자극하였다(도 7)
실시예 9: 태반 ASC-CM은 산화성 스트레스로부터 피부 섬유 아세포를 보호함
HDFa 세포를 200 마이크로몰(μM) 과산화수소(H2O2)에 3 시간 노출시키고, 이어서, (a) HDFa 완전 GM(ATCC cat. #. pcs-201-041)(음성 대조군); 또는 (b) HDFa 완전 GM에서 생산된 모체 태반 ASC-CM에서 확장된 상태에서 24 시간 동안 인큐베이션하였고, 그 후에, 세포 생존성을 RealTime-Glo™ MT 세포 생존성 분석 시약(Promega)을 사용하여 분석하였다. ASC-CM은 산화성 스트레스로 인한 사망으로부터 세포를 보호하였다(도 8).
실시예 10: 태반 ASC-CM은 피부 섬유아세포의 이동을 증가시킴
어린 또는 늙은 HDFa 세포(0 또는 7 PD)를 단일층으로 플레이팅하고, IncuCyte® 라이브-세포 분석 키트(Essen Bioscience)를 사용하여 분석하였다. 단일층을 WoundMaker™를 사용하여 스크래치시키고, 이어서, (a) 혈청-비함유(SF) DMEM(음성 대조군); 또는 (b) 동결 건조되고 SF-DMEM에 재현탄된 태아 태반 ASC-CM (생물 반응 장치 내에서 SFM에서 성장한 ASC로부터)에서 인큐베이션하였다. 창상 부위 내로의 세포 이동을 키트와 함께 제공된 카메라를 사용하여 분석하였다. ASC-CM은 어린 및 늙은 세포 둘 모두의 이동을 모든 시점에서 자극하였다(각각 도 9a 및 도 9b). SF-DMEM를 또한 직선형 태아 태반 ASC-CM(플레이트 내에서 SFM에서 성장한 ASC로부터)에 대항하여 플롯팅하였다. 또한, CM이 어린 및 늙은 세포의 이동을 모든 시점에서 자극하였다(각각 도 9c 및 도 9d).
실시예 11: 태반 ASC-CM은 진피 유두 세포의 증식을 증가시킴
일차 인간 모낭 진피 유두 세포(HFDPC)를 (a) DDW(음성 대조군); 또는 (b) 태아 태반 ASC로부터의 동결 건조되고 재현탁된(30 mg./ml.) CM(태반 ASC-CM)과 함께 X2로 희석된 완전 DMEM 성장 배지(GM)에서 96 시간 동안 배양으로 팽창시켰다. ASC-CM는 HFDPC의 증식을 자극하였다(도 10).
실시예 12: 태반 ASC로부터의 CM의 추가의 배양 연구
태아 및 모체 태반 ASC-CM을 상기 실시예에서 기재된 바와 같이 제조하고, 케라티노사이트와 함께 배양하였다. 세포에 의한 증식, 이동 및 성장 인자 생산을 문헌[Madaan A et al., Rajendran RL et al., Hwang I et al.,] 및 이에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이 분석하였다.
실시예 13: 태반 ASC의 생체내 혈류 연구
마우스를 대퇴골 동맥 결찰에 가하고, 다음날, 100만개의 태반 ASC를 투여하였다. ASC 투여가 혈류를 개선시켰고(도 11), 이는 도플러 레이저 영상화에 의해서 확인되었고, 이러한 투여는 또한 기능적 신생 혈관의 형성을 개선시켰다(도 11c).
실시예 14: 태반 ASC의 생체내 연구 또는 모발 재생을 위한 이로부터 유래돈 인자
인간 두피 피부 이식편을 문헌[Sintov A et al.]에 기재된 바와 같이 SCID 마우스 상에 이식하고, 비히클 (음성 대조군) 대 태반 ASC, ASC 용해물, ASC-CM, 용해물의 분획 또는 CM로 처리하였다. 조직학, 성장기/휴지기 비율(Anagen/Telogen ratio)(모발 사이클의 반영), Ki-67/TUNEL 염색(증식 및 세포자멸사(apoptosis)), 모발 계수, 모발 직경, 및 모발 길이가 수행/분석되었다. 향상된 모발 성장은 치료학적 효능의 지표이다.
실시예 15: 모발 재생에 대한 태반 ASC의 인간 시험
버거병(Buerger's disease) 및 치료에 불응성인 개방형 만성 창상(open, chronic wound)을 앓고 있는 환자에게 150 x 106 태반 ASC를 2회 투여하고, 감염된 사지에 근육 주사하였다. 창상은 유의하게 개선되었다. 추가로, 치료 전(도 12a) 및 후(도 12b)의 영향받은 발가락의 비교에 의해서 나타낸 바와 같이, 두꺼운 모발이 영향받은 다리의 발가락의 등쪽 표면 상에서 돋아났다. 다른 연구에서, 모발 성장이 세포 주사 부위에서 반복적으로 관찰되었다.
주사된 태반 ASC, 또는 국소 ASC에 의한 모발 복원의 위약-대조된 임상 I/II 연구를 안드로겐성 탈모증 환자에서 수행하였다. 모발 밀도, 직경 및 성장 속도가 분석되었다. 다른 실험에서, 태반 ASC, ASC 용해물, ASC-CM, 또는 분획을 유사하게 분석하였다.
실시예 16: 피부 장벽 재생에 대한 태반 ASC로부터의 CM의 인간 시험
인간 대상체를 전문적인 안면 처리 및 화학적 박리 후에 즉각적으로 처리하였다. 안면의 절반은 기본 크림(폐쇄성 피부연화제 및/또는 보습제 또는 회복성 모이스처라이저(moisturizer)를 함유함)을 함유하는 크림으로 처리하는 반면에, 다른 절반을 태반 ASC-CM로 보충된 기본 크림으로 처리하였다. 방벽 복원 및 피부 재생을 피부 케어 전문가에 의해서 며칠 후에 분석하였다. 다른 구현예에서, 태반 ASC, 용해물, 또는 분획을 사용하였다.
실시예 17: 건조 피부 치료에 대한 태반 ASC로부터의 CM의 인간 시험
과도하게 건조한 피부를 갖는 인간 대상체를 기본 크림 대 태반 ASC-CM로 보충된 크림으로 안면 분할 연구(split-face study)로 처리하였다. 1 개월 후에, 피부 보습을 경피 수분 손실(TEWL)을 측정함으로써 및 수분측정기 측정(Khazaka Electronic, Koln, Germany)에 의해서 분석하였다. 다른 구현예에서, 태반 ASC, 용해물, 또는 분획이 사용되었다.
실시예 18: 피부 광 손상 치료에 대한 태반 ASC로부터의 CM의 인간 시험
광 손상된 피부를 갖는 인간 대상체를 기본 크림 대 태반 ASC-CM로 보충된 크림으로 안면 분한 연구로 처리하였다. 1 개월 후에, 피부 보습을 TEWL을 측정함으로써 및 수분측정기 측정에 의해서 분석하였다. 다른 구현예에서, 태반 ASC, 용해물, 또는 분획이 사용되었다.
명확성을 위해서 별도의 구현예의 문맥에서 설명된 본 발명의 특정의 특징이 단일의 구현예에서 조합으로 제공될 수 있음이 인지될 것이다. 반면에, 간략성을 위해서, 단일의 구체에의 문맥에서 기재된 본 발명의 다양한 특징이 또한 별도로 또는 어떠한 적합한 서브 조합으로 제공될 수 있다.
비록, 본 발명이 이의 특정의 구현예와 함께 기재되었지만, 많은 대안, 변형 및 변경이 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 자명할 것임이 명확하다. 따라서, 청구의 범위 및 설명의 사상 및 광범위한 범위 내에 있는 대안, 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원 및 유전자은행 수탁 번호가, 마치 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원 또는 유전자은행 수탁 번호가 본원에 참고로 혼입되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본원에서 이들 전체가 참고로 명세서 내에 통합된다. 또한, 본원에서의 어떠한 참고문헌의 인용 또는 확인은 이러한 참고문헌이 본 발명의 종래 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
참고문헌(추가의 참고문헌이 명세서에서 인용될 수 있음)
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Claims (39)

  1. 대상체에서 피부 상태(skin condition)를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 방법으로서, (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(cultured placental adherent stromal cell; ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(conditioned medium; CM)를 포함하는 조성물을 투여하여, 피부 상태를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 방법.
  2. 대상체에서 피부 상태를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 조성물로서, (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM)를 포함하는, 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 손상된 피부 장벽(compromised skin barrier)인, 방법 또는 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 손상된 피부 장벽이 안면 치료, 레이저 치료, 미세침(micro-needling) 치료, 화학적 박피, 또는 메조테라피(mesotherapy)의 부작용인, 방법.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 여드름(acne)인, 방법 또는 조성물.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 주름, 피부 노화, 및 손상된 피부 탄력성으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 피부 열상(skin laceration)인, 방법 또는 조성물.
  8. 청구항 1 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 피부 상태가 과다색소침착 블레미쉬(hyperpigmentation blemish)인, 방법 또는 조성물.
  9. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 색소침착저하 블레미쉬(hypopigmentation blemish)인, 방법 또는 조성물.
  10. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 피부 건조인, 방법 또는 조성물.
  11. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 표피의 박화(thinning)인, 방법 또는 조성물.
  12. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 피부 상태가 탄력섬유증(elastosis)인, 방법 또는 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 화장용 세럼 제형(cosmetic serum formulation)인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 폼(foam)인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 크림인, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 주사용 조성물(injected composition)인, 방법 또는 조성물.
  17. 대상체에서 탈모를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 방법으로서, (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM)를 포함하는 조성물을 투여하여, 탈모를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 방법.
  18. 대상체에서 탈모를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 조성물로서, (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM)를 포함하는, 조성물.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    상기 조성물이 주사용으로 제형화되는, 방법 또는 조성물.
  20. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    상기 조성물이 국소 조성물인, 방법 또는 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 조성물이 크림인, 방법 또는 조성물.
  22. 청구항 20에 있어서,
    상기 조성물이 로션인, 방법 또는 조성물.
  23. 대상체의 피부 아래의 부피를 증가시키는 방법으로서, (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM)를 포함하는 충전제 조성물을 주사하여 피부 아래의 부피를 증가시킴을 포함하는, 방법.
  24. (a) 배양된 태반 유착 간질 세포(ASC); (b) 배양된 태반 ASC의 용해물; 또는 (c) 배양된 태반 ASC의 적응용 배지(CM)를 포함하는 충전제 조성물(filler composition).
  25. 청구항 23 또는 청구항 24에 있어서,
    상기 조성물이 주사용으로 제형화되는, 방법 또는 조성물.
  26. 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 배양된 태반 유착 간질 세포(cultured placental adherent stromal cell)를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 태반 유착 간질 세포가 살아있는 세포인, 충전제 조성물.
  28. 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 배양된 태반 ASC의 용해물을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  29. 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 배양된 태반 ASC의 CM을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 태반 ASC가 2D 기질 상에서 인큐베이션된(incubated), 방법 또는 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 태반 ASC가, 2D 기질 상에서 인큐베이션된 후에, 3D 기질 상에서 인큐베이션된, 방법 또는 조성물.
  32. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 태반 ASC가 3D 기질 상에서 인큐베이션된, 방법 또는 조성물.
  33. 청구항 1 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 태반 ASC가 생물 반응 장치(bioreactor)에서 인큐베이션된, 방법 또는 조성물.
  34. 청구항 1 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 태반 ASC가 상기 대상체에 대해서 동종이계(allogeneic)인, 방법 또는 조성물.
  35. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ASC가 CD73, CD90, CD29 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 마커(marker)를 발현하는, 방법 또는 조성물.
  36. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ASC가 CD3, CD4, CD11b, CD14, CD19, 및 CD34로 이루어진 군으로부터 선택된 마커(marker)를 발현하지 않는, 방법 또는 조성물.
  37. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ASC가 CD3, CD4, CD34, CD39, 및 CD106으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 발현하지 않는, 방법 또는 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 ASC의 50% 이하가 CD200을 발현하는, 방법 또는 조성물.
  39. 청구항 37에 있어서,
    상기 ASC의 50% 이상이 CD200을 발현하는, 방법 또는 조성물.
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