JP2018184446A - 皮膚美白またはしわ改善用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む脂肪細胞への分化誘導又は脂肪組織再生用組成物の提供。【解決手段】幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚美白、しわ改善、又は皮膚再生用化粧料組成物。前記エキソソームは幹細胞の細胞増殖、分化、再生に関連する遺伝子、タンパク質、成長因子などを含有しており、細胞由来の脂質伝達体であるため、皮膚美白、しわ改善、皮膚再生を含む機能性化粧品組成物、美容目的の傷跡の改善製剤などに適用できる。【選択図】図７

Description

本発明は、脂肪細胞への分化誘導物質を含有する幹細胞由来エキソソームを用いた、幹細胞から脂肪細胞への分化誘導および／または脂肪組織再生用組成物に関する。また、本発明は、幹細胞由来のエキソソームを含有する皮膚美白、しわ改善または再生用化粧料組成物に関する。

脂肪組織に対する再生治療方法で、脂肪組織をハイドロゲルで３次元培養した後、これを基質として培養された幹細胞と、この幹細胞から分泌される成長因子および細胞外基質を含む治療剤を用いることがあるが、これを注入型で使用するためには、培養容器から膜形態のハイドロゲルを除いて分解酵素処理しなければならない煩わしさがあった。これを克服するために、自家脂肪移植または直接幹細胞を移植する組織再生治療方法が開発された。

自家脂肪移植の場合、施術者の身体の一部を利用するため、拒否感もないばかりか、免疫反応が表れない。しかし、脂肪組織は、酸素依存性が高く、周囲に多くの血管を持ちながら、隣接する細胞と相互作用をするが、移植された脂肪は血管生成能力がほとんどないので、低酸素症により細胞死滅や細胞壊死が誘発され、生着率は高くなく、何回も施術を受けなければならないという欠点がある。

幹細胞は、以前から、施術や薬物治療で限界がある損傷した組織を復元するために多く利用されており、幹細胞移植のためにヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）のような生体高分子が使用される。幹細胞が脂肪細胞を含む様々な細胞に分化可能な分、適用分野が広いが、人体内に入ると生存率と生着率が低調なため効率が低下し、未分化幹細胞が腫瘍を形成しうる危険性が存在する。

現在、組織再生のために、一般的に幹細胞を脂肪細胞に分化させる方法は、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）またはイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）などの分化誘導物質を幹細胞に処理して、長期間培養するものである。しかし、前記のような幹細胞の分化誘導物質は、価格が高く、単一成分だけでは分化効果がなく、様々な物質を混合して処理しなければならない短所があり、細胞の分化効率が低いという問題点がある。

一方、従来は幹細胞を培養して得られた培養液を化粧料として使用した。一般的に、幹細胞を培養するためには、適量の抗生剤と血清が含まれた培養培地を使用する。現在、化粧品組成物として開発された幹細胞培養液は、ほとんど一般的な培養培地を使用しており（特許文献１）、リポソームに幹細胞培養液を包接させた化粧品組成物（特許文献２）、化粧品の原料として許容されない成分を除いて作製された培養培地を使用する化粧品組成物（特許文献３）、無血清培養液を含有する化粧品組成物（特許文献４）などが開発された。

培養培地は、細胞が増殖するためのタンパク質、アミノ酸、ホルモンおよび成長因子が含まれる物質で、非常に精巧に作られて供給されてきたが、細胞培養用培地、抗生剤、および血清のすべてが検証されていない危険性があるので、研究用にのみ使用しなければならず、人体には使用を禁止している。また、培養培地に含まれる塩化コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ヒポキサンチンナトリウム塩（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ− ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、プトレシンジヒドロクロリド（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、硝酸第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ ｎｉｔｒａｔｅ）、Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎ）などの成分は、化粧品原料として認可されないため、このような培養培地の利用は、化粧品組成物に適しない。このように培養液には、幹細胞が分泌する様々なタンパク質、サイトカイン、成長因子などが含有されているのに対し、細胞が成長して分泌された老廃物や汚染防止のために添加された抗生剤、また、動物由来の血清などの成分も含まれているため、皮膚に使用する場合、様々な危険にさらされる可能性が高い。

幹細胞培養液の皮膚吸収率を高めるために、脂質で構成されたリポソームに培養液を包接する技術もまた、化粧料として利用するには、培養液の成分に制限があり、リポソームに包接する過程の中で、培養液の成分の変質および汚染、リポソームに包接する別途の処理過程が必要である。

このような幹細胞培養液の欠点を補完するために、幹細胞由来エキソソームを分離して利用するための技術が開発されている。幹細胞は、一般的に抗生剤および血清が含有された培地で培養される。人間を含む多細胞生命体中に存在する様々な細胞から分泌される生体ナノ粒子は、その大きさと分泌機作の差異により、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）とマイクロベジクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）に区分することができる。エキソソームは多数の種類の細胞から分泌される膜構造の小胞体で、他の細胞および組織に結合して膜の構成要素、タンパク質、ＲＮＡを伝達するなど、さまざまな役割をするものと知られている。ほとんどのエキソソームを含む細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）は、細胞培養上清から得られるが、現在使用される幹細胞由来エキソソーム（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅ）分離方法では、エキソソームを含む細胞分泌物を分離する段階で培地（ｍｅｄｉｕｍ）や血清（ｓｅｒｕｍ）内のタンパク質による干渉により、完全な精製が難しいという問題点がある。

そこで、本発明者らは、幹細胞からエキソソームを分離し、分離したエキソソームの幹細胞分化、脂肪組織再生、美白効果、しわ改善効果、皮膚再生効果を確認して、本発明を完成した。

韓国登録特許第１２３７４３０号公報 韓国登録特許第１０４７８７３号公報 韓国登録特許第１４１３６８６号公報 韓国登録特許第１１０８８４７号公報

本発明の目的は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物を含む化粧料組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用培地組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物およびハイドロゲルを含む注射剤を提供することである。

本発明のさらなる目的は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物を提供することである。

本発明の一具体例は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物を提供する。

前記「脂肪細胞に分化されている幹細胞」とは、図１のように幹細胞が脂肪組織起源の幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＳＣｓ）から脂肪細胞へ分化中の幹細胞を意味する。これから、脂肪細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含有しているエキソソームを分離することができる。

具体的には、幹細胞が脂肪細胞に分化するとき、形態がはっきりと変わるが、このときエキソソームを分離するのである。したがって、通常の幹細胞からエキソソームを分離することとは異なると見ることができる。

本明細書で使用される用語、「エキソソーム」とは、様々な種類の細胞から分泌される膜構造の小胞体で、他の細胞および組織に結合して膜の構成要素、タンパク質、ＲＮＡを伝達するなど、様々な役割をすることが知られている。

前記エキソソームは、当業界に知られているエキソソーム分離方法を用いて製造することができ、例えば、
１）幹細胞を培養培地に培養した後、無血清および無抗生剤培地で継代培養する段階；
２）細胞培養上清を回収する段階；
３）回収した細胞培養上清を遠心分離する段階；および
４）エキソソームを分離および精製する段階；によって製造されうるが、これに限定されない。

前記脂肪細胞に分化されている幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞であってよく、ヒト由来または動物や植物由来の幹細胞でもあってもよいが、これに限定されない。

前記エキソソームは、前記脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇ、具体的には５〜１５０μｇ、より具体的には１０〜１５０μｇ、さらに具体的には２０〜１３０μｇ、さらに具体的には２０〜１００μｇの濃度で幹細胞に処理されうるが、これに限定されない。

本明細書で使用される用語、「脂肪細胞への分化誘導」とは、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）が脂肪細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）されるように誘導することを意味する。

本発明の一具体例による脂肪細胞から分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する組成物は、幹細胞を脂肪細胞に分化させることができる。したがって、前記組成物は、脂肪細胞への分化誘導用組成物として使用することができる。

本明細書で使用される用語、「脂肪組織の再生」とは、損傷した脂肪組織を復元したり、または不足する脂肪組織の生成を誘導して脂肪組織を再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）することを意味する。

また、本発明の一具体例による脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する組成物は、脂肪組織を再生することができる。したがって、前記組成物は、脂肪組織再生用組成物として使用することができる。

本発明の他の具体例による前記脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物は、薬学的組成物として使用することができる。具体的には、前記薬学的組成物は、全組成物１００重量部に対して０．００１〜１０重量部を含むことができる。

前記具体例による薬学的組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、たとえば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤なども使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。

前記具体例による薬学的組成物は、非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。

前記具体例による薬学的組成物の投与形態は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態でも使用することができ、また、単独で、または他の薬学的活性化合物と結合だけでなく、適切な集合で使用することができる。前記塩としては、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などを使用することができる。

前記具体例による薬学的組成物は、目的とするところにより、非経口投与や経口投与することができ、一日に体重１ｋｇあたり０．１〜５００ｍｇ、１〜１００ｍｇの量で投与されるように１〜数回に分けて投与することができる。特定患者への投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等により変化されてもよい。

前記具体例による薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液などを含む薬剤学的製剤に適したいかなる形態でも製剤化して使用することができる。

前記具体例による薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に非経口、経口などの多様な経路で投与することができ、投与のすべての方式は予想されうるが、好ましくは、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与することができる。

前記脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用薬学的組成物は、幹細胞を脂肪細胞に分化させるためにインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デヒドロエピアンドロステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＥＡ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）およびイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）などの分化誘導物質をさらに含むことができるが、これに限定されない。

他の側面で、本発明の別の具体例は、前記脂肪細胞に分化される幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用化粧料組成物を提供する。前記化粧料組成物は、脂肪細胞への分化を誘導して脂肪組織の再生を促進することができる。

前記エキソソームは、前記化粧料組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇ、具体的には５〜１５０μｇ、より具体的には１０〜１５０μｇ、さらに具体的には２０〜１３０μｇ、さらに具体的には２０〜１００μｇの濃度で化粧料組成物に含むことができるが、これに限定されない。

前記具体例による化粧料組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞または化粧品に通常使用される任意の他の成分のような化粧品学または皮膚科学の分野で通常使用される補助剤を含有することができる。前記補助剤は、化粧品学または皮膚科学の分野で一般的に使用される量で導入される。

前記具体例による化粧料組成物の外形は、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有する。これは、局所適用に適したすべての剤形で、例えば、溶液、ゲル、固体、練った無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球または、イオン型（リポソーム）および非イオン型の小胞分散剤の形態で提供されてもよく、これら組成物は、当該分野の通常の方法によって製造することができる。

前記具体例による化粧料組成物は、マイクロニードルなどを用いて、皮膚の内部に吸収される形態で適用されることが望ましいが、これに限定されない。

前記脂肪細胞に分化される幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用化粧料組成物は、幹細胞を脂肪細胞に分化させるためにインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デヒドロエピアンドロステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＥＡ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）およびイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）などの分化誘導物質をさらに含むことができるが、必ずしもこれに限定されない。

本発明の別の具体例では、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有し、幹細胞を脂肪細胞に分化するように誘導する幹細胞分化用培地組成物を提供する。

前記エキソソームは、前記幹細胞の分化用培地組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇ、具体的には５〜１５０μｇ、より具体的には１０〜１５０μｇ、さらに具体的には２０〜１３０μｇ、さらに具体的には２０〜１００μｇの濃度で、前記幹細胞分化用培地組成物に含まれてもよいが、これに限定されない。

前記幹細胞分化用培地組成物は、幹細胞培養培地をさらに含むことができるが、必ずしもこれに限定されない。

前記幹細胞分化用培地組成物は、幹細胞を脂肪細胞に分化させるためにインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デヒドロエピアンドロステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＥＡ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）およびイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）などの分化誘導物質をさらに含むことができるが、これに限定されない。

本発明の別の具体例は、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物；およびハイドロゲルを含む注射剤を提供する。

前記エキソソームは、前記注射剤１ｍＬあたり１〜１５０μｇ、具体的には５〜１５０μｇ、より具体的には１０〜１５０μｇ、さらに具体的には２０〜１３０μｇ、さらに具体的には２０〜１００μｇの濃度で注射剤に含まれてもよいが、これに限定されない。

前記ハイドロゲルは、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、フィブリン、エラスチン、ヒアルロン酸、コラーゲン、メチルセルロースなどの１つ以上のハイドロゲルであってもよく、コラーゲンおよびメチルセルロースのハイドロゲルであってもよいが、これに限定されない。

前記注射剤は、脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用注射剤であってもよいが、これに限定されない。つまり、本発明の注射剤を動物に注射する方法で投与する場合、脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織の再生効果が表れうる。

本発明の一実施例では、前記ハイドロゲルは、コラーゲン溶液にメチルセルロース粉末を添加して製造した。具体的には、０．０２Ｎ酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したコラーゲン溶液に、メチルセルロースの最終濃度が６重量％となるようにメチルセルロース粉末を添加した後、４℃で１時間撹拌してコラーゲンおよびメチルセルロースのハイドロゲルを製造した。

本発明の一実施例では、前記注射剤は、コラーゲンおよびメチルセルロースのハイドロゲル（コラーゲン／メチルセルロースハイドロゲル）に脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを担持して製造した。具体的には、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるようにハイドロゲルに担持した後、ピペッティングによりハイドロゲル中に分散させた。

前記具体例による注射剤は、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与することができる。

本発明の一実施例では、増殖する幹細胞由来のエキソソームに比べて、本発明による脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームは、脂肪細胞への分化に影響を与える生体活性因子の発現率に優れていた（図４および５）。

本発明の他の実施例では、幹細胞を脂肪細胞に分化させる実験で、本発明による脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム、および対照群として増殖する幹細胞由来のエキソソーム添加時、本発明によるエキソソーム処理の際には７日目に、分化培地で培養された幹細胞と同様のレベルで脂肪細胞が分化され、これにより、オイルが生成されたことが確認できた。しかし、増殖する幹細胞由来のエキソソームを処理した幹細胞の場合、脂肪細胞に分化されず、増殖のみ行われることを確認した（図６および７）。

本発明の別の実施例では、本発明による脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームをコラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルに担持した注射剤は、増殖する幹細胞由来のエキソソームを担持した注射剤よりも脂肪組織の再生効果が優れていた（図９および１０）
前記具体例による幹細胞の分化および脂肪組織再生用組成物は、脂肪細胞の分化に関連する脂肪細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含有しているエキソソームを含む。これにより、分化のための複雑かつ多様な成長因子を追加しなくてもよいので、幹細胞の分化に効果的に応用が可能である。本発明の脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームにより、幹細胞が脂肪細胞に分化されて生体内に適用されるとき脂肪組織の再生に有利な効果が発揮される。本発明の脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームは、細胞由来物質として生体適合して、既存の細胞治療剤の副作用を最小化することができ、エキソソーム自体がキャリアの役割をすることができ、これに担持した成分を人体に容易に適用することができるので、幹細胞の分化誘導剤、組織再生用注射剤、美容目的のフィラー、組織工学用製剤などに適用することができる。

本発明の別の具体例は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する化粧料組成物、より具体的には、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚美白、しわ改善または再生用化粧料組成物を提供する。

幹細胞から無血清、無抗生剤培地で分離されたエキソソームは、コラーゲンを含む細胞外基質誘導体および皮膚再生に有効な成長因子を含有しており、皮膚改善に効果的に応用することができる。

前記具体例では、「幹細胞」とは、増殖する幹細胞を意味する。これから、幹細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含有しているエキソソームを分離することができる。

前記幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞であってもよく、ヒト由来または動物や植物由来の幹細胞であってもよく、例えば、ヒト脂肪由来幹細胞であってもよいが、これに限定されない。

本明細書で使用される用語、「ヒト脂肪由来幹細胞」とは、ヒトの脂肪細胞から由来された幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を意味する。これから、脂肪細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含有しているエキソソームを分離することができる。

前記エキソソームの分離方法は、当該技術分野で公知となった方法を用いることができ、これに限定されないが、本発明の一実施例では、エキソソームは、ヒト脂肪由来幹細胞を継代培養する過程で分離した。具体的には、ヒト脂肪由来幹細胞（継代３〜７）を、通常の培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養した後、エキソソームを分離する２４時間前に、無血清、無抗生剤培地でありながら、フェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）のないＤＭＥＭ培地に交換し、２４時間維持した。２４時間後、細胞培養上清を回収した。回収した細胞培養上清は、３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、その後、２，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞の分泌物を除去した。その後、分子量３，０００のフィルターが装着された遠心分離チューブを用いて、５０００ｘｇで６０分間遠心分離をして濃縮した。濃縮後、得られた上清は、エキソソーム分離試薬と１：０．５の割合で混合し、４℃で１日保管した。１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離によりエキソソーム沈殿物を得た後、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄したエキソソーム沈殿物は、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離した後、ＰＢＳに再懸濁した（図１１）。上清を回収した後、再び通常の培養培地を幹細胞に添加して培養し、このような過程は、幹細胞の継代７まで繰り返した。このように幹細胞を継代７まで増殖させる過程で分離したエキソソームを用いて、化粧料組成物を製造した。

前記エキソソームは、皮膚美白、しわ改善または再生用化粧料組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇ、具体的には５〜１５０μｇ、より具体的には１０〜１５０μｇ、さらに具体的には２０〜１３０μｇ、さらに具体的には２０〜１００μｇの濃度で含有されてもよいが、これに限定されない。

本発明の一実施例では、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを１０、３０または５０μｇ／ｍＬの濃度で処理した結果、ヒト皮膚線維芽細胞の傷回復力に優れ（図１８）、コラーゲン合成率に優れ（図１９）、メラニン合成が減少することを確認した（図２０）。

前記エキソソームは、リポソームに包接させてエキソソームが包接されたリポソームの形態で化粧料組成物に含有されてもよいが、これに限定されず、化粧料組成物として使用するのに適切な形態であれば、どのような形態であっても可能であり、リポソームに包接されず、エキソソーム自体を使用することが可能である。

前記エキソソームは、エキソソームが包接されたリポソームの形態で使用される場合、リポソームの全体重量に対して０．１〜１０．０重量％で含有されてもよく、より具体的には０．１〜１．０重量％で含有されてもよいが、これに限定されない。

前記エキソソームが包接されたリポソームは、全体化粧料組成物の総重量に対して、０．００１〜１０．０重量％で含有されてもよく、具体的には０．００１〜１．０重量％で含有されてもよく、より具体的には０．０１〜１．０重量％で含有されてもよく、さらに具体的に０．０１〜０．１重量％で含有されてもよいが、これに限定されない。

本発明の一実施例では、常温（１５℃）で幹細胞由来のエキソソーム０．０１重量％が含まれた水相にレシチン３重量％を分散させた後、超臨界二酸化炭素を用いて、逆ミセル（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅ）エマルジョン（水相／低温工程二酸化炭素）を形成させた。次に、前記反応を中止し、超臨界二酸化炭素を減圧気化させて超臨界二酸化炭素相を除去し、エキソソームが包接された低温工程リポソーム懸濁液を得た。このように製造されたエキソソームが包接されたリポソームを全体化粧料組成物の総重量に対して５重量％含有されるようにして化粧料組成物を製造した。

前記具体例によるエキソソームは、ヒト脂肪由来幹細胞の培養過程で得られた培養液を用いるという点では、従来技術と類似するが、培養液をそのまま使用せず、培養液中に存在するナノベシクル形態のエキソソームを分離、精製して化粧料として使用するという点で差別性がある。幹細胞エキソソームを分離、精製する場合、エキソソームに担持された再生関連タンパク質、コラーゲン誘導体、および様々な成長因子のみを有効に使用することができるため、抗生剤および血清を含む培地成分によって引き起こされる問題を解決することができる。

前記具体例によるエキソソームは、幹細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子が担持されただけでなく、エキソソーム自体がキャリアの役割まですることができる。約５０〜１５０ｎｍサイズの脂質からなるエキソソームは、細胞由来の物質であるため生体適合し、細胞の吸収率も非常に良い。したがって、従来の技術のように培養液をリポソームに包接する別途の過程が必要でなく、皮膚に容易に適用することができるという利点がある。

また、前記具体例による幹細胞由来のエキソソームを含有する化粧料組成物は、傷跡改善製剤として用いることができる。幹細胞由来エキソソームは、細胞増殖および分化、皮膚再生を誘導するタンパク質と成長因子が含有されているので、傷跡およびニキビ跡に適用して傷を緩和させることができる。したがって、傷跡の改善製剤に用いられる場合、幹細胞由来のエキソソームが含まれたスプレー、ジェルタイプの軟膏、パッチなどの形態で適用が可能である。

また、本発明の他の具体例は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する薬学的組成物、より具体的には、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚再生用薬学的組成物を提供する。したがって、本発明の一具体例による幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚再生用化粧料組成物は、薬学的組成物としても使用することができる。

前記幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞であってもよく、ヒト由来または動物や植物由来の幹細胞であってもよく、例えば、ヒト脂肪由来幹細胞であってもよいが、これに限定されない。

本発明の一実施例では、増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）のサイズを確認した結果、そのサイズが約６９ｎｍで、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；Ｋ−ＥＸＯ）またはヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；Ｆ−ＥＸＯ）より小さいことを確認することができる（図１３）。

本発明の他の実施例では、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ、Ｋ−ＥＸＯ、Ｆ−ＥＸＯ内に存在するシワ改善、美白、皮膚再生に関連する生体活性因子を比較分析した結果、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯはコラーゲンの合成を促進し、分解を抑制するメカニズムに関する単核細胞化学誘引物質タンパク質−１，−３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＣＰ−１，−３）、ケモカインリガンド５（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ５、ＣＣＬ−５）、コラゲナーゼ阻害剤（ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１、ＴＩＭＰ−１）、美白に関するインターロイキン−６，−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ−６，−８）、皮膚再生および血管生成と関連する肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子抑制剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１、ＰＡＩ−１）、アンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）がＫ−ＥＸＯおよび／またはＦ−ＥＸＯに比べて過発現されることを確認した（図１５〜１７）。

本発明の別の実施例では、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯのヒト皮膚線維芽細胞の傷（ｗｏｕｎｄ）回復効果を確認した結果、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯは１０、３０、５０μｇ／ｍＬの濃度で処理したときに、Ｋ−ＥＸＯまたはＦ−ＥＸＯに比べて、皮膚線維芽細胞の移動効果に優れ、傷回復効果に優れていることが確認できた（図１８）。

本発明の別の実施例では、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯのシワ改善効果を確認した結果、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯの処理濃度が増加するにつれて、コラーゲンの合成も増加し、特に５０μｇ／ｍＬでＫ−ＥＸＯまたはＦ−ＥＸＯより非常に優れたコラーゲン合成率を示したので、シワ改善効果に優れていることが確認できた（図１９）。

本発明の別の実施例では、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯのメラニン生成抑制効果を確認した結果、マウスメラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ）にＳｔｅｍ−ＥＸＯを１０、３０、５０μｇ／ｍＬの濃度で処理したとき、すべての濃度でメラニン合成が減少したことを確認したので、美白効果に非常に優れていることが確認できた（図２０）。

本発明の具体例によるエキソソームは、脂肪細胞への分化に影響を与える生体活性因子の発現率に優れており、幹細胞を脂肪細胞に分化させる効果がある。これにより、本発明は、幹細胞の分化誘導剤、組織再生用注射剤、美容目的のフィラー、組織工学用製剤などに適用することができる。また、本発明の具体例によるエキソソームは、幹細胞が増殖する過程で分泌されるエキソソームで、幹細胞の細胞増殖、分化、再生に関連する遺伝子、タンパク質、成長因子などを含有しているので、細胞の活性化剤や成長因子のような他の添加物がなくても、皮膚再生を誘導することができる。また、抗生剤や血清、培養液の有害因子が含まれない精製された成分であるため、培養液化粧品の問題点を克服することができ、細胞由来の脂質伝達体であるため、細胞浸透および有効因子伝達効率が非常に優れている。これにより、本発明は、皮膚美白、シワ改善、または皮膚再生を含む機能性化粧品組成物、美容目的の傷跡改善製剤などに適用が可能である。

脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームとその応用に対する模式図である。 脂肪細胞に分化されている幹細胞からエキソソームを分離する方法に対する模式図である。 脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームの特性に対する図であり、エキソソームの構造および形状（透過電子顕微鏡、ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）である。 脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームの特性に対する図であり、ｂ：エキソソームのサイズ（ナノ粒子分析器、ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）である。 脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームの特性に対する図であり、エキソソーム膜表面マーカー（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）である。 マイクロアレイによるエキソソーム内の脂肪関連生体活性因子を示した図であり、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）である。 マイクロアレイによるエキソソーム内の脂肪関連生体活性因子を示した図であり、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）である。 マイクロアレイによるエキソソーム内の脂肪関連生体活性因子を示した図であり、アディポカインアレイマップ（Ａｄｉｐｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ ｍａｐ）である。 脂肪細胞への分化に影響を与える因子の発現率を示した図であり、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）である。 ヒト脂肪由来幹細胞を脂肪細胞に分化誘導した結果であり、Ａ：ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣｓ）、Ｂ：陽性対照群（ＤＭ）、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）である。 脂肪細胞に分化誘導された幹細胞をオイルレッドＯ染色（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）した結果であり、Ａ：ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣｓ）、Ｂ：陽性対照群（ＤＭ）、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ −ＥＸＯ）、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）である。 コラーゲンとメチルセルロースを混合したハイドロゲルにエキソソームを担持してヌードマウスの皮下に注入し、３週間脂肪組織の生成を誘導した結果であり、Ａ：コラーゲン／メチルセルロースハイドロゲル（Ｇｅｌ）、Ｂ：増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）を担持したハイドロゲル、Ｃ：脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）を担持したハイドロゲルである。 ヌードマウスの皮下に注入した、一般ゲル、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）が担持されたゲル、および脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）が担持されたゲルをそれぞれヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）した結果であり、Ａ、Ｃ、Ｅ：４０倍率；Ｂ、Ｄ、Ｆ：１００倍率である。 ヌードマウスの皮下に注入した、一般ゲル、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）が担持されたゲル、および脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）が担持されたゲルをそれぞれオイルレッドＯ染色（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）した結果である。 増殖するヒト脂肪由来幹細胞からエキソソームを分離する方法に対する模式図である。 ヒト脂肪由来幹細胞（Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ヒト皮膚角質細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）およびヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を顕微鏡で観察した画像である。 ヒト脂肪由来幹細胞（Ｓｔｅｍ−Ｅｘｏ）由来のエキソソーム特性に対する図であり、エキソソームの構造および形状（透過電子顕微鏡、ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、エキソソームのサイズ（ナノ粒子分析器、ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）をそれぞれ示した（Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓはそれぞれ５０ｎｍ（ｂｌａｃｋ）、１００ｎｍ（ｗｈｉｔｅ）を示す）。 ヒト皮膚角質細胞（Ｋ−Ｅｘｏ）由来のエキソソーム特性に対する図であり、エキソソームの構造および形状（透過電子顕微鏡、ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、エキソソームのサイズ（ナノ粒子分析器、ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）をそれぞれ示した（Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓはそれぞれ５０ｎｍ（ｂｌａｃｋ）、１００ｎｍ（ｗｈｉｔｅ）を示す）。 ヒト皮膚線維芽細胞（Ｆ−Ｅｘｏ）由来のエキソソーム特性に対する図であり、エキソソームの構造および形状（透過電子顕微鏡、ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、エキソソームのサイズ（ナノ粒子分析器、ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）をそれぞれ示した（Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓはそれぞれ５０ｎｍ（ｂｌａｃｋ）、２００ｎｍ（ｗｈｉｔｅ）を示す）。 マイクロアレイを用いて、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）内に含まれた生体活性因子の発現量を比較した図であり、マイクロアレイの表である。 マイクロアレイを用いて、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）内に含まれた生体活性因子の発現量を比較した図であり、マイクロアレイの結果である。 マイクロアレイを用いて、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）内に含まれた生体活性因子の発現量を比較した図であり、生体活性因子の相対的発現量を示すグラフである。 マイクロアレイを用いて、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）内に含まれた生体活性因子の発現量を比較した図であり、生体活性因子の相対的発現量を示すグラフである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＦＧＦ−６）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＭＣＰ−１）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＭＣＰ−３）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ））の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＣＣＬ−５）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子（ＴＩＭＰ−１）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の美白関連の生体活性因子（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の美白関連の生体活性因子（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の美白関連の生体活性因子（ＩＬ−６）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の美白関連の生体活性因子（ＩＬ−８）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（ＥＧＦ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（ＨＧＦ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（ＰＡＩ−１）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（ＶＥＧＦ）の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ））の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 マイクロアレイを用いて、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連の生体活性因子（アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１））の発現量を示した図であり、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）がヒト線維芽細胞の移動に及ぼす影響を示した図であり、ＧＭ：幹細胞培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）、ＳＦＭ：無血清培養培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）がヒト線維芽細胞の移動に及ぼす影響を示した図であり、ＧＭ：幹細胞培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）、ＳＦＭ：無血清培養培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）がヒト線維芽細胞のコラーゲン合成に及ぼす影響を示した図であり、ＳＦＭ：無血清培養培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。 ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）がマウスメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）細胞のメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）の合成に及ぼす影響を示した図であり、ＧＭ：幹細胞培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）、ＳＦＭ：無血清培養培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ：増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム、Ｋ−ＥＸＯ：ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム、Ｆ−ＥＸＯ：ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームである。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示するが、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範疇および技術思想の範囲内で様々な変更および修正が可能であることは、この技術分野の通常の技術者にとって明らかであり、このような変形および修正が添付された特許請求の範囲に属するのも当然のことである。

＜実施例１＞脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム
＜１−１＞エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分離
脂肪細胞に分化されている幹細胞からエキソソームを分離するために、幹細胞を分化培地で培養することにより、脂肪細胞への分化を誘導した。脂肪細胞への分化が行われることは、幹細胞が徐々に肥大しながら細胞質に脂肪滴（Ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）が生じることで確認された。分化されている幹細胞を無血清培地に交換し、４８時間維持した後、細胞培養上清を回収した。回収した細胞培養上清を３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、２，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞の分泌物を除去した。その後、分子量３，０００のフィルターが装着された遠心分離チューブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ＝３０００、ａｍｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）を用いて、５０００ｘｇで６０分間遠心分離をして濃縮した。濃縮後、得られた上清は、エキソソーム分離試薬（ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）と１：０．５の割合で混合し、４℃で１日保管した。その後、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離によりエキソソーム沈殿物を得た後、分子量３，０００のフィルター（Ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を介して濾過し、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄したエキソソーム沈殿物は、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離した後、リン酸緩衝食塩水に再懸濁した（図２）。

＜１−２＞エキソソームの顕微鏡分析
実施例１−１から分離したエキソソームを透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）とナノ粒子分析器（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いてサイズおよび形状を確認し、特定タンパク質を検出するウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を用いてエキソソーム表面タンパク質を確認した。

その結果、図３ａのように、分離されたエキソソームを透過電子顕微鏡で確認することができ、サイズは図３ｂから平均で約５０．７５〜５８．７７ｎｍであることを確認した。また、図３ｃに示すように、エキソソーム膜表面で発現されるエキソソーム特異的マーカーを抗体反応により確認した。

＜１−３＞エキソソーム内のタンパク質および脂肪細胞への分化に関連する生体活性因子分析
脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームおよび増殖する幹細胞由来のエキソソーム内に存在する脂肪関連の生体活性因子を分析するために、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を用いた。マイクロアレイは、抗原抗体反応を介して行われ、レーザースキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）により蛍光（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）の発現程度を測定した。

また、マイクロアレイ分析で、発現された因子の中で、脂肪細胞への分化に影響を与える生体活性因子であるマクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、アンジオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１、ＡＮＧＰＴ１）、脂肪細胞補体関連タンパク質３０（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ３０ ｋＤａ、Ａｃｒｐ３０）を確認し、これに対して脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームおよび増殖する幹細胞由来のエキソソームの相対的な発現量を比較した。

その結果、図４ａ〜４ｃおよび下記の表１のように、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）および脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）内に存在する脂肪関連生体活性因子の種類に差異が存在することを確認し、脂肪細胞への分化に影響を与える生体活性因子の発現率に著しい差異があることを確認した（図５）。

＜１−４＞エキソソームを用いた脂肪細胞への分化誘導
エキソソームを用いて、幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導するために、増殖する幹細胞培養培地由来のエキソソームおよび脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームのそれぞれを含む培地組成物を用いた。前記培地組成物は、エキソソーム３０、５０、１００μｇ／ｍＬの濃度を幹細胞培養培地に追加して使用した。前記培地組成物を、培養されたヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣｓ）にそれぞれ処理した後、前記培地組成物を３日に１回、１４日間交換した。陽性対照群は、５％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１μｇ／ｍＬインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）が含まれたＤＭＥＭ高濃度グルコース（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で培養された幹細胞を使用した。もう一つの陽性対照群は、増殖する幹細胞由来のエキソソームを処理した幹細胞を使用した。その後、１４日間、脂肪細胞への分化が誘導された幹細胞について顕微鏡とオイルレッドＯ染色（Ｏｉｌ−ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて、細胞形態および分化するかどうかを分析した。

その結果、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）を処理時７日目に陽性対照群（ＤＭ）と同様のレベルで脂肪細胞が分化され（図６）、これによりオイルが生成されたことが確認できた（図７）。しかし、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）を処理した幹細胞の場合、脂肪細胞に分化されず、増殖のみ行われることが確認された。

＜１−５＞脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを含む化粧料組成物
前記実施例１−１により脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームが包接されたリポソームを製造した。具体的には、常温（１５℃）でレシチン３重量％を、前記脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム０．０１重量％が含まれた水相に分散させた後、超臨界二酸化炭素を用いて、逆ミセル（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅ）エマルジョン（水相／低温工程二酸化炭素）を形成させた。次に前記反応を中止し、超臨界二酸化炭素を減圧気化させて超臨界二酸化炭素相を除去し、前記脂肪細胞に分化される幹細胞由来のエキソソームが包接された低温工程リポソーム懸濁液を得た。このとき、反応工程の温度は４℃以下で進行した。

前記エキソソームが包接されたリポソームを用いて、下記の表２に記載された組成で化粧料組成物を製造した。

＜１−６＞脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを用いた脂肪組織再生誘導
脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを生体内に注入した時の脂肪組織の再生効果を確認するために、増殖する幹細胞由来のエキソソームおよび脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームをそれぞれコラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルに担持した。

具体的には、前記ハイドロゲルは、コラーゲン溶液にメチルセルロース粉末を添加して、コラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルを製造した。つまり、０．０２Ｎ酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したコラーゲン溶液に、メチルセルロースの最終濃度が６重量％となるようにメチルセルロース粉末を添加した後、４℃で１時間攪拌して製造した。このように製造したコラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルに増殖する幹細胞由来のエキソソームまたは脂肪細胞に分化される幹細胞由来のエキソソームを担持した。具体的には、前記エキソソームを、コラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルに最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるように担持した後、ピペッティングによりハイドロゲル中に分散させた。そして、エキソソームが担持されたハイドロゲルをヌードマウスの皮下に注入した後、３週間観察した。陰性対照群は、エキソソームが含まれないハイドロゲル（Ｇｅｌ）を使用し、陽性対照群は、増殖する幹細胞由来のエキソソーム（ｈＡＳＣ−ＥＸＯ）を含むハイドロゲルを使用した（図８）。３週間後、移植されたハイドロゲルの内部に脂肪組織が再生したかどうかを確認するためにヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）とオイルレッドＯ染色（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施した。

その結果、陰性および陽性対照群に比べて脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソーム（Ｄ−ＥＸＯ）が含まれたゲルの中には大量のマウス細胞が流入されており（図９）、オイルが生成された脂肪細胞が多く観察された（図１０）。このような結果から、脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームまたは前記エキソソームを担持しているコラーゲン／メチルセルロースハイドロゲルは、脂肪組織の再生誘導効果に優れていることが確認できた。

＜実施例２＞増殖する幹細胞由来のエキソソーム
＜２−１＞ヒト脂肪由来幹細胞からエキソソームの分離
ヒト脂肪由来幹細胞を継代（ｐａｓｓａｇｅ）７まで増殖させる過程でエキソソームを分離した。つまり、増殖するヒト脂肪由来幹細胞からエキソソームを分離した。

具体的には、ヒト脂肪由来幹細胞（継代３〜７）を、通常の培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養した。次に、エキソソームを分離する２４時間前に無血清、無抗生剤培地でありながら、フェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）のないＤＭＥＭ培地に交換し、２４時間維持した。２４時間後、細胞培養上清を回収した。回収した細胞培養上清は、３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、その後、２，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞分泌物を除去した。その後、分子量３，０００のフィルターが装着された遠心分離チューブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ＝３０００、ａｍｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）を用いて、５０００ｘｇで６０分間遠心分離をして濃縮した。濃縮後、得られた上清は、エキソソーム分離試薬（ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）と１：０．５の割合で混合し、４℃で１日に保管した。１０，０００ｘｇで６０分間の遠心分離によりエキソソーム沈殿物を得た後、０．２２μｍフィルター（Ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を介して濾過し、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄したエキソソーム沈殿物は、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離した後、ＰＢＳに再懸濁した（図１１）。上清を回収した後、再び通常の培養培地を幹細胞に添加して培養し、このような過程は、幹細胞の継代７まで繰り返した。このように幹細胞を継代７まで増殖させる過程で分離したエキソソームを下記の実験で使用した。ヒト脂肪由来幹細胞エキソソームの効能を比較するために、ヒト皮膚角質細胞およびヒト皮膚線維芽細胞から前記方法により同じようにエキソソームを分離した（図１２）。

＜２−２＞エキソソームの顕微鏡分析
実施例２−１のヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−Ｅｘｏ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−Ｅｘｏ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−Ｅｘｏ）を透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）とナノ粒子分析器（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）とを使用してサイズおよび形状を確認した。

その結果、分離されたそれぞれのエキソソームの形状を透過電子顕微鏡で確認することができた。また、エキソソームのサイズは、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームが約６９ｎｍ、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソームが約７９．７ｎｍ、ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームが約９４．６ｎｍのサイズを有し、ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（Ｓｔｅｍ−Ｅｘｏ）のサイズが最も小さいことが確認できた（図１３ａ〜１３ｃ）。

＜２−３＞エキソソーム内のタンパク質およびシワ改善、美白、皮膚再生に関連する生体活性因子分析
ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）とヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）内に存在するシワ改善、美白、皮膚再生に関連する生体活性因子を比較分析するために、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を実施した。マイクロアレイ分析は、抗原抗体反応を介して行われ、レーザースキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）により蛍光（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）の発現程度を測定した。

マイクロアレイ分析を介してシワ改善に影響を与える９つの生体活性因子（ＰＤＦＧ−ＡＡ、ＰＤＧＧ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−６、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＣＬ− ５、ＴＩＭＰ−１）、４つの美白関連生体活性因子（ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８）、および６つの皮膚再生および血管生成関連生体活性因子（ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＡＩ−１、ＶＥＧＦ、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１））を確認し、これに対してそれぞれの生体活性因子のヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームおよびヒト皮膚角質細胞とヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソームにおける相対的な発現量を比較した（図１４）。図１４ｃおよび１４ｄのグラフは、生体活性因子の相対的発現量を示すものであり、横軸はヒト脂肪由来幹細胞のエキソソーム、縦軸はそれぞれ皮膚角質細胞および線維芽細胞のエキソソームを意味する。また、グラフの中間線を中心に上段の線と下段の線は、それぞれ１．５倍の基準の増加／減少を示す。図１５ａ〜１５ｉは、エキソソーム内のシワ改善効果に関連する生体活性因子を示し、図１６ａ〜１６ｄには、エキソソーム内の美白効果に関連する生体活性因子を示し、図１７ａ〜１７ｆには、エキソソーム内の皮膚再生および微小血管生成関連生体活性因子を示した。

その結果、図１５、１６および１７のように、増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）とヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）に存在する生体活性因子の種類に差が出ることを確認した。特に、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）は、コラーゲンの合成を促進し、分解を抑制するメカニズムに関する単核細胞化学誘引物質タンパク質−１、−３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＣＰ−１、−３）、ケモカインリガンド−５（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ５、ＣＣＬ−５）、コラゲナーゼ阻害剤（ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１、ＴＩＭＰ−１）、美白に関するインターロイキン−６，−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ−６，−８）、皮膚再生および血管生成と関連する肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子抑制剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１、ＰＡＩ−１）、アンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）がＫ−ＥＸＯおよび／またはＦ−ＥＸＯに比べて過発現されることを確認した（図１５、１６および１７）。

＜２−４＞ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを用いたヒト皮膚線維芽細胞の移動効果
ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームがヒト皮膚線維芽細胞の移動に及ぼす影響を調べるために、増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）とヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）をそれぞれ含む培地組成物を用いた。前記培地組成物は、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯは、１０、３０、５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ無血清培養培地に追加して準備し、Ｋ−ＥＸＯとＦ−ＥＸＯは、それぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ無血清培地に追加して準備した。陽性対照群として１０％の血清を含むＤＭＥＭ培地を使用し、陰性対照群としてＤＭＥＭ無血清培地を使用した。ヒト皮膚線維芽細胞は、緑色蛍光染色（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｙｅ）で標識した後、２４ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にそれぞれ１×１０^５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）で分注し、培養培地（ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で７２時間培養した。培養後、細胞が付着したプレート（ｐｌａｔｅ）の底の中心を滅菌されたピペットチップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）を用いて人為的に一定の間隔の傷（ｗｏｕｎｄ）をつくり、エキソソームが含まれた前記培地組成物のそれぞれを細胞に処理した。

その結果、２４時間が経過したときＳｔｅｍ−ＥＸＯが含まれた培地を処理した細胞が陰性対照群、Ｋ−ＥＸＯおよびＦ−ＥＸＯを処理した細胞より移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）される程度がさらに高くなることが確認でき、３０および５０μｇ／ｍＬのＳｔｅｍ−ＥＸＯが含まれた培地でその傾向がより顕著に現れることがわかった。４８時間後、１０、３０、５０μｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ−ＥＸＯが含まれた培地で移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が急速に進行し、Ｋ−ＥＸＯとＦ−ＥＸＯが含まれた培地に比べて傷（ｗｏｕｎｄ）の回復に良い効果を示した（図１８ａおよび１８ｂ）。

したがって、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−Ｅｘｏ）がＫ−ＥＸＯまたはＦ−ＥＸＯよりヒト皮膚線維芽細胞の移動効果に優れていることが確認できた。

＜２−５＞ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームのシワ改善効果
ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームがヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成に及ぼす影響を調べるために、増殖する幹細胞培養培地由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）またはヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）をそれぞれ含む培地組成物を用いた。前記培地組成物は、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯは、１０、３０、５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ無血清培養培地に追加して準備し、Ｋ−ＥＸＯとＦ−ＥＸＯは、それぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ無血清培地に追加して準備し、陰性対照群としてＤＭＥＭ無血清培地を使用した。ヒト皮膚線維芽細胞は、４８ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にそれぞれ５×１０^４細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）で分注し、培養培地（ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で７２時間培養した後、リン酸緩衝食塩水で細胞を洗浄し、エキソソームが含まれた前記培地組成物のそれぞれを細胞に処理した。

培養完了後、各ウェル（ｗｅｌｌ）の培養液は回収し、２５℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、続いて上清を取って水溶性コラーゲン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ）の抽出および定量に使用した。培養液を除去したプレートの各ウェル（ｗｅｌｌ）にＰＢＳを入れて洗浄した後、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）処理を介して細胞を底から分離させて細胞数を測定した。

水溶性コラーゲンの定量のためにＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイキット（Ｓｉｒｃｏｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、ＵＫ）を使用した。前記得られた上清は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）が混合されたＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）バッファーを処理して、４℃で１２時間以上維持させ、その後１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してコラーゲンを濃縮させた。上清を除去した後、提供されたコラーゲン吸着染料（ｓｉｒｃｏｌ ｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ）をコラーゲンペレットに１ｍＬ追加し、３０分間振とう培養した。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して吸着されない染料を除去し、ペレットを酸性塩バッファー（ａｃｉｄ ｓａｌｔ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した後、アルカリ試薬（ａｌｋａｌｉｒｅａｇｅｎｔ）を処理してコラーゲンに吸着された染料を溶かし出して５５５ｎｍの波長で吸光度を測定した。標準曲線の数式に吸光度を代入してＳｔｅｍ−ＥＸＯ、Ｋ−ＥＸＯ、Ｆ−ＥＸＯおよび陰性対照物質を添加したウェルの水溶性コラーゲンの量を計算した。補正されたコラーゲンの量を計算式に代入して合成率を計算した。

その結果、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ投与群の水溶性コラーゲン合成率は陰性対照群（０．１３８μｇ）と比較したとき、エキソソーム処理濃度に依存して増加し、特に５０μｇ／ｍＬのＳｔｅｍ−ＥＸＯ投与群の場合、コラーゲン合成量が２．５９μｇで、同じ量のＫ−ＥＸＯ（１．４μｇ）やＦ−ＥＸＯ（０．８μｇ）に比べて有意に増加した。

したがって、ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームは、皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成を促進させる効果があるものと判断される（図１９）。

＜２−６＞マウスメラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ）を用いたヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームのメラニン生成抑制効果
ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム（Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ）と対照群として、ヒト皮膚角質細胞由来のエキソソーム（Ｋ−ＥＸＯ）およびヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（Ｆ−ＥＸＯ）の美白効果をマウスメラノーマに対するメラニン生成抑制の程度により判断した。前記メラノーマ細胞は、マウス黒色腫に由来する細胞であり、メラニンという黒色色素を分泌する細胞である。メラノーマ細胞を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１×１０^５の濃度で分注して細胞を付着させた後、Ｓｔｅｍ−ＥＸＯ、Ｋ−ＥＸＯ、Ｆ−ＥＸＯがそれぞれ含有された培地で培養培地を交換し、３日間培養した。３日後、培地はすべて回収し、４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、４０５ｎｍで吸光度を測定し、細胞外に放出されたメラニンの量を計算した。プレート（Ｐｌａｔｅ）についている細胞は、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）処理をして取り除いた後、細胞数を測定し、その後遠心分離して細胞を回収した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、遠心分離して細胞ペレットを得、ここに１０％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている１Ｎ ＮａＯＨ（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）溶液を１ｍＬ添加して８０℃で２時間メラニンを溶かした後、９６ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に入れ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。測定された吸光度を用いてメラニンを定量し、試料のタンパク質濃度で正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）して合成されたメラニンの濃度を測定した。

ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを１０、３０、５０μｇ／ｍＬの濃度で前記メラノーマ細胞に処理した後、メラニン合成の程度を観察した結果、幹細胞由来のエキソソームは、すべての濃度でメラニン合成を減少させたことを確認した（図２０）。

＜２−７＞ヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを含む化粧料組成物
前記実施例２−１によって、増殖するヒト脂肪由来幹細胞由来のエキソソームが包接されたリポソームを製造した。

具体的には、常温（１５℃）でレシチン３重量％を、前記増殖する幹細胞由来のエキソソーム０．０１重量％が含まれた水相に分散させた後、超臨界二酸化炭素を用いて、逆ミセル（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅ）エマルジョン（水相／低温工程二酸化炭素）を形成させた。その後、前記反応を中止し、超臨界二酸化炭素を減圧気化させて超臨界二酸化炭素相を除去し、前記増殖する幹細胞由来のエキソソームが包接された低温工程リポソーム懸濁液を得た。このとき、反応工程の温度は４℃以下で進行した。

前記エキソソームが包接されたリポソームを用いて、下記の表３に記載された組成で化粧料組成物を製造した。

＜剤形例１＞柔軟化粧水（スキンローション）の製造
前記実施例２−７の方法で得られた、増殖する幹細胞由来のエキソソームが包接されたリポソームを用いて、下記の表４のような組成で柔軟化粧水（スキンローション）を製造した。

＜剤形例２＞栄養化粧水（ローション）の製造
前記実施例２−７の方法で得られた、増殖する幹細胞由来のエキソソームが包接されたリポソームを用いて、下記の表５のような組成で栄養化粧水（ローション）を製造した。

本発明は、以下のように構成することも可能である。
［１］脂肪細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物。
［２］前記脂肪細胞に分化されている幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞である、［１］に記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物。
［３］前記骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞は、ヒト、動物または植物由来の幹細胞である、［２］に記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物。
［４］前記エキソソームは、前記脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇの濃度で幹細胞に処理されるものである、［１］に記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物。
［５］［１］ないし［３］のいずれかに記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物を含む化粧料組成物。
［６］［１］ないし［３］のいずれかに記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物を含む脂肪細胞への分化誘導用培地組成物。
［７］［１］ないし［３］のいずれかに記載の脂肪細胞への分化誘導または脂肪組織再生用組成物；およびハイドロゲルを含む注射剤。
［８］幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
［９］前記幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞である、［８］に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
［１０］前記骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞は、ヒト、動物または植物由来の幹細胞である、［９］に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
［１１］前記エキソソームは、皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇの濃度で含有されるものである、［８］に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
［１２］前記化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼン、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ、およびスプレー剤から構成された群から選択されたいずれかの剤形である、［８］に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。

Claims (5)

1. 幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
2. 前記幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞である、請求項１に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
3. 前記骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞は、ヒト、動物または植物由来の幹細胞である、請求項２に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
4. 前記エキソソームは、皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物１ｍＬあたり１〜１５０μｇの濃度で含有されるものである、請求項１に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。
5. 前記化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼン、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ、およびスプレー剤から構成された群から選択されたいずれかの剤形である、請求項１に記載の皮膚美白、しわ改善、または皮膚再生用化粧料組成物。