CN110151679A - 一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用 - Google Patents

一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外泌体冻干粉，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。本发明所述脂肪来源间充质干细胞外泌体具有增加皮肤弹性，减轻皮肤细纹的作用，本发明所述外泌体冻干粉中含有脂肪来源间充质干细胞外泌体，并将外泌体制备成方便使用和保存的冻干粉，本发明还公开了所述外泌体冻干粉在抗衰老或去皱化妆品中的应用。

Description

一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种冻干粉及其制备方法和应用，具体涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用。
背景技术
外泌体(Exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。
皮肤衰老是人体衰老固有的生理机制和外界风吹日晒、环境污染等损害共同作用的结果。皮肤衰老通常体现在皮肤弹性降低和皮肤皱纹的产生，据报道，胶原蛋白和弹性蛋白的减少将导致皮肤弹性降低和皮肤皱纹产生，胶原蛋白和弹性蛋白受胶原蛋白酶和弹性蛋白酶调控，胶原蛋白酶和弹性蛋白酶能够引起胶原蛋白和弹性蛋白降解，从而导致胶原蛋白和弹性蛋白减少，导致皱纹产生，皮肤弹性减低。目前尚未有对脂肪来源间充质干细胞外泌体在皮肤抗衰老方面的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种外泌体冻干粉，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。
优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将脂肪组织分散于消化液中，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液离心处理，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，离心，取上清液，浓缩，加入外泌体提取剂，得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
所述脂肪组织来源于人或动物，所述外泌体提取试剂为Exoquick-TC(SBI)，也可以为其他品牌的外泌体提取试剂。所述脂肪来源间充质干细胞外泌体中具有CD9、CD63标志。
优选地，步骤(1)中，所述消化液为含有I型胶原酶的PBS缓冲液；所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2～0.4％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4～6倍，消化时间为45～90min。
优选地，步骤(2)中，所述离心的转速为1800～2200r/min，时间为3～5min。
优选地，步骤(3)中，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为48～72h。
优选地，步骤(3)中，加入外泌体提取剂后，在3～5℃下放置8～15h，然后离心，取沉淀，即所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
优选地，所述外泌体冻干粉还包含甘露醇和海藻糖，所述甘露醇在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为10～30％，所述海藻糖在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为10～30％。所述冻干粉中还可以添加其他成分，如透明质酸钠、寡肽-1、寡肽-3等。
优选地，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为40～80％。
本发明的目的还在于提供所述外泌体冻干粉的制备方法，所述外泌体冻干粉的制备方法为：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃下预冻12～15h后，置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥18～26h后取出，得所述外泌体冻干粉。
本发明的目的还在于提供所述外泌体冻干粉在抗衰老或去皱化妆品中的应用。所述化妆品可以为膏霜、水剂、乳剂等剂型。
本发明的目的还在于提供所述外泌体冻干粉作为抗衰老或去皱的用途。冻干粉可以作为涂敷物也可以用于肌注。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种外泌体冻干粉，本发明所述脂肪来源间充质干细胞外泌体具有增加皮肤弹性，减轻皮肤细纹的作用，本发明所述外泌体冻干粉中含有脂肪来源间充质干细胞外泌体，并将外泌体制备成方便使用和保存的冻干粉，本发明还提供了所述外泌体冻干粉在抗衰老或去皱化妆品中的应用。
附图说明
图1为弹性蛋白酶的活性测试结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明所述冻干粉的一种实施例，本实施例所述冻干粉包含以下重量百分含量的组分：脂肪来源间充质干细胞外泌体50％、甘露醇20％、海藻糖29.6％、透明质酸钠0.2％、寡肽-1 0.1％和水0.1％。
本实施例所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将人脂肪组织分散于含有I型胶原酶的PBS缓冲液消化液中，所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.3％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的5倍，消化时间为60min，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液在2000r/min离心处理4min，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为72h离心，取上清液，浓缩至体积缩小50％以上，加入外泌体提取剂Exoquick-TC(SBI)，外泌体提取剂的加入量为浓缩后的上清液的50％，即得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
本实施例所述外泌体冻干粉的制备方法为：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃下预冻12h后，置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥24h后取出，得所述外泌体冻干粉。
实施例2
本发明所述冻干粉的一种实施例，本实施例所述冻干粉包含以下重量百分含量的组分：脂肪来源间充质干细胞外泌体80％、甘露醇10％和海藻糖10％。
本实施例所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将人脂肪组织分散于含有I型胶原酶的PBS缓冲液消化液中，所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4倍，消化时间为90min，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液在1800r/min离心处理5min，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为72h离心，取上清液，浓缩至体积缩小50％以上，加入外泌体提取剂Exoquick-TC(SBI)，外泌体提取剂的加入量为浓缩后的上清液的50％，即得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
本实施例所述外泌体冻干粉的制备方法为：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃下预冻15h后，置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥26h后取出，得所述外泌体冻干粉。
实施例3
本发明所述冻干粉的一种实施例，本实施例所述冻干粉包含以下重量百分含量的组分：脂肪来源间充质干细胞外泌体40％、甘露醇30％和海藻糖30％。
本实施例所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将人脂肪组织分散于含有I型胶原酶的PBS缓冲液消化液中，所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4倍，消化时间为90min，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液在1800r/min离心处理5min，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为72h离心，取上清液，浓缩至体积缩小50％以上，加入外泌体提取剂Exoquick-TC(SBI)，外泌体提取剂的加入量为浓缩后的上清液的50％，即得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
本实施例所述外泌体冻干粉的制备方法为：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃下预冻15h后，置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥26h后取出，得所述外泌体冻干粉。
实施例4
一、弹性蛋白酶抑制活性
通过测量由胰弹性蛋白酶作用于底物N-琥珀酰-丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸-p-硝基苯胺产生的4-硝基苯胺(4-nitoanilide)肽段的量，利用分光光度法评估弹性蛋白酶的活性。N-琥珀酰-丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸-p-硝基苯胺西格玛)和其它用于测试的物质在37℃下温育，加入猪胰弹性蛋白酶启始反应。测定波长为410nm处的吸光度来测量被释放的游离4-硝基苯胺的量。0.2M的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液用作阴性对照。实施例1制得的脂肪来源间充质干细胞外泌体在分析基质中的最终浓度为0.05％、0.1％、0.3％、0.8％、1％和1.2％。测试结果见图1。从图1中弹性蛋白酶抑制百分比为相对阴性对照的百分比，从图1可以看出，脂肪来源间充质干细胞外泌体对弹性蛋白酶活性具有剂量依赖式抑制效果。
二、胶原蛋白酶抑制分析
胶原蛋白酶(酶EC 3.4.24.3，5μg)单独与脂肪来源间充质干细胞外泌体(1μg/mL和10μg/mL)分别一起加入到含有PZ肽(0.5mg)的0.1M的Tris缓冲液(pH＝7.4)中，使总体积为1.7ml，PZ肽是胶原蛋白酶的底物。混合物在37℃水浴中温育30min，然后加入1mL的25mM的柠檬酸溶液终止酶反应。加入5mL的乙酸乙酯混合后，利用紫外分光光度计在波长为320nm处测量有机层的吸光度。胶原蛋白酶抑制由以下公式计算：
胶原蛋白酶抑制百分比＝[(Ac－As)/Ac]×100，其中，Ac表示(含有胶原蛋白酶的对照的吸光度－不含胶原蛋白酶的对照的吸光度)，As表示(含有胶原蛋白酶的样品的吸光度－不含胶原蛋白酶的样品的吸光度)。
与对照相比，1μg/mL和10μg/mL的脂肪来源间充质干细胞外泌体的胶原蛋白酶抑制百分比分别为91.5％和86.2％，表现出胶原蛋白酶抑制活性。
由上弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的活性抑制测试结果可以得出，本发明制得的脂肪来源间充质干细胞外泌体对减少皮肤皱纹或细纹，对抗肌肤老化具有一定效果。
采用同样的测试方法，测试实施例1～3所述冻干粉对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的活性抑制效果，结果表明实施例1～3所述冻干粉均能保留对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶活性的抑制效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种外泌体冻干粉，其特征在于，包含脂肪来源间充质干细胞外泌体。
2.如权利要求1所述外泌体冻干粉，其特征在于，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将脂肪组织分散于消化液中，得到细胞悬浮液；
(2)将细胞悬浮液离心处理，弃去上清液，得脂肪干细胞；
(3)将脂肪干细胞接种至培养基进行扩增培养，离心，取上清液，浓缩，加入外泌体提取剂，得所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
3.如权利要求2所述外泌体冻干粉，其特征在于，步骤(1)中，所述消化液为含有I型胶原酶的PBS缓冲液；所述I型胶原酶的体积为脂肪组织体积的0.2～0.4％，所述PBS缓冲液的加入量为脂肪组织体积的4～6倍，消化时间为45～90min。
4.如权利要求2所述外泌体冻干粉，其特征在于，步骤(3)中，所述扩增培养的条件为：在温箱内，36～38℃条件下，5％CO2，培养基为含10％FBS的DMEM培养基，培养时间为48～72h。
5.如权利要求2所述外泌体冻干粉，其特征在于，步骤(3)中，加入外泌体提取剂后，在3～5℃下放置8～15h，然后离心，取沉淀，即所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。
6.如权利要求1所述外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体冻干粉还包含甘露醇和海藻糖；优选地，所述甘露醇在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为10～30％，所述海藻糖在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为10～30％。
7.如权利要求1所述外泌体冻干粉，其特征在于，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体在所述外泌体冻干粉中的重量百分含量为40～80％。
8.如权利要求1～7中任一项所述外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述外泌体冻干粉的制备方法为：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃下预冻12～15h后，置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥18～26h后取出，得所述外泌体冻干粉。
9.如权利要求1～7中任一项所述外泌体冻干粉在抗衰老或去皱化妆品中的应用。
10.如权利要求1～7中任一项所述外泌体冻干粉作为抗衰老或去皱的用途。
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