CN113171332A - 一种外泌体冻干粉、其制备方法及护肤品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外泌体冻干粉、其制备方法及护肤品，其中外泌体冻干粉由如下重量百分比的原料制成：脐带间充质干细胞外泌体40‑80％；甘露醇10‑30％；海藻糖10‑30％；透明质酸钠、寡肽‑1和寡肽‑3余量。制备方法是将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在‑80℃以下预冻12‑15h后，置于真置于真空度为<80mT的冻干机中，在‑50℃以下冷冻干燥26‑32h后得到。护肤品含有该外泌体冻干粉。该外泌体冻干粉能够在低温下运输，2‑8℃下可保存至少12个月，使用时使用溶媒溶解外泌体即可使用。

Description

一种外泌体冻干粉、其制备方法及护肤品

技术领域

本发明涉及干细胞加工及应用领域，具体涉及一种外泌体冻干粉、其制备方法及护肤品。

背景技术

皮肤是一个复杂的器官，具有重要的身体屏障功能，且很容易受到各种各样的伤害。皮肤的衰老主要有两大诱因：一是随着年龄增长所导致的内源性自然衰老；二是以紫外线伤害带来的光老化为主的各种外源性衰老，这些外源性衰老并不与年龄成正比。

人体表皮层厚度为50-120微米，表皮-真皮厚度为2-5毫米。人真皮成纤维细胞(HDFs)是皮肤真皮层中的主细胞群，它们的健康和活性关乎着皮肤健康和美丽。不管是内源性(如年龄增长)和外源性(如紫外线、不良饮食作息和情绪压力等)的诱因不仅会让成纤维细胞失去活性，逐渐老化，数量减少，导致皮肤胶原合成减少；还会通过基质降解金属蛋白酶(MMPs)加速真皮基质降解，逐渐失去产生胶原蛋白和更新细胞间基质的能力。

人的肌肤在年轻时，肌肤光滑饱满，吹弹可破，这是由于我们的肌肤细胞在我们年轻时能够不断进行细胞分裂并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，但是随着年龄的增加，我们肌肤细胞分裂再生与分泌能力减弱，肌肤中细胞老化同时细胞基质逐渐减少。至此肌肤细胞再生能力减弱，衰老细胞不能及时被新生细胞所取代，肌肤衰老从细胞组织学的角度开始出来，一些衰老问题，包括小细纹、色斑、肤色暗沉问题接踵而来。因此，在人体肌肤还未出现严重的衰老症状之前，使用含有干细胞外泌体的护肤品干预人体肌肤衰老来是一种十分重要的手段。细胞外泌体是细胞在生理活动过程中分泌出来的生理活性物质，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。外泌体对皮肤有如下作用，最终全面改善皮肤状态。1.促进基地细胞再生、修复；2.促进血管再生和修复；3.促进胶原蛋白分泌、重组。

目前市场有的外泌体冻干粉产品多采用脂肪间充质干细胞分泌的外泌体提取冻干而来。通常情况下，未经处理的外泌体放置在4℃环境下，其结构形态只能维持10天左右，所以需要在-80℃的条件下才能实现长期保存，但-80℃的保存条件需要昂贵的设备，且占用较大的空间，不方便运输，所以-80℃不是完美的外泌体长期保存的方法。

发明内容

有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种外泌体冻干粉、其制备方法及护肤品，该冻干粉能够在低温下运输，2-8℃下可保存至少12个月，使用时使用溶媒溶解外泌体即可使用。

所采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种外泌体冻干粉，其由如下重量百分比的原料制成：

脐带间充质干细胞外泌体 40-80％；

甘露醇 10-30％；

海藻糖 10-30％；

透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3余量。

进一步地，脐带间充质干细胞外泌体的含量为60-70％。

进一步地，甘露醇的含量为10-20％。

进一步地，海藻糖的含量为10-20％。

进一步地，脐带间充质干细胞外泌体采用如下方法制备：首先采用胶原酶-胰酶消化法培养脐带间充质干细胞，然后再进行脐带间充质干细胞外泌体的提取和纯化。

第二方面，本发明提供一种上述方案所述的外泌体冻干粉的制备方法，包括如下步骤：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃以下预冻12-15h后，置于真置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃以下冷冻干燥26-32h后得到外泌体冻干粉。

进一步地，将溶液在-80℃预冻12-15h后，置于真置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥26-32h。

第三方面，本发明提供一种外泌体冻干粉护肤品，其含有上述任一方案所述的外泌体冻干粉。

本发明的有益效果在于：

该外泌体冻干粉能够在低温下运输，2-8℃下可保存至少12个月，使用时使用溶媒溶解外泌体即可使用。

本发明采用冻干粉技术，能够长时间保持外泌体有效活性成分。外泌体经过真空冷冻干燥后，形成的外泌体冻干粉末，可以在4℃的条件下长期保存，且复溶后也能够保持原有的外泌体形态结构和生物活性，是一种非常实用的外泌体储存方法。

附图说明

下面对附图做简要说明：

图1为实施例1的粉末化的外泌体冻干粉复溶后做透射电镜图。

图2为图2为通过Western Blot测定，新鲜提取的(F)、-20℃冻存(-20℃)的和干燥复溶(L)的脐带充质干细胞外泌体粉末CD9和CD63的表达图。

图3为通过NTA测定，新鲜提取的外泌体粉末的外泌体颗粒数和粒径分布图。

图4为通过NTA测定，干燥复溶的外泌体冻干粉的外泌体颗粒数和粒径分布。

具体实施方式

下面对本发明进一步详细的阐述，旨在更好理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

本实施例的一种外泌体冻干粉，其由如下重量百分比的原料制成：

脐带间充质干细胞外泌体 60％；

甘露醇 15％；

海藻糖 15％；

透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3余量。

其中脐带间充质干细胞外泌体采用如下方法制备：首先采用胶原酶-胰酶消化法培养脐带间充质干细胞，然后再进行脐带间充质干细胞外泌体的提取和纯化。

具体的，包括如下步骤：

一、脐带间充质干细胞培养：

脐带间充质干细胞培养有组织贴壁法和胶原酶-胰酶消化法。本实施例采用胶原酶-胰酶消化法。

分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带，将其浸泡在LG-DMEM培养液(美国Gibico公司)中，4℃保存，超净台内取出脐带用PBS(赛尔斯生物技术有限公司)充分冲洗，去除脐带中残留血，将脐带剪碎放入到0.1％胶原酶IV(美国Gibico公司)中，在温度为37℃下进行30min消化，然后向其中加入体积分数10％FBS终止消化，将获得的细胞滤液进行离心，然后加入含有LG-DMEM培养液的T-25塑料的培养瓶中，培养三四天后更换培养液，向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度0.1％的胰酶在37℃的环境中继续搅拌消化30min，加入体积分数10％PBS终止消化，采用细胞筛过滤，含细胞的滤液进行离心，细胞接种在LG-DMEM培养基的T-25塑料培养瓶中，培养三四天后更换培养液，去除未贴壁细胞，之后每隔3d换液1次，直到细胞充分融合传代。

待细胞融合生长80％以上后，采用加入浓度为0.02％的EDTA消化，轻轻摇动培养皿，使得消化液能够覆盖全部细胞表面，除细胞培养液后再加上3-5mL消化液，在光学显微镜下观察间充质干细胞-脐带情况。

取培养第3代足月妊娠剖宫产健康胎儿间充质干细胞-脐带(融合度达到80％以上)放入75cm2塑料培养瓶中培养，去除培养液，加入5mL体积分数0.2％胰酶/0.2％EDTA，显微镜下观察细胞形态，待细胞多数变成圆形后加入终止消化液，10min离心，速度1000r/min，去除上层清夜，采用锥虫蓝染色法评估细胞活性，并进行细胞计数。向细胞中加入小鼠荧光流式细胞术标记的lgG1，调整细胞容积为200mL，流式细胞仪测定结果。间充质干细胞-脐带表型鉴定结果显示：流式细胞仪检测显示，两组CD13，CD29，CD44及CD105表达均为阳性。

二、脐带间充质干细胞外泌体提取：

样本准备：

1收集样品后置于冰上，2000g离心10min，以除去残留细胞；

2收集上清液，10000g离心10min，以除去细胞碎；

3收集上清液至于100KD的超滤管浓缩富集，可浓缩5-10倍。

4收集上清液提取Exosomes或4℃保存待用。注：如需进行下游核酸(DNA或RNA)相关实验，建议样品量不低于30ml。

Exosomes提取：

(1)转移上清液至新离心管中，加入体积比2∶1(V样∶VA＝2∶1)lsolation RegentA；

(2)颠倒混匀3-5次后于4℃静置5min，然后10000g离心2mi；取上清液转移置新的离心管中，加入体积比为1∶1的lsolation Regent B液；

(3)颠倒混匀3-5次后于4℃静置1h-2h，然后13500g离心30min，弃去上清液，收集沉淀，此沉淀即为外泌体；

(4)根据后续实验加入200-500ul PBS重悬沉淀物(或下游实验重悬液)，进行后续实验或-80摄氏度保存。

注意：1.建议起始样本量不低于30ml，原代细胞培养液可适当增加样本体积，对样品进行浓缩后再进行外泌体提取实验；

2.如对提取效率有要求，可适时延长(3)的离心时间10-30min。

三、脐带间充质干细胞外泌体纯化：

为了使用安全，外泌体纯化步骤，去除了微量的各种细胞碎片和细菌病毒颗粒等成分。

本实施例的外泌体冻干粉的制备方法，包括如下步骤：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃预冻12h后，置于真置于真空度为＜80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥26h后得到外泌体冻干粉。

实施例2

参照实施例1，与实施例1不同的是，本实施例是外泌体冻干粉，其由如下重量百分比的原料制成：

脐带间充质干细胞外泌体 65％；

甘露醇 12％；

海藻糖 12％；

透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3余量。

实施例3

参照实施例1，与实施例1不同的是，本实施例是外泌体冻干粉，其由如下重量百分比的原料制成：

脐带间充质干细胞外泌体 70％；

甘露醇 10％；

海藻糖 10％；

透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3余量。

对比例1

参照实施例1，与实施例1不同的是，本对比例是外泌体粉末是在新鲜提取纯化脐带间充质干细胞外泌体后，直接与甘露醇、海藻糖、透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3混合即可。

本对比例不需要经过实施例1的冻干制备步骤。

实验测试

参见图1-图4所示，图1为实施例1的粉末化的外泌体冻干粉复溶后做透射电镜，可见完整典型的外泌体形态(茶托状)。图2为通过Western Blot测定，新鲜提取的(F)、-20℃冻存(-20℃)的和干燥复溶(L)的脐带充质干细胞外泌体粉末CD9和CD63的表达没有明显变化。图3-图4为通过NTA测定，新鲜提取的外泌体粉末和干燥复溶的外泌体冻干粉在外泌体颗粒数和粒径分布没有明显差别。

图3-图4中，横坐标Diameter为直径(粒径)；纵坐标Particles为颗粒数。Mean为平均值。

与对比例1的新鲜外泌体粉末(即不经过冻干机冻干)相比，我们比较了实施例1的外泌体粉末在冻干保存对外泌体形态、蛋白质和核酸的影响，证明了外泌体粉末冻干复溶后没有影响其形态、数量、粒径分布和蛋白质表达。本产品低温下运输，2-8℃下可保存至少12个月。一旦复溶后，建议在2小时内使用。使用时使用溶媒溶解外泌体粉末即可使用。

实施例4

本实施例的一种外泌体冻干粉护肤品，其含有实施例1-3中任一实施例的外泌体冻干粉。可将外泌体冻干粉作为主料，再配以护肤品中一些必要的常见的辅料。

大多数情况下，我们肌肤的衰老从细胞组织学的角度来说是多种组织形态的不足，甚至缺失，进而使用透明质酸类产品，可保持皮肤滋润光滑、细腻柔嫩、富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。透明质酸因而不具备干细胞外泌体发挥的修复与增加胶原蛋白作用。紧紧起到填充组织的作用，治标不治本。

每种不同的干细胞外泌体因子所具有的功能是不同的，EGF主要作用于表皮受损肌肤的修复与再生的；FGF能刺激胶原蛋白产生；KGF能促进角质层生长。本实施例的护肤品含有的多成分的脐带间充质干细胞外泌体粉末能全方位地从表层肌肤到深层肌肤修护受损肌肤，刺激新的年轻活力细胞再生，皮肤缺陷组织回复到先前年轻时的正常形态。所以使用含有多成分的脐带间充质干细胞外泌体粉末的护肤品护肤效果更佳。

采用外泌体冻干粉能够最大限度保持外泌体的活性有效成分，其中的脐带间充质干细胞外泌体中具有肌肤活性成分的物质基本都是寡肽或者蛋白。这类物质很容易受到外界因素(包括高温度、极端pH值、微生物活动、潮湿空气等)的影响而活力逐渐减弱，最终完全失活，所以脐带间充质干细胞外泌体是一种护肤效果非常强但是生物稳定性相对较差的物质。因此将外泌体冻干粉真空干燥保存在西林瓶中，可以避免外界因素影响它的活性，延长它的使用寿命。使用时，溶媒和外泌体冻干粉混匀再使用，改善皮肤质地效果更好。一旦复溶后，建议在2小时内使用。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种外泌体冻干粉，其特征在于，其由如下重量百分比的原料制成：

脐带间充质干细胞外泌体40-80％；

甘露醇10-30％；

海藻糖10-30％；

透明质酸钠、寡肽-1和寡肽-3余量。

2.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，脐带间充质干细胞外泌体的含量为60-70％。

3.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，甘露醇的含量为10-20％。

4.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，海藻糖的含量为10-20％。

5.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，脐带间充质干细胞外泌体采用如下方法制备：首先采用胶原酶-胰酶消化法培养脐带间充质干细胞，然后再进行脐带间充质干细胞外泌体的提取和纯化。

6.权利要求1-5任一所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将外泌体冻干粉原料配制成溶液，然后将溶液在-80℃以下预冻12-15h后，置于真置于真空度为<80mT的冻干机中，在-50℃以下冷冻干燥26-32h后得到外泌体冻干粉。

7.根据权利要求6所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，将溶液在-80℃预冻12-15h后，置于真置于真空度为<80mT的冻干机中，在-50℃冷冻干燥26-32h。

8.一种外泌体冻干粉护肤品，其特征在于，其含有权利要求1-5任一所述的外泌体冻干粉。

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