KR20230043587A - 인간 편도줄기세포 유래 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents
인간 편도줄기세포 유래 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 편도줄기세포로부터 유래한 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 노화가 유도된 섬유아세포의 피부 재생 및 항산화 관련 유전자의 발현을 촉진하고 섬유아세포의 노화를 억제하는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 인간 편도 줄기세포 유래 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물, 특히 피부 재생 및 노화 방지용 조성물에 관한 것이다.
노화는 유기체의 기능 및 재생 특성이 시간 의존적으로 손실되는 것을 특징으로 한다. 피부 노화와 관련된 요인은 세포를 손상시켜, 세포 노화로 알려진 피부 재생 및 세포 증식 지연을 초래한다. 세포 노화는 세포주기의 비가역적 정지 및 국소 부착성 세포 골격(focal adhesive cytoskeletone)의 변경을 특징으로 한다.
피부 조직의 세포 노화는 산화성 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, 자외선 조사와 같은 다양한 요인에 의해 유도된다.
지난 수십 년 동안 많은 연구자들이 이를 극복하기 위한 연구를 수행해 왔다.
최근에는 세포노화를 극복하기 위해 엑소좀의 조직 재생 가능성에 대해 많은 연구가 집중되고 있다.
세포내 경로(endocytic pathway)에 의해 생성된 세포에서 원형질막을 가로질러 분비되는 나노 크기의 생체 모방체로 알려진 엑소좀은 miRNA, mRNA 및 단백질을 포함하는 여러 성분들을 함유하고 있다. 또한, 엑소좀은 피부 회춘 및 노화 방지 접근법을 위해 연구되었다.
그러나, 치료 목적을 위한 엑소좀의 잠재력에도 불구하고 낮은 효율성, 긴 절차 시간 및 높은 기술 전문성과 같은 몇 가지 장애물이 있다.
이러한 장애물을 극복하기 위해 많은 연구자들이 체세포로부터 엑소좀 모방 나노베지클을 직접 생산하는데 집중해 왔다. 이러한 생체모방 나노베지클은 초음파 처리 및/또는 압출을 통해 원하는 세포에서 직접 분리할 수 있으며, 엑소좀과 유사한 특성을 공유하는 것으로 보고되었다. 유사한 특성을 감안할 때 세포 유래 생체모방 나노베지클은 약물 전달, 조직 재생, 및 암 표적화에 활용될 수 있다. 특히 인간 편도선 유래 중간엽 줄기세포 (tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC)에서 유래한 나노베지클은 간섬유화증 및 염증을 약화시킨다고 보고되었다. 또한 인간 편도 유래 줄기세포로부터 유래한 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물이 알려져 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인간 편도 줄기세포 유래의 소포체를 포함하는 피부 재생 및 피부 노화 방지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 인간 편도 줄기세포 유래의 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 피부 노화 방지용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은 피부 재생 및 피부 노화 방지 효과를 가지며, 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1a는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기 세포로의 모폴로지를 나타내는 도면이다 (scale bar = 200 ㎛).
도 1b는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기 세포의 표면 마커의 발현을 나타내는 도면이다.
도 2a는 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조한 나노베지클 (nanovesicles from tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC-NV)의 단백질 발현 및 SEM 이미지를 나타내는 도면이다.
도 2b는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조한 나노베지클의 동적 광산란 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 계대 관련 노화 모델에서의 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로서, 도 3a는 인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)에서의 형태학적 변화를 나타낸 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 3b는 TMSC-NV 처리 후 계대 관련 노화 HDF의 증식을 나타내는 도면이고, 도 3c는 노화 관련 β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 3d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이고, 도 3e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린 (vinculin)의 발현을 나타내는 도면이고, 도 3f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 4는 계대 관련 노화 모델에서 TMSC-NV로 처리한 세포외 매트릭스 및HDF에서 항산화 유전자의 조절에 관한 도면으로서, 도 4a는 계대 관련 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 mRNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 4b는 계대 관련 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 4c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 5는 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화 조절에 관한 도면으로서, 도 5a는 처리에 의한 HDF에서의 형태학적 변화를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 5b는 TMSC-NV 처리 후 UV 유도 HDF의 증식 시험을 나타내는 도면이고, 도 5c는 TMSC-NV 처리 후 UV 유도 노화 HDF의 SA-β-갈락토시다제 분석을 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 5d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 데이터를 나타내는 도면이고, 도 5e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린의 발현을 나타내는 도면이고, 도 5f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 6은 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV 처리에 의한 세포외 매트릭스 및 항 산화 유전자의 제어에 관한 도면으로서, 도 6a는 UV 유도 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 6b는 UV 유도 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 6c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 7은 계대 관련 노화 모델에서 CD146+ TMSC-NV로 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로, 도 7a는 노화 HDF에서 COL1 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 7b는 노화 관련 β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 7c는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이다.
도 8은 인체 피부 조직에 자외선 B (ultraviolet B, UVB)를 조사한 피부 노화 모델에 CD146+ TMSC-NV 처리 후, 면역염색법을 통해 확인한 결과에 관한 것으로 도 8a는 콜라겐 타입 1, 콜라겐 타입 3, 인볼루크린 및 필라그린을 면역염색법을 통한 결과이며, 도8b는 면역염색결과의 정량결과이다.
도 1b는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기 세포의 표면 마커의 발현을 나타내는 도면이다.
도 2a는 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조한 나노베지클 (nanovesicles from tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC-NV)의 단백질 발현 및 SEM 이미지를 나타내는 도면이다.
도 2b는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조한 나노베지클의 동적 광산란 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 계대 관련 노화 모델에서의 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로서, 도 3a는 인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)에서의 형태학적 변화를 나타낸 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 3b는 TMSC-NV 처리 후 계대 관련 노화 HDF의 증식을 나타내는 도면이고, 도 3c는 노화 관련 β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 3d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이고, 도 3e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린 (vinculin)의 발현을 나타내는 도면이고, 도 3f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 4는 계대 관련 노화 모델에서 TMSC-NV로 처리한 세포외 매트릭스 및HDF에서 항산화 유전자의 조절에 관한 도면으로서, 도 4a는 계대 관련 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 mRNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 4b는 계대 관련 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 4c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 5는 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화 조절에 관한 도면으로서, 도 5a는 처리에 의한 HDF에서의 형태학적 변화를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 5b는 TMSC-NV 처리 후 UV 유도 HDF의 증식 시험을 나타내는 도면이고, 도 5c는 TMSC-NV 처리 후 UV 유도 노화 HDF의 SA-β-갈락토시다제 분석을 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 5d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 데이터를 나타내는 도면이고, 도 5e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린의 발현을 나타내는 도면이고, 도 5f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 6은 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV 처리에 의한 세포외 매트릭스 및 항 산화 유전자의 제어에 관한 도면으로서, 도 6a는 UV 유도 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 6b는 UV 유도 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 6c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 7은 계대 관련 노화 모델에서 CD146+ TMSC-NV로 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로, 도 7a는 노화 HDF에서 COL1 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 7b는 노화 관련 β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고 (scale bar = 200 ㎛), 도 7c는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이다.
도 8은 인체 피부 조직에 자외선 B (ultraviolet B, UVB)를 조사한 피부 노화 모델에 CD146+ TMSC-NV 처리 후, 면역염색법을 통해 확인한 결과에 관한 것으로 도 8a는 콜라겐 타입 1, 콜라겐 타입 3, 인볼루크린 및 필라그린을 면역염색법을 통한 결과이며, 도8b는 면역염색결과의 정량결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따른 피부 재생 및 피부 노화 방지용 조성물은 인간 편도줄기세포 유래의 소포체를 유효성분으로 포함한다.
본 명세서에서 "줄기세포 (stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 "나노베지클"은 성체 줄기세포로부터 얻은 나노 크기의 베지클을 의미하는 것으로서, 세포외 소낭인 엑소좀과 유사한 나노 크기를 갖는 베지클을 의미한다.
또한, 나노베지클은 생체막의 기본 구조인 인지질을 이용하여 외부와 구분된 지질막 형태를 이룬다. 나노베지클은 내부에 수용성 분자 (DNA 포함) 또는 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라 지용성 약물을 붙이거나, 또는 양전하 및 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 인지질은 양친매성 (amphipathic) 물질로서, 음이온성 또는 양쪽성 이온의 극성 분자단과 탄화수소 16개 내외의 다양한 불포화도를 갖는 2개의 비극성 지용성 사슬을 가지고 있는 분자구조이기 때문에 인지질이 물에 분산되어 자발적으로 베지클을 형성한다.
응용과학분야에서 나노베지클은 화장품 산업, 약물 전달, 및 생체 외 (in vitro)에서 배양중인 세포에 유전물질을 전달하는 모델로 이용하고 있으며, 현재는 나노베지클 내에 수용성 및 지용성 물질 모두를 포획할 수 있고, 특정 조직에 표적이 용이하며, 크기 및 변형이 용이하고 인지질의 사용으로 독성의 문제점이 거의 없고, 포획시킬 수 있는 약물을 다른 약물운반체보다 더 많이 포획할 수 있다.
본 명세서에서 소포체라 함은 주로 세포외 소포체를 의미하는 것으로, 세포외 소포체는 모든 세포가 외부 환경으로 분비하는 지질 이중층으로 둘러쌓인 소포체를 의미할 수 있다.
세포외 소포체는 기원과 분비 기전, 크기 등을 기준으로 엑소좀(exosomes), 마이크로베지클(microvesicles), 엑토좀(ectosomes), 마이크로파티클(microparticles), 막소포체(membrane vesicles), 나노베지클(nanovesicles), 외막소포체(outer membrane vesicles) 등 다양한 명칭으로 불려질 수 있다.
상기 소포체는 세포외 소포체, 마이크로베지클 및 나노베지클 중에서 선택된 1종일 수 있다. 특히 나노베지클일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인간 편도줄기세포 유래의 나노베지클은 엑소좀에서 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커를 발현한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인간 편도 줄기세포는 인간 편도 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 인간 편도줄기세포는 CD146 포지티브일 수 있다.
상기 나노베지클은 직경이 50 nm 내지 250 nm, 30nm 내지 200nm일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 나노베지클은 30 nm 이상, 32 nm 이상, 34 nm 이상, 36 nm 이상, 38 nm 이상, 40nm 이상, 42 nm 이상, 44 nm 이상, 46 nm 이상, 48 nm 이상 또는 50 nm 이상이면서, 200 nm 이하, 190 nm 이하, 180 nm 이하, 170 nm 이하, 160 nm 이하, 150 nm 이하, 140 nm 이하, 130 nm 이하, 120 nm 이하, 110 nm 이하, 100 nm 이하, 95 nm 이하, 90 nm 이하, 85 nm 이하, 80 nm 이하, 75 nm 이하 또는 70 nm 이하의 직경을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 나노베지클은 30 내지 100 nm, 40 내지 80 nm, 50 내지 100 nm, 또는 50 내지 80 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 나노베지클은 40 내지 55 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 나노베지클은 40 nm 이상, 42 nm 이상, 44 nm 이상, 46 nm 이상, 48 nm 이상 또는 50 nm 이상이면서, 55 nm 이하, 54 nm 이하, 53 nm 이하, 52 nm 이하, 51 nm 이하 또는 50 nm 이하의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 나노베지클은 42 내지 53 nm, 46 내지 52 nm, 48 내지 52 nm, 또는 50 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 소포체는 CD14, CD34, CD45, CD73, CD90, 및 CD146 중에서 선택된 1종 이상의 면역 항원을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인간 편도 유래 줄기세포는 인간 편도선 조직을 저포도당의 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 콜라게나제 타입 1 및 DNase 1로 분해하는 단계; 상기 분해된 생성물을 여과 및 원심분리하여 상층액을 제거하여 세포 펠렛을 얻는 단계; 및 상기 세포 펠렛으로부터 얻은 세포를 10% 소태아 혈청, 항생제 및 항진균제를 함유한 DMEM에서 배양하여 인간 편도 유래 줄기세포를 얻는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 나노베지클은 계대배양된 인간 편도 유래 줄기세포를 배양 배지로 현탁한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 상기 상층액을 제거한 세포 펠렛을 재현탁한 다음 압출기로 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터를 연속적으로 통과하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터는 포어 사이즈가 큰 필터에서 포어 사이즈가 작은 필터의 순으로 사용되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터는 8 내지 12 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터, 3 내지 7 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터, 및 0.2 내지 0.6 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터로 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터는 포어 사이즈가 10 ㎛, 5 ㎛ 및 0.4 ㎛인 필터의 순으로 사용되는 것일 수 있다.
한편, CD146 포지티브인 소포체를 얻는 방법은 상기 얻은 인간 편도 유래 줄기세포를 FcR 블로킹 시약(FcR Blocking Reagent)으로 처리한 다음, CD146 ㅁ마이크로비즈(croBeads) 처리 후 빛 차단 상태에서 반응시키는 단계; 반응 후 자기 활성 세포 분리법 (magnetic-activated cell sorting, MACS)용 완충액으로 처리한 다음 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 MACS 세퍼레이터 및 LS 컬럼을 통해 CD146 포지티브와 네가티브를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 인간 편도줄기세포 유래 CD 146 포지티브 나노베지클은 CD146 세포 표면 마커로 선별된 세포로부터 CD 146 포지티브 인간 편도줄기세포 유래 나노베지클을 생산하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있는데, 나노베지클을 생산하는 단계는 상기한 인간 편도 유래의 줄기세포로부터 나노베지클을 제조하는 방법과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 피부재생 및 노화 방지용 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 소포체 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 소듐 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 소듐 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 유효성분의 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일 측면에서 상기 조성물 1 ㎍/kg 내지 200 mg/kg, 다른 일 측면에서 50 ㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 예컨대, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 리브온 (leave-on)형, 미스트 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 샴푸, 린스, 바디클렌저 등의 세정제, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 모발 영양화장수, 헤어에센스, 헤어세럼 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어로션, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물, 수중유 (O/W)형, 유중수 (O/W)형 등의 기초 화장료로 제형화 될 수 있다.
또한, 상기 조성물은, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 자외선 차단제, 헤어 컨디셔닝제, 향료등을 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 구현예에서, 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포(TMSC) 추출 및 배양
편도선 절제술로 얻은 인간 편도선 조직에서 편도 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)를 다음과 같은 방법으로 분리하였다.
먼저, 인간 편도선 조직을 2% 항생제-항진균제 (Gibco, New York, NY, USA) 를 함유한 인산염 완충 식염수 (PBS; phosphate-buffered saline, Welgene, Seoul, South Korea)로 세척하였다. 그런 다음, 조직을 잘게 자르고, 저포도당의 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM; Gibco, New York, NY, USA)에서 210U/mL의 콜라게나제 유형 1(Gibco, New York, NY, USA) 및 4KU/mL의 DNase 1(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 37℃에서 1시간 30분 동안 분해시켰다. 분해된 생성물을 저포도당의 둘베코 배지 (DMEM/low glucose)에서 10% 소태아혈청 및 1% 항생제가 첨가된 줄기세포 배양액으로 처리한 후, 40 ㎛의 스트레이너 (strainer)를 통해 여과하고 3분 동안 1,300 rpm에서 3분간 원심분리하였다.
얻은 펠렛을 새로운 DMEM으로 2회 세척하였다. 세척 후 얻은 세포를 10% 소태아혈청 (Gibco, New York, NY, USA)과 1% 항생제 및 항진균제 (Gibco, New York, NY, USA)를 함유하는 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배지를 이틀마다 교체하였다. 모든 중간엽 줄기세포는 5-6 일 간격으로 TrypLE express (Gibco, New York, NY, USA)를 통해 계대배양되었다.
도 1a는 상기 제조예 1에서 제조한 인간 편도줄기세포의 광학현미경(scale bar = 200 ㎛. LSM 700, ZEISS) 분석을 통한 세포 형태를 나타내는 도면이다.
도 1a에서 보듯이, TMSC는 기존에 알려진 중간엽 줄기세포와 유사하게 섬유아세포 형태를 가지고 있었다.
한편, 항-CD90, 항-CD105 및 항-CD73 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)를 사용한 유세포 분석기 (flow cytometry, FACSVerse II, BD Biosciences)를 사용하여 TMSC를 특성화 하였다.
도 1b는 제조예 1에서 제조한 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포의 표면 마커의 발현을 나타내는 도면이다. 도 1b에서 보듯이, 유세포 분석 데이터는 TMSC가 CD90, CD105 및 CD73을 포함한 일반적인 TMSC 표면 마커에 대해 양성(> 90 %)임을 나타내었다.
제조예 2: 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포 내 CD146 발현하는 세포(CD146+ TMSC) 선별
인간 CD146 마이크로비드 키트 (human CD146 MicroBead Kit; 130-093-596, Miltenyi Biotec, Auburn, USA)를 사용하여 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 CD146-포지티브 편도 유래 중간엽 줄기세포를 선별하였다.
보다 상세하게는, 제조예 1에서 배양된 인간 편도 유래 중간엽 줄기세포를 인산염 완충액(PBS)로 1 회 세척한 후, TrypLE express로 3 분간 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포에 10% 소태아혈청 (Gibco, New York, NY, USA)과 1% 항생제 및 항진균제 (Gibco, New York, NY, USA)를 함유하는 DMEM을 첨가하고 1,300 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 PBS로 재현탁하여 동일 조건으로 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 0.5 % 소태아혈청 및 2 mM EDTA가 첨가된 PBS를 60 μL/107 세포수 만큼 처리하여 세포 펠렛을 해리하였다. 세포 용액에 20 μL/107 세포수의 FcR 블로킹 시약 (FcR Blocking Reagent, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)으로 처리하고 20 μL/ 107 세포수의 CD146 마이크로비드로 처리한 다음, 빛을 차단하고 4℃에서 15 분간 반응시켰다. 반응 후, 1 mL 의 MACS 완충액으로 처리하고 1,300 rpm에서 3 분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이후 MACS 세퍼레이터 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 통해 CD146-포지티브 편도 유래 중간엽 줄기세포 (CD146+ TMSC)와 CD146-네거티브 편도 유래 중간엽 줄기세포(CD146- TMSC)를 분리하였다.
제조예 3: TMSC에서 유래한 나노베지클(TMSC-NV)의 제조
TMSC 유래 나노베지클의 제조를 위해, 상기 제조예 1에서 얻은 TMSC를 TrypLE express 용액(Gibco, New York, NY, USA)으로 37℃에서 3분간 처리하여 분리하였다. 분리된 세포를 10% 소태아혈청 (Gibco, New York, NY, USA)과 1% 항생제 및 항진균제 (Gibco, New York, NY, USA)를 함유하는 DMEM로 현탁하고 1300rpm에서 2분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 얻은 세포 펠렛을 PBS로 2회 세척하고, 10℃에서 PBS 중 1×106 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.
재현탁된 세포를 미니 압출기 (Avantiㄾ Polar Lipids Mini Extruder, Alabaster, AL, USA)를 사용하여 (리테이너 및 압출기 사이에 끼운) 10 ㎛, 5 ㎛ 및 0.4 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 (다공성 폴리카보네이트) 여과지로 순차적으로 각 3회씩 통과시켜 나노베지클을 제조하였다.
제조예 4: CD146+ TMSC에서 유래한 나노베지클(CD146+ TMSC-NV)의 제조
상기 제조예 1에서 제조한 TMSC 대신 상기 제조예 2에서 제조한 CD 146+ TMSC를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 3과 동일한 방법으로 나노베지클을 제조하였다.
상기 제조예 3 및 제조예 4에서 얻은 나노베지클의 크기와 모양은 각각 동적 광 산란(DLS) 및 투과 전자 현미경 분석(TEM)에 의해 결정하였다.
1) 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)
글로우-방전 탄소-코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grids)(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 정제된 나노베지클을 가하였다. 나노베지클을 1시간 동안 그리드 상에 흡수되도록 한 후, 그리드를 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정시켰으며 탈이온수의 물방울로 세척한 다음, 2% 우라닐 아세테이트(Ted Pella, Redding, CA)로 음성 염색(negative stain)하였다. 전자 현미경 사진은 100 kV의 가속 전압에서 JEM 1011 microscope (JEOL, Tokyo, Japan)로 기록하였다.
2) 동적 광 산란(Dynamic light scattering; DLS)
나노베지클의 크기 분포를 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instrument Ltd., Malvern, U.K.)로 측정하였다.
또한, Micro BCA™ Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 나노베지클의 농도를 측정하였다.
한편, 나노베지클의 단백질 발현을 측정하기 위해, 웨스턴 블롯팅 방법을 사용하였다.
3) 웨스턴 블롯팅
TMSC 및 TMSC-NV을 Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) 완충액 (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 수확 및 용해하였다. 세포 파편의 제거를 위해 20분 동안 13,000 rpm에서 용해물을 원심분리하였다. 상층액에 들어있는 단백질의 양은 Micro BCA™ Protein Assay Kit를 사용하여 측정하였다. 20μg 양의 총 단백질을 로딩하고 10% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 로딩 후 분리된 단백질을 30분동안 5% BSA 용액으로 블로킹된 멤브레인으로 옮겼다. 면역 블롯팅의 경우, 토끼 항-CD9(1:2000), 항-CD63(1:2000) 및 항베타 액틴(1:5000) 1차 항체(Abcam, Cambridge, UK)를 4℃에서 하룻밤 적용하였다.
단백질의 화학발광 검출을 위한 horseradish peroxidase (HRP) 컨쥬게이트 염소 항-토끼 IgG(H + L)(1:5,000) 2차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 실온에서 2시간 동안 적용하고, Amersham™ ECL Select™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 검출에 사용하였다.
도 2a는 TMSC-NV의 단백질 발현 및 TEM (JEM 1011 microscope (JEOL, Tokyo, Japan) 이미지를 나타내는 도면이다. 단백질 수준은 β-액틴에 의해 정규화되었다.
도 2b는 TMSC-NV의 동적 광산란 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2a로부터 TMSC-NV는 CD9 및 CD63과 같은 엑소좀 마커를 발현함을 확인하였다. 한편, TMSC-NV는 구형 형태를 가졌고, 도 2b로부터 TMSC-NV의 직경은 두 개의 피크(88.5 및 228.3 nm)로 표시되었다. 이러한 결과는 TMSC-NV가 엑소좀과 유사한 특성을 가진다는 것을 보여준다.
제조예 5: 지방줄기세포에서 유래한 나노베지클의 제조
상기 제조예 1에서 제조한 TMSC 대신 지방줄기세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 3과 동일한 방법으로 나노베지클을 제조하였다.
제조예 6: 골수줄기세포에서 유래한 나노베지클의 제조
상기 제조예 1에서 제조한 TMSC 대신 골수줄기세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 3과 동일한 방법으로 나노베지클을 제조하였다.
실험예
세포 배양
인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, 미국)에서 구입하였다. 이 세포를 10% 소태아혈청(Gibco, New York, NY, USA)과 1% 항생제-항진균제 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 포함하는 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 배양하였다. 배지는 이틀마다 교체하였다. 고유 복제 노화 세포는 반복 계대에 의해 생성되었다. 계대 3과 계대 15의 세포는 각각 '젊은' 상태와 '늙은' 상태로 식별하였다. 외인성 노화 세포는 200 mJ/cm2의 UV 조사에 의해 처리하였다.
실험예 1: 세포 증식능 비교
세포 증식은 Cell Counting Kit-8 assay (CCK-8, Dojindo, Japan)로 확인하였으며, ATCC에서 구입한 HDF를 12-웰 플레이트에 5,000 세포수/cm2 로 분주하고 줄기세포 배양액(10% 소태아혈청 (Gibco, New York, NY, USA)과 1% 항생제 및 항진균제 (Gibco, New York, NY, USA)를 함유하는 DMEM)으로 배양하였다. HDF를 분주하고 24 시간 후에, 상기 제조예 3 및 제조예 4의 나노베지클을 각각 단백질 농도 기준 50 μg/mL로 HDF 에 1 회 처리한 후 6 일간 배양하였다. 세포 증식을 비교하기 위해, 줄기세포 배양액을 CCK-8과 1:10 비율로 혼합하여 각 웰에 처리하였다. 1시간 30분간 37℃에서 반응시킨 후 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 비교하였다.
실험예 2: 면역염색 분석
면역염색 분석을 수행하기 위해 상기 제조예 3 및 제조예 4의 세포를 4% 파라포름알데히드로 30분동안 고정하였다. 그런 다음, 고정된 세포를 0.05% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 15분 동안 투과화 (permeablization)하였다.
투과화 후, 세포를 1% 소혈청알부민 (BSA) (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 실온에서 30분 동안 차단한 다음 항-빈쿨린 (anti-vinculine)(1:200)으로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세척 후, 염소 항-토끼 IgG H&L Alexa Fluor 488 이차 항체 (1:200) 및 테트라메틸로다민 컨쥬게이티드 팔로이딘(phalloidin)(1:200)을 어둠 속에서 1시간 동안 적용하였다. ECM 생산을 확인하기 위해 세포를 고정, 차단 및 항-콜라겐1 1차 항체(1:200)로 1시간 동안 배양하고 염소 항 토끼 IgG H&L Alexa Fluor 488(1:200)로 배양하였다. 면역세포화학 분석에 사용되는 모든 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. 면역세포화학분석은 DAPI 핵 염색으로 대조염색하고 ZEISS LSM700 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 검사하였다.
실험예 3: 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)
정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (qPCR)을 위해 제조예 3 및 제조예 4 의 나노베지클을 노화 섬유아세포에 6 일간 처리하고, 이 세포를 6-웰 플레이트에 배양하였다.
각 웰을 1 mL PBS로 세척하고, Trizol 시약 500 μL를 처리한 후 1.75 mL 튜브에 수득하였다.
시약을 클로로포름 200 μL와 함께 처리하고 얼음 위에서 10 분간 두었다. 혼합물을 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하고, 수성 상층액을 조심스럽게 수집하고 동량의 이소프로판올 혼합하여 얼음 위에서 10 분간 인큐베이션하였다.
RNA 샘플을 13,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛을 75% EtOH로 세척하고 건조시켰다.
투명한 RNA 펠렛을 뉴클레아제 프리 워터 (nuclease-free water)로 희석하고 Nanodrop 2000으로 RNA 농도를 확인하였으며, 1 μg RNA으로 cDNA를 합성하였다.
cDNA는 PrimeScript RT Reagent kit (TAKARA, Japan)를 이용하여 합성하였으며, ΔΔCT값을 Step-One plus qPCR machine (ThermoFisher Scientific, USA)으로 확인하였다.
실험예 4: 노화 관련 베타-갈락토시다제 분석 (SA-β-갈락토시다제 분석)
노화 관련 베타-갈락토시다아제는 갈락토사이드의 단당류로의 가수분해에 촉매 작용을 하는 효소이다. 노화 세포와 조직에서는 pH 4.0이 아닌 pH 6.0에서만 검출가능하다. 세포 노화의 바이오마커로, 불용성 청색 화합물로 전환되는 5-브로모-4-클로로-3-인도일-D-갈락토피라노사이드(X-gal)를 사용하는 발색 분석을 사용하여 그것의 활성을 검출할 수 있다.
여기서, SA-β-갈락토시다제 분석은 세포 노화 염색 키트 (cell senescence staining kit, Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
세포의 노화 정도를 비교하기 위해, Cellular Senescence Staining Kit (CBA-230, Cell biolabs, USA)를 통해 세포의 SA-β-galactosidase의 활성도를 측정하였다.
보다 상세하게, HDF에 제조예 3 내지 제조예 6의 나노베지클을 각각 처리한 후 6 일 후에 HDF를 PBS로 1 회 세척한 후, 10% 글리세롤로 상온에서 5 분간 처리하여 세포를 고정하였다. 상층액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후 Cellular Senescence Staining Kit를 통해 37℃에서 14 시간 동안 염색시켰다. 반응 후 상층액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후 현미경을 통해 사진 촬영 및 정량 분석하였다. 정량적 데이터는 노화 세포의 착색 비율의 기록에 의해 측정하였다.
실험예 5: Ex vivo 조직 재생능력 확인 (면역염색법)
면역염색법을 통해 인체 피부 조직을 구성하는 단백질인 콜라겐 타입 1, 콜라겐 타입 3, 인볼루크린(involucrin) 및 필라그린(filaggrin)을 염색하였다.
공여받은 인체 피부 조직의 지방을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, 1 cm × 1 cm 로 절단하여 준비하였다. 피부 조직을 semi-agarose DMEM 배지 환경에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배양 중인 인체 피부 조직에 300 mJ/cm2에 해당하는 자외선 B(ultravilolet B; UVB를 조사한 후, CD146+ TMSC-NV를 각각 50 μg/ml, 100 μg/ml의 농도로 각 20 μL 도포하였고 24 시간 후 동일한 조건으로 UVB 조사와 CD146+ TMSC-NV 도포를 반복하였다. 반복 처리 이후, 인체 피부 조직을 새로운 semi-agarose DMEM 배지로 옮겨주었으며, 3 회차 UVB 조사 및 CD146+ TMSC-NV 도포 이 후 24 시간 배양한 뒤 조직을 고정하여 면역염색을 진행하였다.
도 3은 계대 관련 노화 모델에서의 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로서, 도 3a는 HDF에서의 형태학적 변화를 나타낸 도면이고(Scale bar = 200 ㎛), 도 3b는 TMSC-NV 처리 후 계대 관련 노화 HDF의 증식을 나타내는 도면이고, 도 3c는 노화 관련 SA-β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고(scale bar = 200 ㎛), 도 3d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이고, 도 3e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린의 발현을 나타내는 도면이고, 도 3f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정략적 데이터를 나타낸 도면이다(그룹 간 유의미한 차이는 일 방향 ANOVA로 측정하였다(ns > 0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 3a 및 3b에서 볼 수 있듯이 TMSC-NV 처리는 노화 HDF 세포의 증식을 증가시켰다. SA-β-갈락토시다아제 분석을 수행하여 TMSC-NV의 노화 방지 역할을 확인하였다. 도 3c에서 볼 수 있듯이, TMSC-NV로 처리한 것이 노화 HDF의 β-갈락토시다아제의 활성을 감소시켰음을 나타내었다. 도 3d의 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 데이터는 TMSC-NVs 처리에 의해 노화 세포의 비율이 감소됨을 보여주었으며, 이는 TMSC-NV 처리가 HDF의 노화 수준을 감소시킨다는 것을 뒷받침하였다.
또한, TMSC-NV로 처리한 후의 국소 부착에서의 빈쿨린의 단백질 발현과 액틴 세포골격에서의 형태학적인 변화를 조사하였다. 면역형광 분석 결과, 도 3e 및 도 3f에서 보듯이, 노화 HDF의 국소 접착력에서 빈쿨린 의 헌신도 증가를 나타내고, 이것은 TMSCNV 처리에 의해 감소되었다.
이러한 결과는 TMSC-NV가 HDF의 증식을 증가시키고 계대에 의해 유발되는 노화를 감소시킨다는 것을 보여준다.
분자생물학 측면에서 TMSC-NV의 노화방지 특성을 확인하기 위해, TMSC-NVs 처리 후에 세포외 매트릭스(ECM) 생산 및 노화 관련 항산화 유전자의 유전자 발현을 조사하였다.
도 4는 계대 관련 노화 모델에서 TMSC-NV로 처리한 세포외 매트릭스 및HDF에서 항산화 유전자의 조절에 관한 도면으로서, 도 4a는 계대 관련 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 4b는 계대 관련 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 4c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다. 그룹 간 유의미한 차이는 one-way ANOVA로 측정하였다 (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 4a에서 보듯이, 콜라겐 타입 1(COL1)과 ELASTIN의 mRNA 수준은, 젊은 HDF에 비해 노화 HDF에서 감소하는데, TMSC-NV로 처리하면 ECM 생산이 상향 조절되는 것으로 나타났다.
유사하게, 항산화 유전자인 SOD2 및 HMOX1의 mRNA 발현은 노화 HDF에서 TMSC-NV로 처리하면 증가하였다. 또한, COL1의 단백질 발현은 면역형광법으로 조사한 결과 도 4b 및 도 4c에서 보듯이, TMSC-NV로 처리하면 계대 관련 노화 HDF에서 현저하게 증가된 ECM 생성을 나타내었다. 이러한 결과에 따르면 TMSC-NV로 처리하면 노화 세포에서 ECM 생산 및 노화 감소 가능 항산화 유전자의 회복을 가져온다는 것을 알 수 있다.
도 5는 UV 유도 노화 모델에서의 TMSC-NV 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로서, 도 5a는 HDF에서의 형태학적 변화를 나타낸 도면이고(Scale bar = 200 ㎛), 도 5b는 TMSC-NV 처리 후 계대 관련 노화 HDF의 증식을 나타내는 도면이고, 도 5c는 노화 관련 SA-β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고(scale bar = 200 ㎛), 도 5d는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이고, 도 5e는 HDF의 국소 부착에서의 빈쿨린의 발현을 나타내는 도면이고, 도 5f는 국소 부착에서의 빈쿨린 발현의 정략적 데이터를 나타낸 도면이다(그룹 간 유의미한 차이는 일 방향 ANOVA로 측정하였다(ns > 0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 5a 및 5b에서 볼 수 있듯이 TMSC-NV 처리는 UV 유도 노화 HDF 세포의 증식을 증가시켰다. SA-β-갈락토시다아제 분석을 수행하여 TMSC-NV의 노화 방지 역할을 확인하였다. 도 5c에서 볼 수 있듯이, TMSC-NV로 처리한 것이 UV 유도 노화 HDF의 β-갈락토시다아제의 활성을 감소시켰음을 나타내었다. 도 5d의 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 데이터는 TMSC-NV 처리에 의해 노화 세포의 비율이 감소됨을 보여주었으며, 이는 TMSC-NV 처리가 HDF의 노화 수준을 감소시킨다는 것을 뒷받침하였다.
또한, TMSC-NV로 처리한 후의 국소 부착에서의 빈쿨린의 단백질 발현과 액틴 세포골격에서의 형태학적인 변화를 조사하였다. 면역형광 분석 결과, 도 5e 및 도 5f에서 보듯이, UV 유도 노화 HDF의 국소 접착력에서 빈쿨린의 헌신도 증가를 나타내고, 이것은 TMSC-NV 처리에 의해 감소되었다.
이러한 결과는 TMSC-NV가 HDF의 증식을 증가시키고 계대에 의해 유발되는 노화를 감소시킨다는 것을 보여준다.
분자생물학적 관점에서 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV의 노화 방지 특성 확인을 위해 노화 관련 ECM 생산 및 항산화 유전자의 mRNA 발현을 qPCR에 의해 조사하였다.
도 6은 UV 유도 노화 모델에서 TMSC-NV 처리에 의한 세포외 매트릭스 및 항 산화 유전자의 제어에 관한 도면으로서, 도 6a는 UV 유도 노화 HDF에서 COL1, ELASTIN, SOD2, 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이고, 도 6b는 UV 유도 노화 HDF의 콜라겐 타입 1의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 6c는 면역 형광 분석의 정량적 데이터를 나타낸 도면이다.
도 6a에서 보듯이, qPCR의 결과는 COL1 및 ELASTIN은 UV 조사 후 감소되었고 TMSC-NV 처리 결과 현저하게 증가된 COL1을 나타내었다. 그러나 ELASTIN은 증가하지 않았다. 항산화 유전자인 SOD2 및 HMOX1은 UV 조사에 의해 감소하였고 TMSC-NV 처리에 의해 증가되었다. 또한 도 6b 및 도 6c에서 보듯이, 면역형광분석 결과 UV-유도 노화 HDF에서 콜라겐 타입 1의 발현 감소를 보여주었으며, 이는 TMSC-NV로 처리하면 증가하였다. 이 결과는 TMSC-NV가 ECM 생산 및 노화 감소 항산화 유전자를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
분자생물학 측면에서 CD16+ TMSC-NV의 노화방지 특성을 확인하기 위해, CD146+ TMSC-NV 처리 후에 세포외 매트릭스(ECM) 생산 및 노화 관련 항산화 유전자의 유전자 발현을 조사하였다.
도 7은 계대 관련 노화 모델에서 CD146+ TMSC-NV로 처리에 의한 증식 및 노화의 조절에 관한 것으로, 도 7a는 노화 HDF에서 COL1 및 HMOX1의 m-RNA 발현을 나타낸 도면이다.
도 7a를 참고하면, CD146+ TMSC-NV를 6 일간 처리하였을 때, 지방줄기세포 나노베지클(ASC-NV), 골수 줄기세포 나노베지클(BMMSC-NV)로 처리하였을 때보다 피부 재생 관련 마커인 콜라겐 타입 1의 mRNA 발현량이 상승하였고, 항산화 관련 마커인 HMOX1의 발현량이 가장 높게 상승하는 것을 확인하였다.
도 7b는 노화 관련 β-갈락토시다제 분석 결과를 나타내는 도면이고(scale bar = 200 ㎛), 도 7c는 SA-β-갈락토시다제 분석의 정량적 해석을 나타낸 도면이다.
도 7b 및 도 7c에서 보듯이, CD146+ TMSC-NV로 처리한 노화 섬유아세포 및 TMSC-NV로 처리한 노화 섬유아세포가 비교적 낮은 계대 수의 섬유아세포와 거의 유사한 정도로 염색되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, CD146+ TMSC-NV가 항노화 효능 및 피부 재생 효능이 높은 것이 확인되었다.
도 8a 및 도 8b는 인체 피부 조직에 자외선 B (ultraviolet B, UVB)를 조사하여 피부 노화 모델을 제작하고 CD146+ TMSC-NV를 처리한 후, 인체 피부 조직을 구성하는 콜라겐 타입 1, 콜라겐 타입 3, 인볼루크린 및 필라그린을 면역염색법을 통해 확인한 결과이다.
상기 결과를 바탕으로, CD146+ TMSC-NV를 처리하였을 때, 자외선에 의한 인체 피부 조직의 손상이 회복되는 것을 확인하였다.
Claims (12)
- 인간 편도 줄기세포 유래의 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부재생 및 노화 방지용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 소포체는 세포외 소포체, 마이크로베지클 및 나노베지클 중에서 선택된 1종인 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 인간 편도 줄기세포는 인간 편도 중간엽 줄기세포인 것인 조성물. - 청구항 3에 있어서,
상기 인간 편도 줄기세포는 CD146 포지티브인 것인 조성물. - 청구항 2에 있어서,
상기 나노베지클은 직경이 50 nm 내지 250 nm인 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 소포체는 CD14, CD34, CD45, CD73, CD90, 및 CD146 중에서 선택된 1종 이상의 면역 항원을 추가로 포함하는 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 인간 편도 줄기세포는
인간 편도선 조직을 저포도당의 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)에서 콜라게나제 타입 1 및 DNase 1로 분해하는 단계;
상기 소화된 생성물을 여과 및 원심분리하여 상층액을 제거하여 세포 펠렛을 얻는 단계; 및
상기 세포 펠렛으로부터 얻은 세포를 10% 소태아 혈청, 항생제 및 항진균제를 함유한 DMEM에서 배양하여 인간 편도 줄기세포를 얻는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것인 조성물. - 청구항 2에 있어서,
상기 나노베지클은
계대배양된 인간 편도 줄기세포를 배양 배지로 현탁한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및
상기 상층액을 제거한 세포 펠렛을 재현탁한 다음 압출기로 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터를 연속적으로 통과하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것인 조성물. - 청구항 8에 있어서,
상기 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터는 포어 사이즈가 큰 필터에서 포어 사이즈가 작은 필터의 순으로 사용되는 것인 조성물. - 청구항 8에 있어서,
상기 2개 이상의 포어 사이즈가 상이한 필터는 포어 사이즈가 10 ㎛, 5 ㎛ 및 0.4 ㎛인 필터의 순으로 사용되는 것인 조성물. - 청구항 7에 있어서,
상기 얻은 인간 편도 유래 줄기세포를 FcR 블로킹 시약(FcR Blocking Reagent)으로 처리한 다음, CD146 마이크로비드(CD146 MicroBeads) 처리 후 빛 차단 상태에서 반응시키는 단계;
반응 후 자기 활성 세포 분리법 (magnetic-activated cell sorting, MACS)용 완충액으로 처리한 다음, 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및
MACS 세퍼레이터 및 LS 컬럼을 통해 CD146 포지티브와 네거티브를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것인 조성물.
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