KR20210137335A - 해조류의 세포외소포를 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 청각 또는 톳 세포외소포를 포함하는 조성물은 화장료 조성물; 의약외품 조성물; 약학 조성물; 및 건강기능식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로 멜라닌 합성 저하, 멜라닌 합성 관련 단백질의 하향조절 효능을 통해 피부 미백 효능을 제공한다.

Description

해조류의 세포외소포를 포함하는 피부 미백용 조성물{Cosmetic composition comprising extracellular vesicles of seaweed for whitening skin}

본 발명은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 청각 또는 톳 세포외소포를 포함하는 조성물은 화장료 조성물; 의약외품 조성물; 약학 조성물; 및 건강기능식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

사람의 피부색은 피부 내 멜라닌의 농도와 분포에 따라 유전적으로 결정되나, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다.

피부의 색을 결정하는 멜라닌 생성에 대한 화학적 작용은 현재까지 여러 논문 등을 통해 많이 보고되고 있는데, 멜라닌 생성세포인 멜라노사이트(melanocyte)가 멜라노좀(melanosome)이라는 세포내 소기관 내에서 자외선으로부터 세포를 보호하는 기능을 가지는 멜라닌을 합성한 후, 상기 멜라닌이 멜라노사이트에서 각질형성세포(keratinocyte)로 이동하는 것으로 알려져 있으며, 이렇게 각질형성세포로 이동된 멜라닌이 피부색을 결정하는 것으로 보고되고 있다.

상기 멜라닌 생합성 과정에서 필요한 전구물질은 티로신이라는 아미노산으로, 이 티로신은 디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 전환되고, 그 후 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질 등을 거쳐 최종적으로 멜라닌으로 전환된다고 알려져 있다.

이와 관련하여, 멜라닌 형성 효소로는 티로시나아제(tyrosinase; TYR), 티로시나아제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1; TRP-1) 및 티로시나아제 관련 단백질 2(tyrosinase-related protein 2, TRP-2/DOPA, chrome tautomerase) 등이 알려져 있으며, 상기 멜라닌 형성 효소는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)라 불리는 전사인자에 의해 조절된다고 알려져 있다. 멜라닌 합성 경로에 중요한 역할을 수행하는 티로시나아제는 L-티로신을 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)로 전환하고, 생성된 L-DOPA를 L-도파퀴논으로 신속하게 전환하며, 이후의 여러 반응을 통해 결국 멜라닌을 형성한다. 티로시나아제에 의해 합성된 멜라닌은 피부색을 짙게 만드는데, 건강 또는 미용상의 요구로 인해 상기 멜라닌 합성을 억제하여 피부색을 밝게 하려는 피부 미백 방법에 관한 연구가 활발히 진행 중이다.

일반적으로 알려진 미백 성분으로서, 티로시나아제 효소 활성을 억제하는 알부틴, 코지산(코직산), 아젤라익산, 알로에신, 4-부틸레소시놀, 레스베라트롤, 세라마이드, 스핑고신-1-인산, 스핑고실포스포릴콜린 등과 같은 물질이나, 하이드로퀴논(대한민국 공개특허공보 2016-0014271)등이 있다. 이러한 미백 성분들은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현하거나, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다. 그러나 일부 미백성분들은 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다. 특히 하이드로퀴논의 경우 비가역적 백화현상 등의 원치 않는 부작용으로 그 사용이 금지 되었고(European Committee 24th Dir 2000/6/EC), 하이드로퀴논의 구조 유사체인 알부틴 등으로 대체된 바 있다. 이와 같이 미백분야에서는 티로시나아제 활성 저해 효과를 보유하여 미백 효과를 지니는 것뿐만 아니라 안정성 확보가 특히 중요하여, 상기와 같은 요건을 모두 충족하는 물질의 개발이 여전히 요구되고 있다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 낮은 부작용 및 높은 미백 효능을 가지는 물질의 개발을 위해 예의 노력한 결과, 해조류의 세포외소포가 피부에 무해함과 동시에 높은 피부 미백 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 미백 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태는 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 해조류의 세포외소포를 이용한 피부 미백 효능을 지니는 신규한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 해조류 추출물 중 세포외소포에서 피부 미백 효능이 있음을 확인하고, 이의 조성물을 개발하였다.

본 발명의 용어 “해조류의 세포외소포”란 해조류로부터 분리한 세포외소포를 의미한다.

구체적으로, 상기 해조류 세포외소포는 청각 또는 톳 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 “해조류”는 바다에서 나는 조류를 통틀어 이르는 말로서, 조류란 은화식물(Cryptogam: 포자로 번식하는 식물을 지칭하는 식물의 2대 분류군 중 하나)의 한 무리를 지칭하는 단어로 물 속에 살면서 엽록소로 동화작용을 한다. 확실하게 정의된 분류군은 아니지만 물 속에 사는 엽록소를 가진 엽상식물을 관습적으로 부르고 있다.

상기 용어 “세포외소포(extracellular vesicles)”는 이중 지질막으로 이루어진 50~1000nm의 크기를 갖는 나노 소포 체로 DNA, RNA 및 단백질 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포막으로부터 분비되어 세포와 세포 사이의 communication에 매우 중요한 기능을 한다고 밝혀져 있다.

상기 용어 “청각(Codium fragile)”은 청각과에 속하는 녹조류로 즐기는 대롱처럼 속에 구멍이 있고, 불규칙하게 갈라져 사슴의 뿔과 비슷하다.

상기 용어 “톳(Sargassum fusiforme)”은 갈조식물 모자반과의 바닷말로서, 조간대 하부에 서식하며 유성세대만 존재하는 다년생 해조류이다.

본 발명자들은 상기 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 조성물이 멜라닌 합성 저하, 멜라닌 합성 관련 단백질의 하향조절 효능을 통해 피부 미백 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명에서는 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 추출액에서 피부 미백 효과가 나타나지만, 세포외소포를 포함하지 않는 상등액에서는 피부 미백 효과가 나타나지 않음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 “피부 미백”은 멜라닌 색소의 합성을 저해하고/하거나 티로시나아제 활성을 억제시킴으로써 피부 톤을 밝게 하는 것을 말한다. 또한, 상기 피부 미백은 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨, 검버섯, 잡티 또는 흑색종 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 포함한다.

상기 멜라닌은 흑갈색 알갱이의 색소로서, 멜라닌 세포 내 멜라노솜이라는 세포 소기관에 의해 만들어진다. 멜라닌은 피부, 털, 눈 등에 존재하며, 멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다.

따라서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백 효능을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 피부 미백은 멜라닌 합성 저하 효능 또는 멜라닌 합성 관련 단백질 하향조절에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 멜라닌 합성 관련 단백질은 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, 또는 MITF인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 피부 멜라노마 세포에 해조류 세포외소포를 처리하여 멜라닌 합성이 저하됨을 확인하고(도 2A), 해조류 추출물 중 상등액과 세포외소포를 포함하는 침전물을 분리하여 실험한 결과, 상등액에서는 미백 효능이 미미하지만 세포외소포를 포함하는 침전물에서 우수한 미백 효능이 있음을 확인하고(도 2B), 피부 멜라노마 세포에서 멜라닌 합성 관련 단백질이 하향조절되지만(도 3), 피부 생존률에는 영향을 끼치지 않는 것을 확인하였으며(도 4), 인공 피부 모델에서의 피부 침착 억제 효능을 확인하고(도 5), 임상시험 평가를 통해 인간 피부에 염증을 유발하지 않으며, 미백 효능이 있음을 확인하였다(도 6).

본 발명의 용어 “화장료 조성물”은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제 포함 클렌징, 오일, 앰플, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 구체적으로, 저자극성 화장료 피부 보호제, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 크림, 에센스, 스트레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 용어, “해조류의 세포외소포”, 및 “피부 미백”에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함 된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본 발명의 해조류 세포외소포를 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 해조류 세포외소포를 포함하는, 미백 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 용어, “해조류의 세포외소포”, 및 “피부 미백”에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "미백 관련 질환"은 피부에 색소가 과다하게 침착되는 증상을 가진 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 미백 관련 질환은 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티 또는 흑색종일 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 조성물이 미백 관련 질환 의 발생을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물이 미백 관련 질환의 증상을 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 본 발명 조성물의 미백 관련 질환 증상의 예방 또는 치료 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체는 비자연적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 유효가능한 양"은 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 체중, 건강, 성 별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을, 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부를 미백하는 방법을 제공한다.

본 발명의 피부를 미백하는 방법에 있어, 해조류 세포외소포를 포함하는 조성물 및 미백에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 투여는 피부에 도포하는 것을 포함하는, 방법일 수 있다.

본 발명은 해조류 세포외소포를 포함하는 조성물은 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있다. 유효용량의 수준은 목적하는 피부 미백 효과가 나타나는 정도로 당업자가 통상적인 상식에 기초하여 결정할 수 있다.

본 발명은 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로 멜라닌 합성 저하, 멜라닌 합성 관련 단백질의 하향조절 효능을 통해 피부 미백 효능을 제공한다.

도 1A는 해조류 청각/톳으로부터 세포외소포를 분리하여 DLS를 통해 지름별로 분류한 그래프이다.
도 1B는 해조류 청각/톳으로부터 세포외소포를 분리하여 TEM을 이용하여 찍은 사진이다.
도 2A는 α-MSH으로 유도된 멜라닌 합성에 대한 해조류 세포외소포의 농도별 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 2B는 청각 세포외소포를 포함하는 침전물 및 상등액의 미백 효능 비교하는 모식도 및 그래프이다.
도 3A는 멜라닌 합성 관련 단백질 발현을 전기영동을 통해 비교하는 사진이다.
도 3B는 L-DOPA 염색을 통한 코직산, 알부틴, 및 세포외소포의 미백효능을 나타내는 사진이다.
도 4는 MTT 어세이를 통해 해조류 청각/톳 세포외소포에 의한 세포 생존률을 나타내는 그래프이다.
도 5A는 인공 피부 모델에서의 청각 세포외소포에 의한 색소 침착 억제 실험 일정을 나타내는 모식도이다.
도 5B는 인공 피부 모델에서의 톳 세포외소포의 미백 효능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5C는 인공 피부 모델에서의 청각 세포외소포의 미백 효능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 6A는 임상시험을 통한 피부 자극 평가 결과를 나타내는 결과이다.
도 6B는 임상시험을 통한 피부 미백 평가 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 시약 및 항체 준비

티로신, TRP-1, TRP-2의 다클론성 항체 및 b-액틴 단클론성 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 또한, MITF의 다클론성 항체는 Proteintech (Chicago, IL, USA)에서 구매하여 사용하였으며, α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone), L-DOPA, 코직산(kojic acid) 및 알부틴은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.

실험예 2: 세포 배양

MNT-1 세포(인간 멜라노마 세포)를 사용하였으며, 배양 조건은 20% 소태아혈청, 10% DMEM, 20mM HEPES, 및 50μg/mL 젠타마신(gentamicin)이 포함된 MEM 배양액에서 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다.

실험예 3: 세포외소포 분리

세포외소포 분리는 원심분리기를 통해 수행하였다. 보다 구체적으로, 살아있는 한국 해조류를 PBS로 헹군 뒤, 반건조된 해조류를 분쇄하여, 5000 x g에서 1시간, 20,000 x g에서 2시간, 및 100,000 x g에서 2시간에서 원심분리 하였다. 이후, 각 세포외소포가 포함된 침전물은 PBS로 세척한 뒤, 100,000 x g에서 2시간 원심분리하고 PBS로 다시 부유시킨 뒤, -20℃에서 저장하였다. 해조류 세포외소포의 정량은 Bradford assay를 통해 실시하였다.

실험예 4: 멜라닌 함량 조사

멜라닌 함량 조사는 멜라닌 흡광도를 측정하여 확인하였다. 보다 구체적으로, 세포는 PBS로 두 번 세척하고, 트립신/EDTA를 처리한 뒤, 원심분리기 1,000 x g에서 3분간 원심분리하였다. 이후, 8 x 10⁵ 세포를 200μL의 1N NaOH - 10% DMSO에 담지하고 80℃, 4시간 조건에서 용해하여, 용해된 멜라닌의 흡광도를 405nm에서 확인하였다.

실험예 5: 티로시나아제 활성 조사

12-웰 배양접시 내 커버슬립 위에 세포를 접종하고, 3.5%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 10분간 처리하여 고정시킨 뒤, PBS로 세척하여, 10mM L-DOPA가 포함된 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼에서 37℃에서 3시간 배양하였다. 이후, PBS로 세척한 뒤, 유리 슬라이드를 커버슬라이드 위에 덮고 현미경을 통해 관찰하였다.

실험예 6: 면역블랏팅

1 g/ml aprotinin, 1 g/ml antipain, 1 mM dithiothreitol, 5 g/ml leupeptin, 1 g/ml pepstatin A, 및 20 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride가 포함된 RIPA 버퍼를 세포에 처리한 뒤, 13,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 다시 같은 버퍼로 변성시킨 뒤, SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 항체를 처리하고 Odyssey CLx imager (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)를 통해 신호를 감지하고, Image Studio Lite software (LI-COR Biosciences)를 통해 분석하였다.

실험예 7: 세포 증식 조사

세포 증식은 MTT 어세이를 통해 조사하였다. 보다 구체적으로, MNT-1 세포는 0.05% 트립신/EDTA를 처리하고 96-웰 배양접시에 5 x 10³ 개 세포를 접종하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 0.5 mg/ml MTT을 포함하는 배양액을 첨가하여 1시간 동안 배양하고, 배양액을 제거한 뒤, 100μL의 acidic isopropanol (90% isopropanol, 0.5% SDS, 25 mM NaCl)을 처리하였다. 그 뒤, 마이크로틸터 플레이트 리더기(microtiter plate Reader; Dynatech, Chantilly, VA, USA)를 통해 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 8: 멜라노덤 배양 및 H&E 염색

멜라노덤(MEL-300-B) 및 배양액은 MatTek Corporation (Ashland, MA, USA)에서 구매하였다. 멜라닌 함량을 측정하기 위하여, 멜라노덤 조직은 12-웰 배양접시에 접종하고 예열된 배양액과 함께 배양하였다. 배양액은 14일동안 매일 교체하였다

또한, H&E 염색을 위하여는 면도칼을 사용하여 인서트로부터 멜라노덤 조직을 분리하였다. 분리한 조직은 4% 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매하였다. 각 파라핀 블락은 4μm 간격으로 절개하여 구분한 뒤, 각 섹션은 슬라이드 위에 올려두고 H&E 시약(Abcam, Cambridge, UK)을 통해 염색하였다. 각 이미지는 40배로 확대하여 color image analyzer(Leica DM1000 LED; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 통해 조사하였다.

실험예 9: in vivo 임상시험

29세부터 59세까지(평균연령 47세)의 건강한 한국인(N=35)을 대상으로 피부자극 실험을 진행하였다. 본 발명의 조성물을 포함하는 패치를 피부에 24시간 동안 부착한 뒤, 제거하고 30분, 24시간, 48시간 뒤, SOP of Korea Institute of Dermatological Sciences (Seoul, Korea)의 평가 방법을 통해 피부자극 정도를 평가하였다.

또한, 20세부터 50세까지(평균연령 46세)의 건강한 한국 여성을 대상으로 미백 실험을 진행하였다. 4주간, 절반의 참가자에게 본 발명의 조성물을 처리하고, 다른 절반의 참가자에게는 속임약을 처리하여 경과를 3번 확인하고, 이의 평균 값을 계산하였다. 피부는 VISIA-CA (VISIA Complexion Analysis, Canfield Scientific, Inc., USA)를 통해 이미지화 하였고, 미백 효능은 spectrophotometer (CM-2600D, Minolta, Japan)을 통해 평가하였다.

실험예 10: 통계 조사

통계 조사는 unpaired Student’s t test를 통해 수행하였으며, p-value가 0.01 또는 0.05 이하일 경우, 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

실시예 1: 해조류로부터의 세포외소포 추출

4개의 한국 해조류 청각(Codium fragile; C.F), 톳(Sargassum fusiforme; S.F), 미역(Undaria pinnatifida; U.P), 및 곰피(Ecklonia stolonifera; E.S)으로부터 실험예 3 방법을 통해 세포외소포를 추출하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 추출한 세포외소포는 DLS(dynamic light scattering)를 통해, 100 ~ 105nm의 반지름을 가지는 것을 확인하였으며(도 1A). TEM(Transmission electron microscopic)을 통해 지름이 200nm 이하임을 확인하였다(도 1B).

실시예 2: 피부 멜라노마 세포 내 멜라닌 합성 저하 효능

실시예 2-1: 해조류 세포외소포의 효능

α-MSH는 멜라노사이트 내 멜라닌 합성에 중요한 조절자로 알려져 있기에, 본 발명의 해조류 세포외소포가 α-MSH로 인한 멜라닌 합성을 억제하는 효능이 있는지 확인하였다.

보다 구체적으로, MNT-1 세포(인간 색소 멜라노마 세포)에 500nM α-MSH을 처리하고, 실험예 4 방법을 통해, 본 발명의 세포외소포를 처리한 그룹 및 처리하지 않은 그룹을 비교하였다

그 결과, 도 2A에서 볼 수 있듯이, 청각 및 톳으로부터 분리한 세포외소포는 멜라닌 합성을 유도하는 α-MSH를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으나, 미역 및 곰피의 세포외소포에서는 이의 효능이 나타나지 않음을 확인하였다.

또한, 최대 억제 효능은 톳 250μg/mL에서 나타나고, 청각은 25μg/mL에서 나타나는 것을 확인하였다.

이를 통해, 청각 및 톳으로부터 분리한 세포외소포가 미백 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 2-2: 해조류 세포외소포 및 상등액의 효능 비교

구체적인 세포외소포의 효능을 확인하기 위하여, 해조류 추출물을 세포외소포 및 상등액으로 분리하여 이를 비교하였다.

보다 구체적으로, 정제하지 않은 PBS를 통해 얻은 청각 조추출물(crude extract)을 원심분리를 통해 상등액과 세포외소포를 포함하는 침전물(pellet)로 분리한 뒤, PBS를 통해 조추출액과 동일한 용량으로 부유시켰다.

그 결과, 도 2B에서 볼 수 있듯이, 세포외소포가 포함된 조성물에서는 멜라닌 생성 억제 효능을 확인할 수 있었으나, 세포외소포가 포함되지 않은 상등액 조성물에서는 멜라닌 생성 억제 효능을 확인할 수 없었다.

이를 통해, 해조류 추출물 조성물 중 세포외소포에서 미백 효능이 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 3: 피부 멜라노마 세포 내 멜라닌 합성 관련 단백질 하향조절 효능

티로신 발현은 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기에 실험예 5 내지 6 방법을 통해, 청각/톳 세포외소포의 티로신 발현에 미치는 영향에 대하여 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로 코직산 및 알부틴을 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, MNT-1 세포에 톳 250μg/mL 및 청각 25μg/mL을 처리하였을 때, 티로시나아제의 발현이 월등히 감소하는 것을 확인하였다(도 3A). 또한, 톳 세포외소포는 TRP-1 발현을 억제하는 것을 확인하였으나, 청각 세포외소포는 TRP-1 및 TRP-2 모두 억제하는 것을 확인하였으며, 멜라닌 생성 전사인자 MITF는 두 세포외소포에서 모두 하향조절되는 것을 확인하였다(도 3A). 또한, L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 염색을 통해 해조류 세포외소포를 처리한 MNT-1 세포에서 세포 내 티로시나아제 활성이 감소한 것을 확인하였으며(도 3B), α-MSH를 MNT-1 세포에 처리하면 티로시나제 활성에 의하여 검은 색소 침착이 증가하나, 청각/톳 세포외소포를 처리한 세포에서는 이의 침착 발생이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 청각 세포외소포는 5μg/mL의 낮은 농도에서 이의 미백 효능이 나타나는 것을 확인하였다.

이를 통해, 청각/톳 세포외소포가 멜라닌 합성 효소 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, 및 MITF의 하향조절/불활성화를 통해 멜라닌 합성을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 4: 피부 멜라노마 세포 생존률 평가

본 발명의 세포외소포가 피부 멜라노마 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험예 7 방법을 통해, 이를 평가하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 두 세포외소포 모두 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

이를 통해, 청각/톳 세포외소포가 피부 멜라노마 세포의 생존률에 영향을 끼치지 않고 안전함을 확인하였다.

실시예 5: 인공 피부 모델 내 색소 침착 억제 효능

본 발명의 세포외소포의 멜라닌 합성 억제 활성을 확인하기 위하여, 인간 피부와 비슷하게 구현된 인공 피부 모델을 사용하였다. 보다 구체적으로, 멜라노덤 조직을 50μL PBS(대조군), 50μg의 톳 세포외소포, 5μg의 청각 세포외소포, 1%의 코직산(양성 대조군)으로 14일간 매일 처리한 뒤(도 5A), 상기 실험예 8 방법을 통해 멜라노덤 조직을 파라핀에 고정 및 포매하였다. 이후, 고정되어 준비된 피부 섹션은 H&E 염색을 하여 침착된 부위를 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, PBS를 처리에 비하여 50μg의 톳 세포외소포 또는 5μg의 청각 세포외소포를 처리하였을 때, 피부 침착이 감소한 것을 확인하였다(도 5B 내지 도C).

이를 통해, 청각/톳 세포외소포가 피부 침착을 완화하는 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 6: 임상시험 평가

세포외소포의 멜라닌 합성 억제 활성을 확인하고 멜라닌 합성 억제 임상 평가를 위하여, 청각 세포외소포가 함유된 크림 시제품(최종 농도 5μg/mL)을 제작하여 실험예 9 방법을 통해, 임상시험을 수행하였다.

실시예 6-1: 피부 자극 평가

본 발명의 세포외소포가 함유된 크림이 염증을 유발하는지 확인하기 위하여, 크림을 피부에 도포한 뒤, ICDRG의 평가 방법을 통해 평가하였다.

그 결과, 도 6A에서 볼 수 있듯이, 청각 세포외소포가 포함된 크림을 도포한 부위와 상기 세포외소포가 포함되지 않은 크림(대조군)을 도포한 부위가 임상학적 염증 지수에 차이가 없는 것을 확인하였다.

이를 통해, 청각 세포외소포가 인간 피부에서 염증을 일으키지 않고 안전함을 확인하였다.

실시예 6-2: 피부 미백 평가

본 발명의 세포외소포가 함유된 크림을 참가자의 반쪽 얼굴(왼쪽)에 도포하고, 반대편 반쪽(오른쪽)에는 청각 세포외소포가 포함되지 않은 플라시보(placebo) 크림을 4주간 매일 도포한 뒤, 미백 효능을 L-value(색 밝기 지수)를 통해 평가하였다.

그 결과, 도 6B에서 볼 수 있듯이, 청각 세포외소포가 포함된 크림을 도포하였을 때, 2주 뒤 0.94%p, 4주 뒤 1.31%p 향상된 미백 효능이 있음을 확인하였다.

이를 통해, 청각 세포외소포가 인간 피부에서 멜라닌 합성을 억제를 통한 미백 효능이 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 해조류는 청각 또는 톳인 것인, 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기미, 주근깨, 검버섯 및 잡티로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 예방 또는 개선하기 위한 것인, 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 미백은, 멜라닌 합성 저하 효능에 의한 것인, 화장료 조성물.
   
5. 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 의약외품 조성물.
   
6. 해조류의 세포외소포를 유효성분으로 포함하는, 미백관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
7. 제8항에 있어서, 상기 미백관련 질환은 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티 또는 흑색종인 것인, 약학 조성물.
   

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