KR101010744B1 - 지황 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 각질 제거용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 지황 추출물은 활성산소종(ROS) 제거 효과, UV에 의한 세포보호 효과, 세포사멸 저해 효과, 티로시나아제 활성 저해 효과를 나타냄을 확인함으로써, 피부 노화방지, 미백 또는 각질 제거용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

지황, 활성산소종, 티로시나아제, 노화, 미백, 각질

Description

항산화 활성을 갖는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물{Composition comprising the extract of Rehmannia glutimosa LIBOSCH. having antioxidative effect}

본 발명은 항산화 활성을 갖는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화방지, 미백 또는 각질 제거용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Li W, Hill H.Z., Induced melanin reduces mutations and cell killing in mouse melanoma. Phytochem Photobiol. 65, pp.480-485, 1997

[문헌 2] Kaufman, R. J., Vectors used for expression in mammalian cells., Meth . In Enzymol. 205, pp 87, 1991

[문헌 3] Kameyama, K. et al., Pigment production in murin melanoma cells is regulated by tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP 1), dopachrome tautomerase (TRP2) and a melanogenic inhibitor. J Invest Dermatol., 100, pp 126-131, 1993

[문헌 4] Hearing, V.J., Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization. J Investig Dermatol Symp Proc. 4, pp 24-28. 1999

[문헌 5] J. A. Escobar et al.,SOD and catalase inactivation by singlet oxygen and peroxyl radicals. Free Radical Biology & Medicine, 20, pp 285-290, 1995

[문헌 6] 고은정, 지황의 조직배양 신초의 순화와 생육에 관한 연구. 서울대학교 대학원 학위논문, 2001

[문헌 7] 약품식물학연구회 저, 신약품식물학, pp 365, 1991

[문헌 8] Thierry Passeron, MD, et al., Genetic disorders of pigmentation. Clinics in Dermatology, 23, pp 56-57, 2005

[문헌 9] 신대역동의보감, 허준, 동의문헌연구실옮김, 법인문화사(서울), p220,p241,p479, 2007

산소를 이용하여 살아가는 생물체는 생명유지를 위해 산소를 필수적으로 요구하지만, 산소의 대사과정동안 발생하는 유해물질을 피할 수 없다. 이런 독성이 강한 물질을 활성 산소종 (ROS ; reactive oxygen species) 이라 하는 데, 산소에 의해 파생되는 물질이라고 해서 oxygen-derived species라고도 일컬어지며 일부는 최외각에 단일 전자를 하나 가지고 있어 반응성이 매우 크기 때문에 라디칼 (radical) 이라고도 알려져 있다. ROS는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical; O₂ ^-), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical; OH^.), 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical; ROO^.) 등과 같은 산소 라디칼(radical) 뿐만 아니라, singlet oxygen (¹O₂), hydrogen peroxide (H₂O₂) 등과 같은 비-라디칼(non-radical)을 모두 지칭하는 말로써 그 종류가 매우 다양하다. ROS의 반응시간은 매우 짧은 반면에 반응력은 매우 커서 생체 내에서 각종 단백질의 변성, 지질과산화, DNA변이 등과 같은 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (Li W, Hill H.Z., Induced melanin reduces mutations and cell killing in mouse melanoma. Phytochem Photobiol. 65, pp.480-485, 1997).

ROS는 정상 대사 과정 중 진핵생물에서는 미토콘드리아, 원핵생물에서는 세포막의 전자전달계에서 전자 수용체로서 작용하고 궁극적으로 물로 환원된다 (Kaufman, R. J., Vectors used for expression in mammalian cells., Meth . In Enzymol. 205, pp 87, 1991). 이 과정에서 부분적인 산소의 환원에 의해 superoxide anion, hydroxyl radical, hydrogen peroxide 등의 유해 물질이 생성된다. 세균의 침범에 대항하기 위한 식균 작용의 과정에서도 호중구의 NADPH oxidase(respiratory burst oxidase)에 의해 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)이 발생하며, 이 라디칼이 디스뮤타아제(dismutase), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase)의 작용으로 반응성이 큰 라디칼들을 생성하고 세포의 발아, 수정, 세포 분화 과정에서도 상당량의 산소 소비량의 증가 (respiratory burst)에 수반되는 산소 라디칼의 생성이 보고되고 있다 (Kameyama, K. et al., Pigment production in murin melanoma cells is regulated by tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP 1), dopachrome tautomerase (TRP2) and a melanogenic inhibitor. J Invest Dermatol., 100, pp 126-131, 1993), (Hearing, V.J., Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization. J Investig Dermatol Symp Proc. 4, pp 24-28. 1999). 산소 라디칼 외에도 글루타치온(glutathione) (GSH)과 시스테인(cysteine)이 Ames test에서 돌연변이 활성을 나타내어 sulfur-centered 라디칼들이 생체내에서 독성을 나타낼 가능성도 제기되었다. 또한 세포막의 산화 손상에 의해 생성되는 ROOH(lipid hydroperoxide)가 미량의 금속이온에 의해 분해되면 퍼옥실 라디칼(peroxyl radical), 알콕시 라디칼(alkoxyl radical), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 등이 생성되기도 한다.

수퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical)은 다른 활성 산소 종들이 생기게 되는 핵심요소로서 NADPH 산화효소 (NADPH oxidase)나 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)와 같은 효소에 의해 산소에 전자 하나가 환원되면서 생성된다. 이렇게 생성된 수퍼옥사이드(superoxide)는 특정 효소에 의해서 hydrogen peroxide와 물과 산소로 분해된다. 퍼옥실 라디칼(Peroxyl radical)은 지질 과산화의 결과 생성되는 것으로 다른 ROS와 다르게 생물체 내에서 오래 지속되는 성질이 있으며, singlet oxygen은 산소가 빛을 받아 전자기적으로 불안정한 상태로 변형되어 생성된다. 이와 같이 생명체가 살아가는 동안 일어나는 수많은 화학 반응에서 세포에 독성을 나타내는 활성 산소종들이 다량 만들어지는 것으로 알려져 있다 (J. A. Escobar et al.,SOD and catalase inactivation by singlet oxygen and peroxyl radicals. Free Radical Biology & Medicine, 20, pp 285-290, 1995).

현재 퇴행성질병과 노화의 기작에 대한 많은 가설 중 세포 내 활성산소종이 그 발생에 주된 원인이 된다는 것이 많은 지지를 얻고 있다. UV의 경우 피부노화에 매우 밀접한 관련이 있고, 피부암, 홍반, 부종을 일으키는 등 인체에 매우 유해한 반응을 일으킨다. UV에 의한 노화 발생은 활성 산소종에 의해 발생된다고 생각되어 U937 세포에 UV를 쬐어준 후 세포 사멸을 일으키고, 지황을 처리하여 세포 내 활성산소를 효과적으로 제거할 수 있는지 항산화 기능을 실험해보았다.

지황은 중국이 원산지이고 약용식물로 재배한다. 현삼과 식물이며 뿌리는 굵고 육질이며 옆으로 뻗고 붉은빛이 도는 갈색이다. 줄기는 곧게 서고 높이가 20∼30cm이며 선모가 있다. 뿌리에서 나온 잎은 뭉쳐나고 긴 타원 모양이며 끝이 둔하고 밑 부분이 뾰족하며 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있고, 잎 표면은 주름이 있 으며, 뒷면은 맥이 튀어나와 그물처럼 된다. 줄기에 달린 잎은 어긋난다. 개화기는 6∼7월이며 꽃은 붉은빛이 강한 연한 자주색으로 피고, 열매는 삭과이고 10월에 익는다. 한방에서는 뿌리의 생것을 생지황, 건조시킨 것을 건지황, 쪄서 말린 것을 숙지황이라고 한다. 숙지황은 보혈제로 쓰이고 강장, 당뇨병, 혈압강하, 생리불순·허약 체질·어린이의 발육 부진·치매·조루증·발기부전에 사용하며, 생지황은 해열, 해독, 강심, 토혈, 코피, 자궁 출혈·생리불순·변비에 사용하고, 건지황은 열병 후에 생기는 갈증과 장기 내부의 열로 인한 소갈증에 효과가 있으며 토혈과 코피를 그치게 하는 것으로 알려져 있다 (고은정, 지황의 조직배양 신초의 순화와 생육에 관한 연구. 서울대학교 대학원 학위논문, 2001)

지황의 뿌리에 케타폴(catapol)이라는 이리도이도 글리코시드(iridoid glycoside)가 많이 함유되어 있으므로 (약품식물학연구회 저, 신약품식물학, pp 365, 1991) 지황이 노화관련 질병에 효과가 있을 것으로 생각된다.

멜라닌 (melanin)는 페놀류의 생체고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이며, 사람의 피부, 머리카락, 눈 등에서 관찰된다. 멜라닌은 자외선 등에 의한 피부의 광노화나 일광각화증을 억제하고 보호하는 긍정적인 기능을 가지고 있는 반면, 색소침착 뿐만 아니라 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포의 사멸을 촉진하는 부정적인 기능도 가지고 있다.

멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 색소세포 (멜라닌 세포)내의 melanosome에서 합성된다. 생성된 멜라닌은 각질형성세포로 전달되어 피부 상피층으로 배출된다. 피부의 과색소침착(hyperpigmentation)은 피부내 멜라닌 세포에서 endothelin, UV, α-MSH, NO 등의 여러 요인들에 의해 멜라닌 생성활동이 증가되고 이에 다량의 멜라닌이 축적된 결과이다. 멜라닌의 과색소침착은 기미,주근깨를 형성하고, 더 나아가서는 피부암을 유발하기도 한다 (Thierry Passeron, MD, et al., Genetic disorders of pigmentation. Clinics in Dermatology, 23, pp 56-57, 2005).

멜라닌 합성에 조효소는 티로시나아제이며, 티로시나아제의 활성 억제는 피부 내에서의 멜라닌의 생합성을 효과적으로 저해할 수 있기 때문에 피부미백제의 개발에 있어서 유용한 평가방법으로 인정되고 있다.

이에 본 발명자들은 U937 cell line에 UV에 의한 활성산소종의 생성 및 세포사멸에서 지황의 방어효과를 확인하여 지황의 항산화 물질로서의 가능성을 알아보고자 하였으며, 생지황이 멜라닌 합성 조절 기전에 미치는 영향을 조사하고자, B16/F10 멜라노마 세포를 이용하여 티로시나아제 활성 및 멜라닌량을 관찰하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 항산화 활성을 갖는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화방지, 미백 또는 각질 제거용 피부외용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 항산화 활성을 갖는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화방지, 미백, 또는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름으로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 추출물은 생지황, 건지황 또는 숙지황, 바람직하게는 생지황을 포함한다.

상기 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 지황 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 지황을 각각 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 약 0.5 내지 20배, 바람직하게는 약 1 내지 2배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로, 60 ℃ 내지 90 ℃의 추출온도, 바람직하게는 85℃에서, 약 0.5 내지 5시간, 바람직하게는 3시간 동안 교반추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은 피부 노화방지. 미백 또는 각질 제거용 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 지황 추출물을 포함하는 조성물은 피부 노화방지, 미백, 각질 제거용 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테 아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마 자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아 르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모 늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량 , 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량으로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물은 이외의 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클 렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 지황 추출물은 활성산소종 제거 효과, UV에 의한 세포보호 효과, 세포사멸 저해 효과, 티로시나아제 활성 저해 효과를 나타내므로 피부 노화방지, 미백 또는 각질 제거용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 세포( U937 ) 배양

1-1. 시료 및 시약의 준비

동물 세포 실험에 사용한 U937 세포주는 ATCC(American type culture collection, Rockvill, 미국)에서 구입하였으며, RPMI 1640 medium, FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 등은 Gibco BRL (Grand Island, 미국) 사에서, 배양조는 코닝 (Rochester, 미국)사로부터 구입하였다. 그 외 실험에 사용한 시약 중 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), β-NADPH, GSSG, 글루타치온 환원효소(glutathion reductase), 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 요오드화 프로피디엄(propidium Iodide;PI), 아지드화 나트륨(sodium azide), PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride), 2-mercaptoethanol, 항-토끼(anti-rabbit) IgG, 항-마우스(anti-mouse) IgG, 항-염소(anti-goat) IgG 등은 시그마 (St. Louis, 미국)사에서 구입하였다. 트리스(Tris), 아크릴아미드(acrylamide), N,N,N',N'-tetra-methyl-ethylenediamine, SDS(sodium dodecyl sulfate), 글리신(glycine), 아가로스(agarose), 비스-아크릴아미드(bis-acrylamide), APS(ammonium persulfate), 바이오-래드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit) 등은 바이오-래드(Bio-Rad, Hercules, 미국)사에서 구입하였고, 2-비닐-피리딘(2-vinyl-pyridine)은 알드리치사에서 트리에탄올아민(triethanolamine)은 산요사에서 구입하였으며 ECL(Enhanced chemilumine-scence) 디텍션 키트(detection kit)는 Amersham Phamacia Biotech. (Oxford, UK)사에서 구입하였다. Cleaved caspase-3 (Asp-175), cleaved PARP (Asp-214), phospho-JNK 항체들은 Cell Signalling Biotechnology (Waltham, 미국)사에서 구입하였고, Phospho-ERK (E-4), phospho-p38 (D-8), Cytochrome C (7H8), AIF (D-20), Bid (FL195), lamin-B (C-20) 등은 Santa Cruz (Santa Cruz, 미국)사에서 구입하였다. 그리고, Ac-Asp-Glu-Val-Asp-pNa (AC-DEVD-pNA)는 Calbiochem (La Jolla, CA)로부터 구입하였다. DCFHDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate), DHR 123(dihydrorhodamine 123), rho-123(rhodamine-123), Annexin V/FITC 등은 Molecular Probes (Eugene, 미국)로부터 구입하였다. 세포의 형광 발현에 대한 관측은 Zeiss사의 Axiovert 200 inverted microscope와 Axiocam CCD camera (Germany)를 사용하였고 FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter)를 이용한 유세포 측정 분석을 위해 Becton-Dickinson FACS Calibur를 사용하였다. 이 외 기타 본 실험에서 사용된 모든 시약들은 분석용 등급 이상이 사용되었고, 하기 실험예에서 이용되었다.

1-2. 세포 배양

U937 세포주는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 3 × 10⁵ 또는 5 × 10⁵ cells/ml의 밀도로 유지하면서 37^oC (5% CO₂/95% 상대습도)의 항온, 항습 배양기로 배양하였다.

참고예 2. 세포(B16/F10) 배양

2-1. 시료 및 시약의 준비

동물 세포 실험에 사용한 B16/F10 세포주는 ATCC(American type culture collection, Rockvill, 미국)에서 구입하였으며, DMEM 배지(medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), trypsin/EDTA 등은 Gibco BRL (Grand Island, 미국) 사에서, 배양조는 코닝 (Rochester, 미국)사 로부터 구입하였다. 그 외 실험에 사용한 시약 중 탄산수소나드륨(sodium bicarbonate), L-DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride), 멜라닌(melanin), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 등은 시그마 (St. Louis, 미국)사에서 구입하였다. 트리스(Tris), 아크릴아미드(crylamide), N,N,N',N'-테트라-메틸-에틸렌디아민(N,N,N',N'-tetra-methyl-ethylenediamine), SDS(sodium dodecyl sulfate), 글리신(glycine), 비스-아크릴아미드(bis-acrylamide), APS(ammonium persulfate), 바이오-래드 단백질 키트(Bio-Rad protein assay kit)등은 바이오-래드 (Hercules, 미국)사에서 구입하였고, 단백효소 억제제 혼합물(protease inhibitor cocktail)은 칼바이오캠(Calbiochem) (La Jolla, 캐나다)로부터 구입하였다. 본 실험에 사용한 기기는 멀티플레이트 리더 (Bio-Rad, Hercules, 미국), UV/VIS 분광광도계 (SHIMAZU, 일본) 등 이다.

2-2. 세포 배양

B16/F10 세포주는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지에서 5 × 10⁴ cells/ml의 밀도로 유지하면서 37^oC (5% CO₂/95% 상대습도)의 항온, 항습 배양기로 배양하였다.

참고예 3. 경옥고의 처방

생지황이 다량 포함되는 처방으로 경옥고가 대표적이다. 문헌이 기재된 방법 을 이용하여 하기와 같이 경옥고를 제조하였다 (신대역동의보감, 허준, 동의문헌연구실옮김, 법인문화사(서울), p220,p241,p479, 2007).

경옥고의 처방내용은 생지황취즙(生地黃取汁) 6.4kg, 인삼가루 960g, 백복령말(白茯末) 1,920g, 백밀련(白蜜煉)을 고루 섞어서 사기항아리에 넣고 유지(油紙) 5겹과 두꺼운 천 1겹으로 항아리의 입구를 꼭 봉한 다음, 냄비 속에 넣어 수중(水中)에 매달아 놓고 항아리의 입구는 물 위로 나오게 하고 3일 동안 중탕하여 끓여. 경옥고를 제조하였고, 이를 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실시예 1. 지황 추출물의 제조

지황 (영남약업사) 1,200g을 음건하여 마쇄한 후 물 3,600L을 가하여, 85℃에서 3시간 동안 2회 반복 추출하였다. 여과 및 감압 농축하여 지황 추출물 240g을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다 (이하 "SJH"라 명명함). 상기 지황 추출물은 분말 형태로 얻게 되며, 이를 물에 퍼센트 농도로 희석시켜 농도별 지황 추출물을 얻을 수 있었다.

실시예 2. 세포의 지황 추출물 처리 - UV 방사(irradiation)

세포 사멸 실험에 사용된 세포는 60mm 배양접시에 세포를 5 × 10⁵ cells/ml밀도로 유지한 후 상기 실시예 1의 SJH를 0.5~2 mg/ml 농도로 12 시간동안 전처리하고, UV (254 nm)를 22 cm 높이에서 30초간 쬐어준 후 6시간 동안 37^oC에서 배양하 였다. 세포 사멸이 유도된 세포는 수거하여 초음파 분해 버퍼(sonication buffer) (20 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/2 mM phenylmetylsufonyl fluoride)에 녹여 초음파 세포 파쇄기를 이용하여 파쇄하고 4^oC에서 12,000 × g에서 15분 동안 원심 분리한 상등액을 수거하여 단백질 양을 정량한 후 실험에 사용하였다.

실험예 1. UV에 의한 세포 형태 변화시 지황 추출물의 역할

세포가 외부의 자극을 받아 손상될 때 일차적으로 세포의 형태 변화를 동반할 수 있다. 그래서 본 실험에서는 우선적으로 생지황을 농도별로 처리한 세포주에 UV를 쬐어준 다음 37℃ 배양기에서 6시간 동안 반응시킨 후 세포의 겉보기 형태를 관찰을 하였다. 그 결과 UV를 쬐어준 후 6시간부터 세포들의 모양이 깨지고 일그러지는 것들이 보이기 시작했다. 이러한 현상은 생지황 농도가 높아질수록 눈에 띄게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이것으로 생지황이 UV에 의한 세포 손상으로부터 세포를 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조).

실험예 2. 세포내 산화환원반응 상태(Redox status) 및 막전위변화(MPT; membrane potential transition) 변화 비교

2-1. 세포내 ROS(reactive oxygen species) 측정

세포내 라디칼 생성 정도를 산화제 민감 프로브(oxidant sensitive probe)인 DCFHDA를 사용하여 여기(exicitation) 파장은 504 nm, 방출(emission) 파장은 524 nm에서 과산화물(peroxide)에 의해 DCFHDA가 산화되어 생성되는 DCF의 형광세기를 측정하였다. 손상된 세포를 10 μM의 DCFHDA 환경에서 20분간 배양 후 PBS로 여러 번 수세하여 Zeiss Axiovert 200 현미경을 이용하여 FITC 영역 (Ex ; 488 nm, Em; 520 nm)에서 DCF의 형광세기를 사진으로 측정하였다.

2-2. 미토콘드리아 ROS 측정

세포사멸이 유도되면 미토콘드리아의 손상도 병행하여 발생하게 된다. 이런 미토콘드리아의 손상은 미토콘드리아 내에서 발생한 ROS의 발생량을 측정함으로써 확인할 수 있는 데, DHR(dihydrorhodamine 123)은 그 자체로는 형광을 나타내지 않다가 세포사멸에 의한 ROS에 의해 Rh-123(rhodamine 123)로 전환되어 형광을 발생시킨다. 그래서 세포에 열 스트레스를 가해 세포사멸을 유도시킨 후, 5 μM DHR을 처리하여 1시간 반응시킨 다음 Zeiss Axiovert 형광 현미경으로 FITC 영역 (Ex; 488 nm, Em; 520 nm)에서 상대적인 형광 세기를 관찰하였다.

2-3. 미토콘드리아 막전위 변화 측정

MMP(Mitochondrial membrane potential)의 변화는 형광현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 형광프로브(fluorescence probe)인 Rh-123(rhodamine 123)의 uptake를 측정함으로써 구해질 수 있다. 실험을 위해 세포를 10 μM Rh-123(rhodamine 123) 환경에서 20분간 배양 후 PBS로 여러 번 수세하여 상대적인 형광 세기(fluorescence intensity)를 FITC 영역 (Ex; 488 nm, Em; 520 nm)에서 Zeiss Axiovert 200 현미경으로 측정하였다.

2-4. GSH ( Thiol ) 레벨 측정

세포 추출물내에 포함된 GSH이 DTNB(5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)와 반응하면 TNB(5-thio-2-nitrobenzoate)가 형성되고 이 과정에서 생성된 GSSG를 글루타치온 환원효소(glutathione reductase)가 다시 GSH로 환원시키는 연속적인 반응에서 생성되는 TNB를 측정하였다. 이 때 TNB 형성 정도는 전체 글루타치온(glutathione) 농도 (GSH + 2GSSG)와 비례한다. 0.1 M K-phosphate buffer (pH 7.0)/1 mM EDTA에 NADPH를 4 mg, DTNB를 1.5 mg, 글루타치온 환원효소(glutathione reductase)를 6 unit 되도록 넣고 412 nm (ε = 1.36 × 10⁴ M^-1㎝^-1)에서 흡광도 변화를 측정하였다. GSSG 측정을 위해서는 200 μg의 세포 추출물 100 μl에 50 μl의 10% 5-sulfosalicyclic acid를 넣어 원심 분리하여 단백질을 제거시키고 50 μl의 상등액에 1 μl의 2-비닐피리딘(2-vinylpyridine), 3 μl의 트리에탄올아민(triethanolamine)을 넣어 1시간 방치한 후 GSH 함량을 측정하는 것과 동일한 방법으로 GSSG 함량을 측정하였다. 이것을 전체 GSH + GSSG양에 대한 GSSG의 비율로 나타내었다.

2-5. 실험결과

SJH의 처리 유무에 따라, UV에 의해 세포 내에 발생하는 활성 산소종의 축적 에 어떤 차이가 있는가를 알아보기 위해 산화제 민감 프로브(oxidant-sensitive probe)인 DCFH-DA를 이용하여 형광 발현의 차이를 비교함으로써 조사하였다. 그 결과, UV를 쬐었을 때 생지황이 전 처리된 세포가 UV만을 쬐어 준 세포보다 형광세기가 약하게 나타난 것을 확인할 수 있었고, 이것으로 UV에 의해 생성되는 세포 내에 활성 산소종의 축적을 생지황이 감소시킴을 확인할 수 있었다. 또한 dihydrhodamin dye를 이용하여 미토콘드리아 내의 ROS 발생량을 측정하였고, 생지황이 방어 작용을 하는지를 확인하였다. Rhodamine 123 dye를 사용해서는 UV에 의한 미토콘드리아 막전위의 변화를 생지황이 차단할 수 있는 지를 확인하였다. 그 결과 UV만을 쬐어 준 세포주에서 막전위의 변이가 생겨 형광 dye의 밝기가 감소한데 반해, 생지황이 전처리된 세포주는 형광세기가 회복이 된 것을 볼 수 있다. 그리고 세포내 GSH 함량을 GSH에 선택적으로 반응하는 형광 dye인 CMAC을 이용하여 형광사진으로 측정하였다. 그 결과 UV만을 쬐어준 세포주에서 UV에 의해 감소되었던 GSH 형광이 생지황을 전처리한 세포주에서는 회복되는 것을 확인하였다. 이것은 GSH pool 측정 실험에서 실행했던 GSSG/GSHt 비율 결과에서도 비슷한 패턴의 결과를 얻었다. 세포 손상시 세포내 GSH의 GSSG로의 산화를 가중시키고 생지황은 이러한 세포내 산화를 감소시키는 것으로 생각된다. 상기의 결과에서 UV는 세포내 라티칼 생성 및 막전위 변화를 일으키고 세포를 산화상태에 놓이게 함을 알 수 있었고, 이러한 세포의 산화손상을 생지황이 감소시킴을 알 수 있었다 (도 2 및 도 3 참조).

실험예 3. 유세포 측정법(Flow cytometry)을 이용한 세포 주기 분석

FAC를 통한 유세포 측정법(flow cytometry) 분석법을 이용하여 DNA 함량 측정을 통한 세포 주기의 변화를 관찰하였다. U937 세포를 1,000 × g에서 5분간 원심 분리하여 수거하여 PBS buffer로 수세한 후, 70% (v/v) ice-cold ethanol에서 2시간 이상 세포 고정시켰으며, 고정된 세포를 1,000 × g에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 조심스럽게 버린 다음 RNase A (100 ㎍/㎕)를 함유한 요오드화 프로피디엄 (PI 50 ㎍/㎕, 0.1% NP-40)를 가하여 DNA 염색 시켜 유세포 측정법(flow cytometry) (FACS clider, Becton Dickinson, USA)로 분석하였다. 세포사멸은 Sub-G1 피크에서 일어남을 확인할 수 있었다 (도 4 참조).

실험예 4. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 및 캐스파제 활성 분석(Caspase activity assay)

4-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

세포 추출물의 상등액 (30~50 μg 단백질)을 10~12.5% SDS-PAGE로 분리한 후 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)한 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 필터를 3% 무지방 우유(nonfat milk)/TBST (2.42 g Tris base, pH 7.6, 8 g NaCl, 0.1% Tween 20) buffer 용액으로 1시간 동안 브로킹(blocking)시킨다. 그런 다음 세포 시그널(cell signal)에 관련된 1차 항체들을 각각 1시간 정도 상온에서 반응시키고 여러 번의 수세 과정을 거친 후, 1:2,000으로 희석시킨 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated)들을 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 필터는 여러 번 수세 후 ECL 웨스턴 블롯 탐지 키 트(western blot detection kit)로 확인하였다. 사용된 1차 항체는 anti-cleaved PARP, anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved caspase-8,anti-cleaved caspase-9, anti-lamin B, anti-AIF, anti-cytochrome C 그리고 anti-Bid 등이다.

4-2. 캐스파제 활성 분석(Caspase activity assay)

세포를 수거하여 PBS buffer로 여러 번의 수세 과정을 거친 후, 세포 용해 버퍼(lysis buffer, 50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA)로 0^oC에서 10분간 세포를 용해시키고, 4^oC에서 10,000 × g로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 그런 다음 상등액 30 μg단백질을 Ac-DEVD-pNA 캐스파제 기질(caspase substrate)이 첨가된 반응 버퍼(reaction buffer, 100 mM HEPES, pH 7.4, 0.5 mM PMSF, 10 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 10% glycerol)와 37^oC에서 한 시간 동안 반응시켜 멀티 플레이트 리더 (Bio-Rad, Hercules, 미국)로 측정하였다. 캐스파제 활성은 405 nm에서 10분 간격으로 측정하여 흡광도의 증가로 나타내었다.

4-3. 실험결과

4-3-1. MAP Kinase의 발현 및 비교

산화적 스트레스는 세포 내에서 세린-트레오닌 활성효소(serine-threonine kinase) 인 MAPK(mitogen-activated protein kinase)를 활성화시켜 복잡한 신호 전 달 경로를 자극하는 것으로 알려져 있다. 이 MAP Kinase familiy에는 ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2), JNK/SAPK(c-Jun NH₂-terminal kinase/stress-activated protein kinase)와 p38이 있다. 이러한 MAP Kinase들은 UV에 의한 세포손상에서 유전자 반응(gene response)에 관여한다. ERK1/2는 일반적으로 분열촉진 시그널(mitogenic signal)에 활성화되는 반면 JNK와 p38은 UV 방사(radiation), 항염 사이토카인(inflammatory cytokine), 열 쇼크(heat shock), 그리고 DNA-damaging agent와 같은 외부 스트레스에 의해 활성화 된다고 알려져 있다. ERK의 활성화는 세포증식과 분화에 관여하고 또한 산화적 스트레스에 의해 자극되는 종양성장(tumorgenesis)에도 역할을 하며, JNK와 p38의 활성은 세포의 성장을 멈추게 하고 세포 사멸을 유도한다.

MAP Kinase의 활성은 항산화 물질에 의해 감소된다고 보고되어지고 있고, 이는 MAPK 신호 경로(signaling pathway)가 산화적 스트레스의 중요한 target임을 보여준다.

UV에 의해 유도된 세포 사멸에서 생지황을 전처리한 세포주와 처리하지 않은 세포사이의 MAPKs의 발현정도를 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 확인하였다. UV에 의해 MAPK 단백질들의 인산화반응(phosphorylation)이 3시간에서 6시간 사이에서 증가하였고 생지황이 전처리한 세포의 경우 상대적으로 인산화반응(phosphorylation)이 감소하였다. 이는 생지황이 UV에 의해 발생하는 MAPKs 활성을 저해하여 산화적 스트레스에 의한 신호 변환을 막는 것을 의미함을 확인할 수 있었다 (도 5 및 도 6 참조).

4-3-2. Apoptotic Marker 의 발현

세포사멸의 주요 신호 전달은 캐스파제 캐스케이드(caspase cascade)에 의해 일어난다. 캐스파제 8(Caspase 8)은 활성화되어 Bid의 절단과 프로캐스파제3(procaspase 3)를 활성화 시킴으로써 세포 사멸을 증진 시킨다. 절단된 Bid는 미토콘드리아로 이동하여 MPT (membrane permeabilty transition)의 변화를 가져오고, 이로 인해 미토콘드리아에서는 Cytochrome C와 AIF 등을 방출시키고 다운스트림 캐스파제(downstream caspase; caspase 9, caspase 3)를 활성화 시킨다. 캐스파제-3(capase-3)은 절단되어 활성화되면 핵막의 구성 성분인 Lamin B를 절단하고, 폴리머라제인 PARP(poly ADP-ribose polymerase)를 절단해서 세포사멸 과정동안 회복 기능이 없어지게 한다. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통해 생지황을 전처리한 세포에서 처리하지 않은 세포보다 UV에 의한 세포사멸 지표의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 이러한 현상은 생지황의 농도가 증가할수록 뚜렷하게 나타났다. 또한 캐스파제-3(caspase-3)의 활성은 캐스파제 색도계 분석법(caspase colormetric assay)을 통해 측정하였다. 그 결과 캐스파제-3(caspase-3)의 활성이 SJH를 전처리한 세포에서 처리하지 않은 세포보다 저해됨을 확인하였다 (도 7 및 도 8 참조).

실험예 5. DNA 분열( fragmentation )

5-1. 아가로스 겔을 이용하여 DNA 분열 측정

Genomic DNA IsolationKit (NucleoGen)를 사용하여 게놈(genomic) DNA를 분리한 다음 2% 아가로스 겔에서 확인하였다.

측정 결과, 세포사멸을 유도한 세포를 수거하여, Genomiv DNA를 분리한 다음 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 절단을 확인하였다. 그 결과, 생지황이 전처리된 세포가 처리하지 않은 세포보다 DNA의 절단의 정도가 적은 것을 관찰할 수 있었다 (도 9 참조).

5-2. DAPI 염색을 통한 DNA 분열 측정

DAPI 염색은 세포사멸 핵 측정(apoptotic nuclei determination)에 사용된다. 실험을 위해 U937 세포를 수거하여 PBS buffer로 수세한 후, 70%(v/v) ice-cold 에탄올로 밤새 고정하여 0.8 μg/ml 4,6-diamidingo-2-Phenylindole (DAPI, Sigma)로 염색한다. 세포사멸 세포의 형태학적 변화들은 DAPI 영역 (Ex; 351 nm, Em; 380 nm)에서 Zeiss Axiovert 200 현미경으로 관찰하였다.

측정 결과, 세포는 세포사멸이 일어나면 염색체의 응축이 일어나는 데 이러한 핵 모양의 변화를 DAPI를 사용해 확인하였다. 염료가 세포로 들어갈 수 있게 세포를 고정시킨 후 DAPI로 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, UV에 의한 세포사멸이 유도되었을 때, 생지황이 전처리된 세포가 처리하지 않은 세포보다 염색체의 응축 정도가 적은 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 6. 유세포 측정법( Flow cytometry )에 의한 Annexin -V와 요오드화 프로피디엄(Propidium Iodide)의 이중 염색( double staining )

세포를 수거하여 PBS로 수세한 후, 1X annexin-binding buffer (25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.1% bovine serum albumin) 100 ㎕로 resuspention하고 annexin V/FITC를 5 ㎕ 와 요오드화 프로피디엄 1 ㎕ (100 ㎍/ml)을 처리한 후 상온에서 15분 동안 배양한 후 1X annexine-binding buffer를 400 ㎕ 첨가한 후 유세포 측정법(flow cytometry)으로 530 nm, 610 nm에서 측정하였다.

측정 결과, PS의 구체화(externalization)는 초기 세포사멸을 측정하는 데 사용되는 지표이다. 이를 측정하기 위해 Annexin V/FITC와 PI를 double staining하여 Flow cytometry로 확인하였다. 일반적으로 정상 생존 세포(normal live cell)에서 PS는 세포막의 사이토플라즈마 표면(cytoplasmic surface)에 위치하지만 세포사멸 세포(apoptotic cell)에서는 PS가 세포막의 바깥쪽으로 노출된다. UV를 쬔 세포에서 초기 세포사멸 (only Annexin V/FITC)이 증가하였고, 생지황의 농도가 증가할 수록 UV에 의한 세포사멸이 방어됨을 확인하였다. 또한 실험을 수행한 조건에서는 후기 세포사멸 (double Annexin V/FITC and PI staining)과 세포 괴사 (only PI staing)는 거의 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다 (도 10 및 도 11 참조).

실험예 7. 과산화수소( Hydrogen peroxide )의 스커벤징 분석( scavenging assay ) 및 DPPH 자유 라디컬( free radical)의 스커벤징 분석( scavenging assay )

7-1. 과산화수소( Hydrogen peroxide )의 스커벤징 분석( scavenging assay )

다양한 농도의 실시예 1의 SJH (0, 0.5, 1, 2 mg/ml) 500 ㎕를 과산화수소(hydrogen peroxide)(40 mM) 용액 500 ㎕ 와 섞고 상온에서 10분간 둔 후 분광광도계(spectrophotometer)에서 230 nm의 흡광도를 측정한다. Blank solution은 과산화수소(hydrogen peroxide)가 들어 있지 않은 인산염 버퍼(phosphate buffer)로 한다.

하기 수학식 1을 이용하여 측정하였다.

7-2. DPPH 자유 라디컬(free radical)의 스커벤징 분석(scavenging assay)

다양한 농도의 실시예 1의 SJH (0, 0.5, 1, 2 mg/ml) 100 ㎕를 50 μM DPPH 용액 100 ㎕ 와 섞고 상온에서 30분간 둔 후 마이크로플레이트 리더에서 517 nm의 흡광도를 측정한다. 하기 수학식 2를 이용하여 측정하였다.

7-3. 실험결과

SJH의 활성 산소종의 제거 능력을 알아보기 위해 과산화수소(hydrogen peroxide)와 DPPH 자유 라디컬(free radical)의 스커벤징 분석(scavenging assay)을 수행하였다. SJH는 0, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 실험하였고, SJH가 과산화수소(hydrogen peroxide)와 DPPH 자유 라디컬(free radical)를 제거함을 확인하였다. 이러한 제거 능력은 생지황의 농도가 높아질수록 증가하였다 (도 12 참조).

실험예 8. 멜라닌 양 측정

8-1. 흡광도를 이용한 멜라닌 정량

60 mm 배양용기에 B16/F10 멜라노마 세포를 5 × 10⁴ cells/ml 로 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1의 SJH를 0, 0.5, 1, 2 mg/ml , 상기 참고예 3의 경옥고는 0, 1, 2 mg/ml 농도로 처리하였고, 37^oC CO₂ 인큐베이터에서 48시간동안 배양하였다. 48시간 배양 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후 1X trypsin/EDTA를 1 ml 씩 가하여 세포를 수거하였다. 각 군당 5 × 10⁵ 개의 세포를 원심 분리하여 세포 침전물을 얻고, 0.1M 인산염 버퍼 (pH 6.8)와 1% triton X-100로 구성된 lysis buffer를 100 ㎕씩 가하여 세포를 파괴한 후 원심 분리하여 침전물만 사용하였다. 세포침전물에 100% 에탄올을 가하여 세척한 후 건조시킨 후 1% DMSO가 첨가된 1N 수산화나트륨 100 ㎕를 가하여 80℃에서 1시간동안 용해하였다. 용해한 용액의 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이는 합성멜라닌(Sigma chemical Co.)을 기준으로 하여 자성된 표준곡선에서 멜라닌을 정량하였다. 멜라닌의 양은 1% DMSO가 첨가된 1N 수산화나트륨 용액의 흡광도를 기준으로 백분율로 나타내었다 (도 13, 14 참조).

8-2. 멜라닌색소 침착의 육안적 관찰

상기 실험예 8-1과 동일한 방법으로 세포침전물을 얻고 침전물의 색 변화를 관찰하였고, 결과를 SJH는 도 15, 경옥고는 도 16 에 나타내었다 (도 15 및 16참조).

8-3. 실험결과

B16/F10 멜라노마 세포에 추출물을 처리하고 배양 2일 째 멜라닌 양을 측정한 결과 대조군에 비해 실시예 1의 SJH와 참고예 3의 경옥고를 각각 처리한 군에서 멜라닌의 양이 상대적으로 감소하였고, 이러한 현상은 농도에 의존하여 유의성 있 게 감소하였다. 또한 멜라닌 색소침착의 변화를 육안으로 확인 하였을 때도 생지황 및 경옥고 처리군에서 세포침전물의 색깔이 연하게 변하였으며 상기 결과를 통해 실시예 1의 SJH와 참고예 3의 경옥고가 멜라닌색소 침착을 저해함을 확인할 수 있었다.

실험예 9. 티로시나아제 활성 측정

9-1. 분광광도계를 이용한 흡광도 측정

티로시나아제는 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase), DOPA 산화효소(oxidase), 카테콜 산화효소(catechol oxidase) 활성을 가지고 있으며 본 실험에서는 DOPA 산화효소(oxidase) 활성으로 나타내었다. 60 mm 배양용기에 B16/F10 멜라노마 세포를 5 × 10⁴ cells/ml 로 분주하여 24시간 배양한 후, 실시예 1의 SJH를 0, 0.5, 1, 2 mg/ml, 참고예 3의 경옥고는 0, 1, 2 mg/ml 농도로 처리하였고, 37^oC CO₂ 인큐베이터에서 48시간동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 수세 후 수거하여 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1% 단백효소 억제제 혼합물(protease inhibitor cocktail)이 포함된 0.1 M 인산염 버퍼 (pH 6.8)를 첨가한 후 sonicator로 세포를 파쇄 하였다. 4^oC에서 1시간 동안 방치하여 티로시나아제를 생체막으로부터 용출시키고 4^oC, 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 Bradford method에 의해 정량하여 50 ㎍ 단백질을 활성 측정에 사용하였다. 50 ㎍ 단백질에 0.1% L-DOPA가 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)을 1 ml이 되게 첨가한 후 475 nm에서 흡광도 변화를 10분 간격으로 1시간동안 분광광도계를 이용하여 측정하였다. L-DOPA는 티로시나아제에 의해 DOPAchrome으로 산화되는 데 DOPAchrome의 흡광도변화를 측정함으로써 티로시나아제의 활성을 측정할 수 있다 (도 17 및 도 18 참조).

9-2. DOPA stainig gel 의 전기영동에 의한 활성 측정

60 mm 배양용기에 B16/F10 멜라노마 세포를 5 × 10⁴ cells/ml 로 분주하여 24시간 배양한 후, 실시예 1의 SJH 0, 0.5, 1, 2 mg/ml, 참고예 3의 경옥고는 0, 1, 2 mg/ml 농도로 처리하였고, 37^oC CO₂ 인큐베이터에서 48시간동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 수세 후 수거하여 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1% 단백효소 억제제 혼합물(protease inhibitor cocktail)이 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 첨가한 후 sonicator로 세포를 파쇄 하였다. 4^oC에서 1시간 동안 방치하여 티로시나아제를 생체막으로부터 용출시키고 4^oC, 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 Bradford method에 의해 정량하여 20 ㎍ 단백질을 활성 측정에 사용하였다. SDS-PAGE를 위한 샘플의 준비는 β-mercaptoethanol 과 열이 없는 조건으로 하였다. 8% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후 겔을 rinse buffer (0.1 M NaH₂PO₄, pH 6.8) 200 ml에 상온에서 30분간 흔들어 주어 equilibration 시킨다. 린스 버퍼(Rinse buffer)를 버리고 린스 버퍼(rinse buffer)에 5 mM L-DOPA가 첨가된 starting buffer 200 ml을 gel에 첨가한 후 37^oC 어두운 곳에서 약 2시간동안 배양하였다.

티로시나아제의 활성은 밴드(band) (containg DOPA-melanin)의 진한 정도로 비교하였다 (도 19 및 도 20 참조).

9-3. 실험결과

멜라닌 세포에서 멜라닌 생합성이 일어나는 주요기전은 티로시나아제가 활성화 됨으로써 가속화된다. 즉, 티로시나아제(Tyrosinase)의 활성 저해를 통해 멜라닌 생합성을 막을 수 있다. 따라서, 실시예 1의 지황 추출물과 참고예 3의 경옥고의 B16/F10 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향은 대조군의 티로시나아제(tyrosinase) 활성에 비해 활성이 저해되었고, 또한 이러한 현상은 각각 추출물의 농도 의존적으로 감소하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 유연 화장수

번 호	원 료	단위 (중량%)
1	지황 추출물 (실시예 1)	4.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	폴리옥시에칠렌(60) 경화피마자유	0.5
5	에탄올	6.0
6	향료, 방부제, 색소	적량
7	정제수	잔량
	합 계	100.0

제제예 2. 영양로션

번호	원 료	단위 (중량%)
1	지황 추출물(실시예 1)	10.0
2	스쿠알란	4.0
3	유동파라핀	3.0
4	카프릴릭/카프릭 글리세라이드	4.0
5	스테아린산	1.0
6	세틸알코올	1.0
7	글리세릴모노스테아레이트	0.5
8	폴리솔베이트 60	1.5
9	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
10	글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.0
11	글리세린	3.0
12	부틸렌글리콜	2.0
13	카보머	0.1
14	트리에탄올아민	0.1
15	방부제, 색소, 향료	적량
16	정제수	잔량
	합 계	100.0

제제예 3. 영양크림

번호	원 료	단위 (중량%)
1	지황 추출물(실시예 1)	10.0
2	스쿠알란	5.0
3	유동파라핀	3.5
4	카프릴릭/카프릭 글리세라이드	4.5
5	스테아린산	1.5
6	세틸알코올	2.0
7	밀납	1.0
8	바셀린	2.0
9	글리세릴모노스테아레이트	1.0
10	폴리솔베이트 60	1.5
11	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
12	글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.5
13	글리세린	5.0
14	부틸렌글리콜	5.0
15	카보머	0.2
16	트리에탄올아민	0.2
17	방부제, 색소, 향료	적량
18	정제수	잔량
	합 계	100.0

제제예 4. 에센스

번호	원 료	함량(중량%)
1	지황 추출물(실시예 1)	0.5
2	시토 스테롤	1.70
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50
4	세라마이드	0.7
5	세테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	선플라우어오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량
계		100.0

제제예 5. 친수성 연고제

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	지황 추출물(실시예 1)	0.5	-
2	지황 추출물	-	0.5
3	백색 바세린	250	250
4	스테아릴 알콜	220	220
5	에칠(또는 메칠)p-옥시벤조에이트	0.25	0.25
6	프로필렌 글리콜	120	120
7	라우릴 황산 나트륨	15	15
8	프로필 p-옥시벤조에이트	0.15	0.15

도 1은 지황 추출물을 미처리 또는 전처리한 U937 세포의 UV에 의한 형태 변화를 나타낸 도이고,

도 2는 지황 추출물을 미처리 또는 전처리한 U937 세포의 UV에 의한 다양한 형광 염색을 나타낸 도이며,

도 3은 U937 세포의 UV에 의한 GSSH/GSHt를 나타낸 도이고,

도 4는 유세포 측정법을 이용한 세포 주기 분석을 나타낸 도이며,

도 5는 U937 세포에서의 ERK, JNK, p38 MAPK 활성을 나타낸 도이고,

도 6은 U937 세포의 다양한 아폽토시스 관련 단백질의 이뮤노블롯 분석을 나타낸 도이며,

도 7은 세포 추출물에 대한 이뮤노블롯 분석을 나타난 도이고,

도 8은 U937 세포에서의 caspase-3의 활성을 나타낸 도이며,

도 9는 아가로스 겔을 이용한 DNA fragmentation 및 DAPI 염색을 통한 DNA fragmentation을 나타낸 도이고,

도 10은 유세포 측정법에 의한 Annexin-V와 요오드화 프로피디엄의 이중 염색을 나타낸 도이며,

도 11은 괴저성 세포 사멸을 나타낸 도이고,

도 12는 지황 추출물의 과산화 수소와 DPPH 자유 라디컬의 스커밴징(scavenging)효과를 나타낸 도이며,

도 13은 B16/F10 세포의 티로시나아제 활성을 나타낸 도이고,

도 14는 경옥고의 멜라닌 함량을 나타낸 도이며,

도 15는 지황 추출물의 세포 침전물 상태를 나타낸 도이고,

도 16은 경옥고의 세포 침전물 상태를 나타낸 도이며,

도 17은 지황 추출물의 멜라닌 함량을 나타낸 도이고,

도 18은 경옥고의 티로시나아제 활성을 나타낸 도이며,

도 19는 지황 추출물의 티로시나아제 활성을 밴드(band)로 나타낸 도이고,

도 20은 경옥고의 티로시나아제 활성을 밴드(band)로 나타낸 도이다.

Claims (7)

1. 지황을 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 1 내지 2배 분량의 물로, 60℃ 내지 90℃의 추출온도에서 열수 추출한 후 수득한 물 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득한 지황 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 각질 제거용 피부외용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 지황을 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 1 내지 2배 분량의 물로, 60℃ 내지 90℃의 추출온도에서 열수 추출한 후 수득한 물 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득한 지황 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 각질 제거용 화장료 조성물.
7. 삭제

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