KR20210158265A - 자연살해 세포 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물 및 약학 조성물 - Google Patents
자연살해 세포 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물 및 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포의 배양액을 포함함으로써, 피부 세포 증식 효과 및 간세포 증식 효과가 우수하여, 피부 질환과 더불어 간 질환의 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수한 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 자연살해 세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해 세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 자연살해 세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해 세포 배양액을 포함하는 간 질환 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
면역체계를 구성하는 세포들 중, 특히 자연살해세포(natural killer cell; 이하 NK 세포라고 함)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 행동세포이다.
이러한 NK 세포의 다양한 기능 중 특히, 암세포를 선택적으로 살상하는 능력이 밝혀지면서 많은 관련 연구들이 진행되었는데, 암 환자의 경우, 말초 혈액의 NK 세포 수나 활성이 정상인보다 감소하였으며, 동물실험에서 NK 세포활성이 저하되면 암 발생 및 암전이 위험이 증가하는 것으로 알려졌다.
또한, NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암세포에 대항하기 위한 선천성 면역 반응과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는데, NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) B와 같은 세포 용해성 과립을 면역 시냅스를 통하여 표적 세포에 분비하는 것으로, 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임이 표적 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다.
이와 같이, NK 세포는 세포가 악성으로 변형되는 발암과정이나, 바이러스 감염 초기의 방어기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었으나, 상기 NK 세포 자체가 아닌 이의 분비물질 등에 대한 연구, 이의 새로운 용도 등에 대한 연구는 미진한 실정이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 거동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 많은 기능을 가지는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
본 발명의 목적은 NK 세포 배양액 유래 엑소좀 또는 NK 세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 NK 세포 배양액 유래 엑소좀 또는 NK 세포 배양액을 포함하는 간 질환 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 NK 세포 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 1 이상의 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 NK 세포 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 1 이상의 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 NK 세포 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
1. 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 화장료 조성물.
4. 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 위 4에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 약학 조성물.
7. 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 간 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 위 7에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
9. 위 7에 있어서, 상기 간 질환의 개선은 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상 개선을 포함하는 것인 약학 조성물.
10. 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 간 질환의 개선, 예방 또는 치료 기능성 식품 조성물.
11. 위 10에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 간 질환의 개선은 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상 개선을 포함하는 것인 식품 조성물.
13. 위 1, 4, 7 또는 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상용 엑소좀 분리 시약을 사용하여 분리하는 방법, TFF 방법, 초원심분리(Ultracentrifuge), 한외여과(Ultrafiltration) 및 SEC(Size Exclusion Chromatography)를 포함하는 방법 중 1 또는 그 이상의 엑소좀 분리 방법으로 분리하는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
본 발명에 따른 엑소좀은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색의 개선과 관련된 다양한 인자들의 증가, 발현 수준의 향상 효과가 우수하다. 이에, 이를 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 상기 증상들의 개선 효과가 우수하고, 약학 조성물은 상기 질병의 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
또한 본 발명에 따른 엑소좀은 간 조직을 재생시키는 효과가 우수하여 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상을 예방, 개선시키거나 치료하는 목적으로 사용할 수 있다.
도 1은 NK 세포 배양액으로부터 유래하는 엑소좀의 크기 분포와 농도를 측정한 결과이다.
도 2는 NK 세포 배양액으로부터 유래하는 엑소좀의 TEM (투과 전자 현미경) 결과이다.
도 3은 NK 세포 배양액으로부터 유래하는 엑소좀의 표면 단백질 마커를 항체를 이용하여 확인한 결과이다.
도 4는 NK 세포 배양액 자체 및 이로부터 유래하는 엑소좀의 인간 섬유아세포에서의 세포 증식능 확인 결과이다.
도 5는 NK 세포 배양액 자체 및 이로부터 유래하는 엑소좀의 간세포에서의 세포 증식능 확인 결과이다.
도 2는 NK 세포 배양액으로부터 유래하는 엑소좀의 TEM (투과 전자 현미경) 결과이다.
도 3은 NK 세포 배양액으로부터 유래하는 엑소좀의 표면 단백질 마커를 항체를 이용하여 확인한 결과이다.
도 4는 NK 세포 배양액 자체 및 이로부터 유래하는 엑소좀의 인간 섬유아세포에서의 세포 증식능 확인 결과이다.
도 5는 NK 세포 배양액 자체 및 이로부터 유래하는 엑소좀의 간세포에서의 세포 증식능 확인 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 개선용 화장료 조성물은 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀을 포함한다.
자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)는 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포로, 정상인 혈액 내에 약 10~15% 가량 존재하며, 비자기(nonself)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 virus에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, NK cell은 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거한다. 이에, 자연살해세포는 면역항암제로서의 적용을 위해 연구되고 있다.
그런데, 본 발명자들은 상기 자연살해세포 자체가 아닌, 자연살해세포 배양액과 배양액으로부터 유래하는 엑소좀이 위의 용도와는 다른, 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 개선에 효과를 가지는 것을 발견하였고, 이에 본 발명을 완성하였다.
또한 본 발명의 자연살해세포 배양액과 배양액으로부터 유래하는 엑소좀이 위의 용도와는 다른, 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상을 예방, 개선시키거나 치료하는 효과를 가지는 것을 발견하였고, 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 예를 들면 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하여, 잔재하는 배양액으로부터 얻어질 수 있고, 잔재하는 배양액 자체를 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 상업적으로 구매할 수 있는 엑소좀 분리 시약(예컨대 ExoQuick-TC™)을 이용하거나 TFF (Tangential Flow Filtration) 방법을 이용하여 배양액으로부터 엑소좀을 분리해 낼 수 있으며, 이 방법 외에도 초원심분리(Ultracentrifuge), 한외여과(Ultrafiltration) 또는 SEC(Size Exclusion Chromatography) 방법을 이용하여 배양액으로부터 엑소좀을 수득할 수 있으며, 여기에 기재한 엑소좀 수득 방법 만으로 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 분비물을 포함하는 화장료 조성물의 경우, 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 미스트, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀을 포함하는 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색의 개선용 약학 조성물을 제공한다.
자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 전술한 범위 내의 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하여 피부 질환 또는 간 질환의 예방 및 치료용 의약 제제로 제제화 할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의약 제제로 제조되기 위해 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 제형으로 제제화될 수 있는데, 일반적으로, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.1 내지 100 mg/㎏의 양, 바람직하게는 1 내지 30 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 등에 따라서도 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피부 도포, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피내, 자궁내 경막 투여, 비강내(nasal), 네뷸라이저(nebulizer) 등을 이용한 흡입 투여 또는 뇌혈관 내 주사 등으로 투여할 수 있다. 간 질환을 개선 또는 예방하기 위한 목적으로 본 발명의 약학 조성물은 간문맥, 간정맥으로 직접 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 자연살해세포 배양액으로부터 엑소좀의 수득
1.1 자연살해세포 배양액의 수득
본 발명의 엑소좀을 수득하기 이전의 NK 세포 배양액은 선행특허 제2014467호에 기재한 방법에 따라 수득하였다.
1.2 자연살해세포 배양액으로부터 엑소좀의 수득
NK세포 배양액으로부터 엑소좀의 분리는 상용화된 엑소좀 분리 시약 ExoQuick-TC™ (System Biosciences)를 사용하여 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하였다.
0.22㎛ 필터를 사용하여 세포 배양액 내에 존재하는 세포와 세포 불순물 (cell debris)을 제거하였다. 세포와 세포 불순물을 제거한 세포배양액을 ExoQuick-TC™와 5대 1의 비율로 섞는다. 이것을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 4 ℃ 1,500 x g에서 30 분 원심분리시키고 상층액을 제거하였다. 가능한 남은 유체를 모두 제거하기 위해 4 ℃ 1,500 x g에서 5 분 동안 한 번 더 원심분리를 진행한 후, 상층액을 완전히 제거하였다. 엑소좀 펠렛 (pellet)에 PBS를 200㎕ 첨가하여 재현탁시켰다. 본 과정에서 분리한 엑소좀을 편의상 엑소좀(EXQ)로 명명하였다.
1.3 TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
0.22㎛ 필터로 여과시킨 NK세포 배양액으로부터 TFF (Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하여 엑소좀을 분리 및 농축하였다. TFF 방법에는 카세트 필터 (cassette filter; Merck Millipore)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단 (molecular weight cutoff; MWCO)을 목적으로 선택할 수 있으며, 본 실험에서는 엑소좀의 분자량을 고려하여 MWCO 300,000 Da (Dalton)의 필터를 사용하였다. 선택한 MWCO 필터에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리 및 농축하였고, 300,000 Da 보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다. 본 과정에서 분리한 엑소좀을 편의상 엑소좀(TFF)로 명명하였다.
이하의 실험은 상기 실시예의 엑소좀(EXQ) 및 엑소좀(TFF)를 사용하여 실시하였으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 엑소좀을 수득하는 방법은 초원심분리(Ultracentrifuge), 한외여과(Ultrafiltration) 또는 SEC(Size Exclusion Chromatography)를 이용하여 수득할 수 있으며, 여기에 기재한 엑소좀 수득 방법 만으로 한정하는 것은 아니다.
실시예 2. 엑소좀의 확인
2.1 NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)
NK 세포배양액으로부터 분리시킨 엑소좀을 PBS에 적절하게 희석하여 Nanosight (NS300, Malvern, UK)를 이용하여 기기 사용 방법에 따라 엑소좀 입자의 크기 분포 및 농도를 측정하였다.
엑소좀의 크기 분포 및 농도를 측정하기 위하여 나노 입자 트래킹 분석 (NTA)을 진행한 결과, NK세포배양액 유래 엑소좀 (EXQ) 및 NK세포배양액 유래 엑소좀 (TFF)의 입자 크기 분포가 대략 50~200 nm인 것을 확인하였다. NK세포배양액 유래 엑소좀 (EXQ)의 평균 입자 크기는 약 115 nm이며, NK세포배양액 유래 엑소좀 (TFF)는 약 89 nm이다. (도 1)
2.2 TEM (Transmission electron Microscopy)
엑소좀의 형태학적 분석을 위하여 NK 세포배양액으로부터 분리한 엑소좀을 그리드(grids)에 1 분(minute) 동안 고정시키고 멸균수로 세척하였다. 이후 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 20초 동안 염색한 다음 완전히 마른 그리드를 TEM(Transmission electron microscope, Talos L120C, FEI, Czech)으로 촬영하였다.
TEM 촬영 결과로 볼 때, 본 발명의 엑소좀의 균일한 크기 및 균일한 형태의 구형의 입자인 것을 확인하였다. (도 2)
2.3 엑소좀 표면 마커의 항체 분석(Exosome Ab array)
NK세포배양액으로부터 분리한 엑소좀의 표면 단백질 마커 8종 (CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5, TSG101)을 확인하기 위하여 Exo-Check Exosome Antibody Arrays (EXORAY200A-4, System Bioscience, USA)를 이용하였다. Exo-Check Exosome Antibody Arrays kit에서 제공하는 멤브레인에 NK 세포배양액으로부터 분리한 엑소좀과 1 X blocking buffer를 첨가하여 2-8 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 1 X Washing buffer로 상온에서 5 분씩 2회 세척하였다. 그리고 5ml Detection buffer를 첨가하여 상온에서 30 분 반응시킨 후 발광 신호를 얻어 각각의 단백질의 발현 정도를 chemiluminescence (FUSION_SOLO.6S, Vilber, France)를 통해 분석하였다.
NK세포배양액 유래 엑소좀(EXQ)의 단백질 마커를 8종의 항체로 분석한 결과 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5, TSG101까지 모두 8종의 항체 존재를 모두 확인하였다. 특히, 막 단백질인 테트라스파닌의 일종인 CD81 및 CD63 마커와 멀티 베지큘러 바디 (multivesicular body, MVB)의 생성에 관여하는 TSG101 마커의 발현량이 다른 단백질 마커에 비해 높게 나타남을 확인하였다. (도 3)
실험예 1. 엑소좀의 인간 섬유아세포 증식능 평가
인간 섬유아세포에서 NK 세포 배양액과 NK 세포 배양액 유래 엑소좀의 증식능을 평가하기 위하여 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 을 사용하였다. 본 실험의 세포 증식능 결과는 피부의 주름 개선 효능을 평가할 수 있는 지표로 활용된다.
인간 섬유아세포 (HDF-N)를 96 well plate에 1.5 x 104 cells/well로 분주하여 세포 배양조건에서 24 시간 배양하였다. FBS가 제외된 배지에서 24 시간 배양하여 기아상태를 유지시킨 후 기존 배지를 제거하고 시험물질을 처리하여 24 시간 동안 추가 배양하였다. 본 실험에서 시험물질은 대조군(Con), FBS(양성대조군), NK 세포배양액 원액, NK 세포배양액 유래 엑소좀 2종류 (EXQ 및 TFF) 그리고 TFF 필터를 빠져나간 투과물인 TFF permeate까지 6종으로 구분하였다.
FBS(양성대조군)은 본 실험에 사용하는 HDF-N 세포가 원활하게 증식 하도록 2% FBS를 포함하는 fibroblast medium을 사용한 조건에 해당한다. 또한 TFF permeate는 엑소좀(TFF) 농축 과정에서 여과막을 통과한 유체이며, 300 kDa보다 작은 물질들로 이루어져 있다.
세포의 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 solution을 FBS가 제외된 배지에 1/10 희석하고 이를 각 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 이후 30 분 - 1 시간 동안 배양기에서 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하였으며, 각 군의 세포 증식율은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 계산하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
NK세포배양액 원액 및 NK세포배양액 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 평가하고자 시험물질 6종 중 대조군(Con)과 FBS를 제외한 4종을 10%에서부터 1.25%까지 2배씩 희석하여 처리한 후 CCK-8 assay를 수행하였다.
실험 결과, NK세포배양액 원액 및 NK세포배양액 유래 엑소좀에 의하여 세포 증식능이 농도의존적으로 증가하였다. 먼저, NK세포배양액 원액은 최대 농도인 10%에서 139% 증가하였으며 NK세포배양액 엑소좀(EXQ)과 NK세포배양액 엑소좀(TFF)은 각각 최대 162%, 161%까지 증가하였다. 이는 NK세포배양액 유래 엑소좀이 NK세포배양액 원액보다 더 높은 세포 증식 효과를 가지는 것을 의미한다. 이외에도 NK세포배양액 TFF permeate에서 최대 130%까지 세포 증식능을 보이는 것을 확인하였다. (도 4)
실험예 2. 간세포 증식능 평가
본 발명의 NK세포 배양액과 NK세포 배양액 유래 엑소좀의 간기능 개선 효능을 확인하기 위하여 인체 간암세포 HepG2 세포를 96-well plate에 well 당 1 x 104 cells로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24 시간 배양하였다. 기존 배지를 제거하고 시험물질을 처리하여 24시간 동안 단독 배양하였다. 본 실험에서의 시험물질은 대조군(Con), FBS 처리군, NK 세포배양액 원액 그리고 NK 세포배양액 유래 엑소좀(EXQ)이다. FBS 처리군은 본 실험에 사용하는 HepG2 세포가 원활하게 증식을 하는 배지 조건에 해당하는 10% FBS를 포함하는 MEM배지이며, 양성 대조군 목적으로 사용하였다.
DPBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 반응액을 FBS가 제외된 배지에 1/10 희석하고 이를 각 well 당 100 ㎕씩 처리하여 30분 ~ 1시간 동안 배양기에서 반응시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NK세포배양액 및 NK세포배양액 유래 엑소좀 (EXQ)의 간세포 증식 효능을 평가하기 위해 시험물질 4종 중 대조군(Con)과 FBS 처리군을 제외한 2종을 10%에서부터 1.25%까지 2배씩 희석하여 CCK-8 assay를 수행하였다. 실험결과, NK 세포배양액 원액과 NK 세포배양액 유래 엑소좀에 의하여 간세포 증식능이 농도의존적으로 증가하였고, 특히 NK세포배양액 원액 10% 처리군에서는 대조군 대비 최대 154%의 증식능 촉진을 나타내었다. (도 5)
NK 세포배양액과 NK 세포배양액 유래 엑소좀의 간세포 증식 효능은 NK세포가 증식할 때 분비해내는 성장인자나 생리활성 물질에 기인하는 것으로 판단할 수 있다.
실시예 3. 리포좀(liposome)의 제조
본 발명의 자연살해세포 배양액 및 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀은 용매, 계면활성제 및 지방산유도체와 배합하여 리포좀화시킬 수 있다. 자연살해세포 배양액 또는 엑소좀을 리포좀화시키기 위한 용매로 콜레스테롤, 부틸렌글리콜(butylene glycol) 또는 글리세린(Glycerine)을 사용할 수 있다. 지방산 유도체는 카프릴 트리글리세라이드(Caprylic triglyceride) 및/또는 카프리 트리글리세라이드(Capric triglyceride)를 사용할 수 있다. 계면활성제는 레시틴(lecithin) 또는 수화 레시틴(Hydrogemated lecithin)을 사용할 수 있다.
Claims (13)
- 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 화장료 조성물.
- 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 피부 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 약학 조성물.
- 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 간 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 간 질환의 개선은 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상 개선을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 자연살해세포 배양액 유래 엑소좀 또는 자연살해세포 배양액을 포함하는 간 질환의 개선, 예방 또는 치료 기능성 식품 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 자연살해세포의 배양액 유래 엑소좀은 CD63, CD81, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5 및 TSG101으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 1 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 간 질환의 개선은 간 조직 재생, 간 기능 개선을 포함하여 간염(NASH, ASH, NAFLD 또는 AFLD), 간경화 또는 간암의 증상 개선을 포함하는 것인 식품 조성물.
- 청구항 1, 4, 7 또는 10 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 엑소좀은 상용 엑소좀 분리 시약을 사용하여 분리하는 방법, TFF 방법, 초원심분리(Ultracentrifuge), 한외여과(Ultrafiltration) 및 SEC(Size Exclusion Chromatography)를 포함하는 방법 중 1 또는 그 이상의 엑소좀 분리 방법으로 분리하는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
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