KR20200141868A

KR20200141868A - 편도 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20200141868A
Application number: KR1020190068967A
Authority: KR
Inventors: 강미란; 김원식
Original assignee: 주식회사 티엠디랩
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2020-12-21

Abstract

본 발명은 편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 편도 줄기세포 유래 나노소포체는 암세포 증식 억제 및 암세포 사멸 유도 효과를 나타내는 바, 항암 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

편도 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 조성물{Composition for Anti-cancer comprising Nanovesicle from Tonsil-derived Stem Cells}

본 발명은 편도 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

암, 종양, 종양-관계된 질환들 및 종양성 질환은 매우 심각하여 종종 삶을 위협하는 상태를 유발한다. 상술한 질병들의 치료에 효과적인 치료제의 동정하기 위한 수많은 연구들이 진행되어 왔다. 일반적으로, 외과적 수술 및 방사선 치료법이 암의 치료를 위해 일차적으로 실시되며, 생존율이 낮을 지라도 특정 암에 대한 화학치료법은 암의 치료에 효과적이다. 현재, 화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법을 포함하는 대부분의 암 치료법은 암 세포에서 간접적으로 아팝토시스를 유도함으로써 기능한다.

한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 다양한 조직원, 일차적으로 골수(BM)로부터 분리되는 다능성(pluripotent) 전구세포의 군(population)을 포함한다. 적절한 조건 하에서, MSC는 외배엽, 내배엽 및 중배엽 세포 계통으로 유도될 수 있다. MSC는 다양한 기능적 말단 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문에 재생 의학에서 광범위하게 연구되었다. MSC는 시험관내 및 생체내 분화와 트랜스분화(transdifferentiation) 능력뿐 아니라 퇴행성 부위에 접목되어(engraft) 치료 기능을 수행할 수 있다. MSC는 치료 단백질의 전달을 위한 세포 비히클로서 고려될 수 있다.

또한, 나노소포체(Nanovesicle)는 생체막의 기본 구조인 인지질을 이용하여 외부와 구분된 지질막 형태를 이룬다. 나노소포체는 내부에 수용성 분자(DNA 포함) 또는 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라 지용성 약물을 붙이거나, 또는 양전하 및 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 인지질은 양친매성(amphipathic) 물질로서, 음이온성 또는 양쪽성 이온의 극성 분자단과 탄화수소 16개 내외의 다양한 불포화도를 갖는 2개의 비극성 지용성 사슬을 가지고 있는 분자구조이기 때문에 인지질이 물에 분산되어 자발적으로 베지클을 형성한다.

응용과학분야에서 나노소포체는 화장품 산업, 약물 전달, 및 생체 외(in vitro)에서 배양중인 세포에 유전물질을 전달하는 모델로 이용하고 있으며, 현재는 나노소포체 내에 수용성 및 지용성 물질 모두를 포획할 수 있고, 특정 조직에 표적이 용이하며, 크기 및 변형이 용이하고 인지질의 사용으로 독성의 문제점이 거의 없고, 포획시킬 수 있는 약물을 다른 약물운반체보다 더 많이 포획할 수 있으며, 치료효과를 높일 수 있는 장점이 있기 때문에 약물전달체(DDS: drug delivery system) 특히, 항암약물의 전달체로서 주목을 받고 있다.

국내공개특허 제10-2010-0114170호

본 발명자들은 항암 기능을 갖는 줄기세포 유래 나노소포체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 편도(tonsil)로부터 유래된 중간엽 줄기세포에서 분리한 편도 줄기세포 유래 나노소포체를 인간 흑색종 유래 A375P 세포주에 처리하는 경우 암세포 증식 억제 및 암세포 사멸 유도 효과를 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 편도 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 항암 기능을 갖는 줄기세포 유래 나노소포체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 편도(tonsil)로부터 유래된 중간엽 줄기세포에서 분리한 편도 줄기세포 유래 나노소포체를 인간 흑색종 유래 A375P 세포주에 처리하는 경우 암세포 증식 억제 및 암세포 사멸 유도 효과를 나타냄을 규명하였다.

본 발명은 편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "줄기세포(Stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.

상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 줄기세포는 편도(tonsil) 유래 줄기세포일 수 있다.

상기 편도 줄기세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암은 유방암, 구강암, 전립선암, 직장암, 비-소세포 폐암, 구순암, 위암, 대장암, 간암, 폐암, 항문암, 신장암, 외음부암, 구인두암(oropharyngeal cancer), 비강/부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암, 요도암, 소장암, 담도암, 방광암, 난소암, 후두암, 식도암, 담낭암, 대장암, 두경부암, 부갑상선암, 음경암, 질암, 갑상선암, 췌장암, 편평세포암, 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 백혈병-관련된 질환, 균상 식육종(mycosis fungoides) 또는 흑색종(melanoma)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 나노소포체(nanovesicle)는 항암 효과를 위한 약물이 로딩된 것일 수 있다.

상기 항암 효과를 위한 약물은 나노소포체 내부에 봉입되거나 나노소포체의 외부에 화학적으로 결합될 수 있다.

상기 항암 효과를 위한 약물은 인간을 포함한 동물에서 암을 저해, 억제, 경감, 완화, 지연, 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 의미한다.

상기 항암 효과를 위한 약물로는 예를 들어, 화합물, 단백질, 유전자, 펩타이드 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 항암 효과를 위한 약물은 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 테가푸르(tegafur), 이리노테칸(irinotecan), 도세탁셀(docetaxel), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 셈시타빈(cemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 미토마이신 C(mitomycin C), 빈크리스틴(vincristine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 토포테칸(topotecan), 타모시펜(tamoxifen), 비노렐빈(vinorelbine), 캄토테신(camptothecin), 다누오루비신(danuorubicin), 클로람부실(chlorambucil), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 칼리케아미신(calicheamicin), 마이아탄신(mayatansine), 레바이솔(levamisole), DNA 재조합 인터페론 알파-2a(DNA recombinant interferon alfa-2a), 미토산트론(mitoxantrone), 니무스틴(nimustine), 인터페론 알파-2a(interferon alfa-2a), 독시플루리딘(doxifluridine), 포메스테인(formestane), 류프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 카모포르(carmofur), 테니포사이드(teniposide), 블레오마이신(bleomycin), 카무스틴(carmustine), 헵타플라틴(heptaplatin), 엑세메스탄(exemestane), 아나스트로졸(anastrozole), 에스트라무스틴(estramustine), 카페시타빈(capecitabine), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 폴리사카라이드 칼륨(polysaccharide potassuim), 메드록시포게스테론 아세테이트(medroxypogesterone acetate), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 피라루비신(pirarubicin), 토포테칸(topotecan), 알트레타민(altretamine), 토레미펜 시트레이트(toremifene citrate), BCNU, 탁소텔(taxotere), 악티노마이신 D(actinomycin D) 및/또는 이들의 합성 아날로그 및 변형되거나 동일한 약효를 나타내는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다

본 발명의 약학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 상술한 편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에서 "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

이러한 세포치료제는 크게 두 가지로 분류할 수 있으며, 그 첫 번째는 조직 재생, 장기기능 회복 또는 면역세포의 기능조절을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 "면역세포 치료제"이다.

상기 줄기세포 치료제는 간암, 위암, 대장암, 전립선암, 방광암, 폐암 등의 암 질환 등의 치료대상 질병을 치료하는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 줄기세포 치료제는 상술한 본 발명의 약학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 편도 줄기세포(TMSC)와 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)의 성분을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)의 형태(morphology)를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)의 암세포 증식 억제를 평가한 도이다. (**p<0.01, ***p<0.001, ###p<0.001)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)의 암세포 사멸 유도를 평가한 도이다. (**p<0.01, ***p<0.001)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)의 암세포 사멸 유도를 평가한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예. 편도 줄기세포 유래 나노소포체 분리

먼저, 서울대병원 이비인후과에서 편도적출술을 시행한 환자로부터 적출된 편도조직(4-20세의 저연령층 조직)으로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, TMSC)를 얻어, 10% FBS(Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 low glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, hyclone)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 90% 밀집될 때까지 배양하였다.

다음으로, PBS에 부유시킨 편도 줄기세포(10⁶ cells/mL)를 가스 타이트 실린지(gas tight syringe)에 넣고 리테이너(retainer) 및 압출기(extruder) 사이에 끼운 10 μm, 5 μm 및 0.4 μm 직경의 다공성 폴리카보네이트 막(polycarbonate membranes) 사이를 각각 왕복으로 6회 이상 통과시켜 나노소포체를 분리하였다(Avanti® Polar Lipids Mini Extruder).

생산된 나노소포체는 원심분리 과정(14000rpm, 30분)을 통해 농축시키고, BCA protein assay 방법으로 단백질을 정량한 후, 사용 전까지 -20°C에서 보관하였다.

실험예 1. 편도 줄기세포 유래 나노소포체 확인

1-1. 편도 줄기세포 유래 확인

먼저, 상기 실시예에서 분리된 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV) 및 상기 실시예에서 사용된 편도 줄기세포(TMSC)에서 단백질을 분리하여 SDS-PAGE 겔 일렉트로포레이션(gel electrophoration) 후 쿠마씨 블루(commassie blue) 염색법을 이용하여 총 단백질(total protein)의 양상을 비교하였다.

도 1a에서 확인할 수 있듯이, 두 그룹의 단백질 밴드 양상이 유사함을 확인하였다.

다음으로, 상기 실시예에서 분리된 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV) 및 편도 줄기세포(TMSC)에 대하여, 줄기세포의 줄기세포능과 관련된 단백질(c-Myc, KLF4), 나노소포체 마커 단백질(CD9) 및 중간엽 줄기세포 마커 단백질(CD90)에 대한 웨스턴블롯(western-blot)을 실시하였다.

도 1b에서 확인할 수 있듯이, 발현양의 차이는 있었지만 두 그룹 모두 해당 단백질들을 포함하고 있음을 확인하였다.

이러한 결과는, 상기 실시예에서 분리된 편도 줄기세포 유래 나노소포체(TMNV)가 편도 줄기세포(TMSC) 유래 성분들을 포함하는 것을 의미한다.

1-2. 나노소포체 형태(morphology) 확인

상기 실시예에서 분리된 나노소포체의 형태는 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)을 사용하여 확인하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 구형의 모양과 다양한 크기의 입자가 존재하는 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 편도 줄기세포 유래 나노소포체 항암 효과 확인

2-1. 편도 줄기세포 유래 나노소포체의 암세포 부착 및 증식 억제 효과

인간 흑색종(human melanoma) 유래 암세포인 A375P 세포주(한국세포주은행)에 상기 실시예에서 분리된 나노소포체를 10ug/mL, 20ug/mL 및 40ug/mL로 처리한 후, 첫째 날 및 셋째 날에 MTT 분석을 수행하여 음성대조군에 대한 %로 증식률을 계산하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 음성대조군과 비교하여 실시예에서 분리된 나노소포체를 처리한 그룹들에서 유의적으로 세포의 증식이 억제되었다. 특히, 세포 증식 억제 효과는 나노소포체의 농도에 비례하여 증가하였다. 구체적으로, 10ug/mL로 처리한 그룹은 음성대조군과 비교하여 첫째 날은 부착력이 약 28%, 셋째 날은 증식률이 약 26% 감소되었다. 또한, 20ug/mL로 처리한 그룹은 첫째 날은 부착력이 약 30%, 셋째 날은 증식률이 약 29% 감소되었다. 끝으로, 40ug/mL로 처리한 그룹은 첫째 날은 부착력이 약 35%, 셋째 날은 증식률이 약 34% 감소되었다.

2-2. 편도 줄기세포 유래 나노소포체의 암세포 사멸 유도 효과

먼저, 인간 흑색종(human melanoma) 유래 암세포인 A375P 세포주(한국세포주은행)에 상기 실시예에서 분리된 나노소포체를 10ug/mL, 20ug/mL 및 40ug/mL로 처리한 후, 아팝토시스(apoptosis) 유도 마커인 BAX 유전자에 대한 realtime qauntitative PCR을 수행하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예에서 분리된 나노소포체를 20ug/mL(음성대조군 대비 약 19배) 및 40ug/mL(음성대조군 대비 약 32배)로 처리한 그룹의 BAX 유전자 발현이 음성대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다.

다음으로, 인간 흑색종(human melanoma) 유래 암세포인 A375P 세포주(한국세포주은행)에 상기 실시예에서 분리된 나노소포체를 10ug/mL, 20ug/mL 및 40ug/mL로 처리한 후, DNA fragment에 대한 TUNEL 염색을 실시하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 음성대조군과 달리, 실시예에서 분리된 나노소포체를 처리한 그룹들에서 TUNEL 염색 시그널(red)이 나타남을 알 수 있었다.

Claims

편도(tonsil) 줄기세포 유래 나노소포체를 포함하는 항암용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 편도 줄기세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)인, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 구강암, 전립선암, 직장암, 비-소세포 폐암, 구순암, 위암, 대장암, 간암, 폐암, 항문암, 신장암, 외음부암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 요도암, 소장암, 담도암, 방광암, 난소암, 후두암, 식도암, 담낭암, 대장암, 두경부암, 부갑상선암, 음경암, 질암, 갑상선암, 췌장암, 편평세포암, 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 백혈병-관련된 질환, 균상 식육종(mycosis fungoides) 및 흑색종(melanoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 편도 줄기세포 유래 나노소포체는 항암 효과를 위한 약물이 로딩된 것인, 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제.