WO2022240243A1 - 나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2022240243A1
WO2022240243A1 PCT/KR2022/006907 KR2022006907W WO2022240243A1 WO 2022240243 A1 WO2022240243 A1 WO 2022240243A1 KR 2022006907 W KR2022006907 W KR 2022006907W WO 2022240243 A1 WO2022240243 A1 WO 2022240243A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanovesicles
skin
composition
present
stem cells
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/006907
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김창수
노용권
김영재
박예진
Original Assignee
주식회사 뉴메이스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 뉴메이스 filed Critical 주식회사 뉴메이스
Publication of WO2022240243A1 publication Critical patent/WO2022240243A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/14—Liposomes; Vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm

Definitions

  • the present invention relates to a composition for skin whitening comprising nanovesicles as an active ingredient; And it relates to a quasi-drug composition for preventing or improving skin pigmentation.
  • melanin acts as a major factor determining skin color. It is known that melanin is generated in melanocytes present in the skin epidermis and then transferred to surrounding keratinocytes to show skin color. In addition, melanin protects the skin by preventing skin damage caused by ultraviolet rays and removing reactive oxygen species (ROS). However, it is known that chronic UV exposure induces pigmentation by promoting melanin production in melanocytes.
  • ROS reactive oxygen species
  • ⁇ -MSH ⁇ -melanocyte stimulating hormone
  • MC1R melanocortin 1 receptor
  • MITF microphthalmia transcription factor
  • Arbutin, mulberry extract, ethyl ascorbyl ether, oil-soluble licorice extract, and ascoliglucoside have been reported for use in reducing pigmentation or skin whitening.
  • arbutin is a component obtained by reacting glucose with hydroquinone extracted from bilberry, bearberry, blueberry, etc., and is known to be very helpful in skin whitening by suppressing the activation of melanin pigment and preventing skin pigmentation.
  • Hydroquinone has been used for melasma, freckles treatment and whitening cosmetics for a long time, but it is used only as a medicine because it can cause side effects such as vitiligo, skin allergy, dermatitis, and acne. It is known that the standard for the concentration of arbutin that shows the whitening effect is unclear because side effects may occur.
  • stem cell-based skin whitening compositions with excellent proliferation and differentiation potential and physiological activity in the body have been actively conducted.
  • Representative stem cell-based skin whitening materials are human stem cell cultures and plant stem cell culture extracts, and products such as skin whitening functional cosmetics using these are showing a significant increase.
  • verification of the whitening effect of these stem cell culture extracts has not been clearly made, and it has limitations in that it is difficult to purify the target composition to high purity during the extraction process.
  • most of the stem cell culture solutions developed as skin whitening compositions currently use general culture media, and only limited use is possible for reasons such as human safety due to antibiotics and serum in the media for cell growth and culture.
  • An object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin whitening containing nanovesicles as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for preventing or improving skin pigmentation comprising nanovesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin whitening containing nanovesicles as an active ingredient.
  • the nanovesicles may be derived from mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be those isolated from tissues selected from the group consisting of cartilage, bone tissue, adipose tissue, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid, placenta, and peripheral blood, but are not limited thereto. not.
  • the nanovesicles may be prepared by extruding or crushing mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • the composition may inhibit melanin synthesis induced by ⁇ -MSH ( ⁇ -Melanocyte-stimulating hormone) or IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) .
  • ⁇ -MSH ⁇ -Melanocyte-stimulating hormone
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the composition may inhibit the expression or activity of MITF (microphthalmia transcription factor) or tyrosinase.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or improving skin pigmentation comprising nanovesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for improving skin whitening comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • the present invention provides a method for inhibiting melanin synthesis comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • the present invention provides a method for preventing or improving skin pigmentation comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • composition according to the present invention has the effect of preventing the deposition of melanin pigment, alleviating or improving skin hyperpigmentation, and has a remarkable effect on improving skin whitening while minimizing side effects on the skin, so that it can be used as a skin whitening functional cosmetic or It can be usefully used as a quasi-drug.
  • the active ingredient of the present invention is (i) a material derived from human stem cells and has excellent biocompatibility, (ii) by removing only the stem cells after removing the cell culture medium and performing the separation process, minimizing concerns due to the content of impurities in the culture medium It has excellent biosafety, and (iii) by physically extruding and crushing stem cells, it contains a large amount of original whitening factors of stem cells compared to existing stem cell culture extracts, so it can be usefully used as a source material for cosmetics and quasi-drug compositions.
  • 1a is the result of observing the structure of the prepared nanovesicles through a cryogenic-transmission electron microscope (Cryo-TEM), and 1b is the particle size distribution of the nanovesicles using a nanoparticle tracking analyzer. (nanoparticle tracking analysis, NTA), 1c is the result of analyzing the attachment molecules of nanovesicles through western blot, and 1d is the result of cytotoxicity (cytotoxicity) using CCK-8 assay kit. ) is the result of the analysis.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • 1c is the result of analyzing the attachment molecules of nanovesicles through western blot
  • 1d is the result of cytotoxicity (cytotoxicity) using CCK-8 assay kit. ) is the result of the analysis.
  • Figure 2a is the result of confirming the expression levels of MITF and tyrosinase mRNA of nanovesicles through real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) (**** P ⁇ 0.0001 between groups), and 2b is MITF and tyrosinase This is the result of confirming the expression level of the enzyme protein through Western blot.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin whitening containing nanovesicles as an active ingredient.
  • nanovesicle refers to a cell-derived endoplasmic reticulum prepared by extrusion of stem cells, which is an endoplasmic reticulum of a nanometer-sized double lipid membrane structure having a cargo therein.
  • the nanovesicles of the present invention have a similar shape to exosomes having a double lipid membrane structure, but are different in that exosomes are vesicles naturally secreted from cells to the outside.
  • the nanovesicles may be prepared by extruding, crushing and reassembling stem cells, preferably, may be produced by extruding, crushing and reassembling mesenchymal stem cells, more preferably Preferably, it may be prepared by proliferating mesenchymal stem cells up to 7 passages and then extruding, crushing and reassembling the cells, more preferably, proliferating human adipose-derived stem cells up to 5 passages It may be prepared by extruding, crushing, and reassembling the cell pellets after processing, but is not limited thereto.
  • the nanovesicles are prepared by: (a) proliferating mesenchymal stem cells and then obtaining cell pellets; (b) extruding, disrupting, and reassembling the cells resuspended in the buffer through a membrane or passing through a microchamber to extrude, disrupt, and reassemble; and (c) obtaining nanovesicles after purifying, separating, and concentrating the suspension including the extruded/reassembled cells.
  • the mesenchymal stem cells are cultured in a culture medium to which 10-15% human platelet lysate (HPL) and 1-5 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF) are added. may have been multiplied.
  • HPL human platelet lysate
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the obtained cell pellet is resuspended in PBS (phosphate buffered saline) buffer, and the cells resuspended in PBS buffer are i) extruded through 5 ⁇ m and 0.4 ⁇ m PCTE (polycarbonate track etch) membranes, disrupted and or ii) extruding, disrupting, and reassembling the cells by passing them through a microchamber channel having a diameter of 30 to 200 ⁇ m.
  • PCTE polycarbonate track etch
  • stem cell refers to a cell that has the ability to differentiate into a specific tissue cell with relatively less developed undifferentiated cells
  • MSC mesenchymal stem cell
  • stem cells that exist in cartilage, bone tissue, adipose tissue, and bone marrow stroma differentiated from the mesoderm formed by division of a fertilized egg.
  • the mesenchymal stem cells may be those isolated from tissues selected from the group consisting of cartilage, bone tissue, adipose tissue, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid, placenta, and peripheral blood, but are not limited thereto.
  • skin whitening means not only clearing the skin tone by inhibiting the synthesis of melanin pigment, but also improving skin hyperpigmentation such as spots or freckles caused by ultraviolet rays, hormones, or heredity.
  • the composition may inhibit melanin synthesis induced by ⁇ -MSH ( ⁇ -Melanocyte-stimulating hormone) or IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine).
  • ⁇ -MSH ⁇ -Melanocyte-stimulating hormone
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the composition may inhibit the activity of tyrosinase.
  • the active ingredient of the present invention may be included in 0.0001 to 50% by weight based on the total weight of the cosmetic composition, preferably 0.001 to 30% by weight, 0.001 to 20% by weight, 0.01 to 20% by weight, It may be included in 0.1 to 20% by weight, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may include commonly used components, and may include, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and conventional auxiliary agents and carriers such as flavoring agents.
  • a functional additive may be further included, and the functional additive may include a component selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, high-molecular peptides, high-molecular polysaccharides, sphingolipids, and seaweed extracts.
  • oils and fats In addition to the ingredients, oils and fats, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, bactericides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments, fragrances, blood circulation promoters, Cooling agents, antiperspirants, purified water, and the like may be further included.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , It may be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, flexible lotion, nutrient lotion, skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrient lotion, massage cream, nutrient cream, moisture cream, eye cream, hand cream, foundation, Essence, nutritional essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, cleansing water, spray, powder, body lotion or body cleanser formulations can be prepared.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain a propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butyl glycol oil, fatty acid esters of glycerol, polyethylene glycol or sorbitan.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Star cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth and the like
  • a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Star cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth and the like may be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleanser
  • carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or improving skin pigmentation comprising nanovesicles as an active ingredient.
  • quadsi-drugs refers to products that are less active than pharmaceuticals among products used for the purpose of diagnosing, treating, improving, mitigating, treating or preventing human or animal diseases.
  • quasi-drugs Products used for the purpose of medicine are excluded, and include products used for the treatment or prevention of diseases in humans and animals, and products with mild or no direct action on the human body.
  • the quasi-drug composition of the present invention is used for the purpose of preventing or improving skin pigmentation, and the formulation is not particularly limited.
  • softening lotion, nutrient lotion, massage cream, nutrient cream, pack, mask pack It may be a cosmetic composition having a formulation of a mask sheet, gel, or skin-adhesive cosmetic, and may also be a transdermal formulation such as a lotion, ointment, gel, cream, patch, or spray.
  • the quasi-drug composition may arbitrarily select and mix other ingredients according to the formulation or purpose of use of other quasi-drugs.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of use (suppression or alleviation).
  • conventional adjuvants such as thickeners, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers may be included.
  • the quasi-drug composition may be for parenteral administration.
  • the present invention provides a method for improving skin whitening comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • the present invention provides a method for inhibiting melanin synthesis comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • the present invention provides a method for preventing or improving skin pigmentation comprising administering a therapeutically effective amount of nanovesicles to a subject.
  • the therapeutically effective amount depends on the type and degree of response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used as the case may be, the subject's age, weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route and composition. It is preferable to apply differently depending on the secretion rate, treatment period, various factors including drugs used together with or concurrently used with a specific composition, and similar factors well known in the medical field. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the foregoing.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates as well as livestock such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • Example 1 Analysis of characteristics and cytotoxicity of nanovesicles
  • the nanovesicles of the present invention were prepared by extruding, crushing, and reassembling adipose-derived mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue, and separated and purified through tangential flow filtration (TFF).
  • TFF tangential flow filtration
  • the structure and particle distribution of the prepared nanovesicles were confirmed using a cryogenic-transmission electron microscope (cryo-TEM) and nanoparticle tracking analysis (NTA).
  • the prepared nanovesicles had a unilamellar double lipid membrane structure formed outside the particles (FIG. 1a).
  • the highest peak appeared at approximately 100 nm and had a size of 50 nm to 200 nm (FIG. 1b).
  • stem cell markers CD44, CD73, CD90 and nanovesicle-specific markers lysosomal-associated membrane protein 1 were analyzed by western blot. Briefly, proteins were separated on 10% polyacrylamide gel electrophoresis and then transferred to a 0.2 ⁇ m nitrocellulose (NC) membrane. After blocking with 5% skim milk, the cells were treated with primary antibodies anti-CD44, anti-CD73, anti-CD90 or anti-LAMP1 and then reacted with respective secondary antibodies. Finally, each antibody band was confirmed using an enhanced chemiluminescence (ECL) solution using a chemiluminescence image analysis device (ibright CL1500 imaging system, Thermo Fisher).
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • the stem cell markers CD44, CD73, and CD90 were expressed in the prepared nanovesicles.
  • LAMP-1 a nanovesicle-specific marker not expressed in stem cells and exosomes, was expressed. This means that the nanovesicles of the present invention are different from stem cells and exosomes.
  • the cytotoxicity evaluation of the nanovesicles was performed using the CCK-8 assay kit in the B16F10 (melanoma) cell line. Briefly, B16F10 cells were attached using DMEM (Dulbecco modified eagle medium) culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator for one day for cell stability. Thereafter, the existing DMEM culture solution was removed, and after washing with PBS, the purified nanovesicles were treated with a new DMEM culture solution at different concentrations (1 ⁇ 10 10 , 1 ⁇ 10 11 particles/ml) and cultured. Then, after performing according to the manufacturer's instructions using the CCK-8 assay kit, the absorbance was measured at 450 nm through a microreader.
  • DMEM Disbecco modified eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the nanovesicles of the present invention had no cytotoxicity even in the high concentration treatment group of 1 ⁇ 10 11 particles/ml (FIG. 1d).
  • B16F10 cells were cultured in 6-well and nanovesicles were treated at different concentrations (1 ⁇ 10 10 , 1 ⁇ 10 11 particles/ml) while measuring melanin synthesis.
  • ⁇ -MSH ⁇ -Melanocyte-stimulating hormone
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the MITF mRNA expression levels were reduced by 53% and 65%, respectively, compared to the a-MSH/IBMX treatment group, and tyrosinase It was confirmed that the mRNA expression level was reduced by 50% and 57%, respectively (FIG. 2a). Thus, it was confirmed that the nanovesicle of the present invention is effective in skin whitening by reducing the mRNA expression level of MITF and tyrosinase.
  • the MITF protein expression levels were reduced by 29% and 52%, respectively, compared to the a-MSH/IBMX treatment group, and tyrosinase It was confirmed that the protein expression level was reduced by 43% and 97%, respectively (FIG. 2b). Thus, it was confirmed that the nanovesicles of the present invention are effective in skin whitening by reducing the protein expression levels of MITF and tyrosinase.
  • a tyrosinase activity assay was performed to determine whether nanovesicles had an effect of inhibiting tyrosinase activity. Briefly, B16F10 cells were divided and cultured in a 6-well plate, treated with a-MSH, IBMX, and nanovesicles at different concentrations (1 ⁇ 10 10 , 1 ⁇ 10 11 particles/ml) and further cultured in PBS. Washed and recovered the cells. Then, it was made into a suspension state using 1% Tris-x 100 (pH 6.8) and reacted on ice for 10 minutes.
  • the supernatant containing the same amount of protein and 15 mM L-DOPA (Levodopa) were reacted at room temperature, and then the absorbance was measured at 405 nm through a microreader to analyze intracellular tyrosinase activity.
  • Arbutin (1 mM) was used as a positive control.
  • nanovesicles have an effect of inhibiting or inhibiting melanin synthesis.
  • B16F10 cells were seeded in 6-well plates and cultured. After confirming the attachment state of the cells, nanovesicles were treated at different concentrations (1 ⁇ 10 10 , 1 ⁇ 10 11 particles/ml), and ⁇ -MSH and IBMX were treated and cultured. Thereafter, washed with PBS, treated with the above-mentioned lysate, and reacted for 1 hour in a heating block at 90 °C. The amount of melanin produced was measured by absorbance at 405 nm through a microreader. Arbutin (1 mM) was used as a positive control.
  • the amount of melanin was reduced by 34% and 67%, respectively, compared to the a-MSH/IBMX treatment group.
  • the nanovesicle treatment group at 10 11 particles/ml it was confirmed that nanovesicles had an effect of inhibiting melanin synthesis to a similar degree to that of arbutin, a positive control group (FIG. 4).
  • the nanovesicles of the present invention had an effect of inhibiting melanin synthesis in a concentration-dependent manner.
  • Example 5 Melanin synthesis inhibitory effect of nanovesicles in 3D skin model
  • nanovesicles In order to confirm whether nanovesicles have an effect of inhibiting or inhibiting melanin synthesis in a 3D skin model, melanin production analysis was performed through Fontana-Masson staining. Briefly, after manufacturing according to the manufacturer's instructions using the 3D skin model Neoderm-ME (Tego Science Co., Ltd.), nanovesicles were applied to the manufactured 3D skin model by concentration (1 ⁇ 10 10 , 1 ⁇ 10 11 particles/ ml) to conduct the experiment. After culturing in a 37°C, 5% CO 2 incubator, the membrane was cut with a blade and fixed with 4% PFA (paraformaldehyde). Thereafter, the membrane was embedded in a paraffin solution, and then cut after fabricating a paraffin block.
  • 3D skin model Neoderm-ME Teego Science Co., Ltd.
  • the cut samples were subjected to Fontana-Masson staining according to the staining test method to analyze the degree of melanin synthesis.
  • the amount of melanin was quantitatively confirmed using the Image J program.
  • Arbutin (1 mM) was used as a positive control.
  • the nanovesicle of the present invention has a remarkable effect on skin whitening by inhibiting melanin synthesis through inhibition of MITF and tyrosinase gene and protein expression and inhibition of tyrosinase activity.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물; 및 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 부작용을 최소화하고 피부 미백의 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부 미백 화장품 및 의약외품 원료로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물
본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물; 및 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데, 이중에서도 멜라닌이 피부색을 결정하는 주요인자로 작용한다. 멜라닌은 피부 표피층(epidermis)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에서 생성된 후 주변의 각질형성 세포(keratinocyte)로 전이(transition)되어 피부색을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이외에도 멜라닌은 자외선에 의한 피부 손상을 막고 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 제거하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 그러나, 만성적인 자외선 노출은 멜라닌세포(melanocyte)에서 멜라닌 생성을 촉진시켜 색소침착(pigmentation)을 유발하는 것으로 알려져 있다.
멜라닌 합성은 멜라닌세포 내의 멜라노좀(melanosome)에서 개시된다. 피부가 자외선과 같은 외부 스트레스에 노출되면 멜라닌세포에서 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)의 생성량이 증가하고, α-MSH는 멜라닌세포에서만 발현되는 막 수용체인 MC1R(melanocortin 1 receptor)과 결합하여 아데닐일 사이클라제(adenylyl cyclase)를 활성화시켜 세포 내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate)를 증폭시키는 것으로 알려져 있다. 세포 내 cAMP 수준이 증가하면 PKA(protein kinase A)가 활성화됨에 따라 CREB(cAMP response element binding protein)가 인산화되고, 결과적으로 MITF (microphthalmia transcription factor)의 발현이 증가된다. MITF는 멜라닌 합성과정의 중요 전사인자로서 멜라닌 합성의 주요 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 수준을 증가시키며, 티로시나아제는 멜라닌 합성의 초기단계에 작용하여 멜라닌 합성의 속도를 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 경로로 멜라닌 세포에서의 멜라닌 합성은 MITF, 티로시나아제 등의 효소가 관여하는 복잡한 과정을 통해 이루어진다.
알부틴, 닥나무추출물, 에칠아스코빌에텔, 유용성감초추출물, 아스코리글루코사이드 등은 색소침착 완화나 피부 미백 용도로 보고된 바 있다. 특히, 알부틴은 월귤나무, 베어베리, 블루베리 등에서 추출한 하이드로쿼논(hydroquinone)과 포도당을 반응시켜 얻는 성분으로서, 멜라닌 색소의 활성화를 억제하고 피부의 색소 침착을 막아 피부 미백에 많은 도움을 준다고 알려져 있다. 하이드로쿼논은 이전부터 기미, 주근깨 치료와 미백 화장품에 사용되었지만, 백반증, 피부 알레르기, 피부염, 여드름 등 부작용을 유발할 수 있어 의약품으로만 사용되고 있으며, 더욱이 적은 함량으로는 효과를 거둘 수 없고 많은 함량으로는 부작용이 생길 수 있어 미백 효과를 나타내는 알부틴의 농도에 대한 기준이 불명확하다고 알려져 있다.
최근에는 증식능과 분화능이 우수하며 체내 생리활성을 지닌 줄기세포 기반 피부 미백 조성물에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 대표적인 줄기세포 기반 피부 미백 소재는 인체 줄기세포 배양물과 식물 줄기세포 배양 추출물로, 이를 활용한 피부미백용 기능성 화장품 등의 제품들이 크게 증가하는 추세를 보였다. 하지만, 이러한 줄기세포 배양 추출물의 미백 효과에 대한 검증은 명확하게 이루어 지지 않았으며, 추출 과정에 타겟 조성물을 고순도로 정제하기 어렵다는 점에서도 한계를 지닌다. 또한, 현재 피부 미백 조성물로 개발된 줄기세포 배양액은 대부분 일반적인 배양 배지를 사용하고 있어, 이들 세포 증식배양용 배지 내 항생제 및 혈청 등에 의한 인체 안전성 측면 등의 이유로 제한적인 사용만이 가능한 실정이다.
본 발명의 목적은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도된 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 저해하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제의 발현 또는 활성을 저해하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 미백의 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 멜라닌 합성을 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 색소의 침착을 방지하고, 피부 과색소 침착을 완화 또는 개선하는 효과가 있으며, 피부에 대한 부작용을 최소화하면서 피부 미백의 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부 미백 기능성 화장품 또는 의약외품으로 유용하게 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 유효성분은 (i) 인간 줄기세포 유래의 물질로서 생체적합성이 뛰어나고, (ii) 세포배양액의 제거 후 줄기세포만을 회수하여 분리공정함으로써, 배양액 내 불순물 함유에 따른 우려를 최소화하여 생체안전성이 뛰어나며, (iii) 줄기세포를 물리적으로 압출, 파쇄하여 제조함으로써, 기존 줄기세포 배양 추출물에 비해 줄기세포의 원천적인 미백 인자들을 다량 포함하고 있어, 화장품 원천 소재 및 의약외품 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 제조된 나노베지클(nanovesicle)의 구조를 초저온투과전자현미경(cryogenic-transmission electron microscope, Cryo-TEM)을 통해 관찰한 결과이고, 1b는 나노베지클의 입자 크기 분포도를 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis, NTA)를 통해 분석한 결과이며, 1c는 나노베지클의 부착 분자를 웨스턴블롯(western blot)을 통해 분석한 결과이고, 1d는 CCK-8 assay kit를 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 분석한 결과이다.
도 2a는 나노베지클의 MITF 및 티로시나아제 mRNA의 발현량을 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 확인한 결과이고 (그룹 간의 ****P < 0.0001), 2b는 MITF 및 티로시나아제 단백질의 발현량을 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 나노베지클의 티로시나아제 활성 저해 효과를 분석한 결과이다 (그룹 간의 **P < 0.0038, ***P < 0.0008).
도 4는 나노베지클의 멜라닌 생성 저해 효과를 분석한 결과이다 (그룹 간의 ****P < 0.0001).
도 5a는 3D 인공피부 모델에서 Fontana-Masson 염색을 통해 나노베지클의 멜라닌 생성 저해 효과를 분석한 결과이고 (scale bar = 50 μm), 5b는 Fontana-Masson 염색 결과를 Image J를 이용하여 정량 분석한 결과이다 (그룹 간의 **P < 0.0084, ***P < 0.0006).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 용어, "나노베지클(nanovesicle)"은 내부에 cargo를 지닌 nm 사이즈의 이중 지질막 구조의 소포체로서, 줄기세포의 압출을 통해 제조된 세포 유래 소포체를 의미한다. 본 발명의 나노베지클은 이중 지질막 구조를 가진 엑소좀과 유사한 형태를 가지고 있으나, 엑소좀은 세포에서 세포외로 자연적으로 분비된 소포체라는 점에서 차이가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노베지클은 줄기세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 바람직하게는, 중간엽 줄기세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 중간엽 줄기세포를 7 계대 (passage)까지 증식시킨 후 세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 인간 지방유래줄기세포를 5 계대(passage)까지 증식시킨 후 세포 펠릿을 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 바람직하게는, 상기 나노베지클은 (a) 중간엽 줄기세포를 증식시킨 후 세포 펠릿을 수득하는 단계; (b) 버퍼로 재부유된 세포를 멤브레인을 통해 압출, 파쇄 및 재조립하거나 또는 마이크로 챔버를 통과하여 압출, 파쇄 및 재조립하는 단계; 및 (c) 세포 압출/재조립물을 포함한 현탁액을 정제 분리, 농축 후 나노베지클을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 10~15 % 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, HPL) 및 1~5 ng/ml 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)가 첨가된 배양액에서 증식된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 수득된 세포 펠릿은 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼로 재부유시키고, PBS 버퍼로 재부유된 세포를 i) 5 μm 및 0.4 μm PCTE(polycarbonate track etch) 멤브레인을 통해 압출, 파쇄 및 재조립하거나, ii) 30 내지 200 μm 구경의 마이크로 챔버 채널을 통과시켜 세포를 압출, 파쇄 및 재조립하는 단계를 수행할 수 있다. 세포 압출 및 재조립 후에는 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF) 방법을 이용하여 분리 정제, 농축 과정을 통하여 나노베지클을 수득할 수 있다.
상기 용어, "줄기세포(stem cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로 특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 말하며, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 용어, "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 맑게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도되는 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성을 저해하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 유효성분은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 30 중량%, 0.001 내지 20 중량%, 0.01 내지 20 중량%, 0.1 내지 20 중량%로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다. 또한, 기능성 첨가물이 추가로 포함될 수 있으며, 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 배합 성분으로 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스처 크림, 아이 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스프레이, 파우더, 바디로션 또는 바디클린저의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면, 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 의약외품 조성물은 피부 색소 침착의 예방 또는 개선을 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 제형일 수 있다.
또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.
또한, 각 제형의 의약외품 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 비경구 투여용인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 미백의 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 멜라닌 합성을 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노베지클의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선 방법을 제공한다.
상기 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나노베지클의 특성 및 세포독성 분석
본 발명의 나노베지클은 지방조직으로부터 분리된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 압출, 파쇄 및 재조립하여 제조하였고, 접선유동 여과장치(tangential flow filtration, TFF)를 통해 분리 정제하였다. 제조된 나노베지클의 구조 및 입자 분포도는 초저온투과전자현미경(cryogenic-transmission electron microscope, cryo-TEM) 및 나노 입자 추적 분석기(nanoparticle tracking analysis, NTA)를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 제조된 나노베지클은 단층(unilamellar)의 이중지질막 구조가 입자 외부에 형성하고 있음을 확인하였다(도 1a). 또한, 제조된 나노베지클의 입자 분포도를 분석한 결과, 대략 100 nm에서 가장 높은 피크가 나타났고, 50 nm 내지 200 nm의 크기를 가진 것을 확인하였다(도 1b).
나노베지클의 특성을 분석하기 위해, 줄기세포 마커인 CD44, CD73, CD90 및 나노베지클 특이 마커인 LAMP1(lysosomal-associated membrane protein 1)를 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 분석하였다. 간단히, 단백질은 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분리한 후, 0.2 μm NC(nitrocellulose) 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 블러킹한 후, 1차 항체 항-CD44, 항-CD73, 항-CD90 또는 항-LAMP1을 처리한 뒤 각각에 해당하는 2차 항체를 반응시켰다. 최종적으로 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 각 항체 밴드를 화학 발광 이미지 분석 장치(ibright CL1500 imaging system, Thermo Fisher)을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 제조된 나노베지클에서는 줄기세포 마커인 CD44, CD73 및 CD90이 발현됨을 확인하였다. 그러나, 줄기세포와 엑소좀에서 발현하지 않는 나노베지클-특이적인 마커인 LAMP-1의 발현됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 나노베지클이 줄기세포 및 엑소좀과 상이함을 의미한다.
나노베지클의 세포독성 평가는 B16F10(melanoma) 세포주에서 CCK-8 assay kit를 이용하여 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco modified eagle medium) 배양액을 이용하여 부착시키고 세포 안정성을 위해 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하루 정도 배양하였다. 이후, 기존 DMEM 배양액을 제거하고, PBS로 세척 후 새로운 DMEM 배양액과 함께 정제된 나노베지클을 농도별(1×1010, 1×1011 particles/ml)로 처리하여 배양하였다. 이후, CCK-8 assay kit를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행한 후, 마이크로리더기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 나노베지클은 1×1011 particles/ml의 고농도 처리군에서도 세포독성이 없음을 확인하였다(도 1d).
실시예 2. 나노베지클의 MITF 및 티로시나아제의 발현 저해 효과
제조된 나노베지클이 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제(tyrosinase)의 발현 저해 효과가 있는지 확인하기 위해 상기 유전자 및 단백질의 발현량을 각각 qRT-PCR과 웨스턴블롯을 통해 분석하였다.
우선, 유전자 단계에서 나노베지클의 효과를 확인하기 위해, B16F10 세포를 6-well에 배양하고 나노베지클을 농도별(1×1010, 1×1011 particles/ml)로 처리하면서 멜라닌 합성을 유도하는 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 반응시켰다. 이후, 총 RNA를 AccuPrep universal RNA extraction kit를 이용하여 추출하고, 분광 광도계(Nanodrop, Thermo Fisher)로 정량한 후, cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 MITF 및 티로시나아제에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 첨가한 후, SYBR Green을 첨가하여 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 1×1010 particles/ml 및 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 MITF mRNA 발현량이 각각 53% 및 65% 감소되었고, 티로시나아제 mRNA 발현량이 각각 50% 및 57% 감소되었음을 확인하였다(도 2a). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 mRNA 발현량을 감소시킴으로써, 피부 미백에 효과가 있음을 확인하였다.
이후, 단백질 단계에서 나노베지클의 효과를 확인하기 위해 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well에 배양한 후 동일하게 나노베지클을 농도별로(1×1010, 1×1011 particles/ml)을 처리하면서 α-MSH 및 IBMX를 반응시켰다. 각 군에서 단백질을 추출하여 정량한 후, 동량의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분리하고, 0.2μm NC(nitrocellulose) 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 블러킹한 후, 1차 항체 항-MITF, 항-티로시나아제 처리하였다. 2차 항체 처리 후 ECL 용액을 이용하여 면역 반응성 밴드를 화학 발광 이미지 분석장치(ibright CL1500 imaging system, Thermo Fisher)을 이용하여 확인 및 분석하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.
그 결과, 1×1010 particles/ml 및 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 MITF 단백질 발현량이 각각 29% 및 52% 감소되었고, 티로시나아제 단백질 발현량이 각각 43% 및 97% 감소되었음을 확인하였다(도 2b). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 단백질 발현량 역시 감소시킴으로써, 피부 미백에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 나노베지클의 티로시나아제 활성 저해 효과
나노베지클이 티로시나아제 활성을 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 티로시나아제 활성도 분석 실험을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well plate에 분주하여 배양하였고, a-MSH 및 IBMX와 나노베지클을 농도별(1×1010, 1×1011 particles/ml)로 처리하여 추가로 배양한 후 PBS로 세척하고 세포를 회수하였다. 이후, 1% Tris-x 100(pH 6.8)을 이용하여 부유액 상태로 만들고 얼음 위에서 10분 동안 반응시켰다. 단백질을 정량한 뒤 동량의 단백질이 포함된 상층액과 15mM L-DOPA(Levodopa)를 상온에서 반응시킨 후, 마이크로리더기를 통해 405 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 내 티로시나아제 활성도를 분석하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.
그 결과, 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 티로시나아제 활성이 약 17% 감소된 것을 확인함으로써, 나노베지클이 양성 대조군인 알부틴과 유사한 정도로 티로시나아제 활성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다(도 3).
실시예 4. 나노베지클의 멜라닌 합성 저해 효과
나노베지클이 멜라닌 합성을 억제 또는 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 멜라닌 생성량 분석 실험을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well plate에 분주하였고 배양하였다. 세포의 부착상태를 확인한 뒤 나노베지클을 농도별(1×1010, 1×1011 particles/ml)로 처리한 뒤 α-MSH 및 IBMX를 처리하여 배양하였다. 이후, PBS로 세척하고, 앞서 언급한 용해액을 처리하여 90 ℃ 히팅블럭에서 1 시간 동안 반응시켰다. 멜라닌의 생성량은 마이크로리더기를 통해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.
그 결과, 1×1010 particles/ml 및 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 멜라닌 양이 각각 34% 및 67% 감소되었고, 특히, 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 나노베지클이 양성 대조군인 알부틴과 유사한 정도로 멜라닌 합성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다(도 4). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 농도-의존적으로 멜라닌 합성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 3D 피부 모델에서 나노베지클의 멜라닌 합성 저해 효과
나노베지클이 3D 피부 모델에서의 멜라닌 합성을 억제 또는 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 Fontana-Masson 염색을 통해 멜라닌 생성 분석을 수행하였다. 간단히, 3D 피부 모델인 Neoderm-ME (㈜테고사이언스)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 제조한 후, 제조된 3D 피부 모델에 나노베지클을 농도별(1×1010, 1×1011 particles/ml)로 처리하여 실험을 진행하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 멤브레인을 칼날(blade)로 자른 뒤 4% PFA(paraformaldehyde)로 고정하였다. 이후, 멤브레인을 파라핀 용액에 임베딩(embedding)하고, 파라핀 블록(paraffin block)을 제작한 후 절단하였다. 절단된 샘플은 염색 시험법에 따라 Fontana-Masson 염색을 진행하여 멜라닌 합성 정도를 분석하였다. 염색 결과는 Image J 프로그램을 이용하여 멜라닌의 양을 정량적으로 확인하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.
그 결과, 나노베지클 처리군에서는 대조군(control)에 비해 멜라닌 합성이 농도-의존적으로 현저하게 저해됨을 확인하였다(도 5a). 정량 결과, 1×1010 particles/ml 및 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 대조군에 비해 멜라닌의 양이 각각 평균 47% 및 평균 82% 감소하였고, 특히, 1×1011 particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 알부틴 처리군(평균 56% 감소)에 비해 멜라닌 합성이 현저하게 저해되었음(평균 82% 감소)을 확인하였다(표 1 및 도 5b).
Figure PCTKR2022006907-appb-img-000001
상기 결과로부터, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 유전자 및 단백질의 발현 저해, 티로시나아제의 활성 저해를 통해 멜라닌 합성을 저해함으로써 피부 미백에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포에서 유래된 것인, 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도된 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 저해하는 것인, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제의 발현 또는 활성을 저해하는 것인, 조성물.
  7. 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
PCT/KR2022/006907 2021-05-14 2022-05-13 나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물 WO2022240243A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20210062572 2021-05-14
KR10-2021-0062572 2021-05-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022240243A1 true WO2022240243A1 (ko) 2022-11-17

Family

ID=84028721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/006907 WO2022240243A1 (ko) 2021-05-14 2022-05-13 나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20220155224A (ko)
WO (1) WO2022240243A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240080781A (ko) 2022-11-30 2024-06-07 주식회사 리치바이오 말레이트 또는 디메틸말레이트를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
US20170209365A1 (en) * 2014-11-07 2017-07-27 Exostemtech Co., Ltd. Cosmetic Composition Containing Exosomes Extracted from Stem Cell for Skin Whitening, Antiwrinkle or Regeneration
WO2021025533A1 (ko) * 2019-08-07 2021-02-11 건국대학교 산학협력단 골격근 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101663912B1 (ko) 2015-01-08 2016-10-10 한양대학교 에리카산학협력단 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170209365A1 (en) * 2014-11-07 2017-07-27 Exostemtech Co., Ltd. Cosmetic Composition Containing Exosomes Extracted from Stem Cell for Skin Whitening, Antiwrinkle or Regeneration
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
WO2021025533A1 (ko) * 2019-08-07 2021-02-11 건국대학교 산학협력단 골격근 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHA HYEONJIN, HONG SEYOUNG, PARK JU HYUN, PARK HEE HO: "Stem Cell-Derived Exosomes and Nanovesicles: Promotion of Cell Proliferation, Migration, and Anti-Senescence for Treatment of Wound Damage and Skin Ageing", PHARMACEUTICS, vol. 12, no. 12, 24 November 2020 (2020-11-24), pages 1135, XP093003935, DOI: 10.3390/pharmaceutics12121135 *
CHO BYONG SEUNG, LEE JINAH, WON YUJIN, DUNCAN DIANE I., JIN RICHARD C., LEE JOON, KWON HYUCK HOON, PARK GYEONG-HUN, YANG STEVEN HO: "Skin Brightening Efficacy of Exosomes Derived from Human Adipose Tissue-Derived Stem/Stromal Cells: A Prospective, Split-Face, Randomized Placebo-Controlled Study", COSMETICS, vol. 7, no. 4, pages 90, XP093003929, DOI: 10.3390/cosmetics7040090 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220155224A (ko) 2022-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2317502T3 (es) Uso de la silimarina y/o de sus constituyentes como agentes promotores de la pigmentacion de la piel o del cabello.
US8647610B2 (en) Use of melanin biosynthesis inhibitors from korean ginseng and the cosmetic composition containing thereof for skin whitening
WO2013027984A2 (ko) 녹차 성분을 함유하는 화장료 조성물
US20100062492A1 (en) Method For Preparing Icariside II, Cosmetic Composition Containing The Same and the Use Thereof For Skin Whitening
WO2016104911A1 (ko) 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2020218846A1 (ko) 우유 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물
WO2017164609A2 (ko) 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 및 이의 용도
WO2017052155A1 (ko) 베타-망고스틴을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물
US20170112737A1 (en) Cosmetics and pharmaceutical applications of gallic acid and gallic acid derivatives
WO2013180526A1 (ko) 에델바이스 추출물을 포함하는 피부 재생 및 모발 성장 촉진제
WO2019088720A1 (ko) 탐라산수국 추출물을 포함하는 피부 항노화및 보습용 화장료 조성물
WO2023027274A1 (ko) 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR20180006699A (ko) 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장료 조성물
WO2019190200A1 (ko) 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤을 함유하는 화장료 조성물
WO2022240243A1 (ko) 나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물
WO2020218888A1 (ko) 신규한 락토바실러스 람노서스 lm1011을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물
WO2021033833A1 (ko) 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
WO2018004281A2 (ko) 피부 미백 활성을 가지는 트라넥삼산-펩타이드 및 그 용도
JP6173362B2 (ja) 皮膚バリア機能改善剤、細胞間接着構造の形成促進剤、タイトジャンクション形成促進剤、ＴＲＰＶ４活性化剤、細胞内Ｃａ濃度上昇亢進剤及び皮脂産生促進剤
WO2021096089A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물
WO2018056581A1 (ko) Tnfrsf14 억제 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 tnfrsf14 억제 물질의 스크리닝 방법
KR20180078869A (ko) Dhpv를 포함하는 피부 광노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2019151585A1 (ko) 5-아이오도튜베르시딘을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물
KR101317433B1 (ko) 지구자, 길경, 밀싹 및 세이지 추출물을 함유하는 미백 화장용 조성물
US20110046217A1 (en) Use of 2,2&#39;-cyclolignans for inducing, restoring or stimulating the pigmentation of the skin, hair or hairs

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22807890

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE