WO2023027274A1 - 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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iris
exosomes
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bulb
derived exosomes
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윤은정
박시준
김정수
김현민
조진성
김영석
김준오
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주식회사 신세계인터내셔날
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Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition containing iris bulb-derived exosomes as an active ingredient. It relates to a cosmetic composition with excellent skin moisturizing, skin wrinkle improvement and skin whitening effects.
  • Exosome means a small membrane-structured vesicle secreted from various cells, and is defined as a type of extracellular vesicles (EVs). All cells exchange information with other cells or the external environment and secrete extracellular endoplasmic reticulum for this purpose. Exosomes have a size of about 50 to 200 nm and contain physiologically active substances such as proteins, lipids, and nucleic acids. Exosomes exist in various cells such as mammals, bacteria, and plants, and can be used for diagnosis and treatment because they reflect the state of the originating cells. Exosomes are a double-phospholipid membrane structure that is easily penetrated into cells and performs various physiological and pathological functions such as immune response and signal transduction.
  • Plant-derived exosomes are natural nanoparticles that help cell movement and absorption as they contain physiological activity and signaling substances secreted by plant cells themselves, and exosomes purified from plants are less toxic than mammalian-derived exosomes. It is known.
  • Korean Patent Registration No. 10-2125567 discloses a method for extracting high-purity plant exosomes from source plants using centrifugation and tangential-flow filtration (TFF).
  • No. 10-2020-0121062 discloses a method for purifying high-purity, high-quality extracellular vesicles using size exclusion chromatography
  • Korean Patent Publication No. 10-2019-0050286 discloses exo in a hyaluronic acid-based filler composition.
  • a filler composition containing some to increase the stability of exosomes is disclosed.
  • exosomes are materials that can be used in the fields of medicine, cosmetics, food, etc. due to their various advantages and activities, but have low dispersibility and tend to aggregate due to their structural characteristics consisting of a phospholipid bilayer.
  • it is unstable at high temperatures and can be easily broken in the process of preparing cosmetic formulations, and these properties may reduce the stability of exosomes in formulations and cause precipitation. Therefore, it is necessary to increase the stability in the formulation by increasing the solubility and dispersibility of exosomes in an aqueous solution in order to maintain continuous activity.
  • the present inventors separated and purified various plant-derived exosomes using an aqueous two-phase system and conducted research on using plant-derived exosomes with excellent skin efficacy as cosmetics, and as a result, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a cosmetic composition containing iris bulb-derived exosomes as an active ingredient and having excellent stability and excellent skin moisturizing, skin wrinkle improvement and skin whitening effects.
  • a cosmetic composition containing iris bulb exosomes is provided.
  • the iris bulb exosomes are prepared by (A) ultra-high pressure treatment of the iris bulb; (B) extracting the iris bulbs treated with ultra-high pressure; (C) obtaining a supernatant by centrifuging the iris bulb juice at 1,000xg to 10,000xg; (D) freeze-drying the supernatant in which exosomes are present; (E) forming an aqueous two-phase system using PEG (Polyethylene glycol)/Dextran in the lyophilisate; and (F) obtaining a lower layer in which exosomes are concentrated in the aqueous two-phase system.
  • A ultra-high pressure treatment of the iris bulb
  • B extracting the iris bulbs treated with ultra-high pressure
  • C obtaining a supernatant by centrifuging the iris bulb juice at 1,000xg to 10,000xg
  • D freeze-drying the supernatant in which exosomes are present
  • E forming an aqueous two-phase system using PEG (Poly
  • the ultra-high pressure treatment is characterized in that it is performed for 20 seconds to 2 minutes at a temperature of 15 ⁇ 25 °C and a pressure of 200 ⁇ 500Mpa.
  • the iris bulb exosomes as an active ingredient are contained in an amount of 0.0001 to 30.0% (w/w) based on the total weight of the composition.
  • the cosmetic composition is at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol or derivatives thereof, butylene glycol, propylene glycol and glycerin in order to increase the stability of the properties of iris bulb exosomes It is characterized in that it further comprises.
  • the cosmetic composition is characterized in that it is for skin moisturizing, skin wrinkle improvement or skin whitening.
  • the iris bulb-derived exosomes of the present invention purified using ultra-high pressure pretreatment and an aqueous two-phase system, have excellent stability and exhibit excellent skin moisturizing effects, skin wrinkle improvement and whitening effects, so they can be usefully used as anti-aging cosmetics.
  • FIG. 1 is a TEM image of purified iris bulb-derived exosomes according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the NTA analysis results for confirming the size distribution and particle number of purified iris bulb-derived exosome particles according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the NTA analysis results for confirming the size distribution and particle number of exosome particles derived from iris bulbs purified without undergoing ultra-high pressure pretreatment.
  • Figure 4 is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of the iris bulb-derived exosomes purified by the present invention by MTT assay.
  • FIG. 5 is a graph showing the result of evaluating the moisturizing effect of the iris bulb-derived exosomes purified according to the present invention by AQP3 expression.
  • Figure 6 is a graph showing the results of evaluating the skin wrinkle improvement efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the present invention by MMP-1 expression.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of evaluating the skin wrinkle improvement efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the present invention by COL1A1 expression.
  • FIG. 8 is a graph showing the results obtained by evaluating the whitening efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the present invention in terms of tyrosinase activity inhibition rate.
  • FIG. 9 is a graph showing the results obtained by evaluating the whitening efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the present invention in terms of melanin production inhibition rate.
  • Plant-derived exosomes contain physiological activity and signaling substances secreted by plant cells themselves, and are known to be less toxic than mammalian-derived exosomes. Due to these advantages, it is a material that can be used in the fields of medicine, cosmetics, food, etc., but due to the structural feature consisting of a phospholipid double membrane, it has low dispersibility and tends to aggregate, making it difficult to maintain its activity continuously in the formulation. have a problem
  • the technical feature of the present invention is to separate and purify exosomes from iris bulbs with high purity and use them as cosmetics.
  • Iris is a perennial plant belonging to the Iris family and Iris genus. Irises are used as medicinal herbs for indigestion, hemorrhoids, bruises, skin diseases, sore throats, tonsillitis, etc. Iris bulbs contain large amounts of fatty acids such as linoleic acid, myristic acid, and lauric acid. Its kind, German iris (Iris germanica), is a perennial plant native to Europe and is a perennial plant of the monocotyledonous plant Liliaceae Iris family planted and grown in dry places. It is very resistant to cold, so it is possible to winter in the open field, and the largest flower among irises blooms in several bunches at the end of the flower stem. It is also treated as a bulb plant because it has a thick underground stem. The bulbs of Iris germanica contain isoflavones such as irisolone and irigenin.
  • the iris bulb exosomes of the present invention are purified by the following method.
  • A ultra-high pressure treatment of iris bulbs;
  • B extracting the iris bulbs treated with ultra-high pressure;
  • C obtaining a supernatant by centrifuging the iris bulb juice at 1,000xg to 10,000xg;
  • D freeze-drying the supernatant in which exosomes are present;
  • E forming an aqueous two-phase system using PEG (Polyethylene glycol)/Dextran in the lyophilisate; and
  • F obtaining a lower layer in which exosomes are concentrated in the aqueous two-phase system.
  • step (A) both living and dried iris bulbs can be used.
  • Exosomes are physiologically active substances, and it is preferable to set the treatment temperature to 15°C to 25°C.
  • the ultra-high pressure treatment is carried out by putting the dry iris bulbs together with distilled water in a plastic pack, sealing it well so that air does not enter, and then using an ultra-high pressure machine at a temperature of 15 to 25 ° C. at a pressure of 200 Mpa or more for 20 seconds It is performed by ultra-high pressure treatment for ⁇ 2 minutes. If using iris bulbs, this can be done without distilled water in plastic bags.
  • step (B) it is preferable to use a screw having an agitation speed of 20 to 50 rpm used in the step of extracting the iris bulb. It is recommended to use a screw with a stirring speed of less than a certain level because the juice easily escapes due to the change in permeability of the plant cell wall caused by the ultra-high pressure treatment.
  • the centrifugal separation method used in step (C) refers to a method of separating particles of a solution using centrifugal force according to size, shape, density, viscosity, and rotor speed. It is necessary to sequentially adjust the rpm to remove large contaminants, and it is more preferable to carry out at 10,000 x g to obtain a final solution for forming an aqueous two-phase system.
  • the freeze-drying used in the step (D) rapidly lowers the temperature of the container to freeze the material to be dried, and then the pressure inside the container is close to vacuum to sublimate the solidified solvent contained in the material into water vapor and dry it way. Freeze at -50 ⁇ -80 °C for 15 ⁇ 24 hours, and dry for 72 ⁇ 120 hours in a vacuum state in a freeze dryer. At this time, the vacuum state usually means the pressure state of the freeze dryer.
  • an aqueous two phase partition method which is one of the separation methods using the difference in affinity between each layer by making two layers with two types of aqueous solutions that are not well dissolved in each other, is used. ) was used.
  • PEG/salts salts such as sulfate, phosphate, citrate, etc.
  • Dextran is a natural polymer obtained by bacterial action and is used as a thickener, binder, and bulking agent in cosmetic formulations.
  • step (E) In the formation of the aqueous two-phase system in step (E), 1 to 15% by weight of PEG having a molecular weight of 10,000 to 35,000, preferably 2 to 5% by weight of PEG is used, and 1 to 8% by weight of Dextran is used with a molecular weight of 300,000 to 650,000 It is characterized by using weight%, preferably 1 to 3% by weight.
  • weight% preferably 1 to 3% by weight.
  • step (F) a step of forming an aqueous two-phase system using an aqueous two-phase solution of the same concentration and obtaining a lower layer solution can be additionally performed 2-3 times. there is.
  • the iris bulb-derived exosomes prepared by this method have excellent moisturizing effect (Test Example 4), wrinkle improvement effect (Test Example 5, Test Example 6, Test Example 9), and whitening effect (Test Example 9) compared to the iris bulb extract. 7, test example 8).
  • the iris bulb-derived exosomes were excellent in stability in the formulation (Test Examples 9 and 10).
  • the iris bulb-derived exosomes can be used in a cosmetic composition for moisturizing, wrinkle improvement, or whitening.
  • the iris bulb-derived exosomes as the active ingredient may be contained in an amount of 0.0001 to 30.0% (w/w) based on the total weight of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol or derivatives thereof, butylene glycol, propylene glycol and glycerin in order to increase the stability of the properties of iris bulb exosomes at least one, more preferably at least one selected from the group consisting of glycerin, butylene glycol and 1,3-propylene glycol, most preferably further comprising butylene glycol and 1,3-propylene glycol to be characterized
  • exosomes have low dispersibility and tend to aggregate due to their structural characteristics composed of a phospholipid bilayer, and thus have a problem in that it is difficult to continuously maintain their activity in a formulation.
  • a compound containing an alcohol group selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene glycol and polypropylene glycol copolymers or derivatives thereof, butylene glycol, propylene glycol, and glycerin is used together, iris bulb exosomes Stability was better.
  • the above cosmetic composition can be in any formulation that is conventionally manufactured, and for example, skin lotion, skin softener, skin toner, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrient lotion, massage cream, nutrient cream, moisture cream, hand cream , Essence, pack, soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, press powder, loose powder, etc. can be manufactured.
  • components commonly used in cosmetics within the range of not impairing the effects of the present invention for example, moisturizers, antioxidants, surfactants, alcohols, thickeners, aqueous components, water , Emulsifiers, vitamins, pigments, and conventional auxiliary agents such as perfumes can be appropriately selected and blended without difficulty by those skilled in the art as needed.
  • ultra-high pressure treatment was performed at a temperature of 25 ° C. and a pressure of 200 Mpa for 30 seconds using an ultra-high pressure machine.
  • Iris germanica bulbs treated with ultra-high pressure were juiced with a low-speed screw of 30 rpm using a general juicer, and the obtained iris bulb juice was filtered through a mesh net to remove suspended matter.
  • the recovered iris bulb juice was stored at -80 °C until proceeding with purification.
  • Iris bulb juice was centrifuged at 10,000xg for 10 minutes at 4° C. because removal of large contaminants was required for exosome purification. After centrifugation, the supernatant was recovered to form an aqueous two-phase system.
  • Freeze-drying was performed for the purpose of reducing the volume of the supernatant for mass production of exosomes. It was frozen at -80 ° C for 20 hours and dried for 100 hours in a vacuum in a freeze dryer. At this time, the vacuum state usually means the pressure state of the freeze dryer, and the freezing and drying time may vary depending on the volume of the solution.
  • Purified water was added to the lyophilized supernatant, and an aqueous two-phase system was formed using PEG (Polyethylene glycol)/Dextran.
  • An aqueous two-phase system was formed using 3.3% by weight of PEG (purchased from Sigma Aldrich) with a molecular weight of 10,000 to 35,000 and 1.7% by weight of Dextran (purchased from Sigma Aldrich) with a molecular weight of 300,000 to 650,000.
  • Comparative Example 1 Purification of exosomes derived from iris bulbs without ultra-high pressure treatment
  • Exosomes derived from iris bulbs were purified in the same manner as in the above example, except that ultra-high pressure treatment was not performed.
  • Comparative Example 2 Comparative Example 3 Comparative Example 4 Comparative Example 5 extraction solvent Purified water methanol ethanol hexane Powder weight (g) 3.32 2.95 2.41 2.44 transference number(%) 16.60 14.75 12.05 12.20
  • Test Example 1 Characteristic analysis of iris bulb-derived exosomes: TEM analysis
  • the purified iris (Iris germanica) bulb-derived exosomes were analyzed by transmission electron microscopy (TEM) to confirm the shape.
  • TEM transmission electron microscopy
  • 1 is a TEM analysis image of exosomes derived from iris bulbs purified according to the above example. As a result of the analysis, the existence of about 160.7 nm particles having a spherical phospholipid bilayer structure was confirmed.
  • Test Example 2 Characterization of iris bulb-derived exosomes: NTA analysis
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Example 3 is a graph showing the results of NTA analysis of exosomes derived from iris bulbs purified according to Comparative Example 1. It was confirmed that the particles had an average size of 172.1 nm and a concentration of 1.61 x 10 9 particles per unit volume of 1 mL. Example and Comparative Example 1 were tested in the same amount, and when the yield was compared, it was confirmed that a larger amount of exosomes could be extracted when ultra-high pressure treatment was performed (Example).
  • Example 1 To confirm the cytotoxicity of Iris germanica bulb-derived exosomes (Example 1) and solvent-specific Iris germanica bulb extracts (Comparative Examples 2, 3, and 4), MTT assay was evaluated. .
  • Human fibroblast cell lines human dermal fibroblast, HDFa
  • Human fibroblast cell lines were inoculated in a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/mL, and then incubated at 37° C. for 18 hours under 5% CO 2 .
  • FIG. 4 is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of the iris bulb-derived exosomes purified according to the above example by MTT assay.
  • Test Example 4 Evaluation of moisturizing efficacy of iris bulb-derived exosomes (AQP3 expression)
  • iris bulb-derived exosomes In order to confirm the moisturizing effect of the iris bulb-derived exosomes, the effect on AQP3 expression was confirmed by comparing with the solvent-specific iris (Iris germanica) bulb extract.
  • HEKa human keratinocyte
  • streptomycin 100 IU/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin were added to the Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) culture medium at 37°C for 24 hours and cultured under 5% CO 2 did After culturing, the medium was discarded and treated with iris bulb-derived exosomes (Stock concentration: 9.90 ⁇ 10 9 particles/mL) and iris bulb extracts by solvent (Stock concentration: 100 mg/mL) and cultured for 48 hours.
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • RT-PCR Real-Time Gene Polymerase Chain Reaction
  • the amount of mRNA change of Aquaporin 3 was measured.
  • the products generated by PCR were electrophoresed on a 1% agarose gel and confirmed with a Gel Documentation system. At this time, PBS was treated as a negative control group, and Hyaluronic acid 0.01% was treated as a positive control group.
  • Figure 5 is a graph showing the results of evaluating the moisturizing effect of the iris bulb-derived exosomes purified according to the above example by AQP3 expression.
  • AQP3 the mRNA expression of AQP3 increased in a concentration-dependent manner when the iris bulb-derived exosomes and the iris bulb extract were treated, and the expression further increased when the iris bulb-derived exosomes were treated.
  • the expression rate was 155.69%.
  • Test Example 5 Evaluation of anti-wrinkle efficacy of iris bulb-derived exosomes (MMP-1 expression)
  • the effect on MMP-1 expression was compared with the extracts from the bulbs of Iris germanica for each solvent.
  • HDFa human dermal fibroblast
  • 100 IU/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin were added in Fibroblast Basal Medium (Medium 106) culture medium at 37°C for 24 hours under 5% CO 2 cultured.
  • the medium was discarded and treated with iris bulb-derived exosomes (Stock concentration: 9.90 ⁇ 10 9 particles/mL) and iris bulb extracts by solvent (Stock concentration: 100 mg/mL) and cultured for 48 hours.
  • the medium was removed from the cultured cell group except for the UVB non-irradiated group, UVB 20 mJ/cm 2 was irradiated, and the medium was replaced with a new medium and cultured for 24 hours.
  • RNA was extracted using TransZol reagent, and RT-PCR (real-time gene polymerase chain reaction) was performed to measure the amount of mRNA change of MMP-1 related to skin aging and wrinkle formation.
  • the products generated by PCR were electrophoresed on a 1% agarose gel and confirmed with a Gel Documentation system. At this time, PBS was treated as a negative control group, and Retinyl palmitate 50 ⁇ M was treated as a positive control group.
  • Figure 6 is a graph showing the results of evaluating the anti-aging efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the above example based on MMP-1 expression.
  • MMP-1 expression was decreased in a concentration-dependent manner, and a much higher reduction rate was confirmed when the iris bulb-derived exosomes were treated.
  • Retinyl palmitate 50 ⁇ M was treated, the expression rate was 72.81%.
  • RT-PCR real-time gene polymerase chain reaction
  • the products generated by PCR were electrophoresed on a 1% agarose gel and confirmed with a Gel Documentation system.
  • PBS was treated as a negative control group
  • Retinyl palmitate 50 ⁇ M was treated as a positive control group.
  • 7 is a graph showing the results obtained by evaluating the anti-aging efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the above example based on COL1A1 expression.
  • Test Example 7 Evaluation of whitening efficacy of iris bulb-derived exosomes (tyrosinase activity inhibition)
  • a tyrosinase activity inhibition test was performed by comparing with the solvent-specific extracts of Iris germanica bulbs. Mushroom-derived tyrosinase and tyrosine were purchased and used from Sigma Chemical.
  • tyrosinase activity 0.1M phosphate buffer (pH 6.5) 150 ⁇ l and mushroom tyrosinase (2100unit/ml, 0.05M phosphate buffer, pH 6.5) 8 ⁇ l, 1.5 Iris bulb-derived exosomes (Stock concentration: 9.90 ⁇ 10 9 particles/mL) and iris bulb extracts (Stock concentration: 100 mg/mL) for each solvent were treated with 36 ⁇ l of L-tyrosine at mM concentration by concentration. Tyrosinase inhibitory activity was confirmed by measuring the absorbance at 490 nm after the sample was reacted at 37° C. for 15 minutes.
  • FIG. 8 is a graph showing the results obtained by evaluating the whitening efficacy of the iris bulb-derived exosomes purified according to the above example in terms of tyrosinase activity inhibition rate.
  • the tyrosinase activity inhibition rate increased in a concentration-dependent manner, and a higher inhibition rate was confirmed when the iris bulb-derived exosomes were treated.
  • Test Example 8 Evaluation of whitening efficacy of iris bulb-derived exosomes (inhibition of melanin production)
  • B16F10 cell line (melanin secreting cells) derived from mice was inoculated and cultured in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) culture medium supplemented with 10% FBS at 37° C. for 24 hours under 5% CO 2 .
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • the medium was discarded and replaced with a new medium, and then the iris bulb-derived exosomes (Stock concentration 9.90 ⁇ 10 9 particles/mL) and the iris bulb extract by solvent (Stock concentration 100 mg/mL) were treated and cultured for 72 hours.
  • the cells were recovered by centrifugation after treatment with Trypsin-EDTA. The recovered cells were washed, treated with 500 ⁇ L of 1N NaOH, and reacted at 100° C. for 10 minutes to dissolve melanin. The amount of melanin was confirmed by measuring absorbance at 405 nm.
  • Test Example 9 Stability analysis of iris bulb-derived exosomes by temperature in a number type formulation
  • Table 3 is a table showing the particle size and concentration of Formulation Example 1 and Comparative Formulation Example 1 through nanoparticle tracking analysis (NTA) after storage at 4° C., 25° C., and 45° C. for 12 weeks.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Formulation Example 1 Formulation Example 1 (Storage at 4°C) Formulation Example 1 (Storage at 25°C) Formulation Example 1 (Storage at 45°C) Particle Number (Particles/ml) Particle Size (nm) Particle Number (Particles/ml) Particle Size (nm) Particle Number (Particles/ml) Particle Size (nm) Early 9.90x10 9 160.7 9.90x10 9 160.7 9.90x10 9 160.7 9.90x10 9 160.7 Week 2 9.79x10 9 161.5 9.71x10 9 163.5 9.84x10 9 160.6 Week 4 9.81x10 9 159.1 9.73x10 9 167.1 9.70x10 9 157.8 week 8 9.67x10 9 157.7 9.57x10 9 162.7 9.78x10 9 165.7 week 12 9.71x10 9 162.9 9.62x10 9 159.4 9.71x10 9 163.0 comparison Formulation example 1 Comparative Formulation Example 1 (Storage at 4°C) Comparative Formulation Example 1 (
  • a cream containing exosomes derived from iris bulbs purified according to the above example with the composition shown in Table 4 below was prepared by a conventional method.
  • the cream containing the hot water extract of iris bulb of Comparative Example 2 which had good efficacy when comparing the efficacy of the iris bulb extract for each solvent, was used as Comparative Formulation Example 2.
  • Test Example 10 Formulation stability analysis of iris bulb-derived exosomes
  • the phase stability test of the cream prepared according to Formulation Example 2 was conducted.
  • the prepared cream was observed for changes in properties while giving a temperature change of 4 °C ⁇ 45 °C at 24-hour intervals in a cycling chamber for 12 weeks.
  • the results are shown in Table 5 below.
  • Test Example 11 Skin wrinkle improvement effect of iris bulb-derived exosomes
  • the cream containing the iris bulb-derived exosomes of the present invention showed an excellent skin wrinkle improvement effect.

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Abstract

본 발명은 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 붓꽃 구근 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며, 피부 보습, 피부 주름개선 및 피부 미백효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
본 발명은 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 붓꽃 구근 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며, 피부 보습, 피부 주름개선 및 피부 미백효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.
최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 이의 항산화, 항염 등의 피부 효능에 대해서도 연구가 시작되고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-2125567호에는 원심분리와 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 이용하여, 원료 식물로부터 고순도의 식물 엑소좀을 추출하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2020-0121062호에는 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 고순도, 고품질의 세포밖 소포체를 정제하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2019-0050286호에는 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시켜 엑소좀의 안정성을 증가시킨 필러 조성물이 개시되어 있다.
이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.
본 발명자들은 수성 2상 시스템을 사용하여 다양한 식물 유래 엑소좀을 분리 정제하고 피부 효능이 우수한 식물 유래 엑소좀을 화장료로 이용하기 위한 연구를 하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 피부 보습, 피부 주름개선 및 피부 미백효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 붓꽃 구근 엑소좀을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
바람직하게는 상기 붓꽃 구근 엑소좀은, (A)붓꽃 구근을 초고압 처리하는 단계; (B)초고압 처리한 붓꽃 구근을 착즙하는 단계; (C)상기 붓꽃 구근 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (D)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (E)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (F)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.
상기 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다.
유효성분으로서의 상기 붓꽃 구근 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.
상기 화장료 조성물은 붓꽃 구근 엑소좀의 성상 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 또는 그 유도체, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부 주름개선용 또는 피부 미백용임을 특징으로 한다.
초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 붓꽃 구근 유래 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 피부 보습 효능과 피부 주름개선 및 미백 효능을 나타내므로 항노화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 초고압 전처리를 거치지 않고 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 피부주름개선 효능을 MMP-1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 피부주름개선 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 티로시나아제 활성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의해 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 멜라닌 생성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 붓꽃 구근으로부터 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.
붓꽃은 붓꽃과 붓꽃속에 속하는 여러해살이풀이다. 붓꽃은 구근에 소화, 소종 등의 효능이 있어 소화불량, 치질, 타박상, 피부병, 인후염, 편도선염 등의 치료 약재로 사용되고 있다. 붓꽃 구근에는 리놀레산(linoleic acid), 미리스트산(myristic acid), 라우르산(lauric acid) 등 지방산이 다량 함유되어 있다. 그 일종인 독일붓꽃(Iris germanica)은 유럽 원산의 다년초로 건조한 곳에 심어 기르는 외떡잎식물 백합목 붓꽃과의 여러해살이풀이다. 추위에 매우 강하여 노지월동이 가능하고 붓꽃류 중에서 제일 큰 꽃이 꽃 줄기 끝에 여러 송이가 피어 달린다. 굵은 땅속줄기가 있어 구근식물로도 취급된다. 독일붓꽃(Iris germanica) 구근에는 irisolone, irigenin 등의 이소플라본이 함유되어 있다.
본 발명의 붓꽃 구근 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 정제된다.
(A)붓꽃 구근을 초고압 처리하는 단계; (B)초고압 처리한 붓꽃 구근을 착즙하는 단계; (C)상기 붓꽃 구근 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (D)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (E)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (F)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.
상기 (A) 단계에서 붓꽃 구근은 생물 또는 건조물을 모두 사용할 수 있으며, 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로, 바람직하게는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다. 엑소좀은 생리활성물질로 그 처리 온도를 15℃~25℃로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 초고압 처리는 붓꽃 구근 건조물을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로 20초~2분간 초고압 처리를 하여 수행한다. 붓꽃 구근 생물을 사용하는 경우에는 증류수 없이 비닐 팩에 넣어 수행할 수 있다.
상기 (B) 단계에서 붓꽃 구근을 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 초고압처리에 의한 식물세포벽의 투과율 변화로 즙이 쉽게 빠져나오기 때문에 교반 속도가 일정 이하인 스크류를 사용하는 것이 좋다.
상기 (C) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 (D) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.
엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.
수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.
상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.
엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (F)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.
이와 같은 방법에 의하여 제조된 붓꽃 구근 유래 엑소좀은 붓꽃 구근 추출물과 비교하여 우수한 보습효과(시험예 4), 주름개선효과(시험예 5, 시험예 6, 시험예 9), 미백효과(시험예 7, 시험예 8)를 나타내었다. 또한, 상기 붓꽃 구근 유래 엑소좀은 제형 내에서의 안정성이 우수하였다(시험예 9, 10).
그러므로 상기 붓꽃 구근 유래 엑소좀은 보습용, 주름개선용 또는 미백용 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 붓꽃 구근 유래 엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다.
바람직하게는 상기 화장료 조성물은 붓꽃 구근 엑소좀의 성상 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 또는 그 유도체, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를, 더욱 바람직하게는 글리세린, 부틸렌글리콜 및 1,3-프로필렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를, 가장 바람직하게는 부틸렌글리콜 및 1,3-프로필렌글리콜을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 엑소좀은 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 또는 그 유도체, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 알코올기를 포함하는 화합물을 함께 사용하는 경우 붓꽃 구근 엑소좀의 안정성이 더욱 우수하였다.
상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 등으로 제조될 수 있다.
한편, 상기의 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위 내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면, 보습제, 산화방지제, 계면활성제, 알코올류, 증점제, 수성성분, 물, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 필요에 따라 당업자가 어려움 없이 적절히 선정하여 배합할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
실시예 1: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 제조
붓꽃 구근 초고압 처리
붓꽃(Iris germanica) 구근 건조물 100g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 25℃의 온도에서 200Mpa의 압력으로 30초간 초고압 처리를 실행하였다.
붓꽃 구근 착즙
초고압 처리한 붓꽃(Iris germanica) 구근을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 붓꽃 구근 착즙을 수행하였으며 수득한 붓꽃 구근 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 붓꽃 구근 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
엑소좀 정제를 위한 상층액 회수
붓꽃 구근 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.
상층액 동결건조
엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.
수성 2상계 형성
동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran (Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.
붓꽃 구근 유래 엑소좀의 회수
상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.
추가 세척 공정
순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.
비교예 1: 초고압처리를 하지 않은 붓꽃 구근 유래 엑소좀 정제
초고압 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일하게 하여 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 정제하였다.
비교예 2: 붓꽃 구근 열수추출물 제조
붓꽃(Iris germanica) 구근 건조물 20g을 정제수 800g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 붓꽃 구근 열수추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.
비교예 3: 붓꽃 구근 메탄올 추출물 제조
붓꽃(Iris germanica) 구근 건조물 20g을 메탄올 800g에 넣고 60℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 붓꽃 구근 메탄올 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.
비교예 4: 붓꽃 구근 에탄올 추출물 제조
붓꽃(Iris germanica) 구근 건조물 20g을 에탄올 800g에 넣고 60℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 붓꽃 구근 에탄올 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.
비교예 5: 붓꽃 구근 헥산 추출물 제조
붓꽃(Iris germanica) 구근 건조물 20g을 헥산 800g에 넣고 60℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 붓꽃 구근 헥산 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다. 하기 표 1은 각 용매 별 추출 수율을 나타내었다.
비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
추출 용매 정제수 메탄올 에탄올 헥산
파우더 무게(g) 3.32 2.95 2.41 2.44
수율(%) 16.60 14.75 12.05 12.20
시험예 1: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 특성 분석:TEM 분석
정제한 붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 160.7nm의 입자의 존재를 확인하였다.
시험예 2: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 특성 분석:NTA 분석
정제한 붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 초고압처리 여부에 따른 엑소좀의 입자 수를 비교하기 위해 비교예 1에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 NTA 분석도 수행하였다. 도 2는 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 160.7nm와 1 mL의 단위 부피당 9.90 x 109 개의 농도를 확인하였다. 도 3은 상기 비교예 1에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로 입자들의 평균 크기 172.1nm와 1 mL의 단위 부피당 1.61 x 109 개의 농도를 확인하였다. 실시예와 비교예 1은 동일한 양으로 실험을 진행하였으며 수율을 비교해보면 초고압처리를 수행했을 때(실시예) 더 많은 양의 엑소좀을 추출할 수 있음을 확인하였다.
시험예 3: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 세포독성 평가
붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀(실시예 1)과 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물(비교예 2, 비교예 3, 비교예 4)의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96 well 플레이트에 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 1×105 cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지와 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL) 및 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 농도별로 투여하고 다시 48시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution(5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 4는 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀 9.90 x 109 particles/mL 농도의 stock을 0.1% 이하로 처리했을 때는 세포독성이 나타나지 않았으며 1% 이상 처리했을 때 세포생존율이 약 90%로 확인되었다.
시험예 4: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 보습 효능 평가(AQP3 발현)
붓꽃 구근 유래 엑소좀의 보습 효능을 확인하기 위해 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물과 비교하여 AQP3 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 표피 각질 세포주(human keratinocyte, HEKa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL) 및 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 처리하고 48시간 배양하였다. 그 후 배양된 세포들을 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR (실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 세포의 수분 이동에 관여하는 보습인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3(Aquaporin 3)의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.01%를 처리하였다. 도 5는 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀과 붓꽃 구근 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 AQP3의 mRNA 발현이 증가하였으며, 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 처리하였을 때 발현이 더 증가됨을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.01%를 처리하였을 때는 155.69% 발현율을 보였다.
시험예 5: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 주름개선 효능 평가(MMP-1 발현)
붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 노화 방지 효능을 확인하기 위해 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물과 비교하여 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium (Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL) 및 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 처리하고 48시간 배양하였다. 세포 손상을 유도하기 위해 UVB 비조사군을 제외한 나머지 배양된 세포군에 배지를 제거한 뒤 UVB 20 mJ/cm2를 조사하고 새로운 배지로 교체 후 24시간 배양하였다. 24시간 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR (실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 피부 노화 및 주름 생성과 관련 있는 MMP-1의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel 에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였다. 도 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 노화 방지 효능을 MMP-1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀과 용매 별 붓꽃 구근 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 MMP-1 발현이 감소하였으며 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 처리하였을 때 훨씬 더 높은 감소율을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였을 때는 72.81% 발현율을 보였다.
시험예 6: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 주름개선 효능 평가(COL1A1 발현)
붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 노화 방지 효능을 확인하기 위해 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물과 비교하여 COL1A1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL) 및 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 피부 연결 조직을 유지시키는 collagen의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였다. 도 7은 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 노화 방지 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀과 붓꽃 구근 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 COL1A1의 발현이 증가하였으며 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 처리하였을 때 발현이 더 증가됨을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였을 때는 173.93% 발현율을 보였다.
시험예 7: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백효능 평가(티로시나아제 활성 억제)
붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 확인하기 위해 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물과 비교하여 티로시나아제 활성 억제 시험을 진행하였다. 버섯 유래의 티로시나아제와 티로신은 Sigma Chemical에서 구매하여 사용하였으며, 티로시나제 활성은 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.5) 150㎕ 와 버섯 티로시나제(2100unit/㎖, 0.05M 포스페이트 버퍼, pH 6.5) 8㎕, 1.5mM 농도의 L-티로신 36㎕와 함께 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL)과 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 농도별로 처리하였다. 티로시나아제 억제 활성은 시료를 37℃에서 15분 동안 반응을 진행한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 미백제로 알려진 합성물질인 arbutin을 표준시료로 사용하고 결과는 %로 환산하였다. 도 8은 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 티로시나아제 활성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀과 붓꽃 구근 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 티로시나아제 활성 억제율이 증가하였으며 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 처리하였을 때 더 높은 억제율을 확인하였다.
시험예 8: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백 효능 평가(멜라닌 생성 억제)
붓꽃(Iris germanica) 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 확인하기 위해 용매 별 붓꽃(Iris germanica) 구근 추출물과 비교하여 멜라닌 생성 억제 시험을 진행하였다. 마우스에서 유래한 B16F10 세포주(멜라닌 분비 세포)를 접종 후 10% FBS를 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간 동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 새 배지로 교체 후 붓꽃 구근 유래 엑소좀(Stock 농도 9.90×109 particles/mL) 및 용매 별 붓꽃 구근 추출물(Stock 농도 100mg/mL)을 처리하고 72시간 배양하였다. 배양 후 세포를 Trypsin-EDTA를 처리 후 원심분리하여 회수하였다. 회수한 세포를 세척 후 1N NaOH 500μL를 처리하고 100℃에서 10분간 반응시켜 멜라닌을 용해하였다. 멜라닌의 양은 405nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 미백제로 알려진 합성물질인 arbutin을 표준시료로 사용하고 결과는 %로 환산하였다. 도 9는 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 미백 효능을 멜라닌 생성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 붓꽃 구근 유래 엑소좀과 붓꽃 구근 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 멜라닌 생성 억제율이 증가하였으며 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 처리하였을 때 더 높은 억제율을 확인하였다.
제형예 1: 수 타입의 제형 제조
하기 표 2의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 포함하는 수 타입의 제형을 제조하였다. 수성 2상 시스템으로 정제한 엑소좀의 제형 내 안정성을 더욱 증가시키기 위해 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜과 그들의 공중합체 및 유도체들, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린과 같이 알코올기를 포함하는 화합물들로 이루어진 군에서 하나 이상 포함시켜 제조하였다. 이와 같은 화합물을 함유하지 않은 제형을 비교제형예 1로 하였다.
성분 제형예 1 비교제형예 1
함량(중량 %)
붓꽃 구근 유래 엑소좀(실시예 1) 10 10
부틸렌글리콜 10 -
프로판다이올(1,3-프로필렌글리콜) 10 -
1,2-헥산다이올 2 2
정제수 68 88
시험예 9: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 수 타입 제형 내 온도 별 안정성 분석
상기 제형예 1 및 비교제형예 1에 따라서 제조된 수 타입 제형의 온도 별 안정성 시험을 진행하였다. 하기 표 3은 상기 제형예 1 및 비교제형예 1을 12주 간 4℃, 25℃, 45℃에서 보관 후 나노입자추적분석(NTA)을 통해 입자의 크기와 농도를 나타낸 표이다.
제형예1 제형예 1
(4℃보관)		 제형예 1
(25℃보관)		 제형예 1
(45℃보관)
Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)		 Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)		 Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)
초기 9.90x109 160.7 9.90x109 160.7 9.90x109 160.7
2주차 9.79x109 161.5 9.71x109 163.5 9.84x109 160.6
4주차 9.81x109 159.1 9.73x109 167.1 9.70x109 157.8
8주차 9.67x109 157.7 9.57x109 162.7 9.78x109 165.7
12주차 9.71x109 162.9 9.62x109 159.4 9.71x109 163.0
비교
제형예1		 비교제형예 1
(4℃보관)		 비교제형예 1
(25℃보관)		 비교제형예 1
(45℃보관)
Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)		 Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)		 Particle Number
(Particles/ml)		 Particle Size
(nm)
초기 9.90x109 160.7 9.90x109 160.7 9.90x109 160.7
2주차 8.41x109 162.5 8.20x109 164.7 6.05x109 157.2
4주차 5.01x109 157.1 6.49x109 160.1 4.28x109 155.4
8주차 2.18x109 155.7 1.77x109 162.6 9.89x108 157.6
12주차 8.90x108 156.9 9.06x108 154.3 6.04x108 156.1
온도별 12주 안정성을 분석한 결과, 제형예 1의 폴리올을 배합한 제형예 1에 해당하는 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 크기 및 농도 변화가 4℃, 25℃, 45℃ 조건에서 모두 안정적임을 확인하였다. 한편, 비교제형예 1의 경우 엑소좀의 농도가 4℃, 25℃, 45℃ 조건에서 모두 감소한 것을 확인하였다.
제형예 2: 크림의 제조
하기 표 4의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 용매 별 붓꽃 구근 추출물 효능을 비교하였을 때 효능이 좋았던 비교예 2의 붓꽃 구근 열수 추출물을 함유하는 크림을 비교제형예 2로 하였다.
성분 제형예 2 비교제형예 2
함량(중량 %)
붓꽃 구근 유래 엑소좀(실시예 1) 3 -
붓꽃 구근 열수추출물(비교예 2) - 3
글리세린 10 10
부틸렌글리콜 5 5
글리세릴올리에이트 1.8 1.8
세테아릴올리베이트 0.5 0.5
솔비탄올리베이트 0.5 0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 5.0
세틸에틸헥사노에이트 1.0 1.0
비즈왁스 0.5 0.5
스쿠알란 0.2 0.2
1,2-헥산다이올 0.2 0.2
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트 1.0 1.0
디메치콘 0.5 0.5
사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산 2.0 2.0
세티아릴알코올 1.0 1.0
미네랄 오일 2.5 2.5
디소듐이디티에이 0.02 0.02
비에이치티 0.05 0.05
토코페릴아세테이트 0.3 0.3
판테놀 0.2 0.2
에칠헥실메톡시신나메이트 0.2 0.2
향 0.01 0.01
정제수 잔량 잔량
시험예 10: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 제형 성상 안정성 분석
상기 제형예 2에 따라서 제조된 크림의 성상안정성 시험을 진행하였다. 제조된 크림을 12 주간 Cycling Chamber에서 24시간 간격으로 4℃ ↔ 45℃ 의 온도 변화를 주면서 그 성상의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
주차 제형예 2
초기 -
2주차 -
4주차 -
8주차 -
12주차 +
(-; 변화없음, +; 약간 색의 변화, ++; 색변화 또는 약간의 침전, +++; 색변화와 침전 발생)
수성 2상 시스템으로 정제한 붓꽃 구근 유래 엑소좀(실시예)을 함유한 크림 제형의 안정성을 관찰한 결과, 성상안정성이 유지되는 것을 확인하였다.
시험예 11: 붓꽃 구근 유래 엑소좀의 피부 주름개선효과
30~50대의 성인 여성 30명을 대상으로 두 그룹으로 나누어 상기 실시예에 따라서 정제된 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 포함하는 크림(제형예 2)과 상기 비교예 2의 붓꽃 구근 열수 추출물을 포함하는 크림(비교제형예 2)을 얼굴 양쪽면에 바르고 LED 광원장치로 633nm의 적색광을 6주간 누적 시간 24시간 조사한 후, 주름 개선 효과를 평가하였다. 하기 표 6은 이 평가를 토대로 한 주름 개선 효과 결과를 나타낸 표이다.
주름개선효과
우수 약간 없음
제형예 2 11 3 1
비교제형예 2 4 4 7
상기 표 6의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 포함하는 크림에서 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다.

Claims (8)

  1. 붓꽃 구근 엑소좀을 함유하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 붓꽃 구근 엑소좀은,
    (A)붓꽃 구근을 초고압 처리하는 단계;
    (B)초고압 처리한 붓꽃 구근을 착즙하는 단계;
    (C)상기 붓꽃 구근 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
    (D)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;
    (E)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및
    (F)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 붓꽃 구근 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 붓꽃 구근 엑소좀의 성상 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 또는 그 유도체, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
  6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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