KR20200121062A - 식물 유래 세포밖 소포체의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 시료, 특히 식물 조직으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포밖 소포체의 고유의 치료적 활성 및 약물전달 활성을 그대로 유지하면서 고순도, 고품질로 이를 수득할 수 있는 효율적인 분리, 정제 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물 유래 세포밖 소포체의 정제 방법{A Method for Purifying Plant-Derived Extracellular Vesicles}

본 발명은 크기배제 크로마토그래피를 이용한 식물 유래 세포밖 소포체의 정제 방법에 관한 것이다.

세포밖 소포체는 다양한 크기를 가지며, 특히 이중 크기가 가장 작은 엑소좀(exosome)은 50~150 nm의 작은 세포막성 수포이다. 세포밖 소포체는 인간과 동물은 물론, 곤충, 식물, 미생물 세포에서 분비된다. 특히 이들은 세포가 갖고 있는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등 특정 분자들을 포함하고 있으며, 지질 이중층으로 둘러싸여 있어 이들 분자들을 안정적으로 보호하면서, 분비 후 다른 세포로 이들을 전달할 수 있는 특징이 있다. 생체 내 혈액, 소변, 침 등과 같은 체액에서 고농도로 발견되는 세포밖 소포체는의 이런 특징으로 인해 새로운 생물학적 소재로서 가능성을 갖고 있다.

인간, 동물, 미생물에 비해 식물유래 세포밖 소포체에 대한 연구는 많이 이뤄지지 않았다. 하지만, 최근 연구에서 포도, 생강 등에 존재하는 세포밖 소포체를 이용한 동물 실험에서 경구 투여된 세포밖 소포체가 쥐의 대장에 있는 세포까지 전달되는 것이 확인되었으며, 특히 이를 이용하여 대장 내 염증성 질환을 치료할 수 있는 결과가 보고되었다. 즉, 식물유래 세포밖 소포체는 식물의 유용 성분을 함유하고 있을 뿐 아니라, 섭식 후 대장에 존재하는 세포까지 이들 분자를 안전하게 전달할 수 있음이 규명된 것이며, 이를 통해 대장 내 대표적 질환인 대장암, 대장염증질환(크론병 등) 등을 치료할 수 있는 가능성이 있다.

식용식물 유래 세포밖 소포체는 1) 천연물질로 부작용 이슈가 매우 적으며; 2) 경구투여를 통해 대장 도달이 가능할 뿐 아니라; 3) 음식으로 직접 식용하는 것에 비해 편의성이 높아 유아나 소아 대상으로 적용이 가능하고; 4) 식물로부터 대량 생산이 가능하여 건강기능식품의 새로운 패러다임 선도할 수 있으며; 5) 약리성분을 탑재하여 대장까지 전달할 수 있는 효율적인 약물 전달체로 적용이 가능하다는 장점이 있다.

하지만, 이런 이점에도 불구하고, 아직 식품으로 사용되는 식물유래 세포밖 소포체의 생물학적 기능 및 응용은 물론, 이들의 추출 및 정제 방법에 대한 연구 역시 체계적으로 이뤄지지 않았다. 식물유래 세포밖 소포체는 일반적으로 세포밖 소포체 분리에 사용되는 초고속원심분리법의 경우, 식물유래 불순물 농도가 상대적으로 높고, 강한 원심력에 의해 세포밖 소포체의 물리적 파쇄가 유발될 수 있다. 상용화되어 판매되는 ExoQuick(SBI사) 등의 폴리머 침강법 역시 불순물의 농도가 매우 높으며, PEG(polyethylene glycol)을 사용하기 때문에 이로 인한 오염 문제를 갖고 있다. 따라서, 식용식물 유래 세포밖 소포체의 산업적 활용을 위해서는 이들을 효율적으로 대량 분리할 수 있는 새로운 기술의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국 공개특허공보 제2010-0184046호 특허문헌 2. 미국 공개특허공보 제2018-0369351호

본 발명자들은 생물학적 시료로부터 유래한 세포밖 소포체, 구체적으로는 식물 유래 세포밖 소포체의 효율적인 수득 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에 통상적으로 이용되는 폴리머 침강법 또는 초고속원심분리법에서 벗어나 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제를 수행할 경우 불순물 함량을 크게 낮추면서도 소포체에 가해지는 물리적 파쇄도 없으면서 고유의 약리학적 및 약물전달적 활성을 그대로 유지하는 고순도, 고품질의 세포밖 소포체를 수득할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 세포밖 소포체를 포함하는 생물학적 시료에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포밖 소포체를 포함하는 생물학적 시료에 대해 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분리 방법을 제공한다.

본 발명자들은 생물학적 시료로부터 유래한 세포밖 소포체, 구체적으로는 식물 유래 세포밖 소포체의 효율적인 수득 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에 통상적으로 이용되는 폴리머 침강법 또는 초고속원심분리법에서 벗어나 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제를 수행할 경우 불순물 함량을 크게 낮추면서도 소포체에 가해지는 물리적 파쇄도 없으면서 고유의 약리학적 및 약물전달적 활성을 그대로 유지하는 고순도, 고품질의 세포밖 소포체를 수득할 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어 "세포밖 소포체(extracellular vesicle)"는 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 대략 30-1,000 nm 범위의 직경을 가지고, 다낭체와 원형질막의 융합을 통해 세포 밖 환경으로 방출된다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료(biological sample)”는 살아있는 생명체로부터 채취, 분리하거나, 또는 이로부터 유래한 관심 성분의 유효량을 함유하고 있는 가공되지 않거나 또는 전처리된 시료를 의미한다. 생물학적 시료는 동물, 식물의 조직 절편(section) 및 약리학적, 진단학적 또는 식품학적 목적을 위해 동물, 식물로부터 채취한 동결 또는 파라핀 포매 절편, 세포, 세포 배양액, 초대배양물(primary culture), 절편체(explant)를 포함할 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. 또한, "생물학적 시료"는 특정 생명체가 존재하는 것으로 의심되는 환경(예를 들어, 물, 대기, 토양 등)으로부터 채취한 물질일 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 생물학적 시료는 동물 세포 배양액, 동물 조직, 식물세포 배양액, 식물 조직, 박테리아 배양액, 효모 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 보다 구체적으로는 상기 생물학적 시료는 식물세포 배양액 또는 식물 조직이고, 가장 구체적으로는 식물 조직이다.

본 명세서에서 용어 “크기배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)”는 비균질 혼합물을 구성하는 각각의 물질 중 정지상의 비드 포어(bead pore) 직경보다 크기가 작은 물질은 포어에 진입하여 상대적으로 느리게 용출되고, 크기가 큰 물질은 포어에 진입하지 않고 이동상을 따라 빠르게 용출됨으로써, 이로부터 유발되는 각 물질의 크기에 따른 이동속도 차이에 기반하여 물질을 분리하는 크로마토그래피를 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 크기배제 크로마토그래피는 정지상(stationary phase)의 포어(pore) 평균 직경은 30-75 nm이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 생물학적 시료에 대해 한외여과를 수행하는 단계를 임의의 순서로 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서 용어“한외여과”는 비균질 혼합용액을 구성하는 각각의 물질을 압력 또는 농도구배에 의해 반투과성 막을 따라 분리시키는 막-기반 분리공정을 의미한다. 한외여과 막은 일정한 컷오프 값을 갖는 기공 크기를 갖는다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 한외여과는 3 내지 100 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지며, 보다 구체적으로는 5 내지 50 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지며, 가장 바람직하게는 5 내지 15 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가진다.

본 발명의 방법에 한외여과를 수행하는 단계가 추가적으로 포함될 경우, 이는 크기배제 크로마토그래피 전에 수행될 수도 있으며, 크로마토그래피 완료 후에 수행될 수도 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 방법은 상기 한외여과를 수행하는 단계와 상기 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 순차적으로 포함한다. 이와 같이 한외여과 후 크기배제 크로마토그래피를 수행할 경우 한외여과를 통한 농축으로 시료의 부피가 감소한 뒤 크기배제 크로마토그래피가 적용되어 보다 효율적인 분리공정이 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료가 실물 조직일 경우, 상기 식물 조직은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수득된다.

(a) 식물체를 분쇄 후 착즙하여 추출물을 수득하는 단계;

(b) 상기 추출물을 여과하여 고형물을 제거하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 여과물을 원심분리하는 단계.

본 명세서에서 용어 "착즙"은 열이나 효소를 가하지 않고 기계적, 물리적인 힘을 가하여 식물 조직의 내부에 포함된 수분 등을 외부로 유출시켜 얻어진 액상의 유체를 의미하는 것으로, 예를 들어, 과즙, 야채즙, 뿌리즙을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는, 상기 단계 (b)는 직경 1mm 이상의 고형물이 제거되도록 여과한다.

보다 구체적으로는, 상기 단계 (c)는 7,000-9,000 x g로 1차 원심분리 후 이의 상층액을 19,000-21,000 x g로 2차 원심분리 함으로써 수행된다. 보다 구체적으로는, 상기 단계 (c)는 7,500-8,500 x g로 1차 원심분리 후 이의 상층액을 19,500-20,500 x g로 2차 원심분리 함으로써 수행된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 생물학적 시료, 특히 식물 조직으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 세포밖 소포체의 고유의 치료적 활성 및 약물전달 활성을 그대로 유지하면서 고순도, 고품질로 이를 수득할 수 있는 효율적인 분리, 정제 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 식물유래 세포밖 소포체를 분리하기 위하여 무게 측정, 세척, 착즙, 거름망 여과를 진행하는 과정을 보여주는 그림이다.
도 2는 식물유래 세포밖 소포체를 제외한 불순물이 포함된 착즙액을 농축 및 정제한 시료의 모습을 보여주는 그림이다.
도 3은 크기배제 크로마토그래피를 통해 식물유래 착즙액이 분리된 세포밖 소포체와 불순물 단백질을 보여주는 그림이다.
도 4는 각각 양배추(도 4a), 붉은 양배추(도 4b) 및 토마토(도 4c) 유래 세포밖 소포체들의 분리 및 정제도를 보여주는 그림이다.
도 5는 각 분획에서 크기배제 크로마토그래피를 통해 정제한 양배추 유래 세포밖 소포체의 크기 분포도를 보여주는 그림이다.
도 6은 각각 PEG를 이용한 폴리머 침강법, 초고속원심분리법 및 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분리한 양배추 유래 세포밖 소포체를 보여주는 그림이다.
도 7은 각각 PEG를 이용한 폴리머 침강법, 초고속원심분리법 및 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분리한 양배추 세포밖 소포체의 크기 분포도를 보여주는 그림이다.
도 8은 각각 PEG를 이용한 폴리머 침강법, 초고속원심분리법 및 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분리한 양배추 세포밖 소포체의 수율 및 순도를 보여주는 그림이다.
도 9는 양배추(도 9a) 및 토마토(도 9b) 각각의 경우 본 기술을 이용한 식용식물 질량 및 가격 대비 세포밖 소포체 수율을 보여주는 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

식물 유래 세포밖 소포체 분리를 위한 착즙

1) 일반적으로 섭취하는 식물인 적배추, 양배추, 토마토, 오이, 귤 등으로부터 세포밖 소포체를 분리하기 위하여 무게를 측정한 후 흐르는 수돗물로 1차적으로 식물의 농약을 제거하였다. 다음으로 흐르는 초순수 증류수를 이용하여 수돗물과 농약을 2차적으로 제거하였다. 이후 과도를 이용하여 가로 40 mm, 세로 30 mm 이하로 토막을 낸 후 착즙기를 이용하여 즙을 낸 다음 즙 내에서 큰 물질을 제거하기 위하여 면 주머니 가로 1 mm, 세로 1 mm 이하의 덩어리만을 여과하였다. 최종적으로 면 주머니로 걸러진 용액에서 단백질 및 세포벽을 제거하기 위해 8,000 x g로 1시간 동안, 4℃에서 원심분리를 진행 후 상층액만을 다시 20,000 x g에서 1시간 동안 4℃에서 다시 원심분리하였다. 이러한 과정으로 수득한 상층액은 추후 실험을 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다(도 1).

식물 유래 세포밖 소포체 분리 및 정제 방법

1) 고순도의 식물 유래 세포밖 소포체를 얻기 위해서는 식물에 포함된 단백질을 포함한 불순물들을 제거해야 한다. 착즙물을 원심분리한 후에도 상층액에는 세포밖 소포체 이외의 단백질 불순물들이 다수 포함되고 있는데, 초고속원심분리 방법과 폴리머를 기반으로 한 침강방법으로는 이들 불순물 단백질들을 제거하는 데 한계가 있다. 따라서 이러한 세포밖 소포체 이외의 물질을 제거한 후 순도를 높이기 위하여 세포밖 소포체 분리 및 정제 방법을 크기배제 크로마토그래피 방법을 이용하였으며, 효율적 분리 및 정제를 위해 한외여과(ultrafiltration)를 동반하여 분리 효율 및 순도를 높이고자 하였다.

2) Amicon Ultra®-15 10kDa Centrifugal filter (Merck Millipore, Cat. No: UFC901024)에 착즙 용액 13 mL를 넣어주고 5,000 x g로 3시간 동안 4℃에서 원심분리를 진행한 후 얻어진 상층액 0.5 mL를 200nm 시린지 필터에 가하여 Eppendorf 튜브 1.5 mL (SPL, Cat. No: 50015)에 옮겼다(도 2).

3) 실험 클램프 스탠드에 qEVoriginal/70 nm(Izon science, Cat.No: SP1)을 클램프에 고정한 후 qEVoriginal 컬럼에 있던 PBS 용액을 제거한 후 1X PBS (pH7.4) 용액으로 중력으로 10 mL 평형을 진행하였다. 다음으로 이전 단계에서 여과된 착즙 용액 0.5 mL를 qEVoriginal 컬럼에 주입하고 용액이 모두 크기배제 크로마토그래피 비드로 넘어가게 되면 PBS 용액을 넣어주었다. 이때 크기배제 크로마토그래피가 받는 중력의 힘을 일정하게 유지하기 위하여 PBS가 2 mL이 넘지 않도록 계속하여 주입하였다. 내려오는 용액을 하나의 Eppendorf 튜브 1.5 mL에 0.5 mL씩 담아 결과적으로 총 33개의 튜브를 얻었다(도 3).

식물유래 세포밖 소포체 크기 분포도 및 농도와 순도

1) 식물유래 세포밖 소포체의 농도와 순도를 결정하기 위하여 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analyzer, NTA)과 단백질을 정량화하는 BCA 어세이를 이용하였다. 우선 분리한 세포밖 소포체의 튜브를 각각 PBS로 1:100로 희석시킨 후 NTA를 이용하여 세포밖 소포체의 농도와 크기 분포도를 측정하였다. 다음으로 크기배제 크로마토그래피를 거친 용액의 단백질 농도를 확인하기 위하여 BCA 어세이를 통해 각 분획의 단백질 농도를 정량화하였다. 단백질의 농도희석을 두 가지로 측정하게 되며 처음으로 희석없이 해당 용액을 바로 찍는 과정과 PBS로 1:10으로 희석한 샘플을 측정하여 BSA 표준곡선 내에 들어오는 단백질의 농도를 확인하였다(도 4 및 도 5).

식물유래 세포밖 소포체의 분리 및 정제 방법에 따른 수율 및 순도의 비교

1) 세포밖 소포체 분리는 현재 주로 초고속원심분리법과 폴리머 침강법에 의해 이루어지고 있다. 하지만 초고속원심분리법의 경우 강한 원심력이 작용하여 물리적인 힘에 세포밖 소포체의 파쇄가 발생할 수 있으며 폴리머 침강법의 경우 세포밖 소포체 이외의 불순물을 다량으로 포함하기 때문에 순도 면에서 바람직하지 않다.

2) 크기배제 크로마토그래피, 초고속원심분리법, 폴리머 침강법은 모두 동일한 양의 양배추 착즙액 13 mL을 이용하여 식물유래 세포밖 소포체를 나노입자 추적 분석장치를 이용하여 크기 분포도를 수득하고, BCA 어세이를 통해 단백질 농도를 측정함으로써 수율, 농도 및 순도를 단백질 1 mg 당 세포밖 소포체의 양으로 계산하여 비교를 진행하였다. 폴리머 침강법과 초고속원심분리법의 경우 다양한 크기의 피크들이 관찰됨에 반하여 크기배제크로마토그래피에 의해 분리된 세포밖 소포체는 균일한 피크를 보였다(도 7). 수율에서는 모든 방법이 통계적으로 유의성 없이 유사한 수준의 수율을 보였으나(도 8a), 순도의 경우 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분리한 경우가 다른 방법에 비해 월등히 높았다(도 8b).

식물 무게 별 세포밖 소포체수율

1) 사용된 식물유래 착즙액의 총 부피를 크기 배제 크로마토그래피에 사용된 13 mL의 비율을 측정한 후 착즙에 사용된 식물의 전체 무게를 곱하여 식물유래 세포밖 소포체 분리에 사용된 무게를 확인한 뒤 1 g당 얻어진 식물유래 세포밖 소포체를 측정하였다. 다음으로 얻어진 농도 별 무게에서 사용된 가격을 구하기 위하여1 g당 식물의 가격을 확인하여 환산하였다. 사용된 식물의 가격은 전년 평균 가격으로 계산하였다(출처:농업관측본부, https://aglook.krei.re.kr/)(도 9).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 세포밖 소포체를 포함하는 생물학적 시료에 대해 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분리 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물 세포 배양액, 동물 조직, 식물세포 배양액, 식물 조직, 박테리아 배양액, 효모 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 식물세포 배양액 또는 식물 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 생물학적 시료에 대해 한외여과를 수행하는 단계를 임의의 순서로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 방법은 상기 한외여과를 수행하는 단계와 상기 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 한외여과는 5 내지 50 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 한외여과는 5 내지 15 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 크기배제 크로마토그래피는 정지상(stationary phase)의 포어(pore) 평균 직경이 30-75 nm인 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 3 항에 있어서, 상기 식물 조직은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 방법:
   (a) 식물체를 분쇄 후 착즙하여 추출물을 수득하는 단계;
   (b) 상기 추출물을 여과하여 고형물을 제거하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)의 여과물을 원심분리하는 단계.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 직경 1mm 이상의 고형물이 제거되도록 여과하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 7,000-9,000g로 1차 원심분리 후 이의 상층액을 19,000-21,000g로 2차 원심분리 함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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