KR20150036856A

KR20150036856A - 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독을 이용한 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20150036856A
Application number: KR20130115807A
Authority: KR
Inventors: 신장철; 박정근; 원하영; 김승주; 이지연; 신연희; 이선영; 김일광; 김철구
Original assignee: 주식회사 청진바이오텍
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2015-04-08
Also published as: KR101512064B1

Abstract

본 발명은 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독과 항산화, 항균 및 미백 등 효과가 뛰어난 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 이용한 크림 및 에센스 등의 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법은, 알러지 성분이 제거되고, 아파민(apamin)과 멜리틴(melittin)이 포함된 분리정제봉독 추출물을 얻는 제 1 단계와, 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는 제 2 단계 및 상기 제 1 단계에서 얻은 분리정제봉독 추출물과 상기 제 2 단계에서 얻은 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 혼합하여 기능성 봉독 화장품 조성물을 얻는 제 3 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

알러지 성분이 제거된 분리정제봉독을 이용한 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법{METHOD FOR MANUFACTURING FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITE USING NO ALLERGIC BEE VENOM}

본 발명은 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독 추출물과 항산화, 항균 및 미백 등 효과가 뛰어난 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 이용한 크림 및 에센스 등의 기능성 봉독화장품 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

봉독(蜂毒)이란 벌이 가지고 있는 독이며, 관절염 완화, 동맥경화 완화, 요통 완화, 피부상처의 치료, 면역체계를 강화하는 항균작용 및 항염증작용뿐만 아니라, 미용의 목적으로도 피부의 미백작용 및 주름개선작용에 관여한다고 알려져 있다.

정제봉독(Purified Bee Venom, PBV)은 봉독채집장치 등을 이용하여 벌로부터 채집된 봉독에 대해 자연건조, 수용정제, 멸균 및 동결건조 등의 공정을 거쳐 생성된 결과물로, 정제봉독과 봉독의 생리활성은 유사한 것으로 알려져 있다.

정제봉독의 구성성분은 복잡한 구조의 펩티드와 단백질(e.g. 효소), 그리고 낮은 분자의 활성아민 등을 포함하여 40가지 이상의 물질로 구성되어 항균, 항 염증, 피부 상처치료, 피부 주름개선에 효과적이며, 또한 세포막 활성화, 세포막 표면장력 축소 및 혈액응고 저하 등의 생리활성을 나타낸다.

정제봉독의 생리활성작용을 가지는 구성성분은 다음의 표 1과 같다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이, 구성성분 중 단백질(효소)은 약 13KDa이상의 분자량을 가지는 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2), 히알루로니다제(Hyaluronidase), 포스파타아제(phosphatase), α-글루코시다아제(α-Glucosidase) 등의 성분으로 구성되고, 주로 혈액세포막 파괴, 혈액응고, 단백질의 가수분해 촉진 등의 생리활성 역할을 할 수 있다.

그러나, 봉독의 성분 중 포스포리파아제 A2와 히알루로니다아제는 강력한 알러지 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.

봉독은 여러 약리 작용을 나타내고, 생리활성이 우수한 것으로 오래 전부터 알려져 왔으며, 최근에는 미용화장적인 피부 상처치료, 피부 여드름치료 및 주름개선 등 분야에서도 사용되고 있다.

그러나 봉독을 이용하는 과정에서 발생하는 여러 알러지 반응은 사용자에게 문제를 유발할 수 있다.

특히 포스포리파아제 A2와 히알루로니다아제는 강력한 알러지 반응을 유도하는 봉독 조성물로, 봉독에 대한 과민성을 지닌 사용자에게서는 매우 심각한 안전상의 문제를 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다.(Stefan Bogdanov; Bee Venom: composition, Health, Medicine: A Review, Bee Product Science (2011))

봉독 추출물을 이용하는 기술과 관련하여, 공개특허공보 제10-2012-0003178호는 봉독 추출물을 함유하는 피부 미백 및 보습용 조성물에 관한 것으로, 봉독을 전처리하거나 봉독으로부터 봉독 추출물을 추출하고 이를 유효성분으로 하는, 피부 미백 및 피부 보습효과를 나타내는 조성물 또는 화장품 조성물에 대하여 개시하고 있다.

그러나, 상기와 같은 종래의 기술에서는 강력한 알러지 반응을 유도하는 포스포리파아제 A2와 히알루로니다제를 제거하는 과정을 포함하지 않고 있어 제조된 봉독 추출물을 유효성분으로 하는 조성물 및 화장품 조성물을, 봉독에 대하여 과민성을 지닌 사용자가 사용할 경우 매우 심각한 안전상의 문제를 일으킬 수 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 봉독화장품의 안정성 및 유효성을 확보하기 위하여, 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독 추출물과 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 조합하여 항균, 항염, 미백 및 주름개선의 특성이 향상된 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 울트라필터방법을 사용하여 정제봉독에서 알러지 성분을 제거하여 유효적인 성분인 아파민(apamin) 및 멜리틴(melittin)의 함량이 높은 분리정제봉독 추출물을 제공할 수 있는 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

그러나 본 발명의 목적은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법은, 알러지 성분이 제거되고, 아파민(apamin)과 멜리틴(melittin)이 포함된 분리정제봉독 추출물을 얻는 제 1 단계와, 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는 제 2 단계 및 상기 제 1 단계에서 얻은 분리정제봉독 추출물과 상기 제 2 단계에서 얻은 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 혼합하여 기능성 봉독 화장품 조성물을 얻는 제 3 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법은, 상기 제 1 단계에서, 봉독과 증류수를 1 : 10의 중량비로 혼합하여 혼합용액을 얻는 제 1 공정과, 여과지를 이용하여 상기 혼합용액에 포함된 이물질을 제거하는 제 2 공정과, 필터막을 이용하여 이물질이 제거된 혼합용액에서 세균 및 미생물을 제거하여 2∼3중량%의 아파민(apamin), 45∼50중량%의 멜리틴(melittin), 12중량%의 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 12중량%의 히알루로니다제(Hyaluronidase)를 포함하는 정제봉독 수용액을 얻는 제 3 공정과, 상기 정제봉독 수용액을 증류수에 1:10의 중량비로 희석하고, 컷오프(cut-off) 사이즈가 30kDa(kilo-Dalton)인 한외여과 막(ultrafiltration membrane)으로 여과하여 히알루로니다제를 제거하고 3∼6중량%의 포스포리파아제 A2로 감축하는 제 4 공정과, 상기 제 4 공정에서 여과된 정제봉독 수용액을 증류수에 1 : 10의 중량비로 희석하고, 컷오프 사이즈가 10kDa인 한외여과 막으로 여과하여 포스포리파아제 A2를 제거하는 제 5 공정 및 제 5 공정에서 여과된 정제봉독 수용액을 컷오프 사이즈가 1kDa인 한외여과 막으로 여과한 후 농축 및 건조하여 6중량% 이상의 아파민 및 65중량% 이상의 멜리틴이 포함된 분리정제봉독 추출물을 얻는 제 6 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명의 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법은, 상기 제 2 단계에서, 뱀딸기전초 및 감태를 각각 세척 및 건조한 후 분쇄하여 분말을 얻는 제 1 공정과, 각각의 분말을 80%의 에틸알코올 수용액에 첨가한 후 초음파를 조사하여 제 1 추출물을 얻는 제 2 공정과, 각각의 제 1 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 순서대로 이용하여 제 2 추출물을 얻는 제 3 공정 및 각각의 제 2 추출물에 에틸알코올과 클로로폼을 용리제로 혼합한 후 크로마토그래피 방법을 이용하여, 분리정제한 후 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는 제 4 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법에 따르면, 알러지 성분이 제거되고, 아파민(apamin) 및 멜리틴(melittin)의 함량이 높은 분리정제봉독 추출물과 항균, 항염, 미백 및 주름개선의 특성을 가지는 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 조합하여 제조함으로써 봉독 화장품의 안정성 및 유효성을 확보할 수 있는 이점이 있다.

또한, 본 발명의 기능성 봉독 화장품 조성물로 화장품 크림과 에센스를 제조하였을 때, 피부의 보습력, 탄력, 피부 저자극, 미백 및 주름 등에서 높은 효능과 개선효과를 가지는 이점이 있다.

도 1은, 본 발명의 실시예에 따른 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독을 이용한 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는, 본 발명에 따른 정제봉독 추출물을 제조하는 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 3은, 본 발명에 따른 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 제조하는 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 4는, SDS page에서 기준정제봉독과 분리정제봉독의 성분비교를 나타내는 예시도이다.
도 5는, HPLC크로마토그램에서 기준정제봉독과 분리정제봉독에 대한 정성 및 정량분석을 나타내는 예시도이다.
도 6은, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물로 제조된 화장품에 대한 피부 보습 및 탄력도에 대한 효과를 나타내는 예시도이다.
도 7은, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물로 제조된 화장품에 대한 피부 색소침착 효과를 나타내는 예시도이다.
도 8은, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물로 제조된 화장품에 대한 모공 및 피부표면 거칠기에 대한 효과를 나타내는 예시도이다.
도 9는, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물로 제조된 화장품에 대한 주름개선 효과를 나타내는 예시도이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예의 상세한 설명은 첨부된 도면들을 참조하여 설명할 것이다. 하기에서 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.

본 발명의 개념에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독을 이용한 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.

도면을 참조하면, 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법은, 먼저, 알러지 성분으로서 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2)와 히알루로니다제(Hyaluronidase)가 제거되고, 유효성분인 아파민(apamin)과 멜리틴(melittin)이 포함된 분리정제봉독 추출물을 획득하고(S101), 자연 숙씨식물인 뱀딸기(Duchesnea chrysantha)와 해조류 갈조식물인 감태(Ecklonia cava)로부터 항 산화, 항균 및 미백 등의 유효성분을 가지는 각각의 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 획득한 후(S102), 분리정제봉독 추출물과 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 혼합하여 기능성 봉독 화장품 조성물을 획득할 수 있다(S103).

본 발명에서 사용되는 뱀딸기(Duchesnea chrysantha)는 쌍떡잎 식물 장미과 다년생 초본으로 한국, 중국, 일본 등 지역의 자연 풀밭, 각지의 들판 및 길가에서 자생하는 것으로, 이러한 뱀딸기의 전초추출물은 다양한 탄닌화합물(tannins)，갈산(gallic acid)，우론산(uronic acid)，우르솔릭산(ursolic acid), 스테아르산(stearic acid)，플리페놀과 프라본 및 다당류 등 성분을 포함 있고 우수한 항산화, 항균, 항암 등 효과를 있다.

또한, 감태(Ecklonia cava)는 갈조류로서, 미역과에 속하며 다년생 대형으로 북 태평양 서안의 바다 숲에 분포되고 있으며, 우리나라 남해안과 제주도 해안에 널리 서식하는 것으로 알려지고 있다. 이러한, 감태는 식용과 사료첨가제로 사용되고 있고, 이뇨효과, 부기를 가라앉은 효과,　항균, 항 염증효과, 항암, 항 산화효과 등 약리성분을 가지고 있으며, 최근에는 항바이러스 활성, 항돌연변이 등 활성성분을 가지는 것이 확인되고 있다.

도 2는 본 발명에 따른 정제봉독 추출물을 제조하는 공정을 나타내는 흐름도로서, 도면에 나타낸 바와 같이, 기능성 봉독 화장품 조성물에 사용되는 분리정제봉독 추출물은, 먼저 봉독과 증류수를 혼합하여 혼합용액을 얻고(S201), 이후, 상기 혼합용액에 포함된 비 수용성 화분 및 먼지 등의 이물질을 제거한 다음(S202), 이물질이 제거된 혼합용액에서 세균 및 미생물을 제거하여 아파민(apamin), 멜리틴(melittin), 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 히알루로니다제(Hyaluronidase)를 포함하는 정제봉독 수용액을 얻는다(S203).

이후, 정제봉독 수용액을 증류수로 희석하고, 컷오프(cut-off) 사이즈가 30kDa(kilo-Dalton)인 한외여과 막(ultrafiltration membrane)으로 여과하여 히알루로니다제를 제거하고 6중량% 이하로 아파민포스포리파아제를 감축한다(S204).

다음에, 여과된 정제봉독 수용액을 다시 증류수로 희석하고, 컷오프 사이즈가 10kDa인 한외여과 막으로 여과함으로써, 정제봉독 수용액에 포함된 포스포리파아제 A2를 제거한다(S205).

마지막으로, 알러지 성분이 제거된 정제봉독 수용액을 컷오프 사이즈가 1kDa인 한외여과 막으로 다시 여과한 후, 농축 및 건조함으로써 6중량% 이상의 아파민 및 65중량% 이상의 멜리틴이 포함된 주 기능성 소재의 분리정제봉독 추출물을 얻을 수 있다(S206).

도 3은 본 발명에 따른 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 제조하는 공정을 나타내는 흐름도이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 분리정제봉독 추출물과 함께 기능성 봉독 화장품 조성물을 이루는 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 제조하는 방법은, 뱀딸기전초 및 감태를 각각 세척 및 건조한 후 분쇄하여 분말을 얻는다(S301).

이후, 각각의 분말을 에틸알코올 수용액에 첨가한 후 초음파를 조사하여 조 추출물 형태의 제 1 추출물을 얻고(S302), 다시 각각의 제 1 추출물을 대상으로 추출 용매의 종류를 달리하면서 2회 이상 추출을 수행하여 분별추출물 형태의 제 2 추출물을 얻는다. 이때, 상기 추출 용매는 헥산, 클로로폼, 에틸아세테이트, 아세톤, 디클로로메탄, 에틸알코올, 메틸알코올, 부틸알코올 또는 이들의 혼합물 등일 수 있다.

그리고, 각각의 제 2 추출물에 에틸알코올과 클로로폼의 혼합물 또는 메틸알코올과 클로로폼의 혼합물 등을 용리제로 혼합한 후 크로마토그래피 방법을 이용하여, 분리정제한 후 항 산화 및 항 노화 등의 기능성 보조소재로 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는다(S304).

<실시예 1> 분리정제봉독 추출물의 제조

생벌로부터 채취한 봉독원료를 증류수와 중량비 1:10으로 충분히 혼합 용해하고, 3㎛의 여과지로 혼합 용액을 여과하여 포함된 비 수용성의 화분, 먼지 등 이물질을 제거하였다.

회수한 여과액을 0.45㎛의 필터 이용하여 미세 이물질을 제거하고, 다시 0.2㎛의 필터를 이용하여 세균과 미생물 등을 제거한 정제봉독 수용액을 준비하였다.

그리고, 준비한 정제봉독 수용액을 증류수와 1:10(v/v)으로 희석한 후 분자량 13KDa이상으로 구성된 단백질효소인 포스포리파아제A2와 히알루로니다아제를 제거 하기 위해 컷 오프(cut-off)사이즈가 30KDa의 Ultrafiltration membrane으로 여과하였다.

이후, 0.4MPa의 질소가스 가압필터를 통해 히알루로니다아제와 대부분의 포스포리파아제A2를 제거하였다.

그리고, 포스포리파아제A2를 완전히 제거하기 위해, 여과물을 증류수와 1:10(v/v)으로 희석하고, cut-off사이즈가 10KDa인 Ultrafiltration membrane을 선정하여 여과공정을 수행하여 포스포리파아제A2를 완전히 제거하였다.

그리고, 봉독의 안전성 확보를 목적으로 알러지 유발성분을 제거할 뿐만 아니라 봉독의 유효성 확보를 위해 cut-off사이즈가 1KDa인 Ultrafiltration membrane을 선정하여, 알러지 성분이 제거된 여과물을 3:2(상하층 농축액과 여과액의 부피 비, v/v)으로 농축시키고, 최종 건조하여 아파민(apamin) 6중량%이상, 멜리틴(melittim) 65중량%이상의 분리정제봉독 추출물을 제조하였다.

(1) 분리정제봉독 추출물 중 알러지 유발성분의 제거 확인 및 유효성분의 정량분석

1) SDS PAGE test(전기영동 테스트)

18% 또는 20%의 겔 조성을 만들고 고정된 유리 플레이트에 약 10㎖((i) 18%의 겔 조성: dH₂O 1.3㎖, 30% 아크릴아미드 믹스 6.0㎖, 1.5 M Tris-HCl(pH8.8) 2.5㎖, 10% SDS 100㎕, 10% 암모늄 퍼설페이트 100㎕, TEMED 4㎕; (ii) 20%의 겔 조성: dH₂O 700㎕, 30% 아크릴아미드 믹스 6.6㎖, 1.5 M Tris-HCl(pH8.8) 2.5㎖, 10% SDS 100㎕, 10% ammonium persulfate 100㎕, TEMED 4 ㎕) 정도 분주한다.

평형을 맞추기 위해 물을 약 1∼2㎖정도 분주하여 separating gel을 굳힌다. Separating gel이 굳으면 위에 분주한 물을 제거하고, staking gel 조성물 약 5㎖(겔 조성: dH₂O 3.4㎖, 30% 아크릴아미드 믹스 830㎕, 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8) 630㎕, 10% SDS 50㎕, 10% 암모늄 퍼설페이트 50㎕, TEMED 5㎕)를 분주 후, 겔이 굳기 전에 comb를 끼워 굳힌다.

Staking gel까지 굳으면 comb를 제거하여 SDS page gel을 완성시킨다.

SDS page로 확인하고자 하는 분획과 샘플 버퍼(Laemmli 2x Concentrate, sigma, S3401)를 1:1 비율로 혼합하고, 90℃의 water bath에서 5분 동안 중탕시킨다.

겔의 comb에 마커 5㎕, 샘플 30㎕씩 로딩하고, 겔을 SDS page 탱크에 끼워서 running buffer(25mM Tris, 192mM 글리신, 0.1% SDS, pH8.3)를 채워준다. SDS page 파워 서플라이를 통하여 staking gel에서 60V로 약 30분 동안 동작시키고, separating gel에서 120V로 약 60-90분 동안 동작시킨다.

시료의 성분은 파워 서플라이에서 흘려주는 전류를 따라 겔에서 분자량 별로 분리되고, coomassie brilliant bule R-250 염료와 destaining solution으로 염색 후 탈색 처리한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 봉독유효성분 분획(10KDa, 30KDa)과 분리 전 봉독(PBV) 및 표준물(apamin:99.9%, STD^A; PLA₂: 90.7%, STD^P; melittin 96%, STD^M)에 대한 각 전기영동 테스트에서 나타난 밴드를 비교하면, 분자량 15-20KDa에 나타나는 PLA₂ 밴드는 10KDa방법으로 회수한 분획에서 제거되고, 30KDa방법으로 회수한 분획에서 많이 감축된 것을 알 수 있다.

또한 50KDa에 나타내는 히알루로니다제의 밴드는 상기 방법에서 제거된 것을 알 수 있다.

2) HPLC으로 분리정제봉독 추출물의 유효성분 정량분석

본 발명에 따른 방법으로 제조된 분리정제봉독 추출물의 유효성분 정량분석을 위해 각각 시료를 1.0 mg/mL의 농도로 정확히 만들고, HPLC장치와 펩티드 분석 전용 컬럼(150 X 4.6mm 4.0㎛, 90Å phenomenex^®)을 이용하여 HPLC용 물(0.2% TFA in water)과 acetonitrile(0.22% TFA in ACN)로 분석하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 봉독 성분의 표준물의 HPLC 크로마토그램과 비교 분석을 통해, 아파민과 멜리틴의 피크(peak)는 10.4분과 21.3분에서 집중 유출되고, PLA₂의 피크는 16.3분에 유출되었음을 확인할 수 있다.

표준 standard의 calibration curve과 각 성분의 면적을 산출하여 각 성분의 함량을 아래 관계식을 통하여 계산할 수 있으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

<관계식 1>

[표 2] 분리정제봉독 추출물과 분리 전 성분함량의 비교

분리정제봉독 추출물은 봉독표준물과 대비하며 알러지 유발성분인 포스포리파아제A₂가 표 2에 나타낸 바와 같이 현저히 제거되었고, 봉독의 유효성분은 아파민 6.64%, 멜리틴 67.25%으로 제고된 것을 알 수 있다.

3) 분리정제봉독 추출물의 안전성 평가

제조된 분리정제봉독 추출물에 대한 봉독의 안전성 평가는 미국 FDA-DMF(미국 식품의약국-원료의약품)인증기관에서 지정된 안정성 평가기관의 실험의뢰 통해 평가 하였고 등록하였다(FDA-DMF 27319). 구체적인 실험은 분리정제봉독 0.25mg/ml과 0.5mg/ml 농도에서 다음과 같이 FDA의 GLP기준에 따라 실험하였다.

L929 세포는 MEM (Minimum Essential Medium (Eagles))과 EBS(Earles Balanced Salts) 배지 속에서 배양하고 저장시키며, 소 태아 혈청과 항생-항 진균성 용액을 혼합하여 세포에 영양분을 준다.

60mm의 멸균된 tissue culture grade의 페트리 플레이트에 confluent 배양세포를 Trypsin 처리와 계대배양을 하여 한 plate당 약 1 x 10^6 cell의 밀도로 세포를 배양한다.

모든 플레이트는 실험을 위해, 약 80%의 confluent 단층을 얻도록 5±1%의 CO₂를 포함하는 37±1℃의 다습한 환경에서 24시간 이상 배양한다. 배양 후, 배양세포의 subconfluency와 형태학을 현미경을 이용하여 확인한다. 약 80% confluency와 일반적이고 건강한 세포를 포함한 배양세포가 실험에 사용되었다.

각 세포단층에서 배지를 조심스럽게 제거하고 1:1로 믹스된 2% w/v purified agar 와 2x Complete MEM 7ml으로 교체하였다. 덧입힌 agar를 상온에서 15분 이상 굳히고, 실험을 시작하기 전에 0.01% neutral red 염색액 2-5ml로 세포단층을 염색한다.

최소 15분 동안 염색 후 염색약을 제거한다.

적당한 농도의 시험물질 약 0.2ml을 적신 멸균된 필터종이(~2.1cm^2)를 agar 표면에 올려놓고, 약 10%의 cell agar 층 표면을 둘러싸도록 한다. 대조용 필터종이는 주사용 멸균증류수에 적신 필터 종이로 준비한다.

표준 양성 혹은 음성 대조물질은 라텍스 고무와 USP HDPE 표준시료를 2.1cm^2의 크기로 멸균 커팅하여 준비하고 agar 표면에 올린다.

모든 시험은 3번 반복하며 3개의 플레이트도 blank(대조군)로 준비한다. 모든 플레이트는 5±1% CO₂가 포함된 37±1℃의 다습한 환경에서 24시간에서 28시간 배양한다.

시험결과의 평가기준은 음성대조군의 값이 0, 양성대조군의 값이 낮아도 3일 경우 세포실험으로 적당하다.

봉독시료의 값이 2 이상일 때 독성효과가 있는 것으로 간주하고, 2 이상이 되지 않을 때 시험물질로서의 조건을 만족할 수 있다.

따라서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 분리정제봉독 추출물은 독성 효과가 없는 것으로 기능성 화장품 조성물의 주 소재로 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

[표 3] 분리정제봉독 추출물의 안전성 평가 결과

<실시예 2> 뱀딸기 및 감태 분획 추출물 제조

천연식물 뱀딸기전초와 갈조류 감태를 각각 500g씩 수집하여 찬물로 세척하고, 그늘에서 자연풍으로 48 ~ 72 시간 동안 건조시켰다.

분쇄기를 이용하여 건조된 시료를 가루로 분쇄분말을 준비하였다. 분쇄시료를 80% 에틸알코올(ethyl alcohol) 수용액으로 초음파장치를 이용하여 2 시간 동안 추출하고, 필터방법으로 추출액을 여과시키고 별도로 보관한다.

그리고 찌꺼기를 다시 같은 방법으로 총 4 번 추출하고 추출액을 모두 합쳐 진공회전건조를 통해 용액을 제거하여 조 추출물을 제조한다.

상기 추출과정을 통해 뱀딸기 조 추출물을 83.62g을 수득하고 감태는 53.75g를 수득하였다.

조 추출물의 유효성분 추출을 위해 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등 유기용매를 이용하여 차례대로 시료의 수용액에서 분별추출을 실시하였다.

유효성분분획은 상기 에틸아세테이트(ethyl acetate)층으로 건조시키고 분리정제를 준비하였다. 이를 통해 뱀딸기 유효성분분획은 37.6g, 감태는 22.74g 수득되었다.

유효성분분획의 분리정제는 에틸알코올과 클로로폼을 eluent로 10:90(v/v) 과 25:75(v/v)의 비율로 각각 혼합하고, silica gel를 이용하여 분리를 실행하였다.

내경이 10cm의 empty 칼럼에 Silica gel 60 (0.04~0.063 mm, Merck) 600g를 packing시키고, 얻어진 분획을 소량의 알코올로 용해하고 gel위에 loading시켰다.

시료를 완전히 gel에 흡착 후 에틸알코올과 클로로폼 10:90(v/v)로 구성된 eluent를 이용하여 흡착된 시료를 용리시켰다. 이 과정에 용출한 성분은 주로 지질과 색소이며 DPPH 항 산화 테스트를 통해 낮은 활성으로 판단하여 폐기하였다.

그리고 다시 에틸알코올과 클로로폼 25:75(v/v)의 eluent를 사용하여 gel에 흡착된 유효활성분획을 수집하였다. 이를 통해 분리 정제된 뱀딸기 14.6g, 감태 19.10g의 유효성분분획을 얻었다.

(1) 천연물 뱀딸기와 감태 추출물의 효과평가

1) DPPH 라디칼(radical) 제거효과

제조한 각 유효성분 추출물의 자유 라디칼 소거 작용은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 사용하는 시마다(Shimada) 방법으로 측정하였다.

에탄올에 녹인 0.5mM DPPH 용액 1mL에 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 1 mL와 에탄올 1 mL를 가하였다. 위 혼합물에 여러 가지 농도(0.5 ppm ~ 250 ppm)의 각 추출물 및 화장료 구성물에 에탄올(대조액) 1mL를 가하고 실온에서 격렬하게 흔들었다.

30분 동안 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료의 상대 효과를 보기 위해 일반적인 항 산화 물질로 알려진 Vitamin E의 항 산화 효과를 측정하여 비교한 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조한 추출물은 기준 조 추출물 보다 현저한 radical제거효과를 나타냈다.

[표 4] 항 산화 효과 - DPPH radical 제거효과(IC₅₀값) 비교

2) 주름 개선 효과

기질 0.1 mM의 N-succinly-(Ala)3-p-nitroanilide 200μL에 각각 기준 조 추출물과 본 발명에 따른 분리 정제한 추출물을 20μL, 또한 0.1mg/mL의 Elastase(Porcine pancreas colution) 10μL을 첨가하여 25℃에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader로 410nm에서 흡광도를 측정하여 Elastase에 대한 저해율(%)을 다음 관계식을 통해 계산하였다.

<관계식 2>

본 발명에 따른 제조 방법을 통해 제조된 분리 정제된 감태 추출물은 피부 주름개선의 지표인 elastase효소 저해효과가 표 5에 나타낸 바와 같이, 기준 조 추출물보다 더 우수함을 알 수 있다. 특히, 20ug/mL의 농도에서 현저한 차이로 구현되었다.

[표 5] 주름개선효과 - Elastase 효소활성 저해효과(%)비교

3) 미백 효과(Tyrosinase inhibitory effect)

21.2mg tyrosine를 46.8㎖ 0.1M PBS buffer(pH6.8)에 용해하여, 2.5mM의 Tyrosine 기질 액을 만들고, 기준 조 추출물과 본 발명에 따른 분리 정제한 추출물을 증류수를 이용하여 0mg/mL, 0.1mg/mL, 0.5mg/mL, 1.0mg/mL, 3.0mg/mL, 5.0mg/mL, 8.0mg/mL, 10mg/mL의 농도별으로 실험액을 준비하였다.

Tyrosinase 효소는 210U/㎖(in PBS buffer)로 희석시키고 사용하였다.

측정방법은, 실험액 300㎕를 기질액225㎕과 혼합시키고, 효소를 107㎕ 첨가하여 37℃로 incubator에서 15분간 반응을 시킨 후, microplate reader과 ELISA를 이용하여 480nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 6에 나타낸 바와 같이, tyrosinase 저해효과의 비교결과를 통해 분리 정제한 추출물은 기준 정제봉독보다 더 우수한 효소저해효과를 나타내었으며, 특히 추출물의 시료농도 20ug/mL에서 현저한 차이를 보였다.

[표 6] 미백효과 - Tyrosinase 효소활성 저해효과(%)비교

<실시예 3> 기능성 봉독 화장품 조성물을 이용한 화장품 제조

(1) 에몰리엔트 크림 화장품 제조

제조방법은, 표 7에 나타낸 바와 같이, 보습제, 금속이온봉쇄제, 정제수, 고분자 및 방부제 등 1~6번의 원료를 정확한 무게를 측정하여 멸균된 용기(A)에 충분히 혼합하여 75℃로 가열 용해하였다.

원료 7번부터 16번까지의 지방산, 왁스, 계면활성제, 오일 및 방부제 등 제시된 무게로 정확히 측정하여 멸균된 용기(B)에 혼합하여 75℃로 가열 용해하였다.

용기(A)에 호모믹서(Homo Mixer, HM1200, MTOPS)를 설치하고 5,000rpm으로 2분정도 혼합하면서, 상기 용기(B)의 혼합원료를 용기(A)에 넣고, 호모믹서의 회전속도를 8,000rpm으로 조절하고 5분동안 유화시켰다.

유화 후 혼합물을 50℃까지 냉각하고 17번 Imidazolidinyl urea를 넣고 다시 40℃로 냉각시켰다.

마지막은 40℃에서 분리정제봉독과 천연추출물 및 향료 등 기능성 첨가원료를 첨가하고, 이때 분리정제봉독과 천연추출물은 미리 소량의 멸균 정제수와 Propylene glycol로 용해하여 사용하였다.

호모믹서를 이용하여 최종 30℃까지 충분히 교반하면서 냉각시킨 후 크림제조를 완료하였다.

[표 7]

(2) 에센스 화장품 제조

제조방법은, 표 8에 나타낸 바와 같이, 1번부터 5번의 보습제, 금속이온봉쇄제, 소염제 및 변색방지제 등 원료를 정확한 무게를 측정하고, 100mL의 뜨거운 정제수와 혼합하여 75℃로 가열을 통해 완전히 용해시킨 후 7번 원료 고분자를 상기 혼합물에 첨가한 후, 75℃로 호모믹서를 이용하여 10분간 교반시켰다(이때, 교반속도는 7,000rpm).

상기 과정을 멸균된 용기(C)에서 진행하였다. 원료 8,9,10 및 12번의 알코올, 가용화제, 방부제 및 산화방지제를 정확한 무게를 측정하고, 멸균된 용기(D)에서 60℃로 5분간 가열 혼합시키고 다시 용기(C)에 교반하면서 첨가하여 가용화시켰다.

호모믹서를 이용하여 10분간 교반하고 차례로 향료(12), 방부제(13), 정제수 및 분리정제봉독과 천연추출물을 첨가하면서 각각 5분씩 교반하였다.

마지막으로 30℃까지 냉각 숙성시킨 후 에센스 제조를 완료하였다.

[표 8]

(3) 화장품의 기능성 평가

본 발명에 따라 제조된 분리정제봉독 추출물과 뱀딸기 및 감태 분획 추출물을 화장품의 기능성소재로 에몰리엔트 크림과 에센스 제조에 활용한 후, 화장품의 기능효과에 대해서는 이하의 임상실험을 통해 평가를 하였다.

임상실험 대상은 30대 여성과 20대 여성으로 선정하고, 30대 여성대상은 에몰리엔트 크림에 대한 효과를 측정하고, 20대 여성대상은 에센스에 대한 효과를 측정하였다.

측정방법은 피부진단측정기(Aramo TS-Ⅱ, aram human vision system)를 이용하여 본 발명에 따른 기능성 봉독 화장품 조성물로 제조한 화장품의 사용 전과 사용 후의 효과를 비교 평가하였다.

보습효과, 탄력증가 및 유분 상태개선 등에 대한 효과는 크림의 경우, 30대 여성에 30일 동안 사용하고 에센스는 20대 여성에 30일 동안 사용하였다.

결과는 도 6에 나타낸 바와 같이, 제품의 사용 전보다 30대와 20대 임상대상의 피부 수분 상태는 현저한 효과가 나타났으며, 약 10∼15의 수치로 향상되었다.

또한, 탄력증가효과는 30대 여성 임상대상에게 약간 증가되었지만, 20대 여성의 임상대상에게는 작용이 현저하지 않았다. 반면, 유분 상태는 모두 복합성에서 건성피부로 효과가 현저하게 나타났다.

또한, 색소침착효과에 있어서, 도 7에 나타낸 바와 같이, 크림과 에센스 모두 30대, 20대의 실험조에서 적용 효과가 나타났다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 30일 동안 제품의 사용 후 30대의 임상대상에게서 피부모공과 표면 거칠기 개선효과는 현저하지 않았지만, 20대 에센스 실험 조에게서 모공수축효과가 현저하게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

주름에 대한 효과는, 도 9에 나타낸 바와 같이, 주로 30대의 실험조의 결과를 비교하면 사용 전과 비교하여 사용 후에 주름개선 효과가 현저한 차이를 보이는 것을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독 추출물과 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 조합한 기능성 봉독 화장품 조성물을 통해 봉독 화장품의 안정성 및 유효성을 확보할 수 있고, 특히, 항균, 항염, 미백 및 주름개선의 특성을 향상시킬 수 있는 특징이 있다.

상기 본 발명의 내용은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims

알러지 성분이 제거되고, 아파민(apamin)과 멜리틴(melittin)이 포함된 분리정제봉독 추출물을 얻는 제 1 단계;
뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는 제 2 단계; 및
상기 제 1 단계에서 얻은 분리정제봉독 추출물과 상기 제 2 단계에서 얻은 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 혼합하여 기능성 봉독 화장품 조성물을 얻는 제 3 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법.
상기 제 1 단계는,
봉독과 증류수를 1 : 10의 중량비로 혼합하여 혼합용액을 얻는 제 1 공정;
여과지를 이용하여 상기 혼합용액에 포함된 이물질을 제거하는 제 2 공정;
필터막을 이용하여 이물질이 제거된 혼합용액에서 세균 및 미생물을 제거하여 2∼3중량%의 아파민(apamin), 45∼50중량%의 멜리틴(melittin), 12중량%의 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2) 및 12중량%의 히알루로니다제(Hyaluronidase)를 포함하는 정제봉독 수용액을 얻는 제 3 공정;
상기 정제봉독 수용액을 증류수에 1:10의 중량비로 희석하고, 컷오프(cut-off) 사이즈가 30kDa(kilo-Dalton)인 한외여과 막(ultrafiltration membrane)으로 여과하여 히알루로니다제를 제거하고 3∼6중량%의 포스포리파아제 A2로 감축하는 제 4 공정;
상기 제 4 공정에서 여과된 정제봉독 수용액을 증류수에 1 : 10의 중량비로 희석하고, 컷오프 사이즈가 10kDa인 한외여과 막으로 여과하여 포스포리파아제 A2를 제거하는 제 5 공정; 및
제 5 공정에서 여과된 정제봉독 수용액을 컷오프 사이즈가 1kDa인 한외여과 막으로 여과한 후 농축 및 건조하여 6중량% 이상의 아파민 및 65중량% 이상의 멜리틴이 포함된 분리정제봉독 추출물을 얻는 제 6 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 제 2 단계는,
뱀딸기전초 및 감태를 각각 세척 및 건조한 후 분쇄하여 분말을 얻는 제 1 공정;
각각의 분말을 80%의 에틸알코올 수용액에 첨가한 후 초음파를 조사하여 제 1 추출물을 얻는 제 2 공정;
각각의 제 1 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 순서대로 이용하여 제 2 추출물을 얻는 제 3 공정; 및
각각의 제 2 추출물에 에틸알코올과 클로로폼을 용리제로 혼합한 후 크로마토그래피 방법을 이용하여, 분리정제한 후 뱀딸기 및 감태의 분획 추출물을 얻는 제 4 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법.