KR20220155224A

KR20220155224A - 나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20220155224A
Application number: KR1020220058713A
Authority: KR
Inventors: 김창수; 노용권; 김영재; 박예진
Original assignee: 주식회사 뉴메이스
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-11-22
Also published as: WO2022240243A1

Abstract

본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물; 및 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 부작용을 최소화하고 피부 미백의 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부 미백 화장품 및 의약외품 원료로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

나노베지클을 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition for skin whitening comprising nanovesicles}

본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물; 및 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데, 이중에서도 멜라닌이 피부색을 결정하는 주요인자로 작용한다. 멜라닌은 피부 표피층(epidermis)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에서 생성된 후 주변의 각질형성 세포(keratinocyte)로 전이(transition)되어 피부색을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이외에도 멜라닌은 자외선에 의한 피부 손상을 막고 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 제거하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 그러나, 만성적인 자외선 노출은 멜라닌세포(melanocyte)에서 멜라닌 생성을 촉진시켜 색소침착(pigmentation)을 유발하는 것으로 알려져 있다.

멜라닌 합성은 멜라닌세포 내의 멜라노좀(melanosome)에서 개시된다. 피부가 자외선과 같은 외부 스트레스에 노출되면 멜라닌세포에서 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)의 생성량이 증가하고, α-MSH는 멜라닌세포에서만 발현되는 막 수용체인 MC1R(melanocortin 1 receptor)과 결합하여 아데닐일 사이클라제(adenylyl cyclase)를 활성화시켜 세포 내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate)를 증폭시키는 것으로 알려져 있다. 세포 내 cAMP 수준이 증가하면 PKA(protein kinase A)가 활성화됨에 따라 CREB(cAMP response element binding protein)가 인산화되고, 결과적으로 MITF (microphthalmia transcription factor)의 발현이 증가된다. MITF는 멜라닌 합성과정의 중요 전사인자로서 멜라닌 합성의 주요 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 수준을 증가시키며, 티로시나아제는 멜라닌 합성의 초기단계에 작용하여 멜라닌 합성의 속도를 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 경로로 멜라닌 세포에서의 멜라닌 합성은 MITF, 티로시나아제 등의 효소가 관여하는 복잡한 과정을 통해 이루어진다.

알부틴, 닥나무추출물, 에칠아스코빌에텔, 유용성감초추출물, 아스코리글루코사이드 등은 색소침착 완화나 피부 미백 용도로 보고된 바 있다. 특히, 알부틴은 월귤나무, 베어베리, 블루베리 등에서 추출한 하이드로쿼논(hydroquinone)과 포도당을 반응시켜 얻는 성분으로서, 멜라닌 색소의 활성화를 억제하고 피부의 색소 침착을 막아 피부 미백에 많은 도움을 준다고 알려져 있다. 하이드로쿼논은 이전부터 기미, 주근깨 치료와 미백 화장품에 사용되었지만, 백반증, 피부 알레르기, 피부염, 여드름 등 부작용을 유발할 수 있어 의약품으로만 사용되고 있으며, 더욱이 적은 함량으로는 효과를 거둘 수 없고 많은 함량으로는 부작용이 생길 수 있어 미백 효과를 나타내는 알부틴의 농도에 대한 기준이 불명확하다고 알려져 있다.

최근에는 증식능과 분화능이 우수하며 체내 생리활성을 지닌 줄기세포 기반 피부 미백 조성물에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 대표적인 줄기세포 기반 피부 미백 소재는 인체 줄기세포 배양물과 식물 줄기세포 배양 추출물로, 이를 활용한 피부미백용 기능성 화장품 등의 제품들이 크게 증가하는 추세를 보였다. 하지만, 이러한 줄기세포 배양 추출물의 미백 효과에 대한 검증은 명확하게 이루어 지지 않았으며, 추출 과정에 타겟 조성물을 고순도로 정제하기 어렵다는 점에서도 한계를 지닌다. 또한, 현재 피부 미백 조성물로 개발된 줄기세포 배양액은 대부분 일반적인 배양 배지를 사용하고 있어, 이들 세포 증식배양용 배지 내 항생제 및 혈청 등에 의한 인체 안전성 측면 등의 이유로 제한적인 사용만이 가능한 실정이다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적거나 없고 미백 효과가 뛰어난 제품의 개발을 위해 줄기세포 유래의 나노베지클을 제조하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2016-0086253호

본 발명의 목적은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도된 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 저해하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제의 발현 또는 활성을 저해하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 색소의 침착을 방지하고, 피부 과색소 침착을 완화 또는 개선하는 효과가 있으며, 피부에 대한 부작용을 최소화하면서 피부 미백의 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부 미백 기능성 화장품 또는 의약외품으로 유용하게 사용할 수 있다.

특히, 본 발명의 유효성분은 (ⅰ) 인간 줄기세포 유래의 물질로서 생체적합성이 뛰어나고, (ⅱ) 세포배양액의 제거 후 줄기세포만을 회수하여 분리공정함으로써, 배양액 내 불순물 함유에 따른 우려를 최소화하여 생체안전성이 뛰어나며, (ⅲ) 줄기세포를 물리적으로 압출, 파쇄하여 제조함으로써, 기존 줄기세포 배양 추출물에 비해 줄기세포의 원천적인 미백 인자들을 다량 포함하고 있어, 화장품 원천 소재 및 의약외품 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1a는 제조된 나노베지클(nanovesicle)의 구조를 초저온투과전자현미경(cryogenic-transmission electron microscope, Cryo-TEM)을 통해 관찰한 결과이고, 1b는 나노베지클의 입자 크기 분포도를 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis, NTA)를 통해 분석한 결과이며, 1c는 나노베지클의 부착 분자를 웨스턴블롯(western blot)을 통해 분석한 결과이고, 1d는 CCK-8 assay kit를 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 분석한 결과이다.
도 2a는 나노베지클의 MITF 및 티로시나아제 mRNA의 발현량을 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 확인한 결과이고 (그룹 간의 ****P < 0.0001), 2b는 MITF 및 티로시나아제 단백질의 발현량을 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 나노베지클의 티로시나아제 활성 저해 효과를 분석한 결과이다 (그룹 간의 **P < 0.0038, ***P < 0.0008).
도 4는 나노베지클의 멜라닌 생성 저해 효과를 분석한 결과이다 (그룹 간의 ****P < 0.0001).
도 5a는 3D 인공피부 모델에서 Fontana-Masson 염색을 통해 나노베지클의 멜라닌 생성 저해 효과를 분석한 결과이고 (scale bar = 50 μm), 5b는 Fontana-Masson 염색 결과를 Image J를 이용하여 정량 분석한 결과이다 (그룹 간의 **P < 0.0084, ***P < 0.0006).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 용어, "나노베지클(nanovesicle)"은 내부에 cargo를 지닌 nm 사이즈의 이중 지질막 구조의 소포체로서, 줄기세포의 압출을 통해 제조된 세포 유래 소포체를 의미한다. 본 발명의 나노베지클은 이중 지질막 구조를 가진 엑소좀과 유사한 형태를 가지고 있으나, 엑소좀은 세포에서 세포외로 자연적으로 분비된 소포체라는 점에서 차이가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 나노베지클은 줄기세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 바람직하게는, 중간엽 줄기세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 중간엽 줄기세포를 7 계대 (passage)까지 증식시킨 후 세포를 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 인간 지방유래줄기세포를 5 계대(passage)까지 증식시킨 후 세포 펠릿을 압출, 파쇄하고 재조립하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

더욱 바람직하게는, 상기 나노베지클은 (a) 중간엽 줄기세포를 증식시킨 후 세포 펠릿을 수득하는 단계; (b) 버퍼로 재부유된 세포를 멤브레인을 통해 압출, 파쇄 및 재조립하거나 또는 마이크로 챔버를 통과하여 압출, 파쇄 및 재조립하는 단계; 및 (c) 세포 압출/재조립물을 포함한 현탁액을 정제 분리, 농축 후 나노베지클을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 10~15 % 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, HPL) 및 1~5 ng/ml 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)가 첨가된 배양액에서 증식된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 수득된 세포 펠릿은 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼로 재부유시키고, PBS 버퍼로 재부유된 세포를 i) 5 μm 및 0.4 μm PCTE(polycarbonate track etch) 멤브레인을 통해 압출, 파쇄 및 재조립하거나, ii) 30 내지 200 μm 구경의 마이크로 챔버 채널을 통과시켜 세포를 압출, 파쇄 및 재조립하는 단계를 수행할 수 있다. 세포 압출 및 재조립 후에는 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF) 방법을 이용하여 분리 정제, 농축 과정을 통하여 나노베지클을 수득할 수 있다.

상기 용어, "줄기세포(stem cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로 특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 말하며, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 용어, "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 맑게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도되는 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성을 저해하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 유효성분은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 30 중량%, 0.001 내지 20 중량%, 0.01 내지 20 중량%, 0.1 내지 20 중량%로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다. 또한, 기능성 첨가물이 추가로 포함될 수 있으며, 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 배합 성분으로 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스처 크림, 아이 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스프레이, 파우더, 바디로션 또는 바디클린저의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면, 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 피부 색소 침착의 예방 또는 개선을 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 제형일 수 있다.

또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

또한, 각 제형의 의약외품 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 비경구 투여용인 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 나노베지클의 특성 및 세포독성 분석

본 발명의 나노베지클은 지방조직으로부터 분리된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 압출, 파쇄 및 재조립하여 제조하였고, 접선유동 여과장치(tangential flow filtration, TFF)를 통해 분리 정제하였다. 제조된 나노베지클의 구조 및 입자 분포도는 초저온투과전자현미경(cryogenic-transmission electron microscope, cryo-TEM) 및 나노 입자 추적 분석기(nanoparticle tracking analysis, NTA)를 사용하여 확인하였다.

그 결과, 제조된 나노베지클은 단층(unilamellar)의 이중지질막 구조가 입자 외부에 형성하고 있음을 확인하였다(도 1a). 또한, 제조된 나노베지클의 입자 분포도를 분석한 결과, 대략 100 nm에서 가장 높은 피크가 나타났고, 50 nm 내지 200 nm의 크기를 가진 것을 확인하였다(도 1b).

나노베지클의 특성을 분석하기 위해, 줄기세포 마커인 CD44, CD73, CD90 및 나노베지클 특이 마커인 LAMP1(lysosomal-associated membrane protein 1)를 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 분석하였다. 간단히, 단백질은 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분리한 후, 0.2 μm NC(nitrocellulose) 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 블러킹한 후, 1차 항체 항-CD44, 항-CD73, 항-CD90 또는 항-LAMP1을 처리한 뒤 각각에 해당하는 2차 항체를 반응시켰다. 최종적으로 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 각 항체 밴드를 화학 발광 이미지 분석 장치(ibright CL1500 imaging system, Thermo Fisher)을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 제조된 나노베지클에서는 줄기세포 마커인 CD44, CD73 및 CD90이 발현됨을 확인하였다. 그러나, 줄기세포와 엑소좀에서 발현하지 않는 나노베지클-특이적인 마커인 LAMP-1의 발현됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 나노베지클이 줄기세포 및 엑소좀과 상이함을 의미한다.

나노베지클의 세포독성 평가는 B16F10(melanoma) 세포주에서 CCK-8 assay kit를 이용하여 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco modified eagle medium) 배양액을 이용하여 부착시키고 세포 안정성을 위해 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 정도 배양하였다. 이후, 기존 DMEM 배양액을 제거하고, PBS로 세척 후 새로운 DMEM 배양액과 함께 정제된 나노베지클을 농도별(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)로 처리하여 배양하였다. 이후, CCK-8 assay kit를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행한 후, 마이크로리더기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 나노베지클은 1×10¹¹ particles/ml의 고농도 처리군에서도 세포독성이 없음을 확인하였다(도 1d).

실시예 2. 나노베지클의 MITF 및 티로시나아제의 발현 저해 효과

제조된 나노베지클이 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제(tyrosinase)의 발현 저해 효과가 있는지 확인하기 위해 상기 유전자 및 단백질의 발현량을 각각 qRT-PCR과 웨스턴블롯을 통해 분석하였다.

우선, 유전자 단계에서 나노베지클의 효과를 확인하기 위해, B16F10 세포를 6-well에 배양하고 나노베지클을 농도별(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)로 처리하면서 멜라닌 합성을 유도하는 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 반응시켰다. 이후, 총 RNA를 AccuPrep universal RNA extraction kit를 이용하여 추출하고, 분광 광도계(Nanodrop, Thermo Fisher)로 정량한 후, cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 MITF 및 티로시나아제에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 첨가한 후, SYBR Green을 첨가하여 qRT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 1×10¹⁰ particles/ml 및 1×10¹¹ particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 MITF mRNA 발현량이 각각 53% 및 65% 감소되었고, 티로시나아제 mRNA 발현량이 각각 50% 및 57% 감소되었음을 확인하였다(도 2a). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 mRNA 발현량을 감소시킴으로써, 피부 미백에 효과가 있음을 확인하였다.

이후, 단백질 단계에서 나노베지클의 효과를 확인하기 위해 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well에 배양한 후 동일하게 나노베지클을 농도별로(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)을 처리하면서 α-MSH 및 IBMX를 반응시켰다. 각 군에서 단백질을 추출하여 정량한 후, 동량의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분리하고, 0.2μm NC(nitrocellulose) 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 블러킹한 후, 1차 항체 항-MITF, 항-티로시나아제 처리하였다. 2차 항체 처리 후 ECL 용액을 이용하여 면역 반응성 밴드를 화학 발광 이미지 분석장치(ibright CL1500 imaging system, Thermo Fisher)을 이용하여 확인 및 분석하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.

그 결과, 1×10¹⁰ particles/ml 및 1×10¹¹ particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 MITF 단백질 발현량이 각각 29% 및 52% 감소되었고, 티로시나아제 단백질 발현량이 각각 43% 및 97% 감소되었음을 확인하였다(도 2b). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 단백질 발현량 역시 감소시킴으로써, 피부 미백에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 나노베지클의 티로시나아제 활성 저해 효과

나노베지클이 티로시나아제 활성을 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 티로시나아제 활성도 분석 실험을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well plate에 분주하여 배양하였고, a-MSH 및 IBMX와 나노베지클을 농도별(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)로 처리하여 추가로 배양한 후 PBS로 세척하고 세포를 회수하였다. 이후, 1% Tris-x 100(pH 6.8)을 이용하여 부유액 상태로 만들고 얼음 위에서 10분 동안 반응시켰다. 단백질을 정량한 뒤 동량의 단백질이 포함된 상층액과 15mM L-DOPA(Levodopa)를 상온에서 반응시킨 후, 마이크로리더기를 통해 405 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 내 티로시나아제 활성도를 분석하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.

그 결과, 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 티로시나아제 활성이 약 17% 감소된 것을 확인함으로써, 나노베지클이 양성 대조군인 알부틴과 유사한 정도로 티로시나아제 활성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 4. 나노베지클의 멜라닌 합성 저해 효과

나노베지클이 멜라닌 합성을 억제 또는 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 멜라닌 생성량 분석 실험을 수행하였다. 간단히, B16F10 세포를 6-well plate에 분주하였고 배양하였다. 세포의 부착상태를 확인한 뒤 나노베지클을 농도별(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)로 처리한 뒤 α-MSH 및 IBMX를 처리하여 배양하였다. 이후, PBS로 세척하고, 앞서 언급한 용해액을 처리하여 90 ℃ 히팅블럭에서 1 시간 동안 반응시켰다. 멜라닌의 생성량은 마이크로리더기를 통해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.

그 결과, 1×10¹⁰ particles/ml 및 1×10¹¹ particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 a-MSH/IBMX 처리군에 비해 멜라닌 양이 각각 34% 및 67% 감소되었고, 특히, 1×10¹¹particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 나노베지클이 양성 대조군인 알부틴과 유사한 정도로 멜라닌 합성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다(도 4). 이로써, 본 발명의 나노베지클은 농도-의존적으로 멜라닌 합성을 저해하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 3D 피부 모델에서 나노베지클의 멜라닌 합성 저해 효과

나노베지클이 3D 피부 모델에서의 멜라닌 합성을 억제 또는 저해하는 효과가 있는지 확인하기 위해 Fontana-Masson 염색을 통해 멜라닌 생성 분석을 수행하였다. 간단히, 3D 피부 모델인 Neoderm-ME (㈜테고사이언스)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 제조한 후, 제조된 3D 피부 모델에 나노베지클을 농도별(1×10¹⁰, 1×10¹¹ particles/ml)로 처리하여 실험을 진행하였다. 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, 멤브레인을 칼날(blade)로 자른 뒤 4% PFA(paraformaldehyde)로 고정하였다. 이후, 멤브레인을 파라핀 용액에 임베딩(embedding)하고, 파라핀 블록(paraffin block)을 제작한 후 절단하였다. 절단된 샘플은 염색 시험법에 따라 Fontana-Masson 염색을 진행하여 멜라닌 합성 정도를 분석하였다. 염색 결과는 Image J 프로그램을 이용하여 멜라닌의 양을 정량적으로 확인하였다. 양성 대조군은 알부틴(1 mM)을 사용하였다.

그 결과, 나노베지클 처리군에서는 대조군(control)에 비해 멜라닌 합성이 농도-의존적으로 현저하게 저해됨을 확인하였다(도 5a). 정량 결과, 1×10¹⁰ particles/ml 및 1×10¹¹ particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 대조군에 비해 멜라닌의 양이 각각 평균 47% 및 평균 82% 감소하였고, 특히, 1×10¹¹ particles/ml의 나노베지클 처리군에서는 알부틴 처리군(평균 56% 감소)에 비해 멜라닌 합성이 현저하게 저해되었음(평균 82% 감소)을 확인하였다(표 1 및 도 5b).

상기 결과로부터, 본 발명의 나노베지클은 MITF 및 티로시나아제의 유전자 및 단백질의 발현 저해, 티로시나아제의 활성 저해를 통해 멜라닌 합성을 저해함으로써 피부 미백에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포에서 유래된 것인, 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 나노베지클은 중간엽 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone) 또는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 의해 유도된 멜라닌 합성(melanin synthesis)을 저해하는 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 MITF(microphthalmia transcription factor) 또는 티로시나아제의 발현 또는 활성을 저해하는 것인, 조성물.
나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 침착의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.