CN107106613B - 用于成脂分化诱导、脂肪组织再生、皮肤美白或改善皱纹的包含干细胞来源外泌体的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物组合物，用于诱导分化成脂肪细胞和/或脂肪组织的再生，包含作为活性成分的衍生自分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体。所述外泌体显示出影响分化成脂肪细胞的极佳的生物活性因子表达速率，并具有将干细胞分化成脂肪细胞的作用。据此，本发明可被用为干细胞分化诱导试剂，用于组织再生的可注射制剂，用于化妆品目的的填充物，用于组织工程的制剂等。此外，本发明涉及用于皮肤美白、改善皱纹和皮肤再生的化妆品组合物，包含来源于干细胞的外泌体，作为活性成分。外泌体包含与细胞增殖、干细胞的分化和再生相关的基因、蛋白质、生长因子等；其为不包括培养液的抗生素、血清或有害因子的纯化组分；并且其为细胞来源的脂质载体，并且由此，所述外泌体可被用于具有皮肤美白、改善皱纹和皮肤再生功能的功能性化妆品组合物，以及出于美容目的来改善疤痕的制剂，等等。

Description

用于成脂分化诱导、脂肪组织再生、皮肤美白或改善皱纹的包 含干细胞来源外泌体的组合物
技术领域
本发明涉及一种组合物，使用包含脂肪细胞分化诱导物质的干细胞来源外泌体，诱导干细胞分化成脂肪细胞和/或使脂肪组织再生。另外，本发明涉及用于皮肤美白、改善皱纹或皮肤再生的包含干细胞来源外泌体的化妆品组合物。
背景技术
作为使脂肪组织再生的治疗方法，存在使用包括干细胞的治疗试剂的方法，该干细胞使用具有在水凝胶中三维培养的脂肪组织的基质来培养。在水凝胶中三维培养所述组织之后，生长因子和细胞外基质可由干细胞分泌出。然而，为了使治疗试剂用作可注射剂型，从培养容器去除薄膜形式的水凝胶和使用裂合酶处理组织是不方便的。为了克服这样的不方便，已经研发了通过自体同源脂肪移植或者直接移植干细胞来再生组织的治疗方法。
在自体同源脂肪移植的情况中，所述方法使用手术中受试者的身体的一部分。因此，所述方法不会导致组织或免疫排斥的问题，并且不会出现免疫应答。然而，脂肪组织为高度氧依赖性的，并在周围具有许多血管的时候与相邻细胞相互作用。移植的脂肪很难表现出血管形成能力，并且由此是不利的。例如，可能会由于组织缺氧而导致细胞凋亡或者细胞坏死，并且由于植入率不高，受试者可能需要接受数个步骤。
以前，干细胞已经常被用于修复已损坏的组织，其受到手术或者药物治疗的限制。例如，如透明质酸和胶原蛋白的生物聚合物被用于干细胞移植。因为干细胞可被分化成包括脂肪细胞的多种不同的细胞，所以这些干细胞具有广泛的应用。然而，因为存活率和植入率较低，一旦它们被置于体内，效率就会被降低。而且，存在无法分化的干细胞可能会形成肿瘤的风险。
目前，用于将干细胞分化为脂肪细胞用于组织再生的方法通常包括在干细胞上处理分化诱导材料，例如胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤等，并长时间培养它们。然而，如上所述的干细胞分化诱导材料是昂贵的，并且对于仅通过单一组分的分化并不是有效的。由此，它们是不利的。例如，它们必须通过混合不同的物质来处理，并且细胞分化的效率较低。这是有问题的。
在另一方面，便利地，已经做出尝试，使用通过培养干细胞而获得的培养溶液作为化妆品。总的来说，包含合适量抗生素和血清的培养基被用于培养干细胞。作为化妆品组合物而研发的绝大多数干细胞培养液使用常规培养基，且化妆品组合物包括脂质体，其中，干细胞培养溶液被封装在脂质体中(参见韩国专利号1237430；1047873)。另外，已经研发出使用培养基的化妆品组合物，所述培养基不使用作为不允许用于化妆品的原材料的成分来制备，以及包括不含血清的培养基的化妆品组合物等(参见韩国专利号1413686；1108847)。
培养基为包含用于细胞增殖的蛋白质、氨基酸、激素和生长因子的物质。所述培养基已经以非常成熟的方式制备并供给。然而，因为细胞培养基、抗生素和血清具有尚未被证明是安全的风险，它们应当仅被用于研究的目的，并且它们在人体的应用是禁止的。在培养基中包括的组分，例如氯化胆硷、次黄嘌呤钠盐、胸苷、腐胺二盐酸盐、硝酸铁、L-谷氨酰胺等，并未被允许作为用于化妆品的原材料。由此，这样的培养基的使用不适用于化妆品组合物。由此培养基包含有干细胞分泌的各种蛋白质、细胞因子、生长因子等。与之相比，它们还包含例如随着细胞生长而分泌的废物、经添加以防止污染的抗生素、或者动物来源的血清等的组分。由此，当用于皮肤上的时候，它们极有可能会引起不同的风险。
用于化妆品的干细胞培养溶液的组分受到限制。而且，在封装至脂质体内的过程中，培养溶液组分的变质和污染，以及使用脂质体进行封装的其它处理过程是必然会发生的。由此，使用包括脂质的脂质体封装干细胞培养溶液来提高培养溶液的皮肤吸收速率的技术在应用于化妆品时也是受限的。
为了克服这些干细胞培养溶液的不利之处，研发了使用干细胞来源外泌体的技术。干细胞通常在包含抗生素和血清的培养基中培养。由在包括人类的多细胞生物体中存在的不同细胞分泌的生物纳米颗粒可被分为外泌体和微囊泡，取决于它们的尺寸和分泌机制的不同。已知，外泌体为由不同类型细胞分泌的膜结构囊泡，其扮演着多种角色。例如，所述角色包括通过结合至其它细胞和组织来转移膜组分、蛋白质、RNA等。包括外泌体的绝大多数分泌组由细胞培养上层清液获得。由此，在目前使用的干细胞来源外泌体分离方法中，由于在分离包括外泌体的分泌组的步骤中的培养基或血清中蛋白质的干预，完全纯化外泌体很难。
因此，本发明已经从干细胞分离出外泌体，并且发现干细胞来源外泌体具有干细胞分化、脂肪组织再生、美白、改善皱纹和皮肤再生的作用。
发明概述
本发明的一个方面在于提供一种组合物，用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织。所述组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，作为活性成分。
本发明的另一个方面在于提供一种化妆品组合物，包括用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的组合物。所述组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，作为活性成分。
本发明的又一个方面在于提供一种培养基组合物，用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织。所述培养基组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞来的外泌体，作为活性成分。
本发明的又一个方面在于提供一种可注射制剂，包括用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的组合物。所述可注射制剂可以包括作为活性成分的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，以及水凝胶。
本发明的又一个方面在于提供一种化妆品组合物，用于皮肤美白、改善皱纹或皮肤再生。化妆品组合物可以包括衍生自增殖的干细胞的外泌体，作为活性成分。
发明详述
本发明的一个实施方式提供了一种用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的组合物。所述组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，作为活性成分。
如在本文中所使用的，“正在分化成脂肪细胞的干细胞”是指干细胞，其正在分化成脂肪细胞，例如来自脂肪组织(ASCs)来源的干细胞。在图1中示出脂肪组织来源的干细胞的一个例子。包含遗传信息、蛋白质和生长因子的外泌体可以由其分离。
特别地，当干细胞分化成脂肪细胞的时候，它们的形状会发生明显的变化，并且此时外泌体被分离。因此，不同于由未分化的干细胞分离的外泌体。
外泌体是指包含细胞特异性组分的细胞来源的信使囊泡，其通过与受体细胞融合在细胞间的通信中发挥作用。在一个实施方式中，外泌体为内吞作用来源的并且为囊泡，参与细胞通信，由包含细胞特异性组分例如脂质、遗传物质和蛋白质的细胞分泌。
外泌体可以由本领域已知的外泌体分离方法制备，或者通过如下的步骤制备，例如1)在培养基中培养干细胞，并随后在不含血清和无抗生素的培养基中传代培养；2)回收细胞培养上层清液；3)离心所回收的细胞培养上层清液；和4)分离并提纯外泌体，但不限于此。
正在分化成脂肪细胞的干细胞可以是骨髓干细胞，脐带血干细胞或者脂肪来源干细胞，并且可以是人、动物或者植物来源的干细胞，但不限于此。
外泌体可以1至150μg每1mL组合物的浓度应用于干细胞，所述组合物用于诱导分化成脂肪细胞或者再生细胞组织，特别是5至150μg的浓度，更特别是10至150μg的浓度，甚至更特别是20至130μg的浓度，并且还更特别是20至100μg的浓度，但不限于此。
如在本文中所使用的，术语“诱导分化成脂肪细胞”是指将干细胞诱导分化成脂肪细胞。
根据本发明的一种实施方式，组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，作为活性成分。所述组合物可以将干细胞分化成脂肪细胞。因此，组合物可被用作为用于诱导分化成脂肪细胞的组合物。
如在本文中所使用的，术语“再生脂肪组织”是指通过复原受损的脂肪组织或者诱导有缺陷的脂肪组织的产生。
另外，组合物可以再生脂肪组织。因此，组合物可被用作为用于再生脂肪组织的组合物。
根据本发明的另一种实施方式，用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪细胞组织的组合物可被用作为药物组合物。特别地，药物组合物的含量可以是0.001至10重量份，基于100重量份的全部组合物计。
根据上述实施方式，药物组合物可以是不同的口服或者非肠道制剂。所述制剂可以使用稀释剂或者赋形剂来制备，例如常规填料、增重剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒、胶囊等。这样的固体制剂可以通过混合至少一种化合物和至少一种赋形剂来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或者乳糖、凝胶等。除了简单的赋形剂，例如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂也可被使用。用于口服给药的液体制剂包括混悬液、用于内服的液体、乳液、糖浆等。除了常用的简单稀释剂，例如水和液体石蜡，液体制剂还可以包括不同的赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、增味剂、防腐剂等。用于非肠道给药的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶剂、混悬液、乳液、冻干制剂和栓剂。
对于根据上述实施方式的药物组合物，植物油例如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油，以及可注射酯例如油酸乙酯等，可被用作为非水性溶剂和悬浮剂。合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂(laurinum)、甘油明胶等可被用作栓剂基质。
根据上述实施方式的药物组合物的剂型可以是其制药学上可接受的形式，或者其可被单独使用或者恰当地与其它药物活性化合物组合使用。外泌体化合物的盐并未被特别地限制，只要其为制药学上可接受的。所述盐例如包括盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、甲酸、乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸等的盐。
根据上述实施方式的药物组合物可以根据目的非肠道或者口服给药，并且可以根据需要每天给药一次或多次，从而使得给药量为0.1至500mg/kg，1至100mg/kg。具体病人的有效剂量取决于病人的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药周期、给药方式、排泄速率、疾病严重程度等而有所不同。
根据常规方法，根据上述实施方式的药物组合物可以通过配制成适用于药物剂型的任意形式来使用，包括口服组合物例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、混悬液、乳液、糖浆、气雾剂等，外用制剂例如药膏、乳剂等，栓剂和无菌可注射溶液。
根据上述实施方式的药物组合物可以使用不同的路径例如非肠道、口服等给药至哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等，并且尽管所有的给药路径都可预期，但优选通过口服、直肠或者静脉内、肌肉、皮下、子宫内或者脑室内注射给药。
用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的药物组合物可以进一步包括分化诱导材料，例如胰岛素、地塞米松、脱氢表雄酮(DHEA)、组胺和异丁基甲基黄嘌呤等，从而将干细胞分化成脂肪细胞，但不限于此。
本发明的另一个实施方式提供了一种化妆品组合物，用于诱导分化成脂肪细胞或再生脂肪组织，并且可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，作为活性成分。化妆品组合物可以通过诱导分化成脂肪细胞而促进脂肪组织的再生。
在化妆品组合物中包含的外泌体的浓度可以是1至150μg每1mL的化妆品组合物，特别是5至150μg的浓度，更特别是10至150μg的浓度，甚至更特别是20至130μg的浓度，并且还更特别是20至100μg的浓度，但不限于此。
根据上述实施方式的化妆品组合物可以包含在化妆品或者皮肤病科学中常用的辅料，例如含脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂、胶凝剂、软化剂、抗氧剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、增味剂、表面活性剂、水、离子或非离子乳化剂、填料、隐蔽剂、螯合剂、防腐剂、维生素、阻滞剂、润湿剂、基础油、染料、颜料、亲水性或亲脂性活性试剂、脂质囊泡或者化妆品中常用的任何其它成分。这样的辅料以在化妆品或皮肤病领域中以常用的用量引入。
根据上述实施方式的化妆品组合物的外在形式包含化妆用或者皮肤病学上可接受的介质或基质。化妆品组合物可以是适用于局部施用的任意形式。例如，化妆品组合物可以溶液、凝胶、固体、软膏、无水产物、在水相中分散油相而获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、或者离子(脂质体)和非离子囊泡分散剂的形式来提供，并且这些组合物可以根据本领域常规方法来制备。
根据上述实施方式的化妆品组合物优选以使用微型针等而吸收至皮肤内的形式而被施加，但不限于此。
用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的化妆品组合物可以包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体作为活性成分。化妆品组合物可以进一步包括分化诱导材料，例如胰岛素、地塞米松、脱氢表雄酮(DHEA)、组胺和异丁基甲基黄嘌呤，从而将干细胞分化成脂肪细胞，但不限于此。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于干细胞分化的培养基组合物，其包含源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，并诱导干细胞以分化成脂肪细胞。
在用于干细胞分化的培养基组合物中包含的外泌体的浓度为1至150μg每1mL的用于干细胞分化的培养基组合物，特别是5至150μg的浓度，更特别是10至150μg的浓度，甚至更特别是20至130μg的浓度，并且还更特别是20至100μg的浓度，但不限于此。
用于干细胞分化的培养基组合物可以进一步包括干细胞培养基，但不限于此。
用于干细胞分化的培养基组合物可以进一步包括分化诱导材料，例如胰岛素、地塞米松、脱氢表雄酮(DHEA)、组胺和异丁基甲基黄嘌呤等，从而将干细胞分化成脂肪细胞，但不限于此。
本发明的另一个实施方式提供了一种可注射制剂，包括用于诱导分化成脂肪细胞或者再生脂肪组织的组合物。可注射制剂可以包括作为活性成分的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体；以及水凝胶。
在可注射制剂中包含的外泌体的浓度为1至150μg每1mL，特别是5至150μg的浓度，更特别是10至150μg的浓度，甚至更特别是20至130μg的浓度，并且还更特别是20至100μg的浓度，但不限于此。
水凝胶可以是至少一种水凝胶例如明胶、藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、胶原蛋白、甲基纤维素或胶原蛋白和甲基纤维素水凝胶，但不限于此。
可注射制剂可以是用于诱导分化成脂肪细胞或再生脂肪组织的可注射制剂，但不限于此。也就是说，当本发明的可注射制剂通过注射而被给药至动物的时候，就会表现出诱导分化成脂肪细胞或再生脂肪组织的效果。
在本发明的一个实施方式中，水凝胶通过将甲基纤维素粉末添加至胶原蛋白溶液来制备。特别地，甲基纤维素粉末被添加至胶原蛋白溶液，以3mg/mL的浓度溶解于0.02N的乙酸中，从而使得甲基纤维素的最终浓度为6wt％。随后，在4℃下搅拌混合物1小时来制备胶原蛋白和甲基纤维素水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，可注射制剂通过在胶原蛋白和甲基纤维素水凝胶中装载(carry)外泌体而制备，所述外泌体源自正在分化成脂肪细胞的干细胞。特别地，源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体在水凝胶中装载成50μg/mL的最终浓度，并随后通过移液操作分散于水凝胶中。
根据上述实施方式的可注射制剂可以通过口服、直肠或静脉内、肌肉、皮下、子宫内或者脑室内注射给药至哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体与源自增殖干细胞的外泌体相比，显示出极佳的影响分化成脂肪细胞的生物活性因子的表达速率(图4和5)。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体，以及源自增殖干细胞的外泌体作为对照组，添加到用于使干细胞分化成脂肪细胞的实验中。在这些情况中确认的是，当使用根据本发明的外泌体时，脂肪细胞在第7天以类似于在分化培养基中培养的干细胞的水平而分化，并且因此，产生油。然而，在使用源自增殖干细胞的外泌体处理干细胞的情况中，所确认的是这些干细胞仅发生增殖，而不会分化成脂肪细胞(图6和7)。
在本发明的另一个实施方式中，与装载源自增殖干细胞的外泌体的可注射制剂相比，其中源自根据本发明正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体被装载至胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶中的可注射制剂显示出对脂肪组织的再生极佳的作用(图9和10)。
用于根据上述实施方式的干细胞分化和脂肪组织再生的组合物包括外泌体，所述外泌体包含与分化成脂肪细胞相关的遗传信息、蛋白质和脂肪细胞生长因子。因此，组合物可被有效地用于分化干细胞，因为其并不必须添加复杂的和不同的生长因子来分化。干细胞通过本发明的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体而分化成脂肪细胞，由此当应用于体内的时候，对脂肪组织的再生起到有利的作用。本发明的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体为细胞来源的材料，因此为生物相容性的，最小化现有细胞治疗试剂的副作用。另外，外泌体本身可以作为载体，其能够将在其中装载的组分容易地应用于人体。由此，外泌体可被用作干细胞分化诱导剂，用于组织再生的可注射制剂，用于化妆品目的填充物，用于组织工程的制剂等。
本发明的另一个实施方式提供了一种化妆品组合物，包含干细胞来源的外泌体作为活性成分，并且更特别地，用于皮肤美白、改善皱纹或者皮肤再生的化妆品组合物包含干细胞来源的外泌体作为活性成分。
在不含血清的并且无抗生素的培养基中，干细胞来源的外泌体包含细胞外基质衍生物以及胶原蛋白和对皮肤再生有效的生长因子，并由此可以有效地用于改善皮肤。
在上述实施方式中，术语“干细胞”是指增殖的干细胞。能够由其分离包含干细胞的遗传信息、蛋白质和生长因子的外泌体。
干细胞可以是骨髓干细胞、脐带血干细胞或者脂肪来源的干细胞，并且可以是人、动物或植物源干细胞，但不限于此。
如在本文中所使用的，术语“人脂肪源干细胞”是指源自人脂肪细胞的干细胞。能够由其分离包含干细胞的遗传信息信息、蛋白质和生长因子的外泌体。
分离外泌体的方法可以通过本领域已知的方法来实施，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，外泌体在传代培养人脂肪源干细胞的过程中分离。特别地，人脂肪组织源干细胞(通道3至7)在标准培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基，包含10％牛胎儿血清，1％青霉素/链霉素的DMEM)中培养。随后，在分离外泌体前的24小时，使用DMEM培养基代替细胞培养基，其为不含血清的并且是无抗生素的培养基，不存在酚红，并随后保持24小时。在24小时后，回收细胞培养上层清液。经回收的细胞培养上层清液以300xg离心10分钟，从而去除细胞，并随后以2000xg离心30分钟，从而去除细胞分泌物。其后，使用装备有具有3000分子量的过滤器的离心管以5000xg离心60分钟来浓缩细胞。浓缩后获得的上层清液与外泌体分离试剂以1:0.5的比例混合，并在4℃储存一天。外泌体沉淀物通过在10000xg下离心60分钟而获得，随后通过0.22μm过滤器过滤，并使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗。经冲洗的外泌体沉淀物以10000xg离心60分钟，并再次悬浮于PBS中(图1)。在回收上层清液之后，标准培养基被添加至干细胞并培养。该程序被重复至干细胞的通道7。化妆品组合物使用在增殖干细胞至通道7的过程中分离的外泌体来制备。
在用于皮肤美白、改善皱纹或再生的化妆品组合物中，所含有的外泌体的浓度可以是1至150μg每1mL的化妆品组合物，特别是5至150μg的浓度，更特别是10至150μg的浓度，甚至更特别是20至130μg的浓度，并且还更特别是20至100μg的浓度，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，源自人脂肪源干细胞的外泌体所使用的浓度为10、30或50μg/mL。另外，已确定人包皮纤维原细胞极佳的伤口愈合(图18)、极佳的胶原蛋白合成速率(图19)和黑色素合成的减少(图20)。
通过将外泌体封装至脂质体内，外泌体可以封装外泌体的脂质体的形式包含于化妆品组合物中，但不限于此。在某些实施方式中，外泌体可以是任何形式，只要其适用于化妆品组合物。还能够使用外泌体本身，而不将其封装至脂质体中。
当外泌体以脂质体封装的形式被使用的时候，外泌体的含量可以是0.1至10.0wt％，更特别地为0.1至1.0wt％，基于脂质体的总重量计，但不限于此。
包封外泌体的脂质体的含量可以是0.001至10.0wt％，特别是0.001至1.0wt％，更特别是0.01至1.0wt％，并且甚至更特别是0.01至0.1wt％，基于整个化妆品组合物的总重量计，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，3wt％的卵磷脂在室温下(例如15℃)分散于包含0.01wt％源自干细胞的外泌体的水相中，并随后使用超临界二氧化碳形成反向微乳液(水/低温处理的二氧化碳)。随后，终止反应，超临界二氧化碳在减压下汽化以去除超临界二氧化碳相，由此获得低温处理的脂质体悬浮液，其中外泌体被封装。化妆品组合物经制备以使得由此制备的封装外泌体的脂质体的含量为5wt％，基于整个化妆品组合物的总重量计。
在常规技术中，使用在培养人脂肪源干细胞过程中获得的培养溶液。然而，前述实施方式是与之不同的，其中，在培养溶液中呈纳米囊泡形式的外泌体会被分离并提纯，以作为化妆品成分，而非使用培养溶液作为所述成分。当干细胞外泌体被分离并提纯时，在外泌体中所包含的再生相关蛋白质、胶原蛋白衍生物和不同的生长因子可以这种方式而被有效地使用，即它们会消除来自于培养基组分的干扰。由此，由包括抗生素和血清的培养基组分所导致的问题就可被解决。
根据上述实施方式的外泌体包含干细胞的遗传信息，蛋白质和生长因子，并且外泌体自身可用作为载体。由约50至150nm尺寸的脂质组成的外泌体为生物相容性的，因为其为细胞源材料，并且显示出极佳的细胞吸收速率。因此，有利的是，其无需如在常规技术中的那样，没有将培养溶液封装至脂质体内的额外步骤，并且其可以容易地应用于皮肤。
此外，根据上述实施方式包含源自干细胞的外泌体的化妆品组合物可被用作为用于改善疤痕外观的制剂。由于干细胞来源外泌体包含诱导细胞增殖和分化以及皮肤再生的蛋白质和生长因子，所以它们可被应用于旧伤和痤疮疤痕以减轻疤痕或其表观。因此，当被用作用于改善疤痕组织的制剂时，其可以包含源自干细胞的外泌体的喷雾、凝胶类型的药膏和贴片等的形式来应用。
此外，本发明的另一个实施方式提供了一种包含源自干细胞的外泌体作为活性成分的药物组合物，更特别地，提供了一种包含源自干细胞的外泌体作为活性成分的用于皮肤再生的药物组合物。据此，根据本发明的一个实施方式的包含源自干细胞的外泌体作为活性成分的用于皮肤再生的化妆品组合物可被用作为药物组合物。
干细胞可以是骨髓干细胞，脐带血干细胞或者脂肪来源干细胞，并且可以是人、动物或植物来源干细胞。举例来说，这些干细胞可以是人脂肪来源干细胞，但不限于此。
在本发明的一种实施方式中，当衍生自增殖人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)尺寸被检测时，其尺寸为约69nm，确认其小于衍生自人表皮角化细胞的外泌体(K-EXO)或者衍生自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)(图13)。
在本发明的另一个实施方式中，当比较和分析与在Stem-EXO、K-EXO和F-EXO中存在的改善皱纹、美白和皮肤再生相关的生物活性因子时，所确认的是单核细胞趋化蛋白-1、-3(MCP-1、-3)，趋化因子配体5(CCL-5)和胶原酶抑制剂(金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1))涉及与促进胶原蛋白合成和抑制其分解相关的机制，与K-EXO和/或F-EXO相比，与美白相关的白介素-6、-8(IL-6、-8)，与皮肤再生和血管生成相关的肝细胞生长因子(HGF)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、血管生成素和血管生成素-1，在Stem-EXO中被过度表达(图15、16和17)。
在本发明的另一个实施方式中，Stem-Exo中人包皮纤维原细胞的伤口愈合效果被检测到。结果是，当Stem-Exo的使用浓度为10、30和50μg/mL时，与K-EXO或F-EXO相比显示出对包皮纤维原细胞移植的极佳效果，由此显示出对伤口愈合极佳的效果(图18)。
在本发明的又一个实施方式中，Stem-EXO的皱纹改善作用被确认。结果是，胶原蛋白合成随着Stem-EXO所使用浓度的提高而加强。特别地，在50μg/ml时与K-EXO或F-EXO相比，Stem-EXO显示出非常优异的胶原蛋白合成速率，由此确认对皱纹改善极佳的效果(图19)。
在本发明的另一个实施方式中，Stem-EXO对黑色素形成的抑制效果被检测到。结果是，当Stem-EXO以10、30和50μg/mL的浓度用于小鼠黑素瘤时，确认黑色素合成有所下降，由此确认非常良好的美白效果(图20)。
有益效果
根据本发明实施方式的外泌体显示出影响分化成脂肪细胞的生物活性因子极佳的表达速率，并具有将干细胞分化成脂肪细胞的作用。因此，本发明可被用作为干细胞分化诱导试剂，用于组织再生的可注射制剂，用于化妆品目的的填充物，用于组织工程的制剂等。此外，根据本发明实施方式的外泌体为在干细胞增殖过程中分泌的外泌体，并包含与干细胞的细胞增殖、分化和再生等相关的基因、蛋白质、生长因子等，并由此可以在不存在其它添加剂例如细胞激活剂或生长因子的情况下诱导皮肤再生。另外，外泌体为提纯的组分，其并不包括抗生素、血清或培养溶液中的有害因子，并且由此，与培养化妆品相关的问题就可被克服。而且，所述外泌体为细胞来源脂质载体，由此显示出极佳的细胞浸润，并对传递有效因子是高度有效的。由此，本发明可被用于具有皮肤美白、皱纹改善和皮肤再生功能的功能性化妆品组合物，以及用于美容目的的改善疤痕表观的制剂，等等。
附图说明
图1为源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体及其应用的示意图。
图2为从正在分化成脂肪细胞的干细胞分离外泌体的方法的示意图。
图3A至3C示出描述源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体的特征的图示；A：外泌体的结构和形状(透射电子显微镜)，B：外泌体的尺寸(纳米颗粒分析仪，动态光散射)，C：外泌体膜表面标记(蛋白质免疫印迹杂交)。
图4A至4C示出通过微阵列描述脂质相关的生物活性因子的图示；A：源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)，B：源自分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)，C：脂肪因子阵列地图(array map)。
图5示出描述影响分化成脂肪细胞的因子的表达速率的图示；源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)和源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)。
图6示出将人脂肪来源干细胞诱导分化成脂肪细胞的结果；A：人脂肪来源干细胞(hASCs)，B：阳性对照组(DM)，源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)和源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)。
图7示出经诱导分化成脂肪细胞的干细胞的油红O染色结果；A：人脂肪来源干细胞(hASCs)，B：阳性对照组(DM)，源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)和源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)。
图8示出通过在混合胶原蛋白和甲基纤维素而获得的水凝胶中装载外泌体并将外泌体皮下注射至裸鼠模型内3周来诱导形成脂肪组织的结果；A：胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶(Gel)，B：装载源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)的水凝胶，C：装载源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)的水凝胶。
图9示出对皮下注射至裸鼠模型内的凝胶进行苏木精-曙红染色的结果。一种凝胶并未装载有外泌体(Gel)，并且其它凝胶分别装载有源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)以及源自分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)。A，C，E：放大40倍；B，D，F：放大100倍。
图10示出对皮下注射至裸鼠模型内的凝胶进行油红O染色的结果。一种凝胶并未装载有外泌体(Gel)，并且其它凝胶分别装载有源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)以及源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)。
图11为从增殖的人脂肪来源干细胞分离外泌体的方法的示意图。
图12示出使用显微镜观察到的人脂肪来源干细胞、人表皮角化细胞和人包皮纤维原细胞的图像。
图13A至13C示出描述衍生自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-Exo)特征的图像。源自人表皮角化细胞的外泌体(K-Exo)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-Exo)被用作对照组。外泌体的结构和形状(透射电子显微镜)，以及外泌体的尺寸(纳米颗粒分析仪，动态光散射)分别被描述；A：Stem-Exo(比例尺分别为50nm(黑色)，100nm(白色))，B：K-Exo(比例尺分别为50nm(黑色)，100nm(白色))和C：F-Exo(比例尺分别为50nm(黑色)和200nm(白色))。
图14A至14D示出使用微阵列显示在衍生自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)，源自人表皮角化细胞的外泌体(K-Exo)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-Exo)中包含的生物活性因子表达水平的对比图；A：微阵列表格，B：微阵列结果，C和D：示出生物活性因子相对表达水平的示意图。
图15A至15I示出使用微阵列说明在外泌体中与皱纹改善效果相关的生物活性因子表达水平的示意图(A：PDGF-AA，B：PDGF-AB，C：PDGF-BB，D：FGF-6，E：MCP-1，F：MCP-3，G:嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)，H：CCL-5，I：TIMP-1)；Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
图16A至16D示出使用微阵列说明在外泌体中与美白效果相关的生物活性因子表达水平的示意图(A：TGF-β，B：TNF-α，C：IL-6，D：IL-8)；Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
图17A至17F示出使用微阵列说明在外泌体中与皮肤再生和血管生成相关的生物活性因子表达水平的示意图(A：EGF，B：HGF，C：PAI-1，D：VEGF，E：血管生成素，F：血管生成素-1)；Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
图18A至18B示出描述人脂肪来源干细胞外泌体(Stem-EXO)对人纤维原细胞移植的作用的示意图；GM：干细胞培养基(生长培养基)，SFM：不含血清的培养基，Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
图19示出说明人脂肪来源干细胞外泌体(Stem-EXO)对人纤维原细胞的胶原蛋白合成的作用的示意图：SFM：不含血清的培养基，Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
图20示出说明人脂肪来源干细胞外泌体(Stem-EXO)对小鼠黑色素细胞的黑色素合成作用的示意图；GM：干细胞培养基(生长培养基)，SFM：不含血清的培养基，Stem-EXO：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体，K-EXO：源自人表皮角化细胞的外泌体，F-EXO：源自人包皮纤维原细胞的外泌体。
具体实施方式
在下文，提供优选的实施方式以帮助理解本发明，但是实施方式仅用于说明性的目的。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在本发明的范围和技术理念内进行各种修改和替代形式，并且这些修改和替代形式落入本发明的范围内。。
实施例1源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体
实施例1-1：外泌体的分离
为了从正在分化成脂肪细胞的干细胞分离外泌体，通过在分化培养基中培养干细胞来诱导分化成脂肪细胞。
已确认分化成脂肪细胞因为在细胞质中形成脂滴，而干细胞变得逐渐不均匀。分化干细胞培养基由不含血清的培养基替代，并维持48小时，并且细胞培养上层清液被回收。经回收的细胞培养上层清液以300xg离心10分钟来去除细胞，并随后以2000xg离心30分钟来去除细胞分泌物。
其后，使用装备有分子量为3000的过滤器的离心管(截留分子量＝3000，超滤管)以5000xg离心60分钟来浓缩细胞。在浓缩之后获得的上层清液与外泌体分离试剂以1:0.5的比例混合，并在4℃下储存一天。随后，细胞以10,000xg离心60分钟，用以获得外泌体沉淀物，随后通过分子量为3000的过滤器(离心柱)过滤，并使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗。经冲洗的外泌体沉淀物以10,000xg离心60分钟，并在PBS中再悬浮(图2)。
实施例1-2：外泌体的显微镜分析
源自实施例1-1的外泌体的尺寸和形状使用透射电子显微镜和动态光散射来确定，并且外泌体的表面蛋白使用蛋白质免疫印迹杂交来确定，蛋白质免疫印迹杂交检测对外泌体膜表面的特异蛋白。
结果，如在图3A中所示分离的外泌体通过透射电子显微镜而确认，并且其尺寸如在图3B中所示的被确认为平均约50.75至58.77nm。此外，如在图3C中所示的，在外泌体膜表面上表达的外泌体特异性标记物通过抗体反应来确认。
实施例1-3：与外泌体中脂肪细胞分化相关的蛋白质和生物活性因子的分析
微阵列被用于分析在源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体以及源自增殖干细胞的外泌体中存在的脂质相关生物活性因子。所述微阵列通过抗原-抗体反应来实施，并且荧光度(链霉亲和素-Cy3)表达使用激光扫描器(GenePix 4000B)来测量。
另外，巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、瘦蛋白、胰岛素、血管生成素1(ANGPT1)和30kDa的脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30)，均被确认为在微阵列分析中表达的因子中影响分化成脂肪细胞的生物活性因子，并且在这一方面，比较其在源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体和源自增殖干细胞的外泌体中的相对表达水平。
结果，如在图4A至4C和表1中所示的，所确认的是，在源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)和源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)中存在的脂质相关生物活性因子为不同类型的，并且还确认的是，影响分化成脂肪细胞的生物活性因子的表达水平存在着显著的差异(图5)。
表1
Figure GDA0002574562360000201
实施例1-4：使用外泌体诱导脂肪细胞分化
为了使用外泌体诱导干细胞的脂肪细胞分化，使用分别包含源自增殖干细胞的外泌体和源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体的培养基的培养基组合物。所使用的培养基组合物中，外泌体添加至干细胞培养基的浓度为30、50和100μg/mL。在培养的人脂肪细胞来源干细胞(hASCs)中处理每种培养基组合物之后，每三天更换一次培养基组合物，持续14天。
在包含5％牛胎儿血清、1μM地塞米松、1μg/mL胰岛素、100μM吲哚美辛、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的达尔伯克改良伊格尔培养基的高葡萄糖培养基(DMEM)中培养的干细胞被用作阳性对照组。使用源自增殖干细胞的外泌体处理的干细胞被用作阳性对照组。随后，分析干细胞的细胞形状以及是否分化，其中，分化成脂肪细胞被诱导，使用显微镜和油红O染色，持续14天。
结果，当源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)被使用的时候，干细胞在第7天以类似于阳性对照组(DM)的水平而被分化成脂肪细胞(图6)，因此，油的形成被确认(图7)。然而，在使用源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)处理干细胞的情况中，所确认的是仅产生增殖，而不会分化成脂肪细胞。
实施例1-5：包括源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体的化妆品组合物
根据实施例1-1，制备封装源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体的脂质体。特别地，3wt％的卵磷脂在室温下(15℃)分散于包含0.01wt％的源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体的水相中，并随后使用超临界二氧化碳制备反向微乳液(水/低温处理的二氧化碳)。随后，终止反应，超临界二氧化碳在减压下汽化以去除超临界二氧化碳相，获得低温处理脂质体悬浮液，其中，源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体被封装。在此，反应过程的温度为4℃或更低。
使用封装外泌体的脂质体通过表2中所示的组合物来制备化妆品组合物。
表2
Figure GDA0002574562360000211
Figure GDA0002574562360000221
实施例1-6：使用源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体诱导脂肪组织再生
为了确认对脂肪组织再生的作用，当源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体被注射至体内时，在胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶中独立地装载源自增殖干细胞的外泌体和源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体。
特别地，水凝胶通过将甲基纤维素粉末添加至胶原蛋白溶液中以形成胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶来制备。也就是说，甲基纤维素粉末以3mg/mL的浓度而被添加至溶解于0.02N乙酸的胶原蛋白溶液中，从而使得甲基纤维素的最终浓度变为6wt％，并且随后在4℃下搅拌混合物1小时来制备凝胶。在由此制备的胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶中，装载有源自增殖干细胞的外泌体或者源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体。特别地，在胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶中装载有的外泌体的最终浓度为50μg/mL，并且随后通过移液分散于水凝胶中。此外，包含外泌体的水凝胶被皮下注射至裸鼠内，并观察3周。不包含外泌体的水凝胶被用作阴性对照组，并且包含源自增殖干细胞的外泌体(hASC-EXO)的水凝胶被用作阳性对照组(图8)。三周后，进行苏木精-曙红染色和油红O染色以确认脂肪组织在移植的水凝胶中的再生。
结果，与阴性和阳性对照组比较，大量的小鼠细胞被引入至包含源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体(D-EXO)的凝胶中(图9)，并且细胞内生成油的大量脂肪细胞被观察到(图10)。根据这些结果，可以得出源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体或者装载有外泌体的胶原蛋白/甲基纤维素水凝胶对于诱导脂肪组织的再生是显著有效的。
实施例2增殖干细胞源外泌体
实施例2-1：来自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体的分离
在人脂肪来源干细胞增殖至通道7的过程中分离外泌体。也就是说，从增殖的人脂肪来源的干细胞分离外泌体。
特别地，在标准培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，其包含10％牛胎儿血清，1％青霉素/链霉素)中培养人脂肪组织来源干细胞(通道3至7)。随后，在分离外泌体前的24小时，使用DMEM培养基代替细胞培养基，其为不含血清的和无抗生素的培养基，不具有酚红，并随后保持24小时。在24小时后，回收细胞培养上层清液。经回收的细胞培养上层清液以300xg离心10分钟来去除细胞，并随后以2000xg离心30分钟来去除细胞分泌物。其后，使用装备有分子量为3000的过滤器的离心管(截留分子量＝3000，超滤管)以5000xg离心60分钟来浓缩细胞。在浓缩之后获得的上层清液与外泌体分离试剂以1:0.5的比例混合，并在4℃下储存一天。随后，以10,000xg离心60分钟，获得外泌体沉淀物，随后通过0.22μm过滤器(外泌体离心柱)过滤，并使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗。经冲洗的外泌体沉淀物以10,000xg离心60分钟，并在PBS中再悬浮(图11)。在回收上层清液之后，标准培养基被添加至干细胞并培养。该步骤被重复至干细胞的通道7。在至通道7的增殖过程中分离的外泌体被用于如下的实验中。为了与来自人脂肪来源干细胞的外泌体的效力进行比较，通过如上方法以相同的方式从人表皮角化细胞和人包皮纤维原细胞分离外泌体(图12)。
实施例2-2：外泌体的显微镜分析
实施例2-1的源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-Exo)、源自人表皮角化细胞的外泌体(K-Exo)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)的尺寸和形状使用透射电子显微镜和动态光散射来确定。
结果，每种衍生的外泌体的形状通过透射电子显微镜而确认。此外，源自人脂肪来源干细胞的外泌体、源自人表皮角化细胞的外泌体和源自人包皮纤维原细胞的外泌体的尺寸分别为约69nm、约79.7nm和约94.6nm，并且人脂肪源干细胞源外泌体(Stem-Exo)的尺寸是最小的(图13A至13C)。
实施例2-3：外泌体中与皱纹改善、美白和皮肤再生相关的蛋白质和生物活性因子的分析
实施微阵列分析以对比和分析在源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-Exo)、源自人表皮角化细胞的外泌体(K-Exo)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)中存在的与皱纹改善、美白和皮肤再生相关的生物活性因子。微阵列分析通过抗原-抗体反应来执行，并且荧光度(链霉亲和素-Cy3)表达使用激光扫描器(GenePix 4000B)来测量。
通过微阵列分析，影响皱纹改善的9个生物活性因子(PDFG-AA，PDGG-AB，PDGF-BB，FGF-6，MCP-1，MCP-3，嗜酸性粒细胞趋化因子，CCL-5，TIMP-1)4个美白相关活性因子(TGF-β，TNF-α，IL-6，IL-8)以及与皮肤再生和血管生成相关的6个生物活性因子(EGF，HGF，PAI-1，VEGF，血管生成素，血管生成素-1)被确认，并且关于此，比较在源自人脂肪来源干细胞的外泌体和源自人表皮角化细胞的外泌体以及源自人包皮纤维原细胞的外泌体中的每种生物活性因子的相对表达水平(图14)。图14C和14D示出生物活性因子的相对表达水平，并且横轴表示来自人脂肪来源干细胞的外泌体，竖轴分别表示来自表皮角化细胞的外泌体和来自纤维原细胞的外泌体。此外，最上边的线和最下边的线以及位于中心的图形的中线分别示出相对于参考值的1.5倍升高/下降。图15A至15I示出与外泌体的皱纹改善作用相关的生物活性因子，图16A至16D示出与外泌体的美白作用相关的生物活性因子，并且图17A至17F示出与外泌体的皮肤再生和血管生成相关的生物活性因子。
结果，如在图15、16和17中所示的，所确认的是在源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-Exo)、源自人表皮角化细胞的外泌体(K-Exo)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)中存在不同类型的生物活性因子。特别地，所确认的是，单核细胞趋化蛋白-1、-3(MCP-1、-3)，趋化因子配体5(CCL-5)和胶原酶抑制剂(金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1))涉及与促进胶原蛋白合成和抑制其分解相关的机制，与K-EXO和/或F-EXO相比，在源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)中，与美白相关的白介素-6、-8(IL-6、-8)，与皮肤再生和血管生成相关的肝细胞生长因子(HGF)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、血管生成素和血管生成素-1被过度表达(图15、16和17)。
实施例2-4：使用源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体对人包皮纤维原细胞的移植作用
为了检测源自人脂肪来源干细胞的外泌体对人包皮纤维原细胞移植的作用，使用分别包含源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)、源自人表皮角化细胞的外泌体(K-EXO)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)的培养基组合物。通过以10、30和50μg/mL的浓度将Stem-EXO添加至DMEM不含血清的培养基，和以50μg/mL的浓度分别将K-EXO以及F-EXO添加至DMEM不含血清的培养基来制备每种培养基组合物。包含10％血清的DMEM培养基被用作为阳性对照组，并且DMEM不含血清的培养基被用作为阴性对照组。使用绿色荧光染料标记人包皮纤维原细胞，并在24孔板中以1×105个细胞/孔接种和在培养基(包含10％牛胎儿血清，1％青霉素/链霉素的DMEM)中培养72小时。在培养过后，使用无菌黄色尖端(tip)在细胞附着的板的底部中心处制备人造的均匀间隔的伤口，并将包含外泌体的每种培养基组合物施加至细胞。
结果，与使用阴性对照组，K-EXO和F-EXO进行处理的细胞相比，使用包含Stem-EXO的培养基处理的细胞在24小时显示出更高程度的移植，并且这样的趋势在包含30和50μg/mL浓度的Stem-EXO的培养基中是更加突出的。在48小时后，与包含K-EXO和F-EXO的培养基相比，所述移植在包含10、30和50μg/mL Stem-EXO的培养基中更快速地发生，显示出更好的(例如更快的，留下更小疤痕的，或者更少变色的)伤口愈合作用(图18A和18B)。
因此，与K-EXO或F-EXO相比，源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)显示出对人包皮纤维原细胞的移植更佳的作用。
实施例2-5：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体对皱纹改善的作用
为了检测源自人脂肪来源干细胞的外泌体对人包皮纤维原细胞的胶原蛋白合成的作用，使用分别包含源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)、源自人表皮角化细胞的外泌体(K-EXO)和源自人包皮纤维原细胞源的外泌体(F-EXO)的培养基组合物。通过以10、30和50μg/mL的浓度将Stem-EXO添加至DMEM不含血清的培养基，和以50μg/mL的浓度分别将K-EXO以及F-EXO添加至DMEM不含血清的培养基来制备每种培养基组合物。DMEM不含血清的培养基被用作为阴性对照组。在48孔板中以5×104个细胞/孔接种人包皮纤维原细胞，并在培养基(包含10％牛胎儿血清，1％青霉素/链霉素的DMEM)中培养72小时，随后使用PBS冲洗，和将包含外泌体的培养基组合物分别施加至细胞。
在培养完成后，回收每个孔的培养溶液，在25℃下，以3000rpm离心10分钟，并随后收集上层清液，用于可溶胶原蛋白的萃取和定量。使用PBS冲洗已去除培养溶液的板的每个孔。随后，通过施加胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA)以从每个孔的底部分离细胞，并测量细胞的数目。
Sircol胶原蛋白分析盒(Biocolor，英国)被用于可溶胶原蛋白的定量。使用与聚乙二醇混合的Tris-HCl(pH 7.6)缓冲溶液处理获得的上层清液，并维持在4℃下12小时或更长时间。其后，生成物在12000rpm下离心10分钟，以浓缩胶原蛋白。在去除上层清液后，将1mL所提供的胶原蛋白吸收染料(sircol染料试剂)添加至胶原蛋白小球，并随后振荡培养30分钟。未吸收的染料通过12000rpm离心10分钟而被去除，并使用酸性盐缓冲溶液冲洗小球。随后，吸附在胶原蛋白上的染料通过使用碱性试剂而被溶解，并且吸光度在555nm的波长下测量。将所述吸光度代入标准曲线方程来计算可溶胶原蛋白在分别添加Stem-EXO、K-EXO、F-EXO和阴性对照组物质的孔中的量。胶原蛋白的校准量被代入方程中来计算合成速率。
结果，对于使用Stem-EXO处理的组，可溶胶原蛋白合成速率随着所使用的外泌体的浓度而增高，与阴性对照组相比(0.138μg)。特别地，在以50μg/mL使用Stem-EXO处理的组的情况中，胶原蛋白合成的量为2.59μg，其与相同量的K-EXO(1.4μg)或F-EXO(0.8μg)相比显著地提高。因此，这意味着源自人脂肪来源干细胞的外泌体具有促进人包皮纤维原细胞的胶原蛋白合成的作用(图19)。
实施例2-6：源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体对使用小鼠黑素瘤形成的黑色素的抑制作用
源自人表皮角化细胞的外泌体(K-EXO)和源自人包皮纤维原细胞的外泌体(F-EXO)作为对照组，源自人脂肪来源干细胞的外泌体(Stem-EXO)的美白作用通过在小鼠黑素瘤中形成的黑色素的抑制程度来确定。黑素瘤细胞为源自小鼠黑素瘤的细胞，并分泌称为“黑色素”的黑色素颜料。黑素瘤细胞以1×105细胞/孔的密度在96孔板中接种以附着细胞，并随后通过使用分别包含Stem-EXO，K-EXO和F-EXO的培养基替代培养基培养3天。3天后，回收培养基并以4500rpm离心10分钟，并在405nm下测量吸光度来计算由细胞释放的黑色素量。通过施加胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA)来去除附着至孔板的细胞，并测量细胞数量，随后离心回收细胞。使用PBS冲洗细胞一次，并离心以获得细胞小球。将1ml包含10％二甲基亚砜(DMSO)的1N氢氧化钠(NaOH)溶液添加至细胞小球以在80℃下溶解黑色素2小时，随后将生成物添加至96孔板，并在405nm下测量吸光度。使用所测量的吸光度定量黑色素，并归一化为试样的蛋白质浓度来确定已合成的黑色素的浓度。
源自人脂肪来源干细胞的外泌体以10、30和50μg/mL的浓度用于黑素瘤细胞上，并检测黑色素合成的程度。结果是，已确认黑色素合成对于所有浓度的源自干细胞的外泌体都有所降低(图20)。
实施例2-7：包含源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体的化妆品组合物
根据实施例2-1，制备封装源自增殖的人脂肪来源干细胞的外泌体的脂质体。
特别地，3wt％的卵磷脂在室温下(15℃)分散于包含0.01wt％源自增殖的干细胞的外泌体的水相中，并随后使用超临界二氧化碳制备反向微乳液(水/低温处理的二氧化碳)。之后，终止反应，超临界二氧化碳在减压下汽化以去除超临界二氧化碳相，并获得低温处理的脂质体悬浮液，其中封装有源自增殖的干细胞的外泌体。在这里，反应温度为4℃或更低。
化妆品组合物使用封装外泌体的脂质体通过在下表3中所示的组合物来制备。
表3
组合物 含量(wt％)
硬脂酸 2
十六醇 2
羊毛脂醇 2
液体石蜡 7
环甲硅油 5
聚氧乙烯单油酸酯 2
己二醇 2
甘油 3
三乙胺 5
卡波姆 0.2
根据本发明实施例2-1封装外泌体的脂质体 0.01
纯水 余量
制剂实施例1：制备皮肤软化化妆水(爽肤水)
皮肤软化化妆水(爽肤水)通过在下表4中所示的成分使用封装根据实施例2-7的方法获得的源自增殖的干细胞的外泌体的脂质体来制备。
表4
Figure GDA0002574562360000291
Figure GDA0002574562360000301
制剂实施例2：营养化妆水的制备(牛奶润肤乳)
营养化妆水(牛奶润肤乳)通过在下表5中所示的成分来制备，使用封装有实施例2-7的方法获得的源自增殖的干细胞的外泌体的脂质体。
表5
组合物 含量(wt％)
封装根据本发明实施例2-1的外泌体的脂质体 0.01
甘油 5
矿物油 4
蜂蜡 4
聚山梨醇酯-60 1.5
羧乙烯基聚合物 0.1
丁二醇 3
异三十烷 5
三乙胺 0.15
防腐剂、调味剂、着色剂 0.1
纯水 余量

Claims (5)

1.一种源自正在分化成脂肪细胞的干细胞的外泌体在制备用于再生脂肪组织的药物中的用途,其特征在于，所述外泌体包含巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、瘦蛋白、胰岛素、血管生成素1（ANGPT1）和30kDa的脂肪细胞补体相关蛋白（Acrp30）。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述正在分化成脂肪细胞的干细胞包括骨髓干细胞、脐带血干细胞和脂肪来源干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述正在分化成脂肪细胞的干细胞为人来源或动物来源干细胞。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述外泌体以1至150μg每1mL药物浓度被包含。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是一种包括水凝胶的可注射制剂。
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