CN116814542A - 细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用。本发明将细胞因子作为刺激剂，牙髓干细胞表面均表达本发明所选5种因子受体，5种细胞因子均能刺激牙髓干细胞增殖、分化或迁徙，细胞增殖、分化、迁徙等过程均是细胞活化及细胞代谢旺盛的过程，细胞在活化状态下可分泌大量的外泌体。因此，经5种细胞因子刺激后，牙髓干细胞处于活化状态，进而显著提高牙髓干细胞的外泌体分泌量，所得的外泌体可用于抗衰老或其他医疗用途，具有广阔的市场价值。
Description
本申请是申请日为2019年12月20日、申请号为2019113277049，发明名称为“细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是一群具有成骨、成软骨和成脂肪功能的成体干细胞。MSC可以通过旁分泌的形式，发挥调节免疫、促进血管新生和支持造血等功能。MSC来源丰富，存在于胎盘、脐带、骨髓、牙髓、脂肪等多种组织中。因此，MSC作为药物已经被多个国家批准，用于移植物抗宿主病、溃疡型结肠炎、心肌梗塞恢复期等疾病的治疗。然而，无论静脉注射、肌肉注射或心肌内注射，外源移植的MSC多在72小时内死亡。那么，关于死亡的MSC如何发挥上述作用这一问题，既往的研究表明，体外培养的MSC在低氧和血清撤除条件下，可以释放大量的外泌体，这种外泌体在体外可以促进内皮细胞增殖，促进内皮细胞形成毛细血管网状结构，加速缺血模型血流的恢复。事实上，MSC来源的外泌体已经进入临床试验阶段，用于糖尿病和肾功能不全的治疗。因此，MSC来源的外泌体作为“无细胞”细胞治疗的材料，具有潜在的实用价值。为提高治疗效果，探索获取具有更强功能外泌体的途径，对开展MSC外泌体的临床试验研究是十分必要的。
现有技术中却没有对干细胞外泌体分泌的促进因子进行过专门研究。
申请公布号为CN 106492194 A的中国专利公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用，其采用的细胞因子仅仅为碱性成纤维细胞生长因子，其制备的制剂是作为外泌体的补充，是额外添加至外泌体中，该专利是将牙髓干细胞+外泌体+碱性成纤维细胞生长因子(10ng/ml)作为一种混合制剂治疗胃炎，没有对干细胞外泌体分泌的促进因子进行专门研究，也未涉及能够用于皮肤的干细胞培养。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂促进牙髓干细胞分泌外泌体。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂用于促进牙髓干细胞分泌外泌体。该外泌体具体可以用于制备抗皮肤衰老药物等用途。
可选地，所述细胞因子选自表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素一号增长因子(IGF-1)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、干细胞生长因子(SCF)、γ-干扰素(IFN-γ)中的至少一种。
优选地，所述细胞因子为表皮细胞生长因子(EGF)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的组合。
优选地，所述表皮细胞生长因子与所述人血小板衍生生长因子BB的质量比为1：1。
本发明还提供一种外泌体的制备方法，包括：将细胞因子加入培养基中，制得含有细胞因子的培养基，将牙髓干细胞加入所述培养基中培养，得到牙髓干细胞分泌的外泌体。
可选地，所述细胞因子选自表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素一号增长因子(IGF-1)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、干细胞生长因子(SCF)、γ-干扰素(IFN-γ)中的至少一种。
优选地，所述细胞因子为表皮细胞生长因子(EGF)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的组合。
优选地，所述表皮细胞生长因子与所述人血小板衍生生长因子BB的质量比为1：1。
可选地，所述表皮细胞生长因子在所述培养基中的浓度为1-20ng/mL，优选为10-20ng/mL，包括但不限于1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL等。
可选地，所述类胰岛素一号增长因子在所述培养基中的浓度为1-100ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL。
可选地，所述人血小板衍生生长因子BB在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。
可选地，所述干细胞生长因子在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。
可选地，所述γ-干扰素在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。
可选地，所述培养基包括用于促进牙髓干细胞生长的培养基，所述用于促进牙髓干细胞生长的培养基具体可以为MSC无血清培养基，该培养基可以从市场上购买得到。
可选地，所述培养基还含有生理盐水，用于培养外泌体。
可选地，将所述牙髓干细胞加入所述培养基中，培养的时间为72h。
可选地，培养结束后，收集上清液，离心，得到所述外泌体。
本发明提供上述方法制得的外泌体。
本发明还提供含有上述外泌体的制剂，所述制剂用于促进成纤维细胞增殖和/或促进血管新生，进而起到抗皮肤衰老的作用。
本发明具有以下有益效果：
本发明将细胞因子作为刺激剂，牙髓干细胞表面均表达本发明所选5种因子受体，5种细胞因子均能刺激牙髓干细胞增殖、分化、迁徙，细胞增殖、分化、迁徙等过程均是细胞活化及细胞代谢旺盛的过程，细胞在活化状态下可分泌大量的外泌体。因此，经5种细胞因子刺激后，牙髓干细胞处于活化状态，进而显著提高牙髓干细胞的外泌体分泌量，所得的外泌体可用于抗衰老或其他医疗用途，具有广阔的市场价值。
附图说明
图1显示为本发明实施例的人牙髓干细胞的细胞形态学照片(50×)。
图2和图3显示为本发明实施例的人牙髓干细胞的流式细胞学分析结果图。
图4显示为本发明实施例的外泌体的形态观察(透射电镜)图。
图5显示为本发明实施例的外泌体Western blot检测结果图。
图6显示为本发明实施例不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对成纤维细胞增殖的影响情况图。
图7显示为本发明实施例不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对血管内皮细胞形成毛细血管样结构的影响情况图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明选择牙髓干细胞，具有如下优点：
1)来源丰富。
6-12岁的小孩自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓干细胞。
2)副作用小。
牙髓干细胞是一种间充质干细胞，具有间充质干细胞的通性，不仅免疫原性低，不需经过严格配对即可使用，不会引起强烈的排异反应，而且还具有免疫调节功能，异体移植不会引起排斥反应。
3)无伦理争议。
因牙髓干细胞取自小孩自然脱落的牙齿及成人的智齿，属于废弃物品，且不损及生命，不存在伦理上的争议。
牙髓干细胞能通过旁分泌的方式分泌外泌体。外泌体是多种细胞分泌的直径30-100nm的小囊泡，外膜主要由脂质和蛋白质构成，表达特异性标志物CD63、CD9和CD81，同时表达其来源细胞的一些表面标志物。外泌体携带多种功能性蛋白质、脂质、DNA、RNA、微小RNA(miRNA)等物质，介导细胞间的通讯。外泌体运载了其来源干细胞的生物活性物质，发挥干细胞类似功能，可回避干细胞直接移植的潜在风险；外泌体能通过皮肤、粘膜及血脑屏障进入组织细胞，可避免被过滤器管所清除；外泌体可进行人工修饰，作为药物及药物靶向递送载体，利于储存、运输及产业化生产。
外泌体是已被证实可以渗透到皮肤角质层的物质，我们推测牙髓干细胞外泌体中含有大量的抗衰老因子，并且可以渗透到皮肤真皮层中从而发挥抗衰老效果。外泌体运载了牙髓干细胞的生物活性物质，发挥干细胞类似功能，可回避干细胞直接移植的潜在风险；同时，外泌体能通过皮肤、粘膜及血脑屏障进入组织细胞，可避免被过滤器官清除；外泌体还可进行人工修饰，作为药物及药物靶向递送载体；并且外泌体较干细胞更利于储存、运输及产业化生产。
鉴于此，特提出本发明。本发明涉及一种提高牙髓干细胞分泌的外泌体的数量的方法，该方法通过在培养牙髓干细胞时添加特定的细胞因子，优选为EGF+PDGF-BB，使得MSC释放的外泌体数量增加，同时得到更多的抗皮肤衰老的细胞因子，具有更强的促成纤维细胞增殖能力和促血管生成的能力。本发明为牙髓干细胞应用于临床提供了有力工具。
本发明提供牙髓干细胞外泌体培养方法，能得到更多量的外泌体。
实施例1
1、主要设备
表1
2、主要试剂
表2
| 试剂名称 | 试剂厂家 |
| MSC培养基及添加剂 | 北京友康科技有限公司 |
| ɑ-MEM | 北京友康科技有限公司 |
| FBS(胎牛血清) | Gibco |
| 外泌体CD63&TSG101蛋白检测试剂盒 | 上海宇玫博生物科技有限公司 |
| MSC干细胞流式分析试剂 | BD |
| 表皮细胞生长因子(EGF) | 北京同立海源生物科技有限公司 |
| 胰岛素样生长因子(IGF-1) | 北京同立海源生物科技有限公司 |
| 血小板衍生生长因子(PDGF-BB) | 北京同立海源生物科技有限公司 |
| 干细胞因子(SCF) | 北京同立海源生物科技有限公司 |
| 重组人干扰素-γ(IFN-γ) | 北京同立海源生物科技有限公司 |
| PBS | Gibco |
| 分散酶 | Gibco |
| 胶原酶 | Gibco |
| VEGF，TGF-β，IL-6，bFGF的Elisa试剂盒 | 北京晶美科技有限公司 |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | 北京晶美科技有限公司 |
| 0.25％胰蛋白酶 | Gibco |
3、实验步骤：
3.1牙髓干细胞分离培养
3.1.1牙齿表面清理
将收集的健康完整的牙齿用75体积％酒精浸泡1min，然后用无菌生理盐水漂洗2～3次。剪刀剐蹭，去除牙齿表面的组织碎屑(尤其是牙根处)，反复漂洗。
3.1.2取牙髓
将处理好的牙齿放在骨锤平坦的一面，用另一骨锤相击，暴露牙髓腔。取配制好的体积比0.2％胶原酶和0.4％体积比分散酶各2mL混合。将暴露牙髓腔的牙齿及碎片放入混合液中，37℃摇床低速(100r/min)摇荡1h。
3.1.3细胞培养
复吹打消化的细胞团落，使之形成单细胞悬浮液。过细胞筛，转移细胞液至另一离心管，1500r/min离心5min。MSC培养基悬浮，接种，加入体积比为5％的添加剂。37℃5％ CO2培养箱培养，待细胞融合度达80％时，0.25％胰蛋白酶消化传代，取生长状态良好的P3-P5代细胞进行实验。
3.1.4待上述细胞融合度达到80％-90％的时候，去除培养上清，换用等体积的生理盐水，加入A-F组刺激因子继续培养72小时，收集上清液。
各组刺激因子的加入情况如下：
A：不加；
B：加10ng/mL EGF；
C：加100ng/mL IGF-1；
D：加50ng/mL PDGF-BB；
E：加50ng/mL SCF；
F：加50ng/mL IFN-γ。
上述各刺激因子的浓度是指各刺激因子在培养基中的终浓度。
3.1.5外泌体收集，密度梯度离心收集外泌体，具体按如下步骤依次进行：
1)300g离心10min，去除细胞。
2)2000g离心10min，去除细胞碎片。
3)10000g离心30min，去除细胞小碎片。
4)100KD超滤管40000g离心20min，收集外泌体。
4、检测
4.1牙髓干细胞鉴定
4.1.1获取牙髓干细胞细胞形态学照片(50×)，见图1。
4.1.2使用流式对牙髓干细胞的表面标记物进行分析。
流式检测牙髓间充质干细胞8种抗原：CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD19、CD34和CD11b，流式检测结果见图2和图3。
4.2外泌体鉴定
4.2.1透射电镜下观察外泌体形态和大小：取分离纯化外泌体10微升，按体积比＝1：1加入4℃的PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置1min后用滤纸浆多余液体轻轻吸去，用3％(W/V)磷钨酸钠溶液(PH6.8)室温负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一半后室温晾干，于透射电镜观察并照相、测量其直径，透射电镜结果见图4。
4.2.2western-blot检测外泌体膜表面特征性蛋白表达
采用外泌体CD63&TSG101蛋白检测试剂盒检测外泌体特征蛋白表达。收集牙髓干细胞和外泌体样品，使用细胞裂解液对样品进行裂解提取蛋白，依标准方法进行10％ SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜，用体积分数5％的脱脂奶粉封闭液封闭1h后，分别加入CD63、TSG101一抗4℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，每次10分钟，再将膜与HRP标记的二抗室温反应50min，TBST洗膜3次，每次10分钟后，加入化学发光底物显色观察。
4.3测定外泌体蛋白质浓度。计算细胞数量及其蛋白质表达量，细胞是最终获得的细胞总数，蛋白是获得的外泌体蛋白质含量总量。从而确定在没有影响细胞增殖状况下，何种细胞因子能刺激外泌体分泌量最大。
A：未加刺激剂(作为阴性对照)；
B：加EGF刺激产生的外泌体；
C：加IGF-1刺激产生的外泌体；
D：加PDGF-BB刺激产生的外泌体；
E：加SCF刺激产生的外泌体；
F：加IFN-γ刺激产生的外泌体。
4.4ELISA法测定外泌体中VEGF、IL-6、TGF、bFGF的含量。
A：未加刺激剂(作为阴性对照)；
B：加EGF刺激产生的外泌体；
C：加IGF-1刺激产生的外泌体；
D：加PDGF-BB刺激产生的外泌体；
E：加SCF刺激产生的外泌体；
F：加IFN-γ刺激产生的外泌体。
4.5牙髓干细胞分泌的外泌体的功能鉴定，促进成纤维细胞(HF-1)增殖实验。
取HF-1细胞(购自上海纪宁实业有限公司)，用含体积比10％FBS的ɑ-MEM培养，消化收集后计细胞数，悬浮于含10％FBS的ɑ-MEM中。接种于96孔板做MTT实验，1000个细胞/孔。分组如下：
A：未加刺激剂的上清10μg/mL(作为阴性对照)；
B：加EGF刺激产生的外泌体10μg/mL；
C：加IGF-1刺激产生的外泌体10μg/mL；
D：加PDGF-BB刺激产生的外泌体10μg/mL；
E：加SCF刺激产生的外泌体10μg/mL；
F：加IFN-γ刺激产生的外泌体10μg/mL；
G：加EGF+PDGF-BB刺激产生的外泌体10μg/mL。
确定何种细胞因子刺激的外泌体具有更好的刺激细胞增殖的功能。
利用MTT实验观察不同组外泌体对HF-1细胞增殖的影响，按照1000个细胞/孔，将HF-1细胞接种于96孔板中，培养体系中分别加入经A-G组处理的外泌体10μg/mL，每组3个复孔。培养72小时后，加入MTT，继续培养4小时。之后，加入二甲基亚砜(DMSO)，测定490nm光密度值。
4.6牙髓干细胞外泌体促进毛细血管样结构形成实验
Matrigel实验是观察内皮细胞功能，尤其是毛细血管网形成能力的经典方法，其结果代表体内新生血管形成活性。将内皮细胞接种于Matrigel铺板的培养板中，培养体系分别加入经Untreated、EGF、IGF-1、PDGF-BB、SCF、IFN-γ、EGF+PDGF-BB刺激组处理的外泌体10μg/mL，24h后计数各高倍视野下网状结构数目。
5、结果
5.1人牙髓干细胞的分离、扩增及鉴定。
5.1.1图1显示为人牙髓干细胞的细胞形态学照片。
5.1.2图2和图3显示为人牙髓干细胞的流式细胞学分析结果图，根据国际细胞治疗协会(ISCT)于2006年颁布的《间充质干细胞鉴定的最低标准》，CD73、CD90、CD105三种表面抗原的表达不低于95％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达不高于2.0％。对照组是牙髓间充质干细胞8种抗原相应的同型对照，对照组的流式结果见图2。样品组是8种抗原的表达情况，样品组的流式结果如图3所示，样品组的CD73、CD90、CD105表达高于95.0％；样品组的阴性标志物(HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b)表达低于2.0％，符合干细胞的表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
5.2从牙髓干细胞中收集到大量的外泌体，进行外泌体鉴定。
5.2.1使用透射电镜观察外泌体大小和形态，图4显示为外泌体的透射电镜图。外泌体大小为30-120nm，其中多数为30-60nm的双层结构，呈中空的囊性结构，符合外泌体的形态学特点。
5.2.2使用western-blot检测外泌体膜表面特征性蛋白CD63、TSG101的表达，图5所示为外泌体Western blot检测结果，外泌体特异性标志物CD63、TSG101清晰可见、牙髓干细胞组则不表达CD63、TSG101抗体。
5.3Elisa法测出外泌体中蛋白含量
各组的外泌体蛋白表达量统计结果如表3所示，单独使某一种刺激剂用时，蛋白含量最高的两组为B组和D组，即EGF、PDGF-BB组，因此，我们尝试将EGF、PDGF-BB两种刺激剂合并，作为G组，结果发现，外泌体蛋白含量显著提高，高达2507±733μg/108个细胞。
表3
| 刺激剂组别 | 外泌体刺激剂 | 外泌体蛋白含量 |
| A | 未刺激组 | 222±115μg/108 |
| B | EGF | 830±265μg/108 |
| C | IGF-1 | 556±124μg/108 |
| D | PDGF-BB | 901±262μg/108 |
| E | SCF | 656±229μg/108 |
| F | IFN-γ | 256±134μg/108 |
| G | EGF+PDGF-BB | 2507±233μg/108 |
5.4Elisa法测VEGF、IL-6、TGF、bFGF等因子含量，确定最佳刺激因子为EGF、PDGF-BB。
表4
| 组别 | 刺激剂 | VEGF含量 | bFGF含量 | TGF含量 | IL-6含量 |
| A | 未刺激组 | 1165±171pg/mL | 1296±187pg/mL | 1301±194pg/mL | 2271±128pg/mL |
| B | EGF | 1888±263pg/mL | 1778±219pg/mL | 1969±275pg/mL | 3630±265pg/mL |
| C | IGF-1 | 1514±231pg/mL | 1579±209pg/mL | 1692±236pg/mL | 2589±135pg/mL |
| D | PDGF-BB | 2218±372pg/mL | 2015±294pg/mL | 2560±213pg/mL | 3781±177pg/mL |
| E | SCF | 1609±182pg/mL | 1701±124pg/mL | 1757±165pg/mL | 3856±187pg/mL |
| F | IFN-γ | 1232±208pg/mL | 1374±124pg/mL | 2012±128pg/mL | 3002±134pg/mL |
| G | EGF+PDGF-BB | 2912±397pg/mL | 2809±625pg/mL | 3011±462pg/mL | 4505±729pg/mL |
各组的VEGF、IL-6、TGF、bFGF因子含量统计结果如表4所示，单独使某一种刺激剂用时，VEGF、IL-6、TGF、bFGF因子含量明显比较高的是B组和D组，即EGF、PDGF-BB组和外泌体蛋白含量成正相关，同时，我们测试了G组VEGF、IL-6、TGF、bFGF因子含量，结果明显高于A-F组，仍旧与外泌体蛋白含量成正相关。
5.5验证各刺激因子EGF、IGF-1、PDGF-BB、SCF、IFN-γ、EGF+PDGF-BB刺激培养的牙髓干细胞外泌体具有更好的刺激成纤维细胞(HF-1)增殖功能。
图6显示为不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对成纤维细胞增殖的影响图，在成纤维细胞(HF-1)中加入各刺激因子Untreated、EGF、IGF-1、PDGF-BB、SCF、IFN-γ、EGF+PDGF-BB刺激培养的牙髓干细胞外泌体，MTT试验观察其增殖情况，纵坐标OD490nm。Untreated为未加刺激剂外泌体的实验组，结果显示加因子组OD值明显高于Untreated组(P<0.05)，混合因子组(EGF+PDGF-BB)处理组略高于单因子处理。上述结果显示，加入因子EGF、IGF-1、PDGF-BB、SCF、IFN-γ、EGF+PDGF-BB处理后的牙髓干细胞所释放的外泌体，可明显促进成纤维细胞(HF-1)的体外增殖，经EGF+PDGF-BB联合刺激后牙髓干细胞所释放的外泌体具有更强的促HF-1增殖能力。
5.6不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对血管内皮细胞形成毛细血管样结构的影响。
图7显示为不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对血管内皮细胞形成毛细血管样结构的影响结果显示，不加任何刺激(Untreated组)、EGF、IGF-1、PDGF-BB、SCF、IFN-γ、EGF+PDGF-BB组的内皮细胞每视野网状结构数量分别为2.3±1.2、9.4±0.89、7±1.42、8.3±1.33、7±0.54、8±1.15、10±1.06，不加任何刺激(Untreated组)的内皮细胞形成管腔能力有限；细胞生长因子处理组的内皮细胞形成管腔能力均显著高于未处理组，并且混合因子(EGF+PDGF-BB)处理组高于单因子处理组。上述结果显示，经EGF+PDGF-BB联合刺激后牙髓干细胞所释放的外泌体具有更强的促血管新生能力。
综上，本发明生产得到高浓度外泌体(碱性成纤维细胞生长因子含量是2000ng/mL)，可直接作用于皮肤。本发明将细胞因子作为刺激剂，显著提高干细胞的外泌体分泌量，所得的外泌体可用于抗衰老或其他医疗用途，具有广阔的市场价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.细胞因子在制备刺激剂中的应用，其特征在于，所述刺激剂用于促进牙髓干细胞分泌外泌体；其中，所述细胞因子为干细胞生长因子。
2.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞因子加入培养基中，制得含有所述细胞因子的培养基，将牙髓干细胞加入所述培养基中培养，得到所述牙髓干细胞分泌的外泌体；其中，所述细胞因子为干细胞生长因子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞生长因子在所述培养基中的浓度为50ng/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基包括用于促进牙髓干细胞生长的培养基以及生理盐水。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，培养结束后，收集上清液，离心，得到所述外泌体。
6.根据权利要求2～5任意一项所述的制备方法制得的外泌体。
7.含有权利要求6所述外泌体的制剂，其特征在于，所述制剂用于促进成纤维细胞增殖和/或促进血管新生。
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