CN116898791B - 一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，涉及医美试剂技术领域，技术方案为：干细胞在培养液中培养后进行离心，得到外泌体颗粒，这些颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，再添加α‑熊果苷活性成分进行孵育，混合液中加入卵磷脂溶液和蚕丝素‑小檗碱溶液，形成外泌体包埋的脂质体并进行孵育，得到的混合液经超声处理后，再添加纳米丝蛋白进行孵育，为形成凝胶状的美白试剂，混合液中加入羟乙基纤维素作为增稠剂，混合后冷藏保存；本发明的有益效果是：通过外泌体提取技术和特定配方，增强了美白活性、稳定性和皮肤兼容性；修饰技术提高了透皮吸收，纳米丝蛋白和羟乙基纤维素优化了制剂的稳定性和触感。
Description
技术领域
本发明涉及医美试剂技术领域，特别涉及一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂。
背景技术
随着医美行业的迅速发展，干细胞外泌体因其独特的细胞修复和再生能力逐渐受到人们的关注。作为一种新型的细胞信号传递载体，干细胞外泌体拥有诸多优势，其中最为关键的是其能够有效地传递多种生物活性分子，从而实现对皮肤的修复和再生。
然而，传统的干细胞外泌体应用于医美领域时面临一系列技术挑战。首先，外泌体可能因为自身不稳定性而很快被分解或降解，这大大限制了其在实际应用中的效果。其次，由于皮肤的天然屏障作用，许多外泌体很难被皮肤有效吸收，这进一步影响其在医美领域的应用效果。另外，现有的外泌体提取和处理技术往往无法确保外泌体的高纯度和完整性，导致其医美效果不稳定。
鉴于上述现有技术的不足，急需一种新的方法来提高干细胞外泌体在医美应用中的稳定性和皮肤渗透性。该方法应确保外泌体颗粒的高纯度和完整性，同时还需提高其在皮肤上的渗透能力，以确保外泌体或其有效成分能够有效、持续地在皮肤内释放，从而实现更好的医美效果。此外，还需要解决可能的皮肤过敏或不良反应问题，使其更具生物相容性。
发明内容
为了实现上述发明目的，针对上述技术问题，本发明提供一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
a）干细胞外泌体颗粒提取：将干细胞在培养液中培养，离心后获得外泌体颗粒；
b）用透明质酸钠溶液对干细胞外泌体颗粒进行修饰：将提取到的外泌体颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，外泌体颗粒与透明质酸钠溶液体积比为1:2 - 1:5；
c）加入α-熊果苷活性成分：向步骤b）混合液中加入0.5-2% (w/v)的α-熊果苷混合孵育；
d）加入卵磷脂溶液和蚕丝素-小檗碱溶液形成外泌体包埋的脂质体：向步骤c）混合液中加入5-10% w/v的卵磷脂和1-3% w/v的蚕丝素-小檗碱溶液，混合孵育，混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.05-1:0.1，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.01-1:0.03；
e）将步骤d）得到的混合液进行超声处理；
f）加入纳米丝蛋白：向超声处理后的混合液中加入纳米丝蛋白混合孵育，添加的量为超声处理后的混合液总量的1-3% (w/v)；
g）制备凝胶，得到美白试剂：添加羟乙基纤维素作为增稠剂混合孵育，制成凝胶，加入的羟乙基纤维素的量为混合液总量的0.5-2%，冷藏保存。
干细胞外泌体包含了多种生物活性分子，它们可以促进皮肤细胞再生、修复和增强皮肤屏障功能。透明质酸钠为一种天然存在于皮肤的大分子多糖，具有极佳的保湿效果。α-熊果苷是一种已知的天然美白活性成分，能够抑制黑色素生成。通过对干细胞外泌体颗粒进行修饰、加入美白和其他活性成分，以及后续的制备步骤，确保了产品的稳定性和美白效果的最大化。尤其是使用卵磷脂和蚕丝素-小檗碱形成的脂质体，有助于外泌体和美白成分的皮肤深层渗透。
组合利用各种活性成分和材料，能够实现即时保湿、长效美白、深层滋养和修复的综合效果。超声处理能够使混合液中的成分更均匀分布，提高其在皮肤上的渗透性和吸收率。整个制备流程中，各个成分的加入均经过了严格的体积或重量比例控制，确保了最终产品的质量和效果。尤其是最后加入的纳米丝蛋白和羟乙基纤维素，不仅使得最终产品具有良好的触感和外观，还增强了凝胶的稳定性，确保了其长时间的保存和使用。
优选的所述干细胞为脂肪干细胞，包括以下步骤：
s1）从脂肪组织中提取脂肪干细胞；
s2）将提取的脂肪干细胞在专用培养基中培养至适当的生长密度；
s3）收集培养上清液并进行离心，得到沉淀物；
s4）用缓冲液进一步纯化外泌体颗粒；
s5）将纯化的外泌体低温存储以备后续使用。
脂肪干细胞具有高度的再生和修复能力，其分泌的外泌体自然包含了大量生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质，这些分子对皮肤再生和修复有极大的促进作用。该方法强调了外泌体的纯化和完整性，旨在获取最活跃和稳定的外泌体准备。从脂肪组织中提取脂肪干细胞，然后在培养基中培养，这确保了获得高质量、高活性的外泌体。离心和纯化步骤则进一步确保了外泌体的纯度和完整性。此外，低温存储也有助于维护其生物活性。采用此方法得到的外泌体，不仅能够在医美应用中实现高效的皮肤渗透，还能确保其有效成分在皮肤内持续释放，从而达到优化的修复和美白效果。
优选的，s4）步骤中，将s3步骤中得到的沉淀物与等体积的PBS混合后，再进行超速离心，速度范围为100,000-120,000 g，离心1小时，移除上清液后，得到沉淀物重新悬浮在等于沉淀物体积的2倍的PBS中，混合均匀，从而获得纯化的外泌体颗粒溶液。
s4步骤的超速离心和PBS重悬浮是为了确保外泌体颗粒从其他非特异性颗粒中得到精确分离。超速离心在高重力环境下将外泌体从其他微小颗粒中分离，而PBS重悬浮则为外泌体提供了一个稳定的环境，确保其在后续应用中的稳定性。这种纯化方法确保了从细胞培养中得到的外泌体颗粒具有最高的纯度和完整性，减少了可能的杂质，从而增加其在皮肤中的渗透性和持久性。经过如此纯化的外泌体颗粒在皮肤上具有更好的生物相容性，减少了可能的皮肤反应，同时其活性成分能在皮肤内更持久、更有效地释放，提供优越的医美效果。纯化的外泌体颗粒是整体方案中的核心成分，其高纯度和完整性为其他步骤和成分的添加提供了稳定的基础。当与其他医美成分结合时，这种高纯度的外泌体可以增强整体配方的功效，确保成分能够深入渗透皮肤并在所需的位置释放。
优选的，在b）步骤中的透明质酸钠溶液的浓度为1-5% w/v，并在4°C下孵育4-6小时。
透明质酸，作为天然存在于皮肤中的多糖，具有高度的保湿性和亲和性。其与外泌体颗粒的结合可能有助于形成一个保护屏障，确保外泌体颗粒的稳定性和完整性。通过选择1-5% w/v的浓度，确保了透明质酸的足够浓度以与外泌体颗粒进行有效结合。而在4°C下孵育4-6小时则有助于最大化透明质酸和外泌体颗粒之间的相互作用，增强结合的稳定性。透明质酸不仅有助于稳定外泌体颗粒，而且增加了皮肤的保湿性，从而提供双重医美效果。此外，透明质酸的添加可能进一步增强外泌体颗粒在皮肤上的渗透能力，使其更深入地渗透到皮肤中。b）步骤与整体方案中的其他成分和步骤形成协同作用。透明质酸的添加为后续添加的成分提供了一个稳定的、亲水的基底，确保其在皮肤上的均匀分布和深度渗透。
优选的，步骤d）中，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为9:1-5:5，并在4°C下孵育30分钟。
蚕丝素，作为一种天然的生物大分子，具有优良的生物相容性和形成膜的能力；小檗碱则是一种有益的化合物，具有良好的皮肤美白效果。通过调整两者的质量比，可以确保兼顾蚕丝素的保护和载体功能与小檗碱的美白效果。选择9:1-5:5的质量比为了确保蚕丝素能够有效地包裹和保护小檗碱，从而增加其稳定性。这种优化比例和孵育条件确保了小檗碱的最大释放和渗透，同时也保证了蚕丝素的载体和保护作用，从而达到了双重的医美效果。该步骤与方案中的其他成分和步骤相互配合。蚕丝素的保护作用能够确保后续添加的成分，如卵磷脂、透明质酸钠等，更好地与小檗碱结合，增强整体医美试剂的稳定性和效果。
优选的，步骤e）中的超声处理采用的频率范围为20-40 kHz，处理时间为5-10分钟。
超声处理能够通过高频震动打破脂质体的结构，使其更加纳米化，从而提高了颗粒的稳定性和渗透性。选择20-40 kHz的频率范围是因为这个范围的频率最适合产生微小的空泡效应，从而使得颗粒更加纳米化。超声处理不仅有助于提高脂质体的稳定性，还可以增加皮肤的渗透性，使得医美试剂中的有效成分能够更好地渗透到皮肤中，从而发挥更好的效果。这种特定的超声处理方式确保了整体医美试剂中的脂质体及其包含的成分达到最佳的尺寸和稳定性，从而提高了试剂的皮肤渗透性和效果。超声处理作为一个关键的步骤，与前面的成分添加和混合步骤紧密配合。超声处理确保了前面步骤中形成的脂质体及其包含的成分能够以最佳的形态存在，为后续的凝胶制备和其他成分的添加打下了坚实的基础。
优选的，在c）步骤中加入的α-熊果苷活性成分，4°C下孵育时间为2-4小时。
α-熊果苷是一种已知的美白成分，它通过抑制酪氨酸酶活性来达到其美白效果。设定特定的孵育时间可以确保α-熊果苷充分渗入并与其他成分相互作用，从而最大化其活性。孵育时间的设定确保了α-熊果苷的充分渗透和分布，使得它能在整体试剂中均匀分布，从而当试剂应用于皮肤时，α-熊果苷能够在所需区域持续、均匀地释放。
优选的，在步骤f）中，所添加的纳米丝蛋白其粒径在50-150纳米范围内，并孵育1小时。
纳米丝蛋白，因其纳米级的粒径，具有极好的表面活性和生物相容性。这种粒径的纳米丝蛋白可以提供更大的表面积与其他成分相互作用，同时因其纳米级大小，易于渗透皮肤，从而提高其活性成分的递送效率。纳米丝蛋白在此处的主要作用是作为一个载体和稳定剂，确保其他活性成分能够稳定地、持续地释放到皮肤上。此外，它们的纳米级大小还有助于提高皮肤的吸收效率。
优选的，在步骤f）中，所添加的纳米丝蛋白其粒径在80-100纳米范围内。
纳米丝蛋白因其在80-100纳米的特定粒径范围内，具备了优越的表面活性、渗透能力和生物相容性。这一特定大小的纳米丝蛋白能更好地与皮肤细胞相互作用，且能更容易穿透角质层，实现深层渗透。在此环境下，纳米丝蛋白主要充当载体和稳定剂的角色，帮助活性成分稳定地渗透至皮肤内部，增加其在皮肤上的留存时间，并提高活性成分的释放效率。
优选的，在g）步骤中制备的凝胶的pH值被调整到5.5-6.5。
皮肤的天然pH值大约在5.5左右，被称为“酸性皮肤屏障”。这一酸性环境有助于维持皮肤的屏障功能，抵御有害微生物的侵害，并维护皮肤的天然保湿因子。通过将凝胶的pH值调整至5.5-6.5的范围，该医美产品更接近皮肤的天然pH，从而确保其更好地与皮肤相容，减少可能的刺激或不良反应，同时帮助活性成分更好地渗透和作用于皮肤。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
增强美白活性并保持稳定性：通过独特的外泌体提取技术，确保了获得的外泌体颗粒具备高度的活性，与此同时，结合卵磷脂和蚕丝素-小檗碱的应用，形成外泌体包埋的脂质体，为外泌体提供了一个保护性的环境，增强其稳定性和持久性。
提高透皮吸收效率：外泌体修饰技术使得外泌体颗粒能够与透明质酸钠等物质充分结合，这种修饰使得美白成分能够更好地渗透皮肤，实现深层美白效果。
增强皮肤兼容性与安全性：结合蚕丝素-小檗碱的应用，这种独特的配方确保了美白制剂与皮肤的高度兼容性，大大降低了潜在的皮肤刺激或过敏风险。
优化制剂稳定性和触感：引入纳米丝蛋白不仅提供了额外的美白效果，还增强了制剂的整体稳定性。另外，利用羟乙基纤维素的增稠技术，提供了一种质地滑润、易于涂抹的凝胶，使得制剂在应用过程中给予用户更佳的使用体验。
本方案通过多种关键技术的结合与应用，成功解决了传统美白制剂中的多个技术问题，实现了高效、深层、稳定和安全的皮肤美白效果，为现代医美领域提供了一个技术先进的解决方案。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。当然，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
a）干细胞外泌体颗粒提取：将干细胞在培养液中培养，离心后获得外泌体颗粒；从脂肪组织中提取脂肪干细胞；将提取的脂肪干细胞在专用培养基中培养至适当的生长密度；收集培养上清液并进行离心，得到沉淀物； 得到的沉淀物与等体积的PBS混合后，再进行超速离心，速度为110,000 g，离心1小时，移除上清液后，得到沉淀物重新悬浮在等于沉淀物体积的2倍的PBS中，混合均匀，从而获得纯化的外泌体颗粒溶液；将纯化的外泌体低温存储以备后续使用。
b）用透明质酸钠溶液对干细胞外泌体颗粒进行修饰：将提取到的外泌体颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，外泌体颗粒与透明质酸钠溶液体积比为1:3，透明质酸钠溶液的浓度为4% w/v，并在4°C下孵育5小时。
c）加入α-熊果苷活性成分：向步骤b）混合液中加入1.5% (w/v)的α-熊果苷混合孵育，4°C下孵育时间为3小时。
d）加入卵磷脂溶液和蚕丝素-小檗碱溶液形成外泌体包埋的脂质体：向步骤c）混合液中加入8% w/v的卵磷脂和1.5% w/v的蚕丝素-小檗碱溶液，混合孵育，混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.08，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.02，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为7:3，并在4°C下孵育30分钟。
e）将步骤d）得到的混合液进行超声处理；超声处理采用的频率范围为30 kHz，处理时间为10分钟。
f）加入纳米丝蛋白：向超声处理后的混合液中加入纳米丝蛋白混合孵育，添加的量为超声处理后的混合液总量的1-3% (w/v)，纳米丝蛋白其粒径在90纳米，并孵育1小时。
g）制备凝胶，得到美白试剂：添加羟乙基纤维素作为增稠剂混合孵育，制成凝胶，加入的羟乙基纤维素的量为混合液总量的1%，冷藏保存，凝胶的pH值被调整到6。
实施例2：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，d）混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.05。
实施例3：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，d）混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.06。
实施例4：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.01。
实施例5：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.03。
实施例6：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为9:1。
实施例7：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为5:5。
实施例8：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，纳米丝蛋白其粒径在80纳米。
实施例9：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，纳米丝蛋白其粒径在100纳米。
实施例10：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，纳米丝蛋白其粒径在50纳米。
实施例11：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，纳米丝蛋白其粒径在150纳米。
实施例12：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
a）干细胞外泌体颗粒提取：将干细胞在培养液中培养，离心后获得外泌体颗粒；从脂肪组织中提取脂肪干细胞；将提取的脂肪干细胞在专用培养基中培养至适当的生长密度；收集培养上清液并进行离心，得到沉淀物； 得到的沉淀物与等体积的PBS混合后，再进行超速离心，速度为110,000 g，离心1小时，移除上清液后，得到沉淀物重新悬浮在等于沉淀物体积的2倍的PBS中，混合均匀，从而获得纯化的外泌体颗粒溶液；将纯化的外泌体低温存储以备后续使用。
b）用透明质酸钠溶液对干细胞外泌体颗粒进行修饰：将提取到的外泌体颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，外泌体颗粒与透明质酸钠溶液体积比为1:2，透明质酸钠溶液的浓度为1% w/v，并在4°C下孵育4小时。
c）加入α-熊果苷活性成分：向步骤b）混合液中加入0.5% (w/v)的α-熊果苷混合孵育，4°C下孵育时间为2小时。
d）加入卵磷脂溶液和蚕丝素-小檗碱溶液形成外泌体包埋的脂质体：向步骤c）混合液中加入5% w/v的卵磷脂和1% w/v的蚕丝素-小檗碱溶液，混合孵育，混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.05，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.01，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为9:1，并在4°C下孵育30分钟。
e）将步骤d）得到的混合液进行超声处理；超声处理采用的频率范围为20 kHz，处理时间为5分钟。
f）加入纳米丝蛋白：向超声处理后的混合液中加入纳米丝蛋白混合孵育，添加的量为超声处理后的混合液总量的1% (w/v)，纳米丝蛋白其粒径在50纳米，并孵育1小时。
g）制备凝胶，得到美白试剂：添加羟乙基纤维素作为增稠剂混合孵育，制成凝胶，加入的羟乙基纤维素的量为混合液总量的1%，冷藏保存，凝胶的pH值被调整到5.5。
实施例13：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
a）干细胞外泌体颗粒提取：将干细胞在培养液中培养，离心后获得外泌体颗粒；从脂肪组织中提取脂肪干细胞；将提取的脂肪干细胞在专用培养基中培养至适当的生长密度；收集培养上清液并进行离心，得到沉淀物；得到的沉淀物与等体积的PBS混合后，再进行超速离心，速度为120,000 g，离心1小时，移除上清液后，得到沉淀物重新悬浮在等于沉淀物体积的2倍的PBS中，混合均匀，从而获得纯化的外泌体颗粒溶液；将纯化的外泌体低温存储以备后续使用。
b）用透明质酸钠溶液对干细胞外泌体颗粒进行修饰：将提取到的外泌体颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，外泌体颗粒与透明质酸钠溶液体积比为1:5，透明质酸钠溶液的浓度为5% w/v，并在4°C下孵育6小时。
c）加入α-熊果苷活性成分：向步骤b）混合液中加入2% (w/v)的α-熊果苷混合孵育，4°C下孵育时间为5小时。
d）加入卵磷脂溶液和蚕丝素-小檗碱溶液形成外泌体包埋的脂质体：向步骤c）混合液中加入10% w/v的卵磷脂和3% w/v的蚕丝素-小檗碱溶液，混合孵育，混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.1，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.03，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为5:5，并在4°C下孵育30分钟。
e）将步骤d）得到的混合液进行超声处理；超声处理采用的频率范围为40 kHz，处理时间为10分钟。
f）加入纳米丝蛋白：向超声处理后的混合液中加入纳米丝蛋白混合孵育，添加的量为超声处理后的混合液总量的3% (w/v)，纳米丝蛋白其粒径在150纳米，并孵育1小时。
g）制备凝胶，得到美白试剂：添加羟乙基纤维素作为增稠剂混合孵育，制成凝胶，加入的羟乙基纤维素的量为混合液总量的2%，冷藏保存，凝胶的pH值被调整到6.5。
对比例1：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤b）中，不添加透明质酸钠溶液，直接进入步骤c）。
对比例2：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤c）中，不添加α-熊果苷，而是继续步骤d）。
对比例3：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤d）中，不加入卵磷脂和蚕丝素-小檗碱溶液，直接进入步骤e）。
对比例4：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤e）中，省略超声处理，直接进入步骤f）。
对比例5：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤a）中，省略超速离心纯化步骤。
对比例6：一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
实验步骤与实施例1相同，区别在于，在步骤d）中，不加入蚕丝素-小檗碱溶液。
1、生物活性稳定性测试：
细胞培养：将角质细胞种植在96孔板中，每孔约有5,000~10,000细胞，然后将其放在细胞培养箱中，培养24小时，直至细胞完全附着；
添加样品：向每孔中加入测试样品；
细胞再培养：继续培养24-48小时；
MTT添加：向每孔中加入10μl的MTT试剂，然后将孔板放回细胞培养箱中继续培养4小时；
溶解甲基噻唑蓝晶体：用吸头仔细除去每孔中的培养基，然后加入100μl DMSO，摇匀，使生成的甲基噻唑蓝晶体完全溶解；
读取吸光值：使用酶标仪在570nm处读取吸光值。
活性率的方法：
活性率(%)=(测试样品的吸光值/对照组的吸光值)×100%。
2、透皮吸收效率预测试：
准备Strat-M膜：取出一片合成皮肤膜，将其放置在容器或培养皿中；
涂抹样品：使用微量移液器，均匀地将含有美白成分的外泌体样品涂抹在Strat-M膜的上表面；
等待：在室温下，样品在合成皮肤膜上干燥并渗透2h；
取样分析：取下合成皮肤膜，将其浸泡在溶解液中，以释放吸附在膜内的药物。振荡后取溶解液进行药物浓度分析；
计算美白成分的透皮吸收速率：
透皮吸收率(%)=(初始涂抹的美白成分总量/从溶解液中测得的美白成分量)×100。
3、美白效果测试：
将黑色素细胞种植在96孔板中；
向每孔中加入测试样品；
培养细胞24小时。
向每孔中加入L-DOPA并继续培养1小时。
使用酶标仪在475nm处读取吸光值。
吸光值变化率的计算公式为：
变化率(%)=[(处理组的吸光值−对照组的吸光值)/对照组的吸光值]×100%。
对照组：黑色素细胞 + L-DOPA (不包括测试样品)。
处理组：黑色素细胞 + L-DOPA + 测试样品。
表1 测试数据表
实施例1与对比例1表明，透明质酸钠对外泌体颗粒的修饰增强了外泌体的稳定性，提高了长时间保存的可行性，并增强了外泌体与皮肤的亲和力，从而增强了其渗透吸收的效果。由于缺少了透明质酸的修饰，对比例1中的外泌体相对不够稳定，容易受到环境因素的影响，从而导致活性下降；透明质酸能够增强外泌体与皮肤的亲和性，使得外泌体更容易被皮肤吸收，透明质酸具有出色的保湿能力，当它与α-熊果苷一起使用时，可以帮助锁住水分，提供更好的皮肤水润状态，使皮肤对α-熊果苷的吸收更为理想，此外，湿润的皮肤环境有助于活性成分更深入地渗透到皮肤内，其缺失在美白方面的效果也会受到影响。
实施例1与对比例2比较，α-熊果苷是一个天然存在的化合物，能够抑制酪氨酸酶活性。酪氨酸酶是参与黑色素合成过程的关键酶，其活性的抑制会导致黑色素生成的减少，从而实现皮肤美白的效果；由于缺乏α-熊果苷这一关键成分，对比例2可能仍然具有某种皮肤修复和再生能力，但在美白效果上明显不足。
实施例1-7、对比例3、6比较说明，卵磷脂是一种天然的磷脂，广泛存在于细胞膜中。卵磷脂在水中能形成双层脂质体，与外泌体有相似的双层结构，这使得它可以作为一种载体，帮助其他成分如α-熊果苷更好地穿透皮肤，由于它的两亲性特点，卵磷脂可以帮助稳定这种复杂的配方，尤其是在涉及到外泌体这种脂质性质的组件时，作为一种天然成分，卵磷脂还能增强皮肤对配方的生物相容性，减少刺激性。
蚕丝素是一种蛋白质，小檗碱是一种生物碱。它们的结合可能在液态配方中形成一种稳定的结构网络，这有助于维持外泌体的完整性和稳定性。蚕丝素-小檗碱的添加可能增强了产品的皮肤渗透性，小檗碱可能有助于增强α-熊果苷的美白效果，蚕丝素则有助于提供一种柔滑的触感和增加皮肤的保湿效果。对比例3（没有加入卵磷脂和蚕丝素-小檗碱）的活性变化、透皮吸收率和美白吸光值变化与实施例1相比都有所下降，这清晰地显示了这两种成分的重要性。
实施例1与对比例4比较，超声波可以导致物质中的气泡迅速膨胀和收缩，这种现象称为空化。强烈的空化效应会破裂细胞壁和细胞膜，这增加提取细胞内容物和增加物质的透皮吸收性，超声处理能增加皮肤的渗透性，使得更多的活性成分能够穿透皮肤屏障，超声波可以促进不同成分之间的混合，尤其是那些难以混合的液体。这有助于形成更稳定的悬浮液或乳液，从而提高产品的稳定性和效果，超声波的空化效应可以产生高温和高压的微环境，这可能有助于某些化学和生物反应的进行，从而增强试剂的活性。超声波可以打散团聚在一起的微粒或分子，使得混合液中的分布更加均匀。这对于提高活性成分的释放和吸收是非常重要的。
实施例1和实施例10、11比较，粒径的变化会影响试剂的稳定性，较大的粒径可能增加试剂的稳定性，但会减少其生物利用度和渗透性，导致缓慢的释放；太小的粒径会导致快速的扩散和浅表吸收，而不是深层吸收，更容易发生聚集或沉淀，这可能导致药物释放不均匀或存储稳定性降低。
实施例1和对比例5比较，超速离心纯化步骤显然对干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂的效果有显著的影响。通过纯化可以更有效地提取外泌体颗粒，同时减少不需要的杂质，这可能有助于提高外泌体的活性和透皮吸收率；纯化后的外泌体颗粒在皮肤美白方面的效果更好，这与外泌体颗粒的纯度和质量有关。高纯度的外泌体可能更多的有效成分，因此在皮肤美白方面的效果更佳；纯化的外泌体颗粒更容易被皮肤吸收，这与外泌体颗粒的大小、形状和表面性质有关，纯化过程可能有助于优化这些参数，从而提高透皮吸收率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂，由以下步骤制备：
a）干细胞外泌体颗粒提取：将干细胞在培养液中培养，离心后获得外泌体颗粒；
b）用透明质酸钠溶液对干细胞外泌体颗粒进行修饰：将提取到的外泌体颗粒与透明质酸钠溶液混合孵育，外泌体颗粒与透明质酸钠溶液体积比为1:2 - 1:5，透明质酸钠溶液的浓度为1-5% w/v，并在4°C下孵育4-6小时；
c）加入α-熊果苷活性成分：向步骤b）混合液中加入0.5-2% (w/v)的α-熊果苷混合孵育，4°C下孵育时间为2-4小时；
d）加入卵磷脂溶液和蚕丝素-小檗碱溶液形成外泌体包埋的脂质体：向步骤c）混合液中加入5-10% w/v的卵磷脂和1-3% w/v的蚕丝素-小檗碱溶液，混合孵育，混合液与卵磷脂溶液的体积比为1:0.05-1:0.1，混合液与蚕丝素-小檗碱溶液体积比为1:0.01-1:0.03，蚕丝素-小檗碱溶液中，蚕丝素与小檗碱的质量比为9:1-5:5，并在4°C下孵育30分钟；
e）将步骤d）得到的混合液进行超声处理，超声处理采用的频率范围为20-40 kHz，处理时间为5-10分钟；
f）加入纳米丝蛋白：向超声处理后的混合液中加入纳米丝蛋白混合孵育，添加的量为超声处理后的混合液总量的1-3% (w/v)，所添加的纳米丝蛋白其粒径在50-150纳米范围内，并孵育1小时，所添加的纳米丝蛋白其粒径在80-100纳米范围内；
g）制备凝胶，得到美白试剂：添加羟乙基纤维素作为增稠剂混合孵育，制成凝胶，加入的羟乙基纤维素的量为混合液总量的0.5-2%，冷藏保存，凝胶的pH值被调整到5.5-6.5，
所述干细胞为脂肪干细胞，包括以下步骤：
s1）从脂肪组织中提取脂肪干细胞；
s2）将提取的脂肪干细胞在专用培养基中培养至适当的生长密度；
s3）收集培养上清液并进行离心，得到沉淀物；
s4）用缓冲液进一步纯化外泌体颗粒，将s3步骤中得到的沉淀物与等体积的PBS混合后，再以100,000-120,000 g进行超速离心，离心1小时，移除上清液后，得到沉淀物重新悬浮在等于沉淀物体积的2倍的PBS中，混合均匀，从而获得纯化的外泌体颗粒溶液；
s5）将纯化的外泌体低温存储以备后续使用。
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