CN114533587A - 一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 - Google Patents
一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114533587A CN114533587A CN202111510797.6A CN202111510797A CN114533587A CN 114533587 A CN114533587 A CN 114533587A CN 202111510797 A CN202111510797 A CN 202111510797A CN 114533587 A CN114533587 A CN 114533587A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- exosome
- solution
- kda
- compounded
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 103
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 101
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 101
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 84
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 80
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 38
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 35
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 31
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 27
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 8
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000013329 compounding Methods 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 101000623895 Bos taurus Mucin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 abstract description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 abstract description 2
- 239000004519 grease Substances 0.000 abstract description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 abstract description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 abstract description 2
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 3
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 230000007234 antiinflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
- A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
- A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
- A61K8/982—Reproductive organs; Embryos, Eggs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/82—Preparation or application process involves sonication or ultrasonication
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法，通过科学配比透明质酸与经破碎外泌体，锁住水分及有效成分从而增强吸收作用，显著增效透过皮肤屏障，同时经超声破碎外泌体中富含油脂，包括磷脂膜，胆固醇，鞘脂类等，这些脂质成分与小分子透明质酸相互融合，与透明质酸水溶液形成微乳化体系，增加了复合溶液的亲肤性及透过性本发明透明质酸主要为中低分子量，可包裹经破碎的外泌体活性成分有效渗入皮肤，给予皮肤补水保湿的同时更有助于提高皮肤的紧致度，长期使用不仅安全，更可以促进皮肤基底成纤维细胞增殖及胶原蛋白的高表达，从而达到抗衰功效。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品生物技术领域，尤其涉及到一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液的制备方法。
背景技术
透明质酸又叫玻尿酸(hyaluronan,hyaluronic acid,HA)是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖。天然透明质酸的双糖单元由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D- 葡萄糖胺构成，分子量最低约800Da，最高可达107Da。不同分子量的透明质酸其作用也不同，寡聚透明质酸是分子量小于10Kda的透明质酸分子，小于 50个单糖结构，只有寡聚透明质酸才可进入真皮层内部，发挥全方位的保湿效果，长期使用具有抗衰老和去除皱纹的作用。
人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stemcell-exosomes，hUCMSC-EXOs)是由人脐带间充质干细胞分泌的细胞内多胞体和细胞膜融合后释放到细胞外基质的，直径在30-120nm，带有多蛋白标记物的膜囊泡。外泌体中含有多种生物活性蛋白质，DNA和RNA是细胞和细胞信传递的主要载体，在细胞间通信过程中发挥重要作用。同时，大量的生物活性分子的脂质双分子层囊泡物质具有类似信号分子的功能，能引起一系列的生物反应，渗透入皮肤深层可以促进组织损伤修复，抗炎症反应调节，免疫抑制以及神经保护作用等。
现有的透明质酸复合外泌体技术中，涉及到透明质酸分子量的添加组成方面鲜有介绍，更加侧重于透明质酸的化学改性以及作为包裹性材料去缓释外泌体，未有研究不同分子量透明质酸对外泌体的透皮促吸收作用，以及二者对皮肤抗衰性的协同作用。
存在的缺点及原因：
1、经过化学改性的透明质酸，虽然在应用中性质有所提升，但是带来的化学试剂残留也是无法避免的，会存在明显的安全问题或潜在的安全隐患。并且改性的透明质酸在结构上不同于天然透明质酸，可能会存在皮肤相容性问题。
2、粗糙的透明质酸添加，未考虑到不同分子量的配比，在透皮吸收作用上以及对皮肤的修复作用上无法发挥其最佳效果。
3、透明质酸复配外泌体的研究很多都停留在损伤修复的层面上，鲜有在皮肤除皱上的应用。
发明内容
为解决上述存在的问题，本发明提供一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法，能显著提高小麦对除草剂的耐药性，扩大其应用范围和效力。具体技术方案如下：
一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，包括包括组分一和组分二；
所述组分一为透明质酸溶液；
所述组分二为人脐带间充质干细胞外泌体；
所述组分一的重量份为99.75～99.85份；
所述组分二的重量份为0.15～0.25份。
作为进一步优选的技术方案的，所述透明质酸溶液为多种分子量的透明质酸溶解于PBS-NaCl缓冲液制得，该透明质酸溶液按重量份包括：
分子量为5kDa～10kDa的透明质酸：0.1～1.0份；
分子量为10kDa～200kDa的透明质酸：0.05～0.5份；
分子量为200kDa～500kDa的透明质酸：0.01～0.2份；
分子量为500kDa～2000kDa的透明质酸：0.01～0.1份
PBS-NaCl缓冲液98.2～99.83份。
作为进一步优选的技术方案的，所述透明质酸溶解于PBS-NaCl缓冲液，各分子量透明质酸与PBS-NaCl缓冲液的比例为5kDa～10kDa：10kDa～200kDa： 200kDa～500kDa：500kDa～2000kDa：PBS-NaCl缓冲液为0.1～1.0份：0.05～0.5 份：0.01～0.2份：0.01～0.1份：99.83～98.2份。
前所述的一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液的制备方法，包括的步骤为：
步骤(A)、制备透明质酸溶液；
步骤(B)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，得到处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
步骤(C)、复配抗衰原液。
作为进一步优选的技术方案的，步骤(A)、制备透明质酸溶液的具体步骤如下，
步骤(A1)、制备PBS-NaCl缓冲液；
步骤(A11)、称取氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；
步骤(A12)、加水搅拌溶解；
步骤(A13)、加入1M盐酸调节pH至6.5～7.5，定容即可；
步骤(A2)、将多种分子量的透明质酸溶解于PBS-NaCl缓冲液中，得到透明质酸溶液。
作为进一步优选的技术方案的，步骤(B)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，将其多次离心的具体步骤如下，
步骤(B1)、取培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；
步骤(B2)、将步骤(B1)中第一次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；
步骤(B3)、将步骤(B2)中第二次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；
步骤(B4)、将步骤(B3)中第三次离心后的细胞培养液进行离心，取沉淀；
步骤(B5)、将步骤(B4)中得到的沉淀用PBS-NaCl缓冲液进行清洗并离心，此时取底部沉淀，该沉淀即为制得的外泌体。
作为进一步优选的技术方案的，所述处理后的人脐带间充质干细胞外泌体处理方法，包括以下步骤：
步骤(C)、复配抗衰原液的具体步骤如下，
步骤(C1)、将步骤(B)中得到的处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用PBS-NaCl缓冲液复溶再进行超声破碎，得到离心超声后的外泌体；
步骤(C2)、将步骤(C1)中离心超声制得的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，对该溶液进行无菌化处理，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
作为进一步优选的技术方案的，所述氯化钠：氯化钾：十二水合磷酸氢二钠：磷酸二氢钾：水的比例为0.8份：0.02份：0.363份：0.024份：98.793 份。
作为进一步优选的技术方案的，(步骤B1)中离心力为250～350×g，离心时间为5～15min；步骤(B2)中离心力为1500～2500×g，离心时间为5～15min；步骤(B3)中离心力为8000～12000×g，离心时间为25～35min；步骤(B4) 中的离心力为8000～12000×g，离心时间为60～80min；步骤(B5)中的离心力为80000～120000×g，离心时间为60～80min。
作为进一步优选的技术方案的，步骤(C1)中超声条件中的功率为 600～800w，超声时间为4.5～5.5s，超声间隔为1.5～2.5s，持续时长为15～25min。
作为进一步优选的技术方案的，步骤(C2)中无菌化处理是用0.2微米滤膜进行处理的，透明质酸-外泌体混合溶液中外泌体浓度为1.5～2.5mg/mL
本发明的有益效果是：
1.本发明的抗衰产品通过科学配比透明质酸与经破碎外泌体，小分子透明质酸可以渗透吸收，中分子及大分子易形成保护膜，锁住水分及有效成分从而增强吸收作用，二者可以互相显著增效透过皮肤屏障。经超声破碎外泌体中富含油脂，包括磷脂膜，胆固醇，鞘脂类等，这些脂质成分与小分子透明质酸相互融合，与透明质酸水溶液形成微乳化体系，增加了复合溶液的亲肤性及透过性。
2.透明质酸和人脐带间充质干细胞外泌体的复配产品可以有效持续地改善人体皮肤的紧致程度，起到更好的协同抗衰作用。由于人脐带间充质干细胞外泌体经破碎后包含多种脂质成分，细胞因子及信号肽，脂质成分和小分子透明质酸的透过和吸收填充了真皮及皮下组织，细胞因子起到了刺激细胞再生，信号肽则调节细胞分泌。
附图说明
图1为本发明实施例的抗衰效果对比示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1～3为配制透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，实施例4为效果例。
实施例1
在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1M盐酸调节pH至7，定容至 1000ml，制得PBS-NaCl缓冲液备用；
依次称取5克、3克、0.8克和0.6克分子量分别为5kDa～10kDa、 10kDa～200kDa、200kDa～500kDa和500kDa～2000kDa的透明质酸，将其加入至PBS-NaCl缓冲液中，充分混匀搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
取2.3g培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 300×g，离心时间为10min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为2000×g，离心时间为10min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为10000×g，离心时间为30min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为10000 ×g，离心时间为70min，取沉淀并用PBS缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为100000×g，离心时间为70min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用PBS-NaCl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为600w，超声时间为4.5s，超声间隔为0.5s，持续时长为15min，得到离心超声后的外泌体；
将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 1.5mg/mL，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
实施例2
在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1M盐酸调节pH至7，定容至 1000ml，制得PBS-NaCl缓冲液备用；
依次称取4.5克、2.5克、0.8克和0.6克分子量分别为5kDa～10kDa、 10kDa～200kDa、200kDa～500kDa和500kDa～2000kDa的透明质酸，将其加入至PBS-NaCl缓冲液中，充分混匀搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
取2.0培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 260×g，离心时间为6min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为1600×g，离心时间为6min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为9000×g，离心时间为26min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为9000×g，离心时间为66min，取沉淀并用PBS缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为90000×g，离心时间为66min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用PBS-NaCl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为700w，超声时间为5s，超声间隔为2s，持续时长为20min，得到离心超声后的外泌体；
将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 2mg/mL，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
实施例3
在容器中，加入氯化钠8克、氯化钾0.24克、十二水合磷酸氢二钠1.44 克、磷酸二氢钾0.24克，加800ml水溶解，以1M盐酸调节pH至7，定容至 1000ml，制得PBS-NaCl缓冲液备用；
依次称取4克、3.2克、0.7克和0.5克分子量分别为5kDa～10kDa、 10kDa～200kDa、200kDa～500kDa和500kDa～2000kDa的透明质酸，将其加入至PBS-NaCl缓冲液中，充分混匀搅拌直至完全溶解程透明状，得到透明质酸溶液；
取1.8g培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，离心力为 340×g，离心时间为14min，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；将第一次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为2400×g，离心时间为14min，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；将第二次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为11000×g，离心时间为34min，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；将第三次离心后的细胞培养液进行离心，离心力为11000 ×g，离心时间为77min，取沉淀并用PBS缓冲液进行清洗，再次离心，离心力为110000×g，离心时间为76min，此时取底部沉淀，该沉淀即为处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
将处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用PBS-NaCl缓冲液复溶再进行超声破碎，超声条件中的功率为800w，超声时间为5.5s，超声间隔为2.5s，持续时长为25min，得到离心超声后的外泌体；
将离心超声后的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，用0.2微米滤膜对该溶液进行无菌化处理，使得外泌体浓度为 2.5mg/mL，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
实施例4效果例
本实施例是对实施例1～3配制的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液通过 Franz扩散池法，测定透明质酸及外泌体特征蛋白在乳猪腹部皮肤的透过率，来评价复配产品的透皮吸收效果，猪皮经去毛洗净，剪成2.5cm正方形于pH7.4 磷酸盐缓冲液中平衡30smin，角质层朝上放入Franz扩散池，将扩散池转移至透皮扩散仪中，32℃，250r/min搅拌30min，测定接收液中和猪皮中的透明质酸及外泌体特征蛋白含量，计算透过率。
透明质酸水解后生产葡萄糖醛酸与咔唑试剂发生显色反应，故测定葡萄糖醛酸(GA)含量来计算透明质酸含量；经破碎外泌体则检测其中胆固醇含量来反映外泌体中脂质的透过效果。
Franz扩散池法，模拟复配溶液在猪皮中的透皮吸收效果，结果如下如表 1所示：
表1复配样品中透明质酸在Franz扩散池中的透过率
表2复配样品中外泌体在Franz扩散池中的透过率
由表1和表2数据看出，透明质酸对照吸收率为33.7％，外泌体溶液对照吸收率为30.7％，而复配溶液中透明质酸平均吸收率为39.4％，复配溶液中外泌体的平均吸收率为56.9％。复配溶液中组分吸收率要明显高出单独组分对照，且复配溶液中外泌体的吸收率得到大幅提高，说明透明质酸可促进人脐带间充质干细胞外泌体超声破碎液的吸收效果。
经临床测试，每天局部涂抹0.2mL，总共涂抹56天，第0/14/28/56天拍摄抗衰效果图片，结果如图1所示，由图1可以看出，复配溶液具有显著的抗衰效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：包括组分一和组分二；
所述组分一为透明质酸溶液；
所述组分二为人脐带间充质干细胞外泌体；
所述组分一的重量份为99.75～99.85份；
所述组分二的重量份为0.15～0.25份。
2.根据权利要求1所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：所述透明质酸溶液为多种分子量的透明质酸溶解于PBS-NaCl缓冲液制得，该透明质酸溶液按重量份包括：
分子量为5kDa～10kDa的透明质酸：0.1～1.0份；
分子量为10kDa～200kDa的透明质酸：0.05～0.5份；
分子量为200kDa～500kDa的透明质酸：0.01～0.2份；
分子量为500kDa～2000kDa的透明质酸：0.01～0.1份；
PBS-NaCl缓冲液98.2～99.83份。
3.根据权利要求1～2任意一项所述的一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液的制备方法，其特征在于：
步骤(A)、制备透明质酸溶液；
步骤(B)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，得到处理后的人脐带间充质干细胞外泌体；
步骤(C)、复配抗衰原液。
4.根据权利要求3所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤(A)、制备透明质酸溶液的具体步骤如下，
步骤(A1)、制备PBS-NaCl缓冲液；
步骤(A11)、称取氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；
步骤(A12)、加水搅拌溶解；
步骤(A13)、加入1M盐酸调节pH至6.5～7.5，定容即可；
步骤(A2)、将多种分子量的透明质酸溶解于PBS-NaCl缓冲液中，得到透明质酸溶液。
5.根据权利要求3所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤(B)、处理人脐带间充质干细胞外泌体，得到处理后的人脐带间充质干细胞外泌体的具体步骤如下，
步骤(B1)、取培养好的人脐带间充质干细胞培养液并将其进行离心，取上清液，得到第一次离心的细胞培养液；
步骤(B2)、将步骤(B1)中第一次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第二次离心的细胞培养液；
步骤(B3)、将步骤(B2)中第二次离心后的细胞培养液进行离心，取上清液，得到第三次离心的细胞培养液；
步骤(B4)、将步骤(B3)中第三次离心后的细胞培养液进行离心，取沉淀；
步骤(B5)、将步骤(B4)中得到的沉淀用PBS-NaCl缓冲液进行清洗并离心，此时取底部沉淀，该沉淀即为制得的外泌体。
6.根据权利要求3所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤C、复配抗衰原液的具体步骤如下，
步骤(C1)、将步骤(B)中得到的处理后的人脐带间充质干细胞外泌体用PBS-NaCl缓冲液复溶再进行超声破碎，得到离心超声后的外泌体；
步骤(C2)、将步骤(C1)中离心超声制得的外泌体加入到透明质酸溶液中，得到透明质酸-外泌体混合溶液，对该溶液进行无菌化处理，得到透明质酸与外泌体复配的抗衰原液。
7.根据权利要求4所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：所述氯化钠：氯化钾：十二水合磷酸氢二钠：磷酸二氢钾：水的比例为0.8份：0.02份：0.363份：0.024份：98.793份。
8.根据权利要求5所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤(B1)中离心力为250～350×g，离心时间为5～15min；步骤(B2)中离心力为1500～2500×g，离心时间为5～15min；步骤(B3)中离心力为8000～12000×g，离心时间为25～35min；步骤(B4)中的离心力为8000～12000×g，离心时间为60～80min；步骤(B5)中的离心力为80000～120000×g，离心时间为60～80min。
9.根据权利要求6所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤(C1)中超声条件中的功率为600～800w，超声时间为4.5～5.5s，超声间隔为1.5～2.5s，持续时长为15～25min。
10.根据权利要求6所述的透明质酸与外泌体复配的抗衰原液，其特征在于：步骤(C2)中无菌化处理是用0.2微米滤膜进行处理的，透明质酸-外泌体混合溶液中外泌体浓度为1.5～2.5mg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510797.6A CN114533587A (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510797.6A CN114533587A (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114533587A true CN114533587A (zh) | 2022-05-27 |
Family
ID=81669639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111510797.6A Pending CN114533587A (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114533587A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116898791A (zh) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂 |
-
2021
- 2021-12-10 CN CN202111510797.6A patent/CN114533587A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116898791A (zh) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂 |
| CN116898791B (zh) * | 2023-09-14 | 2023-12-15 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种利用干细胞外泌体进行皮肤美白的医美试剂 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110721116A (zh) | 一种透明质酸防雾霾保湿组合物及其应用 | |
| CN110812270B (zh) | 一种用于水光注射的透明质酸凝胶组合物及其制备方法 | |
| CN113768819B (zh) | 一种含阳离子透明质酸的保湿抗衰老化妆品组合物的制备方法 | |
| CN112656713A (zh) | 一种含透明质酸和/或其衍生物的美容组合物及其制备方法和用途 | |
| CN110339398A (zh) | 一种含氨基酸透明质酸钠注射剂及其制备方法 | |
| CN116019978B (zh) | 一种微交联透明质酸钠-重组胶原蛋白复合凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN114533587A (zh) | 一种透明质酸与外泌体复配的抗衰原液及其制备方法 | |
| NZ585699A (en) | Mixed butyric-formic esters of acid polysaccharides, and their preparation and use as skin cosmetics | |
| CN114931666B (zh) | 一种用于面部填充的透明质酸-胶原蛋白复合交联微球的制备方法 | |
| Graciela et al. | Hyaluronic Acid—Extraction Methods, Sources and Applications | |
| CN117482034A (zh) | 一种人体脂肪干细胞制备剂与应用 | |
| JP2004210895A (ja) | 免疫機能を有する可能性β−グルカンの製造方法及び用途 | |
| CN116687800A (zh) | 一种注射用透明质酸钠复合溶液及其制备方法 | |
| CN105820267A (zh) | 一种皮肤创面修复制剂及其制备方法和应用 | |
| CN114146018B (zh) | 保湿抗衰Polypeptides组合物、制备方法及含有其的面霜 | |
| CN115161207A (zh) | 半乳糖酵母液的制备方法、半乳糖酵母粉及在亮肤淡化皱纹的应用 | |
| CN115637279A (zh) | 一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN101554363A (zh) | 珍珠胶原蛋白防晒化妆品及其制备方法 | |
| JP3982937B2 (ja) | 化粧料 | |
| JPH08198725A (ja) | 皮膚用化粧品及び頭髪用化粧品 | |
| CN114681386A (zh) | 一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏制剂中的应用 | |
| JPH07285871A (ja) | 活性酸素抑制剤 | |
| EP1407759B1 (en) | A cosmetic composition in colloidal form comprising hyaluronic acids and chitosan | |
| GB2226002A (en) | Stabilisation process for hydrated lipid lamellar phases | |
| JP3172599B2 (ja) | 細胞賦活剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220527 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |