CN102485213A

CN102485213A - 伊立替康脂质体及其制备方法

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Publication number: CN102485213A
Application number: CN2010105699141A
Authority: CN
Inventors: 邓意辉; 李哲
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2012-06-06

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及伊立替康脂质体及其制备方法，该方法制备的脂质体能够制备过程中控制乙醇含量，且能确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。本发明采用改良乙醇注入法制备伊立替康脂质体，膜材组成为磷脂或（及）其它成分。并通过如下方法制备：配置水化介质于45~75℃保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45~75℃溶解脂质相；将水化介质按照一定速度加入至脂质相中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体；按照梯度载药法即可。本发明能够合理控制制备过程中残留的乙醇量，脂质体理化性质与疗效无显著性变化。

Description

伊立替康脂质体及其制备方法

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及伊立替康脂质体及其制备方法，该方法制备的脂质体能够制备过程中控制乙醇含量，且能确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。

背景技术：

盐酸伊立替康（irinotecan hydrochloride，CPT-11）为喜树碱的半合成衍生物，它是治疗转移性结直肠癌的有效药物，对氟尿嘧啶耐药病例仍有效，对结肠癌、小细胞肺癌、白血病疗效显著，现有的CPT-11注射剂存在半衰期短，骨髓抑制和胃肠道功能紊乱的缺点。为了增强药物的靶向性，延长体内滞留时间，增强疗效，降低毒性，美国 PharmaEngine 公司研发了CPT-11脂质体注射液，目前正在进行Ⅱ期临床试验。在台湾进行的Ⅰ期临床试验结果表明， CPT-11脂质体注射液对晚期顽固性肿瘤受试者呈现出良好的有效性、耐受性和药代动力学特性。

一般而言，脂质体是由磷脂分子悬浮在水溶液中聚集形成的，磷脂膜为对称双分子膜，分子间为弱相互作用(疏水相互作用、范德华力、氢键等)，磷脂分子间排列紧密, 碳氢链高度有序, 膜流动性小，但常因温度、pH值和含水量等因素的变化发生相变和相分离。当发生凝胶相→液晶相相变，膜分子间隔加大，流动性和通透性显著增加；当发生凝胶相→六角相相分离, 膜上形成孔洞或发生膜融合, 所载药物迅速渗漏。在制备脂质体时，常常采用乙醇作为溶媒溶解脂质，乙醇能诱导流动磷脂的酰基链无序化，也形成一个交错凝胶相，它使脂质膜的离子半径、分子间范德华力、静电力大小发生变化，对膜的结构有一定的影响。

远距离来说，脂质体间存在范德华力和静电排斥力；当两表面接触很近时，1-3nm，脂质体间存在水合力，一种强烈的排斥力，超过范德华力和静电斥力成为主导作用。水合力是水分子与磷脂的亲水基团作用，可阻止脂质体膜间的聚集。当有高浓度乙醇存在时，水分子就被乙醇分子取代，其吸附于膜表面，或者分布在膜的疏水区。这种取代使脂质体表面的水合层消失，引起DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）脂质体的聚集。但对于EPC（蛋黄卵磷脂）脂质体，没有观察到聚集现象，表明单是水合力的消失并不能引起脂质体的聚集，可能还存在其他引起脂质体聚集的因素。脂质体发生聚集/融合是为了分散由其分子排列结构混乱带来的过多的表面能，以达到稳定状态。

Hiroaki 等研究乙醇对大单室脂质体（直径大约170 nm）渗透性的影响，证明乙醇引起交错相形成，含有交错相和非交错相的相分离导致脂质膜的渗透性增加。乙醇引起了侧向相分离，导致卵磷脂/磷脂酰乙醇胺脂质体膜的渗透性增加。由于脂质体的制备过程中乙醇会对脂质体膜结构产生影响，过多的乙醇易造成脂质体的聚集、双分子层融合以及药物的渗漏，从而影响脂质体的包封率，粒径及稳定性等。已有的专利“注射用盐酸伊立替康脂质体的制备方法申请号：200610105371.1 申请日：2006-12-31”（采用pH梯度）、“伊立替康制剂申请号：200580017600.8 申请日：2005-05-31”（采用硫酸铵梯度），在制备脂质体过程中均除去了有机溶媒，未对溶媒残留量进行研究。已有的阿霉素脂质体（DOXIL，凯莱）商品中乙醇残留量要求小于0.01%，这带来问题。

发明内容：

基于乙醇毒性低，对脂质体膜材溶解性好方面考虑，我们以改良乙醇注入法制备空白脂质体，采用离子梯度装载技术制备盐酸伊立替康脂质体。考察不同乙醇含量对空白脂质体、梯度脂质体及载药脂质体包封率、粒径及抗肿瘤效率的影响，惊喜地发现最终脂质体制剂的乙醇残留量可以控制在10%（v/v）以内，极大地缩短简化工业生产中的乙醇含量控制提供参考。由此我们建立改良乙醇注入法制备CPT-11脂质体的制备工艺，具体方法如下：配置水化介质于45~75 ℃保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45~75 ℃溶解脂质相；将水化介质按照一定速度加入至脂质相中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体；按照梯度载药法即可。

脂质体的制备过程中必定需要采用有机溶媒溶解膜材，之后再采用一定的方法水化及分散，而有机溶媒会对脂质体膜的性质以及脂质体的稳定性等产生严重影响。已有研究中未见考察如何控制伊立替康脂质体中乙醇含量的报道，本发明的关键在于采用改良乙醇注入法制备伊立替康脂质体，乙醇无需全部除去，合理控制制备过程中残留的乙醇量，脂质体理化性质与疗效无显著性变化。

具体实施方式

实施例1 制备空白脂质体

为了避免制备过程中有机溶媒的影响，采用二氯甲烷溶解脂质，薄膜分散法制备空白脂质体。

空白脂质体处方

氢化大豆磷脂（HSPC） 3g

胆固醇（CH） 1g

mPEG₂₀₀₀-DSPE 0.75g

将 HSPC、CH、mPEG₂₀₀₀-DSPE以二氯甲烷溶解，按照薄膜法工艺除去二氯甲烷，得脂质薄膜。加入预热至65 ℃的乙二胺四乙酸铵（NH₄EDTA）溶液，65 ℃水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。将初品探头超声8 min（200 w×2 min、400 w×6 min），再依次通过0.8μm、0.45 μm、0.22 μm微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。

实施例2 空白脂质体梯度建立与载药

梯度建立的方法包括“离子交换树脂法”、“透析法”、“分子筛分离法”。下面以离子交换树脂法为例进行说明。

取“实施例1”的空白脂质体混悬液0.3 mL，上样于经离心预处理的3 mL 阴阳混合离子交换树脂柱（湿法装柱，阴离子树脂与阳离子树脂体积比为2: 1），2000 rpm 离心4 min，得到具有NH₄EDTA 跨膜离子梯度的空白脂质体混悬液。

载药：取上述梯度脂质体 0.1 mL，加入 CPT-11 溶液（3.0 mg/mL）0.3 mL，60 ℃保温10 min，制得 CPT-11 脂质体。

实施例3 乙醇对空白脂质体粒径的影响

量取一定体积的“实施例1”空白脂质体，分别加入0.0%、0.1%、1%、5.0%、10.0%、15%、20.0%、25.0%（v/v）的乙醇，混合均匀后，于0、4、8、24 h测粒径，结果见表1。加入5.0%、10.0%的乙醇24 h内对脂质体粒径没有显著影响；但加入20.0%、25.0%的乙醇24 h后粒径增大。

表1 乙醇对空白脂质体粒径的影响

乙醇浓度（v/v）	0%	0.1%	1%	5%	10%	15%	20%	25%
									粒径（0时）	85.9	87.3	90.5	88.1	83.7	92.6	99.5	104.0
粒径（24时）	86.1	86.2	89.6	89.6	87.6	97.1	105.2	109.3

由表可知，当乙醇大于15%时，粒径增大。

实施例4 乙醇对空白脂质体包封率的影响

分别取上述已加入乙醇的空白脂质体0.3 mL，于0、4、8、24h时，上样于经离心预处理的混合离子交换树脂柱，2000 rpm 离心4 min，之后加0.2 mL 重蒸水于柱顶，2000 rpm 离心4 min，得到具有NH4EDTA 跨膜离子梯度的空白脂质体混悬液。取空白脂质体混悬液0.1 mL，加入盐酸伊立替康溶液（3.0 mg·mL-1）0.3 mL，50 ℃保温10 min，制备盐酸伊立替康脂质体。采用离子交换树脂方法分离游离药物测定包封率。

结果加入5%与10%乙醇，8小时包封率无变化，24小时包封率降低不到10%；加入15%乙醇，包封率逐渐降低，4h包封率降低约5%，24h包封率降低约23%；加入20%乙醇，24h包封率降低约42%；加入25%乙醇，24h包封率降低约65%。

由此可知，当乙醇含量小于等于10%时，4小时内建立梯度与载药无变化。

实施例5 乙醇对梯度脂质体的影响

（一）乙醇对梯度脂质体粒径的影响

制备空白脂质体，用阴阳混合树脂除空白脂质体外水相中离子。取适量脂质体，分别加入0.0%、5.0%、10.0%、20.0%、25.0%（v/v）的乙醇。于0、4、8、24 h测定粒径，结果见表2。

表2 乙醇对梯度脂质体粒径的影响

乙醇浓度（v/v）	0%	5%	10%	15%	20%	25%
							粒径（0时）	88.3	90.2	86.6	90.6	91.8	98.3
粒径（24时）	87.2	91.5	90.3	94.1	100.6	110.3

由表可知，当乙醇大于等于20%时，粒径增大，乙醇对粒径的影响明显。

（二）乙醇对梯度脂质体包封率的影响

0、4、8、24 h时，将空白脂质体和药物溶液混合，50℃，孵育载药，测定包封率。结果表明，24 h 后，0.0%、5.0%与10.0%乙醇对包封率无显著影响； 20.0%与25.0%乙醇使包封率均下降约30%。

实施例6 乙醇对载药脂质体的影响

（一）乙醇对载药脂质体粒径的影响

取载药后脂质体，分别加入5%、10%、15%、20%（v/v）的乙醇，于0、4、8、24 h测粒径，结果表明加入5%、10%与15%乙醇24 h内对脂质体粒径没有显著影响；但加入20%的乙醇24 h内粒径由135nm增大到156nm。

（二）乙醇对载药脂质体包封率的影响

测定加入乙醇后，0、4、8、24h时CPT-11脂质体的包封率，结果见表3。

表3 乙醇对包封率的影响

乙醇浓度	0%	0.1%	1%	5%	10%	15%	20%	25%
									包封率（%）	92.9	93.6	93.8	94.5	92.8	90.3	71.6	58.2

由表可知，当乙醇大于等于20%时，包封率显著下降。

实施例7 其它处方

磷脂 10g

胆固醇 0~4g

PEG脂质衍生物 0~4g

按照上述实施例的研究方法发现，乙醇大于等于20%时，脂质体各项指标均发生显著性变化。

同样，采用硫酸铵梯度、离子梯度（如离子载体A23187）、蔗糖八硫酸酯梯度、柠檬酸梯度等；梯度建立的方法包括“离子交换树脂法”、“透析法”、“分子筛分离法”等，也可以将乙醇控制在15%以内，对伊利替康脂质体的粒径与包封率无显著性影响。

该处方所说磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物如何DSPC、DSPG、DSPE、DPPC、DPPG、DPPE、DOPC、DOPC、DOPE代替HSPC，也可以获得类似结果。PEG脂质衍生物可以是磷脂衍生物，如PEG-DSPE（PEG分子量200～20000），也可以是其他脂质衍生物。

实施例8 抗肿瘤试验

脂质体处方

HSPC 9g

胆固醇 3g

PEG2000-DSPE脂质衍生物 3g

脂质相：取上述处方的各脂质，加入60ml乙醇，于65 ℃溶解得脂质相。

水相：配制200mM的乙二胺四乙酸铵溶液260mL，预热至65 ℃即得。

空白脂质体制备：将水相加入至脂质相中，搅拌分散，均质机处理，依次通过0.8μm、0.45 μm、0.22 μm微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。

梯度建立：以超滤法除去脂质体外水相乙二胺四乙酸铵，得到具有NH4EDTA 跨膜离子梯度的空白脂质体混悬液。

载药：取上述梯度脂质体 0.1 mL，加入 CPT-11 溶液（10.0 mg/mL）0.1 mL，60 ℃保温10 min，制得含有10%乙醇的 CPT-11 脂质体。

类似地制备含有5%、15%、20%、25%乙醇的 CPT-11 脂质体。

抑瘤实验

将48只接种S180肿瘤的小鼠随机分为8组，即生理盐水对照组（NS）、CPT-11溶液组、CPT-11脂质体组，每组6只动物，具体剂量见表。第0天接种，接种后分别于第4、7、10天尾静脉注射给药（30mg/kg）。给药后动物正常饲养，每日称量小鼠体重，同时观察小鼠的生长状态。接种后第13天，处死动物，完整剥离皮下肿瘤，计算抑瘤率，结果见表4。

表4 不同乙醇含量CPT-11脂质体抑瘤结果

	溶液组	0%乙醇	5%乙醇	10%乙醇	15%乙醇	20%乙醇	25%乙醇
								抑瘤率（%）	31.2	86.9	91.2	85.3	69.1	56.6	51.8

由表可知，乙醇含量大于等于15%时，抗肿瘤效果显著降低。

虽然乙醇含量在15%时对脂质体的粒径与包封率影响不大，但体内药效却明显降低，因此在制备CPT-11脂质体时，乙醇含量应该控制在10%以内。

Claims

1.伊立替康脂质体，其特征在于采用改良乙醇注入法制备伊立替康脂质体，膜材组成为磷脂或（及）其它成分。

2.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中所述的脂质体制剂的膜材可以是磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物质通过常用方法氢化的物质；作为主要膜材可以只含一种磷脂，也可以含有多种磷脂；处方中尚可以加入其他成分，包括糖脂质、胆固醇、谷固醇类中任意一种或多种。

3.如权利要求2所述，其中所述的脂质体制剂的膜材中磷脂优选HSPC、HEPC、DSPC，更优选HSPC；“其他成分”优选胆固醇。

4.如权利要求3所述，本发明的脂质体制剂在含有上述构成脂质的同时，尚可含有亲水性高分子脂质衍生物，包括聚乙二醇（PEG）与磷脂或胆固醇的脂质连接所得PEG脂质衍生物，更优选聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）衍生物。

5.如权利要求4所述，PEG-DSPE中PEG的分子量通常为200-20000道尔顿，优选1000-7000道尔顿，更优选2000-5000道尔顿；其用量相对于膜脂质的比率通常为0.0-20 mol%，优选0.5-10%。

6.如权利要求1所述的脂质体的制备方法，其特征在于，采用改良乙醇注入法制备，其制备工艺如下：配置水化介质于45~75 ℃保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45~75 ℃溶解脂质相；将水化介质按照一定速度加入至脂质相中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体；按照梯度载药法即可。

7.如权利要求6所述的脂质体的制备方法，其特征在于，梯度载药法为采用硫酸铵梯度、蔗糖八硫酸酯梯度、EDTA铵梯度、柠檬酸梯度、金属离子梯度将药物装载进入脂质体，控制乙醇含量为0-15%（V/V）。

8.如权利要求7所述的脂质体的制备方法，其特征在于，控制乙醇含量小于10%（V/V）。