KR20160081994A

KR20160081994A - 지방 또는 태반 조직 유래의 부착 세포 및 이의 치료 용도

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Publication number: KR20160081994A
Application number: KR1020167017340A
Authority: KR
Inventors: 모란 메이론; 아미르 토렌; 레이첼 오퍼; 자미 아버만; 니리트 드로리-카미
Original assignee: 플루리스템 리미티드
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2008-09-02
Publication date: 2016-07-08
Also published as: BRPI0815946B8; PL2200622T5; AU2008300185B2; IL248955A0; IL272587B; US9517248B2; KR20140107677A; ES2392729T3; CA2699664A1; US20100209403A1; HRP20120887T1; KR101738323B1; JP6560381B2; PT2200622E; EP2591789A2; IL248955B; US20180256648A9; EP2591789A3; KR101738285B1; HRP20120887T4

Abstract

필요한 대상체에 허혈을 치료하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 상기 대상체에, 태반 및 지방조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포의 치료적 유효량을 투여하고, 이럼으로써 대상체에서 허혈을 치료하는 것을 포함한다. 연결조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

지방 또는 태반 조직 유래의 부착 세포 및 이의 치료 용도{ADHERENT CELLS FROM ADIPOSE OR PLACENTA TISSUES AND USE THEREOF IN THERAPY}

본 발명은 지방 또는 태반 조직에서 유래된 부착성 세포를 사용하여 질병을 치료하는 방법, 더 상세하게는, 상기 부착성 세포를 사용하여 결합조직 재생 및/또는 회복을 요하는 허혈성 및/또는 의학 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

발전하고 있는 의료계에서, 세포 이식, 및 조직 공학의 목적을 위해, 많은 양의 성체 줄기세포에 대한 필요성이 증대되고 있다. 또한, 성체 줄기세포 요법은 조혈질환, 심장병, 파킨슨병, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 화상, 근이영양증, 자가면역질환, 당뇨병 및 관절염과 같은 다양한 상태를 치료하고 치유하는 데 끊임없이 개발되고 있다.

최근, 골수 이식 (BMT)를 지원하고, 뇌, 심장, 뼈 및 간장과 같은 손상된 장기의 조직 복원을 위시한, 다양한 의료 적용에 대한 중간엽 기질세포 (MSCs)의 치료적 능력에 대하여 상당한 활동이 집중되어 왔다. MSCs, 즉, 예를 들어, 골수, 지방, 태반 및 혈액으로부터 얻어진 이질적 세포 집단은, 다양한 생체 활성 인자로부터의 영향에 따라서, 상이한 유형의 중간엽 숙성 세포 (예를 들어, 망상내피세포, 섬유아세포, 지방세포, 골원성 전구세포)로 분화될 수 있다. 따라서, MSCs는 병리적 조직의 손상의 회복 또는 대체를 위해, 뼈, 연골 및 지방과 같은 새로운 조직을 세우는 데 기반으로서, 그리고 선천적 및 후천적 질환의 치료법으로서 재생 의학에서 광범위하게 연구되고 있다 [Fibbe 및 Noort, Ann N Y Acad Sci (2003) 996: 235-44; Horwitz 등, Cytotherapy (2005) 7(5): 393-5; Zimmet 및 Hare, Basic Res Cardiol (2005) 100(6): 471-81]. 더욱이, MSCs은 이의 다중 능력, 이의 손쉬운 분리와 배양은 물론 이의 높은 생체외 확장 능력으로 인하여 매력적인 도구가 되고 있다 [Fibbe 및 Noort, 상기 문서 참조; Minguell 등. Exp Biol Med (Maywood) (2001) 226(6): 507- 20].

태반 유래 MSCs은 다른 조직으로부터 유래된 MSCs에 공통된 많은 마커, 예를 들어, CD 105, CD73, CD90 및 CD29을 보이고, 조혈, 내피 및 영양아성-특이성 세포 마커의 발현이 결여되어 있다. 지방원성, 골원성 및 신경원성 분화는 적절한 조건 하에서 태반 유래 MSCs를 배양한 후 성취되었다 [Yen 등, Stem Cells (2005) 23(1): 3-9]. 또한, 태반으로부터 분리되고 시험관 내 배양된 MSCs는 MSCs과 유사한 형태로 면역 면제 (immune privilege)된다는 것을 나타내 보였다. 따라서, 상기 태반은 실험과 임상 적용에, 윤리적으로 논란이 되지 않고 용이하게 접근할 수 있는 MSCs의 원천을 제공한다 [Zhang 등, Exp Hematol (2004) 32(7): 657-64].

본 발명자들은 이전에, 태반 유래 MSCs의 확장에 적합한 삼차원 (3D) 배양 조건을 고안한바 있고 (PCT 출원 제 IL2007/000380호) 이는 전체적으로 참조문헌으로 기입되어 있다. MSCs의 주된 임상 용도는 하기와 같다.

허혈

허혈성 말초 동맥 질환 (PAD)

허혈성 말초 동맥질환 (PAD)은 팔다리에서의 혈류를 점진적으로 제한하는 만성질환으로 심각한 합병증을 초래할 수 있다. 이러한 질병은 종종, 고혈압, 심혈관 질환, 고지혈증, 당뇨병, 비만 및 뇌졸중을 위시한 다른 임상 상태와 연관된다. 중증사지허혈 (CLI)은 사지에서 허혈 유도 통증, 궤양, 조직 손실 또는 탈저를 보이는 환자를 묘사하는 데 사용된다. CLI는 혈관 외과의 또는 혈관 전문의에 의한 전반적인 치료가 필요한 PAD 환자의 말기를 나타낸다. 관상 및 대뇌 동맥 질환과 달리, 말초 동맥 질환 (PAD)은 심각하고 매우 널리 퍼져있음에도 불구하고,진단되지 않거나 심지어는 치료되지 않는, 과소평가된 상태로 있습니다. 결론적으로, CLI는 종종 절단 또는 죽음에 이르게 하고, PAD 환자의 사망률은 심근경색 및 뇌졸중 환자보다 높다.

허혈성 조건을 치료하기 위한 시도로, 다양한 성체 줄기세포를 사용하였다. 따라서, 지방 조직 유래 기질세포 (ADSC)와 내피세포 (EC)를 공배양하면 EC 생존능, 이동 및 주로 VEGF와 HGF의 분비를 통한 관 형성에서 심대한 증가를 결과를 초래하였다. 기질세포를 허혈성 마우스 뒷다리로 이식하고 4 주 후에, 혈관생성 점수가 향상되었다 [Nakagami 등, J Atheroscler Thromb (2006) 13(2): 77-81]. Moon 등 [Cell Physiol Biochem. (2006) 17: 279-90]은 면역결핍 마우스에서 사지 허혈을 치료할 수 있는 지방 조직-유래 전구 세포 (ADSC)의 능력을 시험하였고 ADSC-이식된 군에서 레이저 도플러 관류 지표가 상당히 증가된 것을 보였다.

또한, 제대혈 (UCB)-유래 중간엽 줄기세포를, 이전에 의료 치료 및 수술 요법을 받은 버거씨병 환자 4명의 남성에게 이식하였을 때, 허혈성 휴식 통증 (rest pain)이 문제의 말단으로부터 갑자기 사라졌다 [Kim 등, Stem Cells (2006) 24(6): 1620-6]. 더욱이, 정상임신 태반의 태아막으로부터 분리된 인간 중간엽 줄기세포 (FMhMSC)를 경색된 래트 심장으로 이식하면, 모세혈관 밀도가 증가하고, 좌심실 기능이 정상화되며, 흉터 조직이 상당히 감소하는 것과 연관이 있고, 이는 상기 줄기세포가 과 부티르산 및 레티노산과의 하이알루로난의 혼합 에스테르로 예비처리되었을 때 향상되었다 [Ventura 등, (2007) J. Biol. Chem., 282: 14243-52].

뇌졸중

뇌졸중은 전 세계에서 주된 사망 원인 중 하나이고, 전체 사망의 약 9%를 야기하며 전체 건강 비용의 약 2-4 %를 소비하고 있다. 비록, 개발국가에서 뇌졸중 사망률이, 아마도 뇌졸중 위험 인자 (특히 고혈압, 당뇨병 및 흡연)의 개선된 조절로 인해, 꾸준히 감소하고 있긴 하지만, 뇌졸중은 여전히 영구적 손상을 초래한다 (예를 들어, 조직 손상, 신경 손상).

뇌졸중에 대한 새로운 치료 섭생은 줄기세포 요법을 포함한다. 줄기세포 또는 전구세포를, 국소적으로 또는 정맥내 경로를 통해 손상된 부위로 이식하여, 비기능적 세포를 대체하고, 내재성 줄기 또는 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 향상시키고 및 필요한 면역 조절자를 공급하는 것이 연구되었고, 주된 세포-기반 전략으로 우뚝 서 왔다. 뇌졸중을 위한 잠재적 줄기/전구 세포원은 신경 줄기세포, 배아 줄기세포, 신경기형암 (neuroteratocarcinoma) 세포, 제대형-유래 비조혈성 줄기세포, 골수-유래 줄기세포 및 태반-유래 중간엽 줄기세포를 포함한다 [Andres 등, Neurosurg Focus (2008) 24(3-4): E 16]. 최근의 연구에서, Koh 등 [Koh 등, Brain Res. (2008)]은 허혈성 뇌졸중 래트 모델에서 이식된 인간 제대-유래 중간엽 줄기세포들 (hUC-MSCs)의 신경보호 효과 및 기작을 조사하였다. 시험관 내 신경 분화 유도 후 20일 경과 시점에서, hUC-MSCs는 신경세포의 형태적 특징을 나타내었고, 신경 세포 마커 및 신경 인자 (예를 들어, 신경교 세포-유래 신경영양성 인자, 뇌-유래 신경영양성 인자)를 발현하였다. 더구나, hUC-MSCs를 면역억제된 허혈성 뇌졸중 래트의 손상된 반구로 생체 내 이식하면, 대조군 래트에 비하여, 신경행동 기능을 향상시켰고 경색 부피를 감소시켰다. 이식 삼 주 후에는, hUC-MSCs이 손상된 반구에 존재하였고, 신경 특이성 마커를 발현시켰지만, 이러한 세포들이 기능적으로 활성적인 신경 세포로 되진 않았다.

정형외과적 적용

다양한 상태 및 병리적 현상에, 결합조직 (예, 뼈, 힘줄 및 인대) 재생 및/또는 복구가 필요하다. 이러한 것들은, 예를 들어, 골절, 화상, 화상 상처, 깊은 상처, 퇴행된 뼈, 결합조직 손실과 연관된 다양한 암 (예, 골암 (bone cancer), 골육종, 골전이) 및 관절 연골 손상을 포함한다.

골 치유를 향상시키기 위해 자기유래 BM-MSCs를 사용하는 것은 가축 및 인간 정형외과 적용에 대하여 기술되었고 골수의 경피 주사로 인대를 치유하는 것 (Carstanjen 등, 2006), 정형외과적 임상에 골수의 자가이식 또는 동종이식에 의한 골결손의 치료 (Horwitz 등, 1999, Horwitz 등, 2002), 개에서 중대한 크기의 골 결손을 수산아파타이트-트리칼슘 인산으로 구성되는 세라믹 실린더에 적재된 동종이계 [Arinzeh TL, 등, J Bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(IO): 1927-35] 또는 자가유래 [Bruder SP, 등, J Bone Joint Surg Am. 1998 Jul;80(7):985-96] 골수-MSCs를 사용하여 재생시키는 것, 또는 토끼에서, 동종이계 말초 혈액 유래 MSCs를 사용하여 재생시키는 것 (Chao 등, 2006), 및 개코원숭이에서 MSCs 이식을 통해 상당히 골 형성시키는 것 (Livingston 등, 2003)을 포함한다.

말의 정형외과 분야에서는, BM 및 지방세포 원천의 중간엽 줄기세포가 연골하골 낭포의 외과적 치료, 뼈골절 복구 [Kraus 및 Kirker-Head,Vet Surg (2006) 35(3): 232-42] 및 연골 복구 [Brehm 등, Osteoarthritis Cartilage (2006) 14(12): 1214-26; Wilke 등, J Orthop Res (2007) 25(7): 913-25]에 실험적으로 및 말에서 과도 긴장으로 유도된 힘줄 손상의 치료에 임상적으로 사용되었다. 더구나,말에서 상이한 치료법을 사용하여 걸이 인대 (suspensory ligament) 치유를 촉진시켰다 (Herthel, 2001).

Herthel (2001)은 자가유래 줄기세포 및 자연적 인대 재생을 자극하는 연관 골수 성분을 국소내 주사하는 것을 포함하는, 걸이 인대 치유를 촉진시키는 신규한 생물학적 접근법을 개발하였다.

손상된 힘줄에 대한 토끼 모델에서, MSC-처리된 조직은 자연적 회복된 조직보다 더 강하고 단단한 것으로 나타났다 (Gordon 등, 2005). 또한, 배양된 MSCs을 힘줄 간극에 넣으면 상당히 향상된 복구 생체역학을 결과하였다 (Young 등, 1998, Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

오시리스 연골원 (Osiris Chondrogen) (성체 중간엽 줄기세포)이 안전성과 효능을 평가하기 위해 환자에 시험중에 있다. MSC 처리된 동물에서, 외과적으로 제거된 반월판 조직을 재생시켰고, 연골 표면을 보호하였고, 관절 손상이 대조군 동물에 비하여 감소하였음이 관찰되었다. 이러한 장점은 적어도 일 년간 동물 모델에서 지속되었다 (Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 필요로 하는 대상체에 허혈을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포의 치료적으로 유효한 양을 투여하고, 이럼으로써 상기 대상체에서 허혈을 치료하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에서, 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포의 치료적으로 유효한 양을 투여하고, 이럼으로써 상기 대상체에서 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에서, 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 부착성 세포를 허혈 치료에 확인된 의약물을 만드는 용도를 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 부착성 세포를 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 데 확인된 의약물을 제조하는 용도를 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포의 약학적으로 유효한 양을 포장하고 있고, 허혈을 치료하는 용도의 라벨을 포함하는 포장 물질을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포의 약학적 유효량을 포장하고, 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 용도의 라벨을 포함하는 포장 물질을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 상기 대상체에서 면역 반응을 억제할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포의 최소 10%는 증식기에 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 허혈은 말초 동맥 질환(PAD)이다.

본 발명의 본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 말초 동맥 질환(PAD)은 중증 사지허혈 (CLI)이다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 허혈은 중추신경계(CNS)의 허혈을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 허혈은 말초 동맥 질환, 허혈성 허혈성 혈관 질환, 허혈성 심장병, 허혈성 뇌 질환, 허혈성 신장 질환 및 허혈성 태반으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 삼차원 (3D) 배양으로부터 얻어진다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 삼차원 (3D) 배양은 3D 반응기를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 3D 배양에서의 세포배양은 관류하에서 실행된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 삼차원 배양의 배양 조건은 폴리에스터 및 폴리프로필렌으로 구성되는 군으로부터 선택된 부착성 물질을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포의 배양은 적어도 3일간 수행된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 세포의 배양은 상기 세포의 적어도 10%가 증식될 때까지 수행된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 CD73, CD90, CD29 및 CD105로 구성되는 군으로부터 선택된 양성 마커 발현을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CDl1b, CD14, CD19, CD34 및 CD79로 구성되는 군으로부터 선택된 음성 마커 발현을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 핵심적으로 발현 프로필을 포함한다..

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 부착성 세포는 기질 줄기세포 표현형을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 기질 줄기세포 표현형은 T 세포 억제 활성을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 결합조직은 힘줄, 뼈 및/또는 인대를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태는 뼈 골절, 골암, 화상 상처, 관절 연골 손상 및 깊은 상처로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 의학적 상태는 연골하골 낭포, 뼈 골절, 골다공증, 골관절염, 퇴행된 골, 골암, 연골 손상, 관절 연골 손상, 퇴행성 디스크 질환, 골형성 부전증 (OI), 화상, 화상 상처, 깊은 상처, 지연된 상처 치유, 손상된 힘줄 및 손상된 인대로 구성되는 군으로부터 선택된다.

별달리 정의하지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 학문적 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본 명세서에 설명된 것과 유사한 또는 동일한 방법과 물질이 본 발명의 실시 또는 시험하는 데 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질들이 하기에 설명된다. 이해관계 충돌 시, 정의를 위시한 본 특허 명세서가 조절할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시에는 예증하기 위한 것일 뿐 제한하려고 의도하지 않는다.

본 발명은 첨부 도면을 참조하여, 실시예의 방법으로만 설명된다. 도면을 상세히 특정 참고하면, 상세한 부분이 실시예의 방법으로 및 본 발명의 예증적 논의 목적으로만 제시되어 있고, 본 발명의 원리 및 개념적 관점을 가장 유용하고 용이하게 이해되는 서술이라고 믿는 것을 제공하기 위해 제공되는 것임을 강조한다. 이와 관련하여, 본 발명의 구조적 상세를 본 발명의 기초적 이해에 필요한 것보다 더 상세히 나타내려고 시도하지 않으며, 도면에 나타난 설명은 본 발명의 몇 가지 형태가 실제적으로 어떻게 구체화되어 있는지 당해 분야의 기술자에게 명백히 드러낼 것이다.

도 1A-G는 3-D 캐리어를 포함하는 생물반응기에서 구현된 뼈 유사 미세환경을 나타내고 있다. 도 1A-B는 천연 뼈(도 IA) 및 뼈 미세 환경을 모방하면서 부착성 세포를 심은 7일 후 PluriX^TM 3D의 구조 (도 1B)를 비교한 것을 나타낸 전자 현미경사진이다. 도 1C-F는 부착성 세포와 같이 심은 PluriX^TM 3D 매트릭스를 나타낸 것으로, 심은 지 20일 후 (도 1C-D, 각각 150 및 250배 확대) 및 40일 후 (도 1E-F, 각각 350 및 500배 확대)에 골수로부터 생성된 것을 나타낸 전자 현미경 사진이다. 도 1G는 Plurix 3D 플러그 플로우 생물 반응기 도면으로 각 부품들이 숫자로 매겨졌다: 배양액 저수조: (1) 가스 혼합물 공급기, (2) 필터, (3) 주입 포인트, (4) 3D 캐리어가 놓이는 칼럼, (5) 플로우 모니터, (6) 플로우 밸브 (6a), 분리 컨테이너, (7) 세포 성장 분석기, (8) 연동 펌프, (9) 샘플링 포인트, (10) 용해 O₂ 측정 전극, (11) pH 측정 전극, (12) 제어 시스템, (13) 새로운 성장 배지, (14) 사용된 성장 배지 (15).
도 2는 태반에서 유래되고 3D 성장 조건에서 상기 생물 반응기 내에서 성장된 부착성 세포의 상이한 제조 로트 (로트 5-8)을 나타낸 그래프이다. 부착성 세포 (2×10⁶)를 10000 - 15000 세포/캐리어의 밀도로 생물반응기에 심었다. 12일간 배양 후, 3D-부착성 세포는 150,000-250,000 세포/캐리어 밀도 또는 150개 캐리어를 가지는 생물반응기에서 22.5-37.5×10⁶ 세포로 늘었다.
도 3A-B는 태반 유래 3D 부착성 세포 (어두운 자주색)에서 발현된 멤브레인 마커와 통상적인 2D 배양 조건에서 배양된 태반 세포에서의 발현된 멤브레인 마커와 비교한 차이를 나타낸 막대 그래프이다. 부착성 세포를 플라스크 (2D)에서 4-6 주간 또는 폴리스티렌 캐리어 상의 생물반응기 시스템 (3D)에서 2-3 주간 배양하였다. 플라스크 또는 캐리어로부터 수확한 후, 세포를 배양하고 부착 세포 (도 3A) 또는 조혈 세포 (도 3B)의 멤브레인 마커 특성을 인지하는 단일 항체 (MAb)의 패널에 부착시켰다. 2D 배양된 세포에서의 MSC 멤브레인 마커는, CD90, CD105, CD73 및 CD29 멤브레인 마커에 대해 나타난 바와 같이, 3D 배양된 부착 세포에서 발현된 MSC 멤브레인 마커에 비하여, 상당히 더 높은 발현, 특히 CD105는 3D 배양된 세포에서는 56% 발현 대 2D 배양된 세포에서는 87 %를 나타낸 것(도 3A)에 유의하라. 2D 및 3D 배양물의 부착성 세포 둘 모두 조혈 멤브레인 마커를 발현한 것은 아니다 (도 3B).
도 4A-D는 2D 및 3D 조건 또는 동일한 조건 배양액에서 배양된 태반으로부터 생성된 부착성 세포에서의 단백질 수준을 비교한 막대 그래프이다. 도 4A-C는 2D 및 3D 배양된 부착성 세포의 조절된 배양액에서, ELISA로 분석시, 1×10⁶ 세포/ml로 표준화했을 때, Flt-3 리간드 (도 4A), IL-6 (도 4B) 및 SCF (도 4C)의 수준을 pg/ml으로 나타낸다. 결과는 세 개 독립된 실험 중 하나를 나타내고 있다. 도 4D는 iTRAQ 시약 표지된 단백질 샘플을 사용하여 질량 분광분석법으로 분석했을 때, 상이한 세포 단백질의 발현 수준을 비교한 것이다. 단백질 샘플은 2D (흰색 막대) 및 3D (회색 막대) 조건하에서 배양된 부착성 세포로부터 취하였다. 상기 도면은 두 개의 복제 실험 중 하나를 나타낸다. 2D 및 3D 배양 조건의 조절된 배양액에서 배양된 세포에서의 특정 단백질의 발현 수준 차이를 유의.
도 5A-D는 태반 유래 3D-부착성 세포의 조골세포로의 시험관 내 분화능력을 나타낸 현미경 사진이다. 인간 태반 유래 부착성 세포를 골원성 유도 배양액 (10% FCS, 100 nM 덱사메타손, 0.05 nM 아스코르브산 2-포스페이트, 10 mM B-글리세로포스페이트를 함유한 DMEM)에서 3주간 배양하였다. 도 5A-B는 알리자린 레드 (Alizzarin Red) S 염색으로 지시되는 바와 같이, 석회화된 매트릭스를 나타낸 세포를 도시한다. 도 5C-D는 골원성 유도 배지로 처리하지 않고 섬유아세포 유사 표현형을 유지하고 미네랄화를 보이지 않는 대조군 세포를 도시한다.
도 6은 화학요법 처리된 (연속 2주간 25 mg/kg 부설판 복강내 주사) NOD-SCID 마우스의 골수 (BM)에서, 이식 후 3.5주에, 감지된 인간 CD45+ 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다. 단핵 제대혈 유래 세포로부터 정제된 CD34+ 세포 (100,000)를 단독으로 (5마리 마우스, a) 또는 2D 조건에서 배양된 0.5×10⁶ 태반 유래 부착성 세포와 함께 (2D-부착성 세포; 2 마리, b), 또는 3D 조건에서 pluriX^TM 생물반응기에서 배양된 태반 유래 부착성 세포와 함께 (3D-부착성 세포)(5마리, c) 이식하였다. 다음, 마우스 대퇴골과 경골로부터 BM을 수집하였다. BM 내의 인간 세포를 유세포 분석으로 검출하였다. CD45 발현 인간 세포의 백분율은 항-인간 CD45-FITC로 세포를 배양하여 결정하였다. HSCs 단독 (a)으로 처리된 마우스에서의 인간 세포 백분율에 비해, 2D-부착성 세포 (b)는 물론 3D-부착성 세포 (c)로 공이식된 마우스의 골수에서의 인간 세포(hCD45+)가 더 높은 백분율임을 유의. 2D-부착성 세포 배양 세포로 처리된 마우스에 비하여, 3D-부착성 세포 배양 세포로 처리된 마우스에서 나타난 더 높은 이식율은 3D 배양된 부착성 세포에 유일한 더 높은 치료적 이점을 나타내고 있다.
도 7A-B는 CD34+ 세포만 (도 7A)을 이식한 마우스에서의 인간 이식편 CD45+ 세포를 지방 조직 유래 부착성 세포와 CD34+ 세포를 같이 이식한 것 (도 7B)과 비교한 FACS 분석이다. 지방 조직 유래 부착성 세포로 공이식한 마우스에서의 인간 조혈 군(hCD45+)의 백분율이(7A - 29%)이 CD34+ 단독으로 처리한 마우스(7B - 12%)에 비하여 높은 것에 주목.
도 8A는 인간 제대혈 단핵 세포 (CB) 및, 동일한 양의 방사능 조사된 (3000 Rad) 제대혈 세포 (iCB), 인간 말초 혈액 유래 단핵세포구 (PBMC), 2D 배양된 (2D) or 3D 배양된 (3D) 태반 유래 부착성 세포, 또는 PBMC 및 2D와 3D 배양된 태반 유래 부착성 세포 (PBMC + 2D 및 PBMC + 3D)의 배합물 간에 실시된 혼합된 임파구 반응을 나타낸 막대 그래프이다. CB 세포군의 크기는 ³H-티미딘 취득 uptake (CPM으로 측정)으로 표현되고, 이는 배양 마지막 18시간 동안 측정되었다. 자극된 CB 세포 군의 증가는 더 높은 수준의 면역 반응을 나타낸다. 부착성 세포와 배양된 세포에 의해 나타난 면역반응의 더 낮은 수준, 특히 부착성 세포와 공배양시 PBMCs에 CB 면역반응의 감소에 유의. 각 반응에 대하여 3개 복제물을 만들었다.
도 8B는 Celligen^TM (PLX-C 세포로 명명)에 의한 태반으로부터 나온 3D 부착성 세포의 생성을 나타낸 흐름도이다.
도 8C는 The New Brunswick Scientific 웹사이트로부터 적용된 Celligen^TM 생물반응기 용기 및 포트의 도면이다.
도 9A-B는 Plurix (PLX로 명명, 도 9B) 및 Celligen (PLX-C로 명명, 도 9A)에 의해 제조된 3D 부착성 세포의 세포 주기 분석을 나타낸다. 세포를 70% EtOH O.N에 고정시키고, 원심분리시키고, 및 요오드화 프로포디움 (PI) 용액에 재현탁시킨 다음, FACS로 분석하였다.
도 lOA-C는 섬유아세포-전형 마커의 발현을 나타내지만, PLX-C 상에 내피세포에 전형적인 마커의 발현을 나타내지 않는다. 도 1OA는 내피세포 마커 CD31의 음성 발현을 나타낸다; 도 1OB는 내피세포 마커 KDR의 음성 발현을 나타낸다; 및 도 1OC는 인간 섬유아세포의 양성 발현을 도시하고 있다 (D7-FIB). 유의할 것은, 이소타입 IgGl (FITC)에 대한 붉은 히스토그램은 음성 대조군을 나타내고, 푸른 히스토그램은 양성적으로 염색된 세포를 나타낸다.
도 11A-D는 PLX-C 세포 상에서 자극 및 공자극 분자의 발현을 나타낸다. 도 11A는 CD80의 PLX-C 발현을 나타낸다; 도 11B는 CD86의 PLX-C 발현을 나타낸다; 도 11C는 CD40의 PLX-C 발현을 나타낸다; 및 도 11D는 HLA-A/B/C의 PLX-C 발현을 나타낸다. 음성 대조군을 적절한 이소타입 형광 분자로 만들었다. 유의할 것은, 붉은 히스토그램은 세포의 PLX-C 마커-발현군을 나타내며, 푸른 히스토그램은 세포의 골수 (BM) 마커-발현 군을 나타내고, 녹색 히스토그램은 세포의 단핵구 (MNC) 마커 발현군을 나타낸다.
도 12A-B는 PLX-C에 의한 임파구 증식 저해를 나타낸다. 도 12A는 2×10⁵ 말초혈액 (PB) 유래 MNC (공여자 A)가 동일량의 방사선 조사된 (3000 Rad) PB 유래 MNCs (공여자 B)로 자극된 후, PLX-C 세포의 양을 증가시키면서 배양물에 첨가하여 수행한 MLR 시험을 나타낸다. 각 군당 세 가지 복제물을 96-웰 플레이트에 심었다. 증식률은 [³H]티미딘 유입으로 측정하였다; 도 12B는 ConA (1.5 mg /ml)로 자극된 말초혈액 (PB) 유래 MNCs를 나타낸다. PLX-C 세포의 양을 증가시키면서 배양물에 첨가하였다. 각 군마다 세 개 복제물을 96-웰 플레이트에 심었다. 증식률은 [³H]티미딘 유입으로 측정되었다;
도 13A-C는 말초혈액 세포로 공배양 후, 친-염증성 및 항염증성 사이토카인 분비의 PLX-C 조절을 나타낸다. 도 13A-B는 ConA로 자극된 인간 유래 MNCs (말초혈액으로부터 분리)를 PLX-C와 공배양한 후 IFNγ (도 13A) 및 TNFα (도 13B)의 분비를 나타낸다; 도 13C는 LPS로 자극된 인간 유래 MNCs (말초혈액으로부터 분리)를 PLX-C와 공배양한 후, IFNγ, TNFα 및 IL-10의 분비를 나타낸다. 상청액을 수집하고 ELISA로 사이토카인 분석하였다.
도 14는 PLX-C 세포를 감염하는 데 사용되는 루시페라제 발현 벡터를 나타낸다. OmicsLink의 발현벡터 Lv33를 사용하였다. 루시페라제 유전자를 ORF로 클론하였다.
도 15는 감염된 세포에 의한 높은 루시페라제 발현을 나타낸다. 세포를 상기 루시페라제 발현벡터로 감염시키고, 감염 48시간 후에 IVIS 시스템을 사용하여 시각화하였다. 유의할 것은 세포가 높은 수준의 루시페라제 발현을 보였다.
도 16A-D는 2×10⁶ 루시페라제 발현 PLX-C 세포를 SCID/Beige 마우스에 주입한 것을 나타낸다. 하나의 마우스를 IM으로 하나는 IV로 주입하였다. IVIS 시스템으로 주입된 마우스를 모니터하여 PLX-C의 생체내 생분포를 계산하였다. 1일차 (도 16A), 4일차 (도 16B), 6일차 (도 16C) 및 22일차 (도 16D)의 IVIS 결과를 표시한다.
도 17은 본 발명의 부착성 세포 (PLX-C로명명)로 처리된 마우스의 힙과 발에서 증가된 관류를 나타낸 그래프이다. 상기 도면은 마우스 힙과 발에서의 관류 백분률의 중앙값을 나타낸다. 힙과 발 상에서의 혈류는 수술 후 0, 6, 9, 14 및 21일차에 양편에서부터 비접촉성 레이저 도플러를 사용하여 측정하였다 (나타난 것은 21일차의 측정치이다). 결과는 실험 동안 정상 사지에서와 비교하여 허혈성 사지에서의 혈류량의 비율로서 표시하였다.
도 18은 사지 기능 및 허혈성 손상이 생체 내 평가를 나타낸 그래프이다. 허혈 사지의 불구 사용에 대한 반정량적 평가가 하기 점수 체계를 사용하여 순차적으로 실시되었다: 3 = 발을 끔, 2 = 끌지 않지만 발바닥 만곡이 없음, 1 = 발바닥 만곡 및 0 = 발가락을 구부려 꼬리의 가벼운 수축을 저항함.
도 19A-C는 PLX-C 처리 후 증가된 모세혈관 밀도를 나타낸다. 도 19A는 PBS로 처리된 마우스에서의 모세혈관 밀도를 나타낸다; 도 19B는 PLX-C 세포로 처리된 마우스에서의 모세혈관 밀도를 나타낸다; 도 19C는 근육세포당 모세혈관의 수를 나타낸 막대그래프이다. 유의할 것은, 특이성 모세혈관 염색으로 증명된, 사지 허혈 유도 후에, PLX-C 처리 마우스에는 증가된 모세혈관 밀도가 나타나지만, 대조군 마우스에는 나타나지 않았다.
도 20A-B는 PLX-C 투여 후 감소된 산화성 스트레스 및 내피 염증을 나타낸다. 도 2OA는 산화성 스트레스 (니트로타이로신 염색)을 나타낸 막대그래프이다; 및 도 2OB는 내피세포 염증 (VCAM 평가)를 나타낸 막대그래프이다. 유의할 것은, 감소된 산화성 스트레스 및 내피세포 염증이 PLX-C로 처리된 마우스에 나타나 있는 것이다.

본 발명은, 특정 구체예에서, 태반 또는 지방조직의 부착성 세포를 사용하여 조직에서의 혈관생성을 증가시키고 및 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 허혈 또는 의학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 원리 및 작용은 도면과 하기 설명을 참조하면 더욱 잘 이해될 수 있다.

본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용이 하기 설명에 제시된 또는 실시예에서 예증된 상세로만 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 구체예를 할 수 있고 또는 다양한 방식으로 실시 또는 이행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 문장 및 용어는 설명하기 위한 목적으로 제한적으로 간주되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명을 실시하는 동안, 본 발명자들은 태반 또는 지방 조직으로부터 얻어진 부착성 세포가 조직에서 혈관생성을 증가시키는 데 및 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 허혈 및 의학적 상태를 치료하는 데 매우 효과적인 것을 발견하였다. 하기에서 설명되고 실시예 부분의 실시예 1-8에서 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 기질 줄기세포 특성을 포함하는 지방 및 태반-유래 부착성 세포를 확장할 수 있었다. 확장된 세포들은, 냉동보관 후, 부착성 및 재-거주 분석에 의해 증명되는 바와 같이 (실시예 1), 살아있는 것으로 발견되었다. 태반 유래 부착성 세포를 유세포 측정 분석하여 독특한 마커 발현 패턴을 발견하였다 (도 3A-B 참조). 후속 실시예 부분의 실시예 6에서 더욱 나타난 바와 같이, 태반 유래 부착성 세포의 이식하면, 동맥결찰한 마우스(허혈성 뒷다리 모델)의 힙과 발에서 혈류를 상당히 유도하였고 (도 17), 사지 기능을 상당히 향상시켰고 (도 18), 모세혈관 밀도를 증가시켰고 (도 19A-C) 및 산화성 스트레스 및 내피세포 염증을 감소시켰다 (도 20A-B).

따라서, 본 발명의 일 관점에 따라서, 조직에서 혈관생성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 조직을 태반 및 지방 조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의 부착성 세포와 접촉시키고, 그럼으로써 조직에서의 혈관생성을 증가시키는 것으로 이행된다. 본 명세서에서 사용되는바, 어구 "조직에서 혈관생성을 증가시키는"은 조직에서 새로운 모세 혈관을 생성하는 과정을 증가 (유도, 증강)하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "부착성 세포"는 정박 의존성인, 예를 들어, 시험관내에서 성장하기 위해 표면에 부착을 요하는 세포의 동질 또는 이질 군을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방 조직"은 지질 세포 (지방세포)를 포함하는 결합조직을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "태반 조직"은 자궁벽에 덧대어지고 임신 동안 태아를 발육시키고, 여기에 제대에 의해 부착되는 포유동물 암컷 기관의 임의 부분을 뜻한다. 출산 후, 태반은 추출된다 (및 출산 후 태반으로 지칭된다). 실시예에서, 태반은 전체 태반을 뜻한다.

태반 또는 지방조직 유래 부착성 세포는 이차원 또는 삼차원 배양 조건을 사용하여 증식될 수 있다.

2D 배양물에서 부착성 세포를 증식하기 위한 조건은 하기 및 실시예에서 더 설명된다. 본 명세서에서 사용된바, 용어 "삼차원 배양"은 세포를 일 년 이상을 성장시키는 동안의 세포 성장과 비견되는 조건에 처해지는 배양을 뜻한다. 살아있는 유기체 (또는 조직)에서의 세포의 본래 장소 (in situe) 환경은 삼차원 구조라는 것이 명백하다. 세포들은 다른 세포들에 의해 둘러싸여 있다. 이들은 다양한 국지적 미소환경을 결정하는 세포외 기질 나노 크기 섬유의 복잡한 망상구조에 잡혀 있다. 이들의 세포외 리간드들은 기저막에 부착을 중계할 뿐 아니라, 다양한 혈관 및 임파성 혈관에 접근한다. 산소, 호르몬 및 영양분들이 세포로 운반되고 노폐물들이 빠져나간다. 본 발명의 삼차원 배양에서의 조건은 하기에서 예증되는 그러한 환경을 모사하려고 고안된다.

삼차원 배양의 조건은 부착성 세포의 확장을 가능케하는 그러한 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는바, 용어 "확장하는 것" 및 "확장"은 실질적으로 분화가 없는 세포의 유지 및 궁극적으로는 세포의 성장, 즉 분화를 수반하지 않는 세포 수의 증가 (예, 적어도 2배)를 뜻한다.

본 명세서에서 사용되는바, 용어 "유지하는 것" 및 "유지"는 실질적으로 분화가 없는 세포의 재생, 즉 분화가 수반되지 않고 실질적으로 세포 수가 정지되어 있는 것을 뜻한다.

논의된 바와 같이, 본 발명의 이러한 관점의 부착성 세포는 지방 또는 태반조직으로부터 분리된다.

태반 세포는 전체 출산 또는 출산 전 태반으로부터 얻을 수 있다. 태반은 바람직하게는 일단 탈혈시킨 후 수집한다. 태반은 바람직하게는 잔류 세포를 제거하는 데 충분한 시간동안 관류시킨다. 사용되는 용어 "관류시키는 것" 또는 "관류"는 기관 또는 조직에 걸쳐 또는 통하여 유체를 붓거나 통과시키는 작용을 의미한다. 태반 조직은 임의의 포유동물로부터 얻을 수 있다; 예를 들어, 태반 조직은 인간 것일 수 있다. 태반 조직의 편리한 소스는 출산 후 태반 (예, 1-6시간)이나, 태반 조직 또는 세포의 소스 또는 태반 조직을 분리하는 방법은 본 발명에 중요하지 않다.

태반 유래 부착성 세포는 태반의 태아 (예, 태반의 양막 또는 내부 부위, 실시예 1 참조) 및 산부 (예, 상탈락막, 및 벽쪽탈락막) 부분 양쪽으로부터 얻을 수 있다. 조직 표본을 생리 완충액에 세척한다 [예, 인산완충 생리수 (PBS) 또는 Hank 완충액]. 상기 조직을 소화 효소 (하기 참조)로 처리 또는/및 나일론 필터를 통해서 조직부분을 잘게 하고 흘려보냄으로써 또는 세척 배지로 부드럽게 피페팅 (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) 함으로써 단일-세포 현탁액을 만든다. 지방조직 유래 부착성 세포는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 방법은 미국 특허 제6,153,432호에 기술되어 있다. 지방 조직은 장막/내장, 유방, 성선 또는 다른 지방 조직 부위에서 유래될 수 있다. 지방 조직의 한가지 원천은 장막 지방이다. 인간에서, 지방질은 지방 흡인술로 분리된다. 지방 조직으로부터 분리된 부착성 세포는 상기 조직을 콜라게나제, 트립신 및/또는 디스파제와 같은 소화 효소로; 및/또는 효과적인 농도의 하이알로니다제 또는 DNA효소; 및 에틸렌디아민테트라-아세트산 (EDTA)으로; 25-50℃에서 10분 내지 3시간 동안 처리함으로써 얻어질 수 있다. 다음, 이러한 세포들을 20 미크론 내지 1 mm의 나일론 또는 치즈천 망상 필터로 통과시킨다. 다음 세포들을 배지에서 직접 또는 피콜 (Ficoll) 또는 퍼콜 (Percoll) 상에서 또는 다른 특별한 구배상에서 차등 원심분리한다. 세포들을 100 내지 3000× g의 속도로 1분 내지 1시간 동안 4-50℃의 온도에서 원심분리한다 (미국특허 제7,078,230호 참조).

태반 또는 지방조직 유래 부착성 세포에 더하여, 본 발명은 기질 줄기세포 표현형에 의해 특징되는 다른 세포 원으로부터 유래한 부착성 세포의 용도를 또한 관여한다 (하기에서 더욱 설명될 것이다). 부착성 세포들을 얻을 수 있는 조직원은, 모든 것은 중간엽 줄기세포를 포함한다고 알려진, 제대혈, 두피, 모낭 [예, 미국특허 출원번호 제20060172304호에 설명된 바와 같이], 고환 [예, Guan K., 등, Nature. 2006 Apr 27;440 (7088): 199-203에 설명된 바와 같이], 인간 코점막 [예, Marshall, CT., 등, Histol Histopathol. 2006 Jun; 21(6): 633-43에 설명된 바와 같이], 배아성 난황낭 [예, Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8; 427(6970): 148-54에 설명된 바와 같이] 및 양수 [Pieternella 등 (2004) Stem Cells 22: 1338-1345]을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조직원으로부터 얻은 부착성 세포는 부착표면에 세포를 배양시킴으로써, 초기 집단에서 다른 세포로부터 부착성 세포를 분리함으로써 얻어질 수 있다.

기원 (예, 태반 또는 지방조직)에 관계없이, 세포 추출은 바람직하게는 멸균 환경하에서 실시된다. 일단 분리된 세포를 얻으면, 이들을 부착 물질 (예 표면으로서 만들어질 수 있는)에 부착시키고, 이로써 부착성 세포를 분리한다. 배양은 실시예 4에서 설명되는 바와 같이 2D 조건하에서 진행될 수 있고, 세포를 3D 조건으로 옮길 수 있다. 본 발명에서 사용된바, "부착 물질"은 세포를 표면에 보유할 수 있는, 합성, 천연 또는 이들의 혼합의 비-세포독성 (즉, 생물학적으로 양립가능한) 물질을 뜻한다.

본 발명의 이러한 관점에 따라 사용될 수 있는 부착 물질의 예는, 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화폴리비닐, 폴리스티렌, 폴리술폰, 셀룰로즈 아세테이트, 유리섬유, 세라믹 입자, 마트리젤 (matrigel), 세포외 기질 성분 (예, 피브로넥틴, 콘드로넥틴, 라미닌), 콜라젠, 폴리 L 락트산 및 불활성 금속 섬유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기질줄기세포를 정제하거나 증대시킬 추가의 단계들은 당해 분야에 공지된 방법 (후술하는 바와 같이 기질 줄기세포 마커 발현을 이용하는 FACS에 의한 것과 같은)을 사용하여 실행될 수 있다.

본 발명에 따른 배양에 유용한 기본 배지의 비제한적 예는 MEM ( Minimum Essential Medium Eagle), ADC-I, LPM (우혈청 알부민이 없는), F10(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI1640, BGJ Medium (피톤-잭슨 변형이 있거나 없는), BME (Basal Medium Eagle, Earle의 염 기본물이 첨가된), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 무혈청), Yamane, IMEM-20, GMEM (Glasgow Modification Eagle Medium), Leibovitz L-15 Medium, McCoy's 5A Medium, Medium M 199 (M199E, Earle의 염 기본물이 첨가된), Medium M199 (M199H, Hank의 염 기본물이 첨가), Minimum Essential Medium Eagle (MEM-E, Earle의 염 기본물 첨가), Minimum Essential Medium Eagle (MEM-H, Hank의 염 기본물 첨가) 및 Minimum Essential Medium Eagle (MEM-NAA, 비필수 아미노산 첨가)를 포함하며, 다른 것으로는 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함한다. 본 발명의 용도에 바람직한 배지는 DMEM이다. 이러한 및 다른 유용한 배지들은 특히, 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재 GIBCO 및 이스라엘, 베트 하에멕 소재 Biological Industries에서 구입할 수 있다. 이러한 수많은 배지들은 Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, William B. Jakoby 및 Ira H. Pastan 편집, Academic Press, Inc. 간행에 요약되어 있다.

배지는 소 또는 다른 종의 태혈청과 같은 혈청, 및 조건적으로 또는 대안적으로, 성장인자, 비타민류 (예, 아스코르브산), 사이토카인류, 염류 (예, B-글리세로포스페이트), 스테로이드류 (예, 덱사메타손) 및 호르몬류, 예, 성장호르몬, 에리스로포이에틴 (erythropoietin), 트롬보포이에틴 (thrombopoietin), 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식세포 콜로니 자극 인자, c-키트 리간드/줄기세포 인자, 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin) 리간드, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 신경성장인자, 섬모향신경성 인자, 혈소판 유래 성장인자 및 골형성 단백질이 피코그람/ml 내지 밀리그람/ml 수준으로 첨가될 수 있다.

추가의 성분이 상기 배양 배지에 첨가될 수 있는 것이 인지된다. 그러한 성분들은 항생제, 항균제, 알부민, 아미노산 및 세포 배양에 대해 당해 분야에 공지된 다른 성분일 수 있다. 또한, 필요하다면 분화 과정을 향상시킬 성분들을 첨가할 수 있다 (하기 참조).

본 발명의 부착성 세포가 인간 대상체에 투여되는 경우, 세포 및 배양 배지 (예, 전술한 배지 첨가제를 가지는 경우)는 실질적으로 외부물질이 없는, 즉 임의의 동물성 오염물, 예, 마이코플라즈마가 없어야 한다. 예를 들어, 배양 배지는 혈청 대체물, 인간 혈청 및/또는 합성 또는 재조합으로 생성된 인자로 보충될 수 있다.

전술한 바와 같이, 일단 부착성 세포를 획득하면, 이들을 이차원 또는 삼차원 장치 (하기 실시예 1 및 4 참조)로 전이할 수 있다. 상기 세포를 분리 후 즉시 3D 형태의 매트릭스로 옮길 수 있거나 대안적으로, 이차원 조건 (전술한 바와 같이) 후 삼차원 장치로 옮길 수 있다.

따라서, 본 발명의 이러한 관점의 부착성 물질은 3D 배양에 대하여 적용되고 따라서 조직의 하부구조 (예, 태반)을 모사하기 위해 세포의 부착성을 위한 이용가능한 부착 표면을 실질적으로 증가시키는 성장 매트릭스를 제공한다.

대량 생산을 위해, 배양은 3D 생물반응기에서 실행될 수 있다. 그러한 생물 반응기의 예는, 플럭 플로우 생물 반응기, 연속 교반 탱크 생물 반응기, 정지상 생물 반응기, CelliGen Plus® 생물 반응기 시스템 (New Brunswick Scientific (NBS) 또는 BIOFLO 310 생물 반응기 시스템 (New Brunswick Scientific (NBS)을 포함한다.

실시예 4에서 나타난 바와 같이, 상기 Celligen 생물 반응기는 조절된 조건 하 (예, pH, 온도 및 산소 수준) 및 연속 세포 성장 배지 관류하에서 부착성 세포의 3D 확장을 수행할 수 있다. 더구나, 상기 세포 배양물은 글루코즈, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트 및 암모늄의 농도에 대하여 직접적으로 모니터될 수 있다. 부착성 세포의 글루코즈 소비율 및 락테이트 형성률은 세포 성장율을 측정하고 수확 시기를 결정할 수 있게 한다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 3D 생물반응기는 연속 교반 탱크 생물 반응기를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 상기 생물 반응기에서, 배양 배지가 생물 반응기로 연속적으로 공급되고 생성물이 연속적으로 인출되어서 반응기 내부에서는 시간-연속적 항상 상태를 유지한다. 섬유상 바스켓이 구비된 교반된 탱크 생물 반응기는 예를 들어, 뉴저지 에디슨 소재 New Brunswick Scientific Co.로부터 구입할 수 있고, 정지상 생물 반응기, 공기 양력 생물 반응기 (여기서, 공기가 중앙 통풍 튜브의 바닥으로 공급되고 위로 흐르는 동안 거품을 형성하며, 칼럼의 상부에서 소비된 가스를 배출한다), 폴리활성 포말을 형성하는 세포 심기 관류 생물 반응기 (Wendt, D. 등, Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)에서 설명된 바와 같은), 방사성-흐름 관류 생물 반응기에서의 관형 폴리-L-락트산 (PLLA) 다공성 구조체 (Kitagawa 등, Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)에서 설명된 바와 같은)이 유용할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 다른 생물 반응기는 미국특허 6,277,151, 6,197,575, 6,139,578, 6,132,463, 5,902,741 및 5,629,186에 설명되어 있다.

세포 심기는 바람직하게는 100,000-1,500,000 세포/mm로 실행된다. 실시 구체예에서, 총 150±30×10⁶ 세포를 심거나, 3-5×10⁶ 세포/gr 캐리어를 심거나, 0.015-0.1×10⁶ 세포/ml를 심는다.

제어되지 못한 분화 및 노화를 피하면서, 세포의 적어도 약 10%가 증식될 때, 세포를 수집할 수 있다.

배양은 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 1달 또는 그 이상 수행된다. 생물반응기에서의 배양은 이러한 기간을 늘릴 수 있는 것으로 이해될 것이다. 3D 배양에서의 부착성 세포의 배양은 배지의 연속 흐름 하에서 수행될 수 있다. 계대 배양 또한 세포수를 늘리기 위해 수행될 수 있다. 배양 배지를 교체하여 배양 조건을 연장시키고 향상시킬 수 있다.

본 발명의 특정 구체예의 부착성 세포는 적어도 약 10%, 28%, 30%, 50%, 80% 또는 그 이상의 증식성 세포 (S 및 G2/M 상을 모니터링하는 FACS로 분석될 수 있는 바와 같이)를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예의 부착성 세포는 적어도 하나의 "기질 줄기세포 표현형"을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "기질 줄기세포 표현형"은 골수 유래 기질 (예, 중간엽) 줄기세포에 전형적인 구조적 또는 기능적 표현형을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기세포"는 종결적으로 분화되지 않는 세포를 뜻한다.

따라서, 예를 들어, 상기 세포는 스핀들 형상을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 세포는 기질 줄기세포에 전형적인 마커 또는 마커 집단 (예, 표면 마커)을 발현할 수 있다. 기질 줄기세포 표면 마커 (음성 및 양성)의 예는 CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD3-, CD4-, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, 및 FMC7-를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 기질 줄기세포 마커들은 타이로신 하이드록실라제, 네스틴 및 H-NF를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 교시에 따라 생성된 태반 조직의 부착성 세포는 하기 실시예 4에서 설명된 바와 같이 본질적으로 유전자 발현 프로필을 가진다.

기질 줄기세포에 전형적인 기능적 표현형의 예는 T 세포 억제 활성 (T 세포를 자극하지 않고 역으로 억제하는), 조혈성 줄기세포 지지 활성은 물론, 지방원성, 간원성, 골원성, 신경원성 분화 중 임의의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 구조적 또는 기능적 특성의 임의의 것을 사용하여 본 발명의 세포를 적합화시킬 수 있다 (하기 실시예 4).

본 발명의 교시에 따라 생성된 세포군은 실시예 1에서 나타난 바와 같이 독특한 단백질 발현 프로필로 특징된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 교시에 따라 형성된 태반 또는 지방 조직의 부착성 세포는 고도의 선택된 인자를 발현하고 및/또는 분비할 수 있다. 예를 들어, 그러한 세포들은 SCF, Flt-3, H2A 히스톤 군 (H2AF) 또는 알데히드 디히드로게나제 X (ALDH X)를 2D 배양에서 성장한 태반 또는 지방 조직의 부착성 세포에 의해 발현되거나 분비된 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 또는 12배까지 높게 발현하거나 분비할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 세포군은 IL-6, 진핵성 번역신장인자 2 (EEEF2), 레티큘로칼빈 (reticulocalbin) 3, EF-핸드칼슘 결합 도메인 (RCN2) 또는 CNN1 (calponin 1 basic smooth muscle)를 2D 배양물에서 성장한 태반 또는 지방 조직의 부착성 세포에 의해 발현되거나 분비된 것보다 적어도 2, 3 또는 5배 크게 분비하거나 발현시킨다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 세포군은 2D 배양된 세포에 비하여 다양한 다른 단백질을 더 낮은 수준으로 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들어, 2D 배양에서 자란 태반 또는 지방 조직의 부착성 세포에 의해 발현되거나 분비되는 이종 핵 리보핵산단백질 H1 (HnrpH1), CD44 항원 이소유형 2 전구체, 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 신타제 2 이소유형 a (Papss2) 또는 리보조말 단백질 L7a (rpL7a) 발현수준의 0.6, 0.5, 0.25 또는 0.125보다 적게 분비하거나 발현한다.

실시예 3-4에서 나타난 바와 같이, 부착성 세포 및 특히 3D-부착성 세포는 혼합된 임파구 반응 (MLR) 분석에서 인간 제대혈 단핵구 세포의 면역 반응을 억제하고 따라서 임상에 선호적으로 사용될 수 있는 생물학적 활성 (예, T 세포 억제 활성, 조혈성 줄기세포 지지 활성)을 나타낸 것으로 발견되었다.

본 발명의 일 구체예에 따라서, 본 발명의 부착성 세포는 대상체에서 면역 반응을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상체에서 면역 반응을 억제시키는 것"은 항원 (예, 외부 세포 또는 이의 일부)에 반응하여 대상체에서 일어나는 면역반응을 감소시키거나 저해하는 것을 뜻한다. 부착성 세포에 의해 억제될 수 있는 면역 반응은 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응으로, 각각 항원 및 T-임파구 (T 세포의 증식)를 통한 병원성 항원의 특이적 인식을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따라서, 본 발명의 부착성 세포는 이차원(2D) 배양에서 성장된 태반 또는 지방 조직의 부착성 세포의 것보다 높은 면역억제 활성을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 면역억제 활성은 T 세포 증식에서의 감소를 포함한다.

상기에서 및 하기 실시예에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 부착성 세포는 생체내에서 혈관생성을 유도하고 (예, 힙과 다리에서의 혈류), 동맥 결찰된 동물의 사지 기능을 상당히 향상시키고, 모세혈관 밀도를 증가시키고 및 산화성 스트레스 및 내피세포 염증을 감소시킨다. 더구나, 실시예 7에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 부착성 세포는 래트 모델에서 뇌졸중으로부터 회복을 상당히 향상시켰다.

따라서, 본 발명의 다른 관점에 따라서, 필요한 대상체에서 허혈을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 대상체에, 본 발명의 부착성 세포의 치료학적으로 효과적인 양을 투여하여 대상체에서 허혈을 치료하는 것을 포함한다.

용어 "허혈"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 불충분한 혈관생성으로 특징되거나 연계된 임의의 병리 (질병, 상태, 증후군, 질환)을 뜻한다. 이의 예는, 사지 허혈 및 중증사지 허혈 (CLI)와 같은 말초 동맥 질환 (PAD), 허혈성 심장병, 허혈성 뇌질환 (예, 뇌졸중), 지연된 상처-치유, 지연된 궤양 치유, 재생 관련 질환, 동맥경화, 허혈성 혈관 질환, 허혈성 심장병, 심근 허혈, 관상동맥질환 (CAD), 동맥경화성 심혈관 질환, 좌주관상동맥 질활 (left main coronary artery disease), 동맥 폐색성 질환, 말초 허혈, 말초 혈관 질환, 신장 혈관 질환, 말초 동맥 질환, 사지 허혈, 하지 말단 질환, 뇌허혈, 뇌혈관 질환, 망막변증, 망막 복구, 리모델릴 질환, 폰 히펠-린다우 증후군, 유전성 출혈성 모세혈관확장허혈성 혈관질환, 버기씨 병, 허혈성 신장 질환 및 허혈성 태반을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 병리 (예, 허혈)의 발달을 저해하거나 붙잡아 두는 것 및/또는 병리의 감소, 면제 또는 퇴보를 야기하는 것을 뜻한다. 당해 분야의 기술자는 다양한 방법론 및 분석법들이 병리의 발달을 산정하는 데 사용될 수 있고, 및 유사하게, 다양한 방법론 및 분석법들을 사용하여 병리의 감소, 면제 또는 퇴보를 산정할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 용어 "치료"는 또한 병리와 연관된 증상을 약화 또는 감퇴시키는 것을 뜻한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "필요한 대상체"는 병리로 진단되었거나 가지고 있는 인간 대상체와 같은 임의의 대상체 (예 포유동물)를 지칭한다. 상기에서 언급되고 및 하기 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 부착성 세포가 결합조직 재생 및/또는 복구를 할 수 있다고 발견하였다.

따라서, 본 발명의 다른 관점에 따라서, 필요한 대상체에서 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 부착성 세포를 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여함으로써 수행된다.

용어 "결합조직"은 콜라젠, 탄성 섬유 (예, 근육 및 혈관 사이 및 그 주위), 및 단순 세포의 선을 포함하는 지지 구조물 조직을 지칭한다. 결합조직의 예는, 방어 결합조직 (예, 인대, 힘줄, 치주 인대), 윤문 결합조직 (예, 콜라젠 및 엘라스틴과 같은 단백질성 섬유를 가진), 망상 결합조직, 지방 조직, 혈액, 뼈, 연골, 피부, 추간원판, 치수, 상아질, 잇몸, 세포외 기질 (ECM)-형성 세포, 성긴 결합조직 및 평활근 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

사용되는 바와 같이, 용어 "결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 의학적 상태"는 결합조직 손상 (예, 비기능성 조직, 암 또는 예비 암성 (pre-cancerous) 조직, 파괴된 조직, 골절된 조직, 섬유소성 조직 또는 허혈성 조직) 또는 손실 (예, 외상, 감염성 질환, 유전성 질환 등의 후에)로 특징되는 임의의 병리를 지칭한다. 그러한 병리의 비제한적 예는 뼈 골절, 골암 (예, 골육종, 골암 전이), 화상 상처, 관절 연골 손상 및 깊은 상처를 포함한다.

용어 "대상체에 투여하는 것"은 본 발명의 세포를 목표 조직에 도입하는 것을 지칭한다. 상기 세포는 수혜자로부터 또는 동종이계의 또는 이종 공여자로부터 유도될 수 있다. 이러한 용어는 또한 본 발명의 세포를 대상체에 "이식", "세포 치환" 또는 "접붙이는 것"을 포함한다.

상기 대상체는 예를 들어, 인간이나, 또는 말, 소, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이, 낙타, 알파카, 라마 및 야크를 포함하지만 이에 한정되지 않는 가축을 위시하여, 결합조직 재생 및/또는 복구가 필요한 임의의 포유류일 수 있다.

본 발명의 교시의 일 구체예에 따라, 본 발명의 부착성 세포를 사용하여, 연골하골 낭포, 뼈골절, 골다공증, 골관절염, 퇴행된 뼈, 결합조직 손실과 연계된 다양한 암 (예, 골암, 골육종, 골 전이), 연골손상, 관절 연골 손상, 퇴행성 디스크 질환, 골형성 부전증 (OI), 화상, 화상 상처, 깊은 상처, 지연된 상처 회복, 손상된 인대와 손상된 힘줄, 예, 말 및 (상술한 바와 같이) 필요한 다른 대상체에서 과부하로 인한 손상을 포함하는 상태를 치료할 수 있다.

본 발명의 이러한 관점에 따라서 투여될 수 있는 세포들은 삼차원 또는 이차원 장치에서 배양될 수 있는 전술한 부착성 세포는 물론 이들의 중간엽 및 부분적 또는 최종적으로 분화되지 않은 중간엽 유도체를 포함한다.

본 발명의 기질 줄기세포로부터 계열 특이성 세포를 유도하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 5,486,359, 5,942,225, 5,736,396, 5,908,784 및 5,902,741를 참조.

상기 세포는 순전한 것 또는 관심의 계열을 유도하기 위한 것과 같이 유전적으로 변형될 수 있다 (미국특허 출원번호 20030219423 참조).

상기 세포는 신선한 또는 동결된 (예, 동결 보존된) 제조물의 자가 또는 비자가 원천 (예, 동종이계 또는 이종)일 수 있다. 의학적 상태에 따라서, 상기 대상체는 추가의 화학 약물 (예, 면역조절, 화학요법, 등) 또는 세포로 투여될 수 있다.

비-자가 세포를 투여시 면역반응을 유도할 수 있기 때문에, 비자가 세포의 거부 가능성을 감소시키는 몇 가지 방법이 개발되었다. 이러한 것은 수혜자 면역 체계를 억제하거나, 이식 전에 비자가 세포를 면역분리, 반투성 막으로 캡슐화하는 것을 포함한다.

캡슐화 기술은 일반적으로 소구형 담체를 위시한 마이크로캡슐화 및 더 큰 편평-시트 및 중공 섬유막을 위시한 마크로캡슐화로 나누어진다 (Uludag, H. 등, Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).

마이크로캡슐 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들어, Lu MZ, 등의 Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine) (알지네이트 및 알파-페녹시신아밀리덴-아세틸화된 폴리(알릴아민)으로 세포 캡슐화). Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM 및 Prakash S.의 Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms (효소, 세포 및 유전공학적 미생물의 마이크로캡슐화 방법). Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, 및 Lu MZ, 등의 A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha- cyanocinnamylideneacetate) (광감성 폴리(알릴아민 알파-신아밀리덴아세테이트)를 사용한 신규의 세포 캡슐화 방법). J. Microencapsul. 2000, 17: 245-51에 개시된 것을 포함한다. 예를 들어, 개질된 콜라젠을 2-하이드록시에틸 메틸아크릴레이트 (HEMA), 메타크릴 산 (MAA) 및 메틸 메타크릴레이트 (MMA)의 삼중합체 껍질로 복합화하여 2-5 μm 캡슐 두께를 만듦으로써 제조된다. 그러한 마이크로캡슐은 추가의 2-5 μm 삼중합체 껍질로 더 캡슐화되어 음하전 평활 표면을 제공하고 혈장 단백질 흡수를 최소화시킬 수 있다 (Chia, S. M. 등, Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

다른 마이크로캡슐들은 해양 다당체인 알지네이트 (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) 또는 이의 유도체에 기초한다. 예를 들어, 마이크로캡슐은 염화칼슘의 존재하에서 다중 음이온 소듐 알지네이트와 다중 양이온 폴리(메틸렌-코-구아니딘) 하이드로클로라이드를 가진 소듐 셀루로즈 설페이트와의 다중전해질 착화에 의해 제조될 수 있다. 저 작은 캡슐을 사용할 때 세포 캡슐화가 개선된다는 것을 알게 된다. 따라서, 캡슐화된 세포의 품질 조절, 기계적 안정성, 분산 특성 및 시험관 내 활성은 캡슐 크기가 1 mm에서 400 μm로 감소될 때 향상된다 (Canaple L. 등, Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002; 13: 783-96). 더욱이, 7 nm 만큼 작은 잘 조절된 기공 크기, 맞추어진 표면 화학 및 정밀한 마이크로구조를 가진 나노다공성 생캡슐은 세포에 대하여 미소환경을 성공적으로 면역분리한다는 것을 발견하였다 (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).

면역억제제의 예는 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 시클로스포린 A, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진 (설파살라조피린), 금 염, D-페니실아민, 레플루노마이드, 아자티오프린, 아나킨라, 인프릭시맙 (REMICADE), 에타네르셉트, TNF 알파, 차단제, 염증성 사이토카인을 겨냥하는 생물학제제, 및 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDs)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. NSAIDs의 예는 아세틸 살리시클릭산, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트, 살사레이트, 소듐 살리실레이트, 디클로페낙, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 메크로페나메이트, 나프록센, 나부페톤, 페닐부타존, 피록시캄, 설린닥, 톨메틴, 아세트아미노펜, 이부프로펜, Cox-2 저해제 및 트라마돌을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 설명된 방법 중 임의의 것에서, 상기 세포를 그 자체로 또는 바람직하게는 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물의 일부분으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된바, "약학적 조성물"은 본 발명의 부착성 세포 (예, 태반 및 지방조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직의, 삼차원 배양으로부터 얻은 부착성 세포)와 약학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과의 제조물을 지칭한다. 약학적 조성물의 목적은 대상체에 상기 세포을 용이하게 투여하기 위한 것이다.

이하, 용어 "약학적 허용 담체"는 대상체에 심각한 자극을 야기하지 않고 및 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 담체의 예는, 제한없이, 프로필렌 글리콜, 살린, 에멀전 및 유기 용매와 물의 혼합물이다.

여기서, 용어 "부형제"는 약학 조성물에 투여되어 화합물의 투여을 더 용이하게 하려는 불활성 물질을 지칭한다.

제한없는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 다양한 당류 및 유형, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜류를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 약학적 담체는 식염수의 수용액이다.

약물의 조성 및 투여 방법은 참조문헌에 포함된, "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판을 참조할 수 있다.

한가지는 약학 조성물을 전신적 방식으로 투여할 수 있다 (전술한 바와 같이). 대안적으로, 한가지는 약학 조성물을 국소적으로, 예를 들어, 약학 조성물을 환자의 조직 부위로 직접적으로 주사하는 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 당해 분야에 공지된 방법으로, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 균질화, 에멀전화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 공정으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 용도의 약학 조성물은 따라서 활성 성분을 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로 제조하는데 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적 허용 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 배합될 수 있다. 적절한 배합물은 선택된 투여 경로에 의존한다.

주사의 경우, 상기 약학 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 Hank 용액, 링거액, 생리적 염 완충액, 또는 동경보존제를 함유하는 동결 배지와 같은 생리적 양립 완충액에서 배합될 수 있다. 경피 투여로는, 투과될 장애물에 적합한 투과제가 그 배합에 사용된다. 그러한 투과제들은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 방법에 사용된 임의의 제조물의 경우, 치료적 유효량 또는 투여량은 시험관 내 및 세포 배양 분석으로 처음부터 산정될 수 있다. 바람직하게는, 일회 투여량은 원하는 농도 또는 역가를 얻기 위해 동물 모델에서 정해질 수 있다. 그러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 투여량을 좀더 정확히 결정할 수 있다.

본 발명에서 설명된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 시험관 내 표준 약학 방식으로 결정될 수 있다.

이러한 것으로부터 시험관 내 및 세포 배양 시험법 및 동물 연구에서 얻어진 데이터를 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용할 수 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 배합, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태의 관점에서 개별 의사가 결정할 수 있다 (참조, 예를 들어, Fingl, 등, 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l). 예를 들어, 파킨슨 환자를 치료에 긍정적 반응을 나타낸 향상된 운동 기능에 대하여 증상적으로 모니터할 수 있다.

주사액의 경우, 상기 약학 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 Hank 용액, 링거액 또는 생리적 염 완충액과 같은 생리적 양립 완충액에서 배합될 수 있다.

투여량 및 간격은 이식된 세포에 의한 신경전달 물질 합성을 효과적으로 제어하기에 충분한 활성 성분의 수준으로 개별적으로 조절될 수 있다. 원하는 효과를 성취하기에 필요한 투여량은 개별 특성 및 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 방법을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.

처치될 상태의 중증도 및 반응도에 의존하여, 치료 경과가 수 일에서부터 수 주간 지속되는 가운데 투여를 단 회 또는 수 회 하여 질병 상태를 약화시킬 수 있다. 투여될 조성물의 양은, 물론, 처리되는 개별 환자, 질환의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 달려 있다. 투여의 용량과 시간은 개별 변화 조건을 면밀히 그리고 지속적으로 감시하는 것에 민감하게 된다. 예를 들어, 처치된 파킨슨 환자는 모니터링 지시에 근거하여, 질환의 증상을 약화시키는 데 충분한 양의 세포로 투여될 것이다.

인대 손상에 대한 모델은, 중간엽 줄기세포를 사용한 앞다리 십자 인대 재건의 토끼 모델 [Jit-Kheng 등, Arthroscopy (2004) 20(9): 899-910], 및 앞다리 십자 인대 복구를 위한 장기간 생체흡수성 구조물을 사용하는 염소 모델 [Altman 등, J Am Acad Orthop Surg. (2008) 16(4): 177-187]을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 힘줄 복구 모델은 힘줄의 자가 중간엽 줄기세포-중재 복구용 뉴질랜드 화이트 토끼 모델 [Awad 등, Tissue Eng. (1999) 5(3): 267-77]을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 뼈 복구용 모델은 예를 들어, 뼈 복구를 위해 중간엽 줄기세포를 조작하는 것을 설명한 Stem Cells in Endocrinology, Humana Press (2005) 183-206에 설명되어 있다. 이식 후, 본 발명의 세포는 바람직하게는 일정 시간동안 (예, 약 1달) 질환 부위에서 살아남아서 치료 효과가 관찰된다.

사용가능한 약학적 담체에 배합된 본 발명의 제조물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적절한 용기에 놓고, 지정된 상태를 치료하기 위한 표지를 붙일 수 있다.

본 발명의 조성물은, 필요 시, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 포함하는, FDA 승인 키트와 같은, 포장물 또는 분배 장치에 있을 수 있다. 상기 포장물은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 이러한 팩 또는 분배 장치는 투여 지시서를 포함할 수 있다. 이러한 팩 또는 분배기는 또한 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 통지서가 수반되어 있고 상기 통지서는 조성물의 형태 또는 인간이나 수의 동물 투여에 관하여 상기 기관의 승인을 나타내고 있다. 그러한 통지서는, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지이거나 승인된 제품 간지일 수 있다.

본 발명의 부착성 세포는 약학 조성물로 적절히 배합될 수 있고 이는 제품으로 적절히 포장될 수 있다. 그러한 제품은 조직에서 혈관 생성을 증가시키는 데, 허혈을 치료하는 데 및/또는 결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 병리를 치료하는 용도의 표지를 포함하는 포장물을 가지며, 이러한 포장물은 본 발명의 부착성 세포를 포장한다.

본 발명의 부착성 세포는 대상체에서 면역억제 및/또는 내성을 유도할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 부착성 세포를 사용하여 면역억제 및/또는 내성이 필요한 임의의 상태를 치료할 수 있다. 그러한 상태는 심혈관 질환, 류머티스성 질환, 선성 (glandular) 질환, 위장질환, 피부질환, 간장질환, 신경 질환, 근육 질환, 신관 질환, 재생에 관련된 질환, 결합조직 질환, 및 전신질환을 포함하는 이에 한정되지 않는다.

자가면역질환의 예는, 아테롬성 동맥경화증 (Matsuura E. 등, Lupus. 1998; 7 Suppl 2: S135), 심근경색 (Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2: S132), 트롬보시스 (Tincani A. 등, Lupus 1998; 7 Suppl 2: S 107-9), 베게너 육아종증, 타카야수 동맥염, 가와사키 증후군 (Praprotnik S. 등, Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 1 12 (15-16): 660), 항-인자 VIII 자가면역 질환(Lacroix-Desmazes S. 등, Semin Thromb Hemost.2000; 26(2): 157), 괴사성 소혈관염, 현미경성 다발성혈관염, 처그-스트라우스 증후군, 불충분 면역성 국소 괴사성 반월상 사구체신염(pauci-immune focal necrotizing and crescentic glomerulonephritis) (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151(3): 178), 항인지질 증후군 (Flamholz R. 등, J Clin Apheresis 1999; 14(4): 171), 항원-유도 심장마비 (Wallukat G. 등, Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83(12A): 75H), 혈전성 혈소판 감소증 (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14(2): 114; Semple JW. 등, Blood 1996 May 15; 87(10): 42-45), 자가면역성 용혈성 빈혈 (Efremov DG. 등, Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28(3-4): 285; Sallah S. 등, Ann Hematol 1997 Mar; 74(3): 139), 샤가스 병에서의 심장 자가면역성 (Cunha-Neto E. 등, J Clin Invest 1996 Oct 15; 98(8): 1709) 및 항-헬퍼 T 임파구 자가면역성 (Caporossi AP. 등, Viral Immunol 1998; 11(1): 9)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 류마티스 질환의 예는, 류마티스 관절염 (Krenn V. 등, Histol Histopathol 2000 JuI; 15(3): 791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18; 91(2): 437) 및 강직성 척수염 (Jan Voswinkel 등, Arthritis Res 2001; 3(3): 189)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 선성 질환의 예는 췌장질환, 유형 I 당뇨병, 갑상선 질환, 그레이브 질환, 갑상선염, 자연적 자가면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액수종, 난소성 자가면역, 자가면역성 항-정자 불임증, 자가면역성 전립선염, 유형 I 자가면역성 다분비성 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 질환의 예는 췌장의 자가면역 질환, 유형 I 당뇨병 (Castano L. 및 Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8: 647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl: S125), 자가가면역성 갑상선 질환, 그레이브 질환 (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29(2): 339; Sakata S. 등, MoI Cell Endocrinol 1993 Mar; 92(1): 77), 자연적 자가면역 갑상선염 (Braley-Mullen H. 및 Yu S, J Immunol 2000 Dec 15; 165(12): 7262), 하시모토 갑상선염 (Toyoda N. 등, Nippon Rinsho 1999 Aug; 57(8): 1810), 특발성 점액수종 (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57(8): 1759), 난소성 자가면역 (Garza KM. 등, J Reprod Immunol 1998 Feb; 37(2): 87), 자가면역성 항-정자불임증 (Diekman AB. 등, Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43(3): 134), 자가면역성 전립선염 (Alexander RB. 등, Urology 1997 Dec; 50(6):893) 및 유형 I 자가면역성 다분비성 증후군 (Hara T. 등 Blood, 1991 Mar 1; 77(5): 1127).

자가면역성 위장관 질환의 예는 만성 염증성 장관 질환 (Garcia Herola A. 등, Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23(1): 16), 복강질환 (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138(2): 122), 대장염, 회장염 및 크론병을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 피부질환의 예는 심상성 천포창, 수포성 유천포창 및 낙엽성 천포창과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 자가면역성 수포성 피부질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역 간성 질환의 예는, 간염, 자가면역성 만성 활성 간염 (Franco A. 등, Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54(3):382), 일차 담즙 간경변 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 91(5):551; Strassburg CP. 등, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11(6): 595) 및 자가면역성 간염 (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug; 33(2): 326)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 신경질환의 예는, 다발성 경화증 (Cross AH. 등, J Neuroimmunol 2001 Jan 1; 112(1-2):1), 알츠하이머 질환 (Oron L. 등, J Neural Transm Suppl. 1997; 49: 77), 중증 근무력증 (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18(1-2): 83; Oshima M. 등, Eur J Immunol 1990 Dec; 20(12): 2563), 신경장애, 운동신경장애 (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May; 7(3): 191); 길랭-바레 증후군 및 자가면역 신경장애 (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319(4): 234), 근무력증, 램버트-이튼 근무력증증후군 (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319(4): 204); 부종양성 신경질환, 대뇌위축, 부종양성 대뇌 위축 및 근육 강직 증후군 (Hiemstra HS. 등, Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27; 98(7): 3988); 비-부종양성 강직 증후군, 진행성 대뇌 위축증, 뇌염, 라스무센 뇌염, 근위축성 측색 경화증, 시드남 무도병, 질 들 라 뚜레 증후군 및 자가면역성 다중내분비 질환 (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156(1): 23); 면역장애 신경질환 (Nobile-Orazio E. 등, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50: 419); 후천성 신경근육긴장증, 선천다발성 관절만곡증 (Vincent A. 등, Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13; 841: 482), 신경염, 시신경염 (Soderstrom M. 등, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May; 57(5): 544) 및 신경퇴행성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 근육 질환의 예는, 근육염, 자가면역성 근육염과 일차 쇼그렌 증후군 (Feist E. 등, Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123(1): 92) 및 평활근 자가면역 질환 (Zauli D. 등, Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53(5-6): 234)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

*자가면역성 신관 질환의 예는 신염 및 자가면역성 간질성 신염 (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug; 1(2): 140)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

재생에 관련된 자가면역성 질환의 예는, 반복되는 유산 (Tincani A. 등, Lupus 1998; 7 Suppl 2: S107-9)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 결합조직 질환의 예는, 자가면역성 귀질환 (Yoo TJ. 등, Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249) 및 내이의 자가면역성 질환 (Gloddek B. 등, Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830: 266)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

자가면역성 전신성 질환의 예는, 전신성 홍반성 낭창 (Erikson J. 등, Immunol Res 1998; 17(1-2):49) 및 전신성 경화증 (Renaudineau Y. el al, Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6(2): 156); Chan OT. 등, Immunol Rev 1999 Jun; 169: 107)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 부착성 세포를 사용하여, 이식편 거부반응, 만성 이식편 거부반응, 아급성 이식편 거부반응, 과급성 이식편 거부반응, 급성 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ±10%를 의미한다.

본 발명의 또 다른 목적, 장점 및 신규한 특징들은 제한적으로 의도되지 않는 하기 실시예를 검토하면 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 다양한 구체예 및 관점 각각은, 전술한 바와 같이 그리고 청구범위에서 청구된 바와 같이, 하기 실시예에서 실험적 근거를 발견한다.

실시예

전술한 설명과 함께 본 발명을 비제한적 형태로 설명하는 하기 실시예를 참고한다.

일반적으로 여기서 사용된 용어 및 본 발명에서 이용된 실험적 과정은 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 그러한 기술들은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., 편집. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", VoIs. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국특허 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 나타난 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes MII Cellis, J. E., 편집. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., 편집. (1994); Stites 등 (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8판), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (편집), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980) 참조; 특허와 과학 문헌에 광대하게 설명된 이용가능한 면역분석법, 참조, 예를 들어, 미국특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., 편집 (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., 편집 (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., 편집 (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, 편집 (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등, "Strategies for 단백질 Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) 참조; 이 모든 문헌은 여기에 설정된 바와 같이, 참조문헌에 기입되어 있다. 다른 일반적인 참조문헌들은 이러한 문서 도처에 제공된다. 제시되는 절차들은 당해 분야에 공지된 것으로 믿어지며 독자들의 편의를 위해 제공된다. 제시된 모든 정보는 참조문헌에 기입되어 있다.

실시예 1

골수, 태반 및 지방조직으로부터 부착성 세포의 생성 및 배양

특이성 세포 마커 발현 프로필로 특징되는 부착성 세포를 3D 담체를 포함하는 생물 반응기에서 배양하여 3D-부착성 세포를 생성하였다. 세포 계수하여 성장 효율을 정하였다. 이러한 세포의 분화 능력은 분화 배지에서 배양함으로써 시험되었다.

재료 및 방법

골수 부착성 세포 - 골수 (BM) 부착성 세포를 개흉 수술 또는 BM 생검으로 혈액적으로 건강한 공여자의 흡인된 흉골 골수로부터 얻었다. 골수 흡인물을 행크 평형 염용액 (HBSS; GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersburg MD)에 3배 희석시키고 Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA) 밀도 구배 원심분리하였다. 다음, 골수 단핵구 세포 (<1.077 gm/cm³)를 수집하고, HBSS로 세 번 세척하고 및 성장 배지 [10% FCS (GIBCO BRL), 10^-4 M 머캡토에탄올 (Merck, White House Station, NJ), 펜-스트렙-나이스타틴 (Pen-Strep-Nystatin) 혼합물 (100 U/ml:100 μg/ml: 1.25 un/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM L-글루타민 (Beit Ha'Emek)으로 보충된 DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel)]에 현탁하였다. 개별 공여자로부터의 세포를 조직 배양 플라스크 (Corning, Acton, MA)에 37℃ (5% CO₂)에서 개별적으로 배양하고 배양 배지를 주간 단위로 교체하였다. 세포를 0.25% 트립신 EDTA (Beit Ha' Emek)를 사용하여 3-4일마다 계대배양하였다. 2-40번의 계대 배양 후, 60-80% 밀집도에 달했을 때, 세포를 수집하여 분석 또는 생물반응기에서 배양하였다.

태반 유도 부착성 세포 - 온전한 임신 출산 태반의 내부 부분 (Bnei Zion medical center, Haifa, Israel)을 멸균 조건에서 자르고, 행크 완충액으로 3번 세척하고 및 37℃에서 0.1% 콜라게나제 (1 mg/ml 조직; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO)로 3시간 처리하였다. 부드럽게 피펫팅하여, 현탁된 세포를 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물 (100 U/ml:100 μg/ml:1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM으로 세척하고, 75 cm² 플라스크에 심고, 5% CO₂를 함유한 습기 조건에서 37℃의 조직 배양기에서 배양하였다. 그 후, 세포를 72시간 동안 플라스틱 표면에 부착한 후, 배지를 3-4일 마다 교체하였다. 60-80% 밀집도 (통상 10-12일)에 달했을 때, 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 성장 플라스크에서 떼어내고 새로운 플라스크로 옮긴다. 배양된 세포를 수집하여 분석하거나 생물 반응기에서 배양하였다.

지방 유래 부착성 세포 - 부착성 세포를 지방 흡입 방법 (Rambam Haifa, Israel)로 인간 지방 조직으로부터 얻었다. 지방 조직을 동일 량의 PBS로 많이 세척하고 콜라게나제 (20 mg/ml)로 30분간 37℃에서 분해하였다. 다음 세포를 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물 (100 U/ml: 100 μg/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM으로 세척하고 실온 (RT)에서 10분간 1200 rpm에서 원심분리시키고, 용해용액에 현탁시키고 (1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, 적혈구 세포를 버리기 위해), 원심불리시키고, 및 10% FCS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물 (100 U/ml: 100 μg/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM에 현탁시켰다. 다음, 세척된 세포를 멸균 조직 배양 배지 플라스크에 3-10×10⁷ 세포/플라스크로 심었다. 다음날, 세포를 PBS로 세척하여 잔류 RBC 및 죽은 세포를 제거하였다. 세포를 5% CO₂를 가진 습윤 조건하의 조직 배양기에서 보관하였다. 배지를 3-4일 마다 교환하였다. 60-80% 밀집도에서, 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 성장 플라스크에서 떼어내고 새로운 플라스크에 심었다. 2-40번 계배 배양 후, 세포가 60-80% 밀집도에 달했을 때, 수집하여 분석하고 생물반응기에서 배양하였다.

PluriX^TM Plug Flow 생물 반응기 - PluriX^TM Plug Flow 생물 반응기 (Pluristem, Haifa, Israel; 도 1G에 도시, 미국특허 6,911,201 참조)에 폴리에스테르의 부직포 매트릭스로 만든 1-100 ml 포장된 3D 포로시브 (porrosive) 담체 (직경 4 mm)를 적재하였다. 이러한 담체들은 상대적으로 작은 체적에서 큰 수의 세포를 증식시킬 수 있다. 용기는 Pluristem (Pluristem, Haifa, Israel)에서 고안되고 제작되었다. 상기 생물 반응기를 37℃의 배양기에서 유지되고, 유동율은 밸브 (도 1G의 6a) 및 연동 펌프 (도 1G의 9)에 의해 조절되고 모니터되었다. 생물반응기는 샘플링 및 주입 포인트 (도 1G의 4)를 함유하며, 세포를 연속적으로 심을 수 있게 한다. 배양 배지는 저장소 (도 1G의 1)로부터 pH 6.7-7.4에서 공급되었다. 저장소는 생물 반응기 내에서 세포 밀도에 의존하여 다른 비율로 공기/CO₂/O₂를 함유하는 여과된 가스 혼합물 (도 1G의 2, 3)에 의해 공급된다. O₂ 비율은 생물 반응기 출구에서 용해된 O₂의 수준에 맞추어지며, 모니터 (도 1G의 6)에 의해 결정된다. 가스 혼합물을 실리콘 튜브 또는 확산기 (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel)를 통해 상기 저수조에 공급된다. 배양 배지는, 유동하는 비부착성 세포를 수집할 수 있는 분리 용기 (도 1G의 7)을 통해 통과된다. 상기 배지의 유동은 연동 펌프 (도 1G의 9)에 의해 행하여 진다. 상기 생물 반응기는 추가의 샘플링 포인트 (도 1G의 10) 및 연속적인 배지 교환용 용기가 설비되어 있다.

3D-부착성 세포의 생성 - 전술한 바와 같이 배양된, 비-밀집성 일차 인간 부착성 2D 세포 배양물을 트립신 처리하고, 세척하고, 10% FBS, 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물 (100 U/ml:100 μg/ml:1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민을 가지는 DMEM에 현탁하고, 주입 포인트를 통해 멸균 Plug Flow 생물 반응기의 3D 담체상으로 심었다 (10³-10⁵ 세포/ml)(도 1G). 접종 전에, 생물 반응기를 PBS-Ca-Mg (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel)로 채우고, 고온 가압 멸균하고 (120℃, 30분) 및 10% 열-비활성화된 우태아 혈청 및 펜-스트렙-나이스타틴 혼합물 (100 U/ml: 100 μg/ml: 1.25 un/ml)을 함유한 둘베코 성장 배지로 세척하였다. 0.1-5 ml/min 유동속도를 유지하였다. 유동을 2-48 시간 멈추어서, 세포가 담체 상에 정주할 수 있게 함으로써 심는 공정을 수행하였다. 생물 반응기를 조절된 온도 (37℃) 및 pH 조건 (pH = 6.7-7.4)하에서 유지하였다; 필요시 멸균 공기 및 CO₂를 배양기에 공급하였다. 성장 배지를 매주 2-3번 교체하였다. 유동 배지를 매 4시간 내지 7일마다 새로운 DMEM 배지로 교체하였다. 1×10⁶-1×10⁷ 세포/ml의 밀도에서 (12-40일 성장 후), 전체 배지를 생물반응기로부터 제거하고, 및 생물반응기와 담체를 PBS로 3-5번 세척하였다. 다음, 3D-부착성 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 담체로부터 떼어내고; (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel; 3-15분, 1-5번 가볍게 교반), 그 후 DMEM에 현탁시키고 동결보관하였다.

3D-부착성 세포 질 생물학적 분석 - 동결보관된 3D-부착성 세포를 해동시키고 계수하였다. 세포 생존성을 평가하기 위해 2×10⁵ 세포를 150 cm² 조직 배양 플라스크에 심었고 이의 부착 능력 및 재증식을 심은 지 7일 이내에 평가하였다. 이 후, 3D-부착성 세포 멤브레인 마커 표현형을 형광 단일클론성 항체 유세포 분석기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 분석하였다.

유세포 분석기를 사용한 3D 및 2D 배양된 세포들의 세포 멤브레인 마커 프로필 간 비교. 2D 배양물 및 3D 유동 시스템 배양물에서 얻든 100,000-200,000 부착성 세포를 5 mL 튜브에 들어있는 0.1 mL 배양 배지에 현탁하였고 하기 각각의 mAb의 포화 농도와 배양하였다 (4℃, 30분, 어두운 상태): FITC-접합 항-인간 CD90 (Chemicon International Inc. Temecula, CA), PE-접합 항인간 CD73 (Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), PE-접합 항인간 CD105 (eBioscience, San Diego, CA), FITC-연계 항인간 CD29 (eBioscience, San Diego, CA), Cy7- PE 접합 항인간 CD45 (eBiosience), PE-접합 항인간 CD19 (IQProducts, Groningen, The Netherlands), PE-접합 항인간 CD14 MAb (IQProducts), FITC 접합 항인간 CD11b (IQProducts) 및 PE 접합 항인간 CD34 (IQProducts) 또는 FITC-접합 항인간 HLA-DR MAb (IQProducts). 배양 후, 상기 세포를 1% 열-비활성화 FCS를 포함하는 빙냉 PBS에 두 번 세척하고, 500 μL 포름알데히드 0.5%에 현탁하고, FC-500 유세포 분석기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 분석하였다.

질량분광분석법을 이용한 3D 및 2D 배양 부착성 세포의 단백질 프로필간의 분석 - 2D 및 3D 유래 배양법 부착성 세포를 전술한 바와 같이 태반으로부터 생성하였다. 간략히는, 상기 2D 배양물은 0.3-0.75×10⁶ 세포를 175 cm² 플라스크에서 4 시간 동안 37℃의 습윤 5% CO₂ 조건하에서 4일간, 60-80% 밀집도에 달할 때까지 배양함으로써 생성되었다. 2000개 담체를 함유하는 생물반응기에서 2-10×10⁶ 세포/gram을 심고 18일간 배양함으로써 3D 배양물을 생성하였다. 수확 후, 세포를 세척하여 (×3) 모든 혈청을 제거하고, 펠렛화시키고 동결하였다. 제조자 지시에 따라서, [Tri 시약 키트 (Sigma, Saint Louis, USA)를 사용하고, 트립신으로 처리하고 및 iTRAQ 시약으로 표지된(Applied Biosciences, Foster City, CA)] 단백질을 펠렛으로부터 분리하였다. 간략히, iTRAQ 시약은 비중합성, 동중원소 표지 시약이다. 각 샘플 내의 펩타이드는 N-말단 및/또는 리신 측쇄를 통해 4개 동중원소, 동위원소-코드 태그들 중 하나로 표지된다. 상기 4개 표지된 샘플을 혼합하고 펩타이드를 질량 분광분석으로 분석하였다. 펩타이드 분절화 때, 각 태그는 독특한 질량 리포터 이온을 방출하고; 4개 리포터들의 비율은 따라서 샘플 내 주어진 펩타이드의 상대적 양을 제공한다 (정보, www.docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf). 태반 유래 부착성 세포의 2D 배양 대 3D 배양에 대한 프로테오믹스 분석은 스몰러 프로테오믹 센터 (Smoler proteomic center) (department of Biology, Technion, Haifa, Israel)에서 QTOF-Premier 상의 LC-MS/MS (Waters, San Francisco, CA)를 사용하면서, nr 데이터베이스의 인간 편에 대하여 Pep-Miner 소프트웨어[Beer, I., 등, Proteomics, 4, 950-60 (2004)] 로 동정과 분석을 하면서 실시되었다. 분석된 단백질은 다음과 같다: 이종 핵의 리보핵산단백질 H1 (Hnrphl GenBank Accession No. NP 005511), H2A 히스톤 패밀리 (H2AF, GenBank Accession No. NP 034566.1), 진핵성 번역 신장 인자 2 (EEEF2, GenBank Accession No. NP 031933.1), 레티큘로칼빈 3, EF-핸드 칼슘 결합 도메인 (RCN2, GenBank Accession No. NP 065701), CD44 항원 이소유형 2 전구체 (GenBank Accession No. NP 001001389), 칼포닌 1 염기성 평활근 (CNNl, GenBank Accession No. NP_001290), 3 포스포아데노신 5 포스포설페이트 신타제 2 이소유형 a (Papss2, GenBank Accession No. NP 004661), 리보조말 단백질 L7a (rpL7a, GenBank Accession No. NP 000963) 및 알데히드 디하이드로게나제 X (ALDH X, GenBank Accession No. P47738). 모든 실험은 2회 실시하였다. 분석 본질상, 모든 단백질을 샘플 내에 나타난 단백질의 펩타이드 번호 (각 분석에서 단백질의 2-20번 출현)에 따라 실시되었다.

ELISA를 사용한 3D 및 2D 배양 부착성 세포에서의 분비된 단백질간의 비교 - 태반에서 생성된 2D 및 3D 유래 배양 기술 부착성 세포를, 24일간 전술한 바와 같이 생성하였다. 다음, 조절된 배지를 F1t-3 리간드, IL-6, 트롬보포이에틴 (TPO) 및 줄기세포 인자 (SCF)에 대하여 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 3개 독립적 실험으로 분석하였다. 결과는 1×10⁶ 세포/ml로 표준화하였다.

*골아세포 분화 배지- 10% FCS, 100 nM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산 2-포스페이트, 10 mM B-글리세로포스페이트가 보충된 DMEM으로 구성되는 골아세포 분화 배지에 3주간 세포를 배양하여 골원성 분화를 분석하였다. 석회화된 매트릭스는 Alizzarin Red S 염색으로 지시되고, 알카리성 포스파타제는 알카리성 포스파타제 분석 키트로 검출되었다 (모든 시약은 Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO로부터 구입).

실험결과

PluriX ^TM 생물 반응기 시스템은 생리적-유사 미소환경을 창출한다

부착성 세포에 대한 효율적인 배양 조건을 부여하기 위해, 생리적-유사 환경 (도 1A에 도시)을, PluriX 생물 반응기 (Pluristem, Haifa, Israel; 담체는 도 1G에 도시도어 있고, 도 1B에서 심기 전에 나타난다)를 사용하여 인공적으로 창출하였다. 도 1C-F에 도시된 바와 같이, 골수 생성된 3D-부착성 세포를 성공적으로 배양하였고 3D 매트릭스 상에서 심은 후 20일간 (도 1B-C, 각각 ×150 및 250배 배율) 및 40일간 (도 1C-D, 각각 x350 및 500 배 배율) 배양하였다.

PluriX 생물반응기 시스템에서 성장한 세포들을 심대히 확대하였다 - 태반 유래 3D-부착성 세포의 상이한 생성 집단을 PluriX 생물반응기 시스템에서 성장시켰다. 심는 밀도는 13,300 세포/담체 (총 2×10⁶ 세포까지)였다. 심은 후 14일째, 세포밀도는 15배 증폭되었고, 약 200,000 세포/담체 (도 2) 또는 150 담체의 생물반응기에서 30×10⁶개에 달하였다. 다른 실험에서, 세포를 생물반응기에 1.5×10⁴ 세포/ml의 밀도로 심고 30일 후에 담체는 50배 이상의 세포수 예, 약 0.5×10⁶ 세포/담체 또는 0.5×10⁷ 세포/ml를 포함하고 있었다. 담체 상에 담체 상에 성장 칼럼의 다양한 수준의 세포 밀도는 일관되어 있고, 이는 산소 및 영양분이 세포로 균질하게 전달된다는 것을 가리킨다. 3D 배양 시스템은 따라서 고밀도 중간엽 세포 배양물의 성장과 지속 유지에 대한 상태를 유지시키는 것으로 증명되었고, 이는 이식 생착 및 성공적인 이식을 지지하기 위한 충분한 양으로 효과적으로 성장될 수 있다.

3D- 부착성 세포는 독득한 멤브레인 마커 특성을 나타낸다 - 골 환경을 복제한 3D 배양 방식에 의해 실행된, 용해성 분자의 분비 프로필 및 단백질 생성에서의 차이를 정의하기 위해, FACS 분석을 실시하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 세포 마커의 FACS 분석 결과, 3D-부착성 세포는 2D 조건에서 성장한 것과 다른 마커 발현 패턴을 보이는 것으로 나타나고 있다. 2D 배양된 세포는 3D 배양된 세포에 비하여, 양성적인 멤브레인 마커 CD90, CD105, CD73 및 CD29 멤브레인 마커들을 상당히 더 높은 수준으로 발현하였다. 예를 들어, CD105는 3D 배양된 세포에서는 56% 발현율을 보인, 반면 2D 배양된 세포에서는 87%였다. 2D 및 3D 태반 배양물의 부착성 세포 양쪽은 어떠한 조혈성 멤브레인 마커를 발현하지 않았다 (도 3B).

3D- 부착성 세포는 용해성 인자의 독특한 프로필을 나타낸다 - 조혈성 장소 (hematopoietic niche)는 상당한 양의 사이토카인류, 케모카인류 및 성장인자를 생성하는 지지 세포를 포함한다. 2D 및 3D 배양된 부착성 세포 간의 차이를 더욱 밝히기 위해, 2D 및 3D 부착성 세포 배양물의 조절된 배지에서 4 가지 주요 조혈성 분비 단백질의 프로필을 ELISA로 실행하였다. 도 4A-C는 3D 조건에서 성장한 세포가 더 높은 수준의 Flt-3 리간드 (도 4A), IL-60 (도 4B) 및 SCF (도 4C)를 생성하는 반면 더 낮은 수준의 IL-6 및 거의 제로 수준에 가깝게 Flt-3 리간드 및 SCF가 2D 배양물의 조절된 배지에서 검출되었다. 트롬보포이에틴 (TPO)의 생성은 양쪽 배양물에서 매우 낮았고 동일하였다.

3D 부착성 세포는 질량 분광 분석기 분석에서 독특한 단백질 프로필을 나타낸다 - 2D 및 3D 배양된 부착성 세포 간의 차이를 더욱 명확히 하기 위해, 이러한 세포들의 단백질 프로필을 질량 분광 분석법으로 분석하였다. 도 4D는 2D 및 3D 배양된 부착성 세포가 상당히 다른 단백질 발현 프로필을 보이는 것을 나타내고 있다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 3D 배양된 세포는 훨씬 높은 발현 수준의 H2AF 및ALDH X (각각 9 및 12배 더 높은), 및 더 높은 수준의 EEEF2, RCN2 및 CNN1 (각각 약 3, 2.5 및 2배)을 나타낸다. 또한, 3D 배양된 세포들은 Hnrph1 및 CD44 항원 이소유형 2 전구체를 약 절반 발현 수준으로 및 Papss2 및 rpL7a의 약 3/1 발현 수준으로 나타낸다.

단백질	단백질 수준(iTRAQ 리포터 군에 대한)
	2D 배양된 부착성 세포		3D 배양된 부착성 세포
	Av	SD	Av	SD
Hnrph1	1.434493	0.260914	0.684687	0.197928
H2AF	0.203687	0.288058	1.999877	0.965915
EEEF2	0.253409	0.130064	0.799276	0.243066
RCN2	0.54	0.25	1.34	0.26
CD44 항원 이소유형 2 전구체	1.68	0.19	0.73	0.17
CNN1	0.77	0.15	1.55	0.17
Papss2	1.48352	0.314467	0.45627	0.137353
rpL7a	1.22	0.24	0.43	0.05
ALDH X	0.15847	0.22411	1.986711	0.212851

3D- 부착성 세포는 골아세포로 분화할 능력을 가진다 - 3D-부착성 세포를 더 특성화하기 위해, 세포를 3주간 골아세포 분화 배지에서 배양하였다. 다음, 칼슘 침전을 시행하였다. 분화된 세포들은 칼슘을 생성하는 것으로 나타났고 (도 5A-B에서 붉은색으로 표시) 반면 대조군 세포들은 섬유아 유사 표현형을 유지하고 미네랄화를 나타내지 않았다 (도 5C-D). 이러한 결과들은 태반 유도 3D-부착성 세포들이 시험관내에서 골아세포로 분화될 수 있는 능력을 가지는 것을 나타내고 있다.

실시예 2

태반 유도 3D-부착성 세포의 HSC 이식생착을 향상시키는 능력 평가

HSC 이식 생착의 3D-부착성 세포 지지를 부치사량적으로 방사능 조사된 또는 화학요법 처리된 면역 결핍성 NOD-SCID마우스에서 검출된 인간 조혈세포 (hCD45+)의 수준으로 평가하였다.

재료 및 방법

CD34+ 세포의 분리 - 제대혈 샘플을 출산 중 멸균 조건하에서 취하고 (Bnei Zion Medical Center, Haifa, Israel) 및 단핵구 세포를 Lymphoprep (Axis-Shield PoC As, Oslo, Norway) 밀도 구배 원심분리함으로써 분획화시키고 동결건조하였다. 해동된 단핵구 세포를 세척하고 항-CD34 항체와 같이 배양하고 및 미디 MACS (Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Germany)를 사용하여 분리하였다. 하나 이상의 샘플로부터 얻은 세포들을 모아 원하는 양을 확보하였다 (50,000- 100,000 세포).

방사능 조사된 마우스에서 이식된 세포의 검출 - 7주령 수컷 및 암컷 NOD-SCID 마우스 (NOD-CB 17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot Israel)를 멸균된 개방 시스템 케이지에서 유지하고, 멸균된 음식과, 고압멸균된 산성수를 주었다. 마우스를 부치사량적으로 조사하였고 (350 cGy), 그 후 (조사 후 48시간) 50,000-100,000 hCD34⁺ 세포를, 태반 또는 지방 조직에서 유래된 추가의 부착성 세포(0.5×10⁶ - 1×10⁶) 와 같이 또는 없이 (각 군당 3-7 마우스), 측정맥으로 정맥 주사함으로써 이식하였다. 이식 후 4 내지 6주간 지난 후, 마우스를 탈구하여 희생시키고 및 FACS 완충액 (50 ml PBS, 5 ml FBS, 0.5 ml 소듐 아지드 5%)로 대퇴골과 경골에 부어 BM을 수집하였다. 마우스 BM에서 인간 세포를 유세포 측정기로 검출하였고, 처리된 NOD-SCID 마우스에서의 인간 및 쥐 CD45 조혈세포 마커 발현 세포 비율을 세포를 항-인간 CD45-FITC (IQ Products, Groningen, The Netherlands)와 같이 배양함으로써 측정하였다. 명확한 인간 이식 생착에 대한 최저 역치는 0.5%로 주어졌다.

화학요법으로 처리된 마우스에서의 이식된 세포의 검출 - 방사능 조사된 마우스에 대해 전술한 바와 같이 유지된, 6.5 주령 암컷 NOD-SCID 마우스 (NOD.CB17/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot Israel)에게 (25 mg/kg - 연속 2일간)로 복강내 주사하였다. 두 번째 Busulfan 주입 이틀 후, 마우스에게 CD34+ 단독 또는 태반으로부터 생성된 0.5×10⁶ 부착성 세포와 같이 주사하였다. 이식 후 3.5주 이후에, 마우스를 희생시키고 인간 조혈세포의 존재를 방사능 조사된 마우스에서 전술한 바와 같이 결정하였다.

실험 결과

3D- 부착성 세포는 방사능 조사된 마우스에서 HSC의 생착을 향상사켰다 - 인간 CD34+ 조혈세포 및 태반 또는 지방조직으로부터 유래된 3D-부착성 세포를 방사능 조사된 NOD-SCID 마우스에 공이식시켰다. 생착 효능을 공이식 후 4주 만에 평가하고 HSC 단독으로 이식된 마우스와 비교하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 3D-부착성 세포 및 UCB CD34+ 세포는 UCB CD34+ 세포 단독으로 처리된 마우스에 비하여 수혜 마우스의 BM에서 상당히 더 높은 생착율 및 더 높은 수준의 인간 세포를 결과하였다.

이식된 세포	평균 h-CD45	STDEV
CD34	3.8	7.9
CD34 + 태반 유래 3D-부착성 세포	5.1	12.2
CD34 + 지방 유래 3D-부착성 세포	8.7	9.6

3D- 부착성 세포는 화학요법 처리된 마우스에서 HSC의 생착을 향상시켰다 - 인간 CD34+ 조혈세포를 태반 유래된 500,000 2D-부착성 세포 또는 3D-부착성 세포를 화학요법 처리된 NOD-SCID 마우스에 공이식하였다. 공이식 후 3.5주 만에 생착 효능을 평가하고 HSC 단독으로 이식된 마우스와 비교하였다. 표 3 및 도 6에 나타난 바와 같이, 부착성 세포 및 UCB CD34+ 세포를 공이식하면 UCB CD34+ 세포 단독에 비하여 수혜 마우스의 BM에서 더 높은 생착 수준을 결과하였다. 더욱이, 표 3에 나타난 바와 같이, PluriX 생물 반응기 시스템 (3D-부착성 세포)에서 성장한 태반유래 부착성 세포로 공이식된 마우스에서가, 통상적인 정지성 2D 배양 조건 (플라스크)에서 성장한 동일 공여자 유래의 세포로 공이식된 마우스에서보다 더 생착 평균율이 높았다.

이식된 세포	평균 h-CD45	STDEV
CD34	0.9	1.1
CD34 + 태반 유래 통상적인 2D 배양물	3.5	0.2
CD34 + 태반 유래 3D 부착성 세포	6.0	7.9

도 7A-B에 나타난 FACS 분석 결과는 부착성 세포를 hHSCs와 같이 공이식하는 장점 (도 7B) 및 부착성 세포가 HSC 이식 후 조혈 시스템의 복구를 향상시키는 능력을 보여주고 있다.

종합하면, 이러한 결과들은 부착성 세포가 HSCs 이식 (자가 또는 동종이계) 후, 조혈적 복구를 향상시키는 지지세포로서 역할할 수 있다는 것을 나타낸다. HSCs 이식 후 조혈 줄기 및/또는 전구 세포 생착을 향상시키는 3D-부착성 세포의 능력은 이식된 세포의 귀소, 자기 재생 및 증식 능력을 향상시킬 수 있는 HSC 지지 사이토카인을 분비하는 3D-부착성 세포 능력으로부터, 또는 이식할 수 있는 HSCs의 귀소 및 증식에 필요한 손상된 조혈적 미소환경을 재건설하는 그러한 세포의 능력으로부터 유래될 수 있다.

실시예 3

2D 및 3D 배양된 부착성 세포에 의한 L 임파구 반응의 억제

부착성 세포, 특히 3D-부착성 세포는 MLR 분석에서 인간 제대혈 단핵구 세포의 면역 반응을 억제하는 것으로 발견되었다.

재료 및 실험 방법

혼합 임파구 반응 (MLR) 분석 - 태반에서 유래된 2D 및 3D 배양 방법으로 생성된 부착성 세포의 면역억제성 및 면역면제된 (immunoprivileged) 특성을 MLR 분석법으로 분석하였고, 이는 반응성 (증식하는) 및 자극하는 (비증식성) 세포의 혼합 배양에서 양립할 수 없는 임파구의 증식률에 의해 실행되는 바와 같이, HLA 좌위에서 조직적합성을 측정한다. 인간 제대혈 (CB) 단핵구 세포 (2×10⁵)를 반응성세포로서 사용하고 동일한 양 (10⁵)의 방사선 조사된 (3000 Rad) 인간 말초 혈액 유래 단핵구 (PBMC)와 함께 또는, 태반에서 생성된 2D 또는 3D 배양된 세포와 함께 또는 부착성 세포와 PBMC의 혼합물과 함께 배양됨으로써 자극되었다. 각 분석은 세 번 복제되었다. 세포를 RPMI 1640 배지 (20% FBS를 함유)를 가지고 있는 96-웰 플레이트 상에서 4일간 공배양시켰다 (5% CO₂ 분위기의 37℃에서). 플레이트를 배양 마지막 18시간 동안 1 μC ³H-티미딘으로 조사하였다. 세포를 유리섬유 필터 상에서 수확하고 티미딘 섭취량을 섬광계수기롤 측정하였다.

실험결과

도 8A는 PBMC로 자극했을 때 CB 세포의 면역 반응을 세포의 증강된 증식으로 표현한 것으로, 이는 이론에 얽매이지 않고, HLA 비양립성에 대하여 T 세포 증식과 연계되어 있다. 그러나, 본 발명의 부착성 세포와 같이 배양될 때 이러한 세포들은 상당히 낮은 수준의 면역 반응을 보였다. 또한, PBMC에 대한 CB 면역반응은 이러한 부착성 세포와 공배양되었을 때 실질적으로 저하되었다. 따라서, MSC와 유사한 방식으로, 부착성 세포들은 GvHD에 특유한, 공여 세포의 T 세포 증식을 감소시키는 잠재적 능력을 가지고 있다는 것이 발견되었다. 비록 2D 및 3D 둘 다의 배양물이 임파구의 면역반응을 감소시키고 전술한 3D-부착성 세포의 다른 장점들과 동조되어 있지만, 상기 3D 부착성 세포가 더 면역억제적이었다.

실시예 4

Celligen에 의해 제조된 3D 부착성 세포와 PluriX에 의해 제조된 3D 부착성 세포와의 비교

대규모 3D 부착성 세포를 제공하기 위해, 새로운 제조 시스템을 사용하였고 Celligen으로 지칭하였다.

재료 및 실험 방법

PluriX^TM 플럭 플로우 생물반응기 - 실시예 1에서 설명된 바와 같음

Plurix (PLX 세포)에 의한 3D 부착성 세포의 생성 - 실시예 1에서 설명된 바와 같음

Celligen^TM 플럭 플로우 생물반응기 - Celligen에 의한 부착성 세포의 생성 (PLX-C 세포)는 도 8B에 설명된 바와 같이 수 개의 주요 단계로 이루어진다. 처음 단계는 출산시 제왕절개 분만으로부터 태반을 수집하는 것이다.

다음, 부착성 세포를 전체 태만으로부터 분리하고, 조직 배양 플라스크에서 성장시키고 (2D 배양물), 수확하고 및 2D-세포 스탁 (2DCS)로 액체 질소에 보관한 후, 적절한 양의 2DCS를 해동하고, 세척하고 3D 배양물로서 더 확장시키기 위해 생물반응기의 담체상에 심었다. 생물 반응기에서 1-2 주간 성장시킨 후, 세포를 수확하고 PLX-C로서 액체 질소의 가스 상에서 동결보존시켰다.

인간 조직의 수납

수득한 모든 태반들을 의료 설비의 헬싱키 위원회의 승인하 산부인과 병동에서 수납하였다. 따라서, 모든 태반 공여자들은 통지된 동의서에 서명하였고 공여자 스크리닝 및 공여자 테스팅 (Donor Screening and Donor Testing)을 실시하였다 (IPCI).

공여자로부터 태반을 받은 즉시 (제왕절개 동안), 멸균 플라스틱 가방에 넣고 얼음이 담긴 스티로폼 박스에 넣었다. 태반을 옮기고, 품질관리 (QC) 및 품질보증 (QA)에 의해 사용될 수 있는 것으로 방출될 때까지 검역 장소에 두었다. 모든 하기 생성 단계는, 세균 (mycoplasma) 시험 결과의 QC 승인이 도착할 때까지 검역, 클린룸 설비에서 행하였고, 세포를 풀어 2D 세포 성장시켰다.

부착성 세포의 복구 및 가공

이러한 공정을 개시하기 위해, 전체 태반을 층류 후드하 멸균 조건에서 조각내고, Hank 완충액으로 세척하고, 37℃에서 3시간 동안 0.1% 콜라게나제 (1 mg 콜라게나제/ml 조직)으로 배양하였다. 2D 세포 배지 (10% FBS, 펀지존 0.25 μg/ml 및 겐타마이신 50 μg/ml이 보충된 DMEM을 함유한 2D-배지)를 첨가하고 소화처리된 조직을 멸균 금속 체로 대충 거르고, 멸균 비이커에 담고 원심분리하였다 (10분, 1200 rpm, 4℃). 부드럽게 피펫팅하여, 현탁된 세포를 항생제 함유 2D-배지로 세척하고, 80cm² 플라스크에 심고, 5% CO₂로 보충된 습윤 환경하에서 조직 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 2-3일 후, 세포가 플라스크 표면에 부착시킨 상태에서, 세포를 PBS로 세척하고 2D-배지를 첨가하였다.

이차원 (2D) 세포 성장

첫 번째 계대배양 전에, 총 플라스크 수의 10%의 성장배지 샘플을 검역소에서 모으고 세균 시험 (IPC2)하였다. 세포가 마이코플라즈마에 대하여 음성으로 발견되면 (EZ-PCR Mycoplasma kit, Biological Industries, Israel), 세포를 검역소에서 풀었다. 1-2번 추가 계대배양 후, 세포를 2D-생성 클린룸 (2DP)으로 옮겼다. 일단 2DP 룸에 오면, 배양물을 계속해서 3-5번 계대배양하였다. 계대배양 4 이후, IPC-3 샘플을 취하여 면역 표현형에 대하여 시험하였다. 이러한 과정을 통틀어, 배양물을 5% CO₂를 가진 습윤 조건 하 37℃에서 조직 배양기에서 항생제 없이 2D 배지로 성장시켰다. 총 6-8 계대배양 (9-16 세포 배가) 후, 세포를 수집하고 2D-세포 스탁 (2DCS)로서 동결보관하였다.

첫 번째 계대배양은 통상 10-15일 후에 실시되었다. 계대배양 2에서 시작하여 계대배양 6-8까지 계속하면서, 배양물이 70-80% 밀집도에 이를 때, 통상 3-5일 후 (1.5-2 배가), 세포를 계대배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA (4분, 37℃)를 사용하여 세포를 플라스크에서 분리하고 3±0.2×10³ cells/cm²의 배양밀도로 심었다. 조직 배양 플라스크의 크기는 계대배양이 진행될수록 커졌다. 배양 과정은 80 cm² 조직 배양 플라스크에서 시작되었고, 175 cm²로 계속되고, 500 cm²에서 연속되다가(삼중 플라스크) 마지막으로 세포를 Cell Factory 10 트레이로(6320 cm²) 옮겨 심었다.

동결보존 전에, 2DCS 성장 과정 말에, 성장 배지를 수집하고 샘플을 만들어 세균 시험을 하기 위해 승인된 GLP 실험실에 보냈다 (IPC 4).

2D-세포-스탁 생성물을 위한 동결보존 과정

2DCS 동결보존을 위해, 2D-배양 세포를 0.25 % 트립신-EDTA을 사용하여 멸균조건하에서 수집하였다. 세포를 원심분리하고 (1200 RPM, 10', 4℃), 계수하고 및 2D-배지에 재현탁하였다.

동결하기 위해, 세포 현탁물을 2D-동결 혼합물과 1:1 희석시켰다 (최종 농도는 10% DMSO, 40% FBS 및 50% 2D-배지). 대략 1.5-2.5×10⁹ 세포를 하나의 태반으로부터 제조하였다. 상기 세포 4 mL를 최종 농도 10×10⁶/ml로 5ml 동결보존 폴리프로필렌 바이얼에 보관하였다. 상기 바이얼에 표지하고 차등적 온도 감소 (1℃/min)의 조절된 속도 동결기로 옮기고, 이후 이들을 냉동 보관실에 위치한 액체 질소 동결기의 가스 상으로 보관하였다. 이러한 재조를 2D-세포 스탁 (2DCS) 배치라 칭한다.

삼차원 (3D) 배양 방법의 개시

3D 배양을 시작하기 위해, 2DCS로부터 얻은 적절한 양 (150±30×10⁶) 세포를 2DP 실에서 해동하고, 미리 준비한 생물반응기 시스템에 심기 전에 3D 배지 (10% FBS 및 20 Mm HEPES를 함유한 DMEM)으로 세척하여 DMSO를 제거하였다. 각 2DCS 바이얼의 내용물을 피펫하고 미리 가온된 (37℃) 3D 배지와 1:9 희석시켰다. 세포를 원심분리하고 (1200 RPM, 10', 4℃) 250 ml 멸균병에 담겨진 50-100 ml 미리 가온된 (37℃) 3D 배지에 재현탁시켰다. 샘플을 취하고 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하여 세포수 및 생존능력을 결정하였다. 세포 현탁액을 층류 후드하에서 0.5 L 시딩 병에 옮겼다. 상기 시딩 병으로부터 세포 현탁액을 멸균 튜빙하여 생물 반응기로 중력에 의해 옮겼다.

Celligen 생물반응기 (PLX-C)에서의 3D-부착성 세포의 생성

생물 반응기 설명

도 8C에 도시된 자동 CelliGen Plus®또는 BIOFLO 301 생물반응기 시스템 [(New Brunswick Scientific (NBS)]을 사용하여 3D 성장기를 만들었다. 생물 반응기 시스템을 사용하여 세포 배양을 하였고, 여기서 조건은 고 세포 농도에 적합하도록 하였다. 생물 반응기를 사용하여 관류 방식으로 배양을 실시하였다. 실험실 규모 생물반응기는 두 개의 주 시스템으로 이루어졌다-제어 시스템 및 생물반응기 자체 (용기 및 부속물). 공정 변수를 감시하고 탐침자, 모터 및 펌프용 콘넥터, 용해 산소 (DO), pH, 관류와 교반 (모터로)용 제어루프, 가스 제어 시스템, 물순환, 및 온도 제어용 가열시스템 및 조작자 인터페이스를 포함하는 제어 콘솔로 제어하였다. 제어된 공정 변수 (온도, pH, DO 등과 같은)은 조작자 인터페이스에 표시될 수 있고 지정된 제어기로 감시된다.

생물반응기에서의 세포 배양물 성장

전술한 바와 같이, 동결보존된 2DCS로부터 얻은 150±30×10⁶ 세포를 해동하고, 세척하고 및 멸균된 생물반응기에 심었다. 상기 생물반응기는 폴리에스터 및 폴리스티렌으로 만든 30-50 gr 담체 (FibraCel®disks, NBS) 및 1.5±0.1 L 3D 배지를 함유하였다. 생물 반응기에서의 성장 배지를 하기 조건에서 유지시켰다: 37℃, 70% 용해 산소 (DO) 및 pH 7.3. 여과된 가스 (공기, CO₂, N₂ 및 O₂)를 제어 시스템에 의해 지시된 대로 공급하여 DO 값을 70% 및 pH 값을 7.3에서 유지시켰다. 처음 24시간 동안, 배지를 분당 50회전에서 교반하고 2일째까지 200 RPM까지 증가시켰다. 처음 2-3일간, 세포를 배치 방식으로 성장시켰다. 배지 글루코즈 농도가 550 mg/리터 이하로 저하되었을 때 관류를 개시하였다. 배지를 공급실로부터 생물반응기로 멸균 실리콘 튜브를 사용하여 펌핑시켰다. 모든 튜브 연결은 멸균 콘넥터를 사용하여 층류하에서 수행하였다. 일일기준으로 약 550±50 mg/리터에서 글루코즈 농도가 일정하게 유지하도록, 관류를 조절하였다. 글루코즈, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트 및 암모늄 농도 분석을 위해 매 1-2일 마다 성장 배지 샘플을 취하였다 (BioProfile 400 analyzer, Nova Biomedical). 세포 배양물 글루코즈 소비율 및 락테이트 형성율은 세포 성장율을 측정하게 한다. 이러한 변수들을 사용하여 축적된 실험 데이터를 근거로 수확 시간을 결정하였다.

3D 성장된 PLX-X 세포의 생물반응기로부터의 수확

세포 수확은 성장기의 말 (4-10일)에 시작하였다. 성장 배지의 두 샘플을 수집하였다. 하나의 샘플을 준비하여 USP 및 EU Standards에 따라서 마이코플라즈마 시험하기 위해 승인된 GLP 실험실로 송부하였고, 다른 하나는 차등적 온도 감소 (1℃/분)의 조절된 속도 동결기로 옮기고, 이후 냉동 보관실에 있는 액체 질소 동결기의 가스 상으로 보관하였고, 필요시 마이코플라즈마 시험을 반복하였다. 이러한 배지 샘플은 최종 마이코플라즈마 시험의 부분으로 간주되며, 결과는 생성물 방출에 기준으로 간주된다.

3D성장된 배양물을 하기와 같이 3DP 실에서 Class-100 층류 지역에서 수확하였다: 생물 반응기 용기를 중력을 이용하여 튜브를 통해 폐기물 용기로 비워내었다. 헤드 플레이트를 제거함으로써 용기를 개방시키고 담체를, 멸균된 겸자를 이용하여 바스켓으로부터 상부 바스켓 망으로 옮겼다 (도 8C 참조). 다음, 생물반응기를 막고, 1.5 L 예비-가온된 PBS (37℃)로 충전시켰다. 교반속도를 2분간 150 RPM으로 증가시켰다. PBS를 압력 또는 중력에 의해 튜브를 통해 폐기물 용기로 배출시켰다. 두 번 반복하여 세척하였다.

세포를 담체로부터 방출하기 위해, 37℃로 예비가열된 1.5 L 트립신-EDTA (트립신 0.25%, EDTA 1 mM)을 생물 반응기 용기로 첨가하였고 및 담체를 5분간 150 RPM으로 37℃에서 교반하였다. 세포 현탁액을 250 mL FBS를 함유한 5 L 들이 멸균 용기에 수집하였다. 세포 현탁액을 4개 500 mL 멸균 원심분리 튜브에 나누고, 마이코플라즈마 시험 샘플은 남겨두었다. 밀봉된 원심분리 튜브를 3DP 활성 통로를 거쳐 Class 10,000 충전실 (FR1)으로 옮겼고, 여기서 세포를 멸균적으로 채우고 PLX-C로서 동결보존하였다.

세포 주기 분석 - Celligen로 수확한 PLX-C 세포 및 Plurix로 수확한 PLX 세포를 70% EtOH O.N으로 고정하고, 원심분리하고 2 μg/ml PI (Sigma), 0.2 mg/ml Rnase A (Sigma) 및 0.1% (v/v) Triton (Sigma)을 함유한 요도드화 프로피디움 (PI)에 30분간 재현탁시켰다. 세포주기를 FACS로 분석하였다.

유전자 발현 분석 (마이크로어레이) - 부착성 세포를 인간 만삭 태반으로부터 얻고 Plurix 또는 Celligen에 의해 확장되었다. 세 가지 다른 세포 배치를 더 조사하기 위해 각 확장 방법으로부터 얻었다.

RNA를 세포로부터 추출하고 (Qiagen-RNeasy micro kit) 및 Affymetrix 전체 게놈 발현 어레이에 적용하였다. 칩은 GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clar, Califonia, USA)를 사용하였다.

멤브레인 마커들의 FACS 분석 - 세포를 전술한 바와 같이, 단일항체로 염색하였다. 간략하게는, 400,000 - 600,000 세포를 5 mL 시험관에 담겨있는 0.1 mL 유세포 분석 완충액에 현탁시키고 어두운 곳에서 15분간 실온(RT)에서, 하기 단일클론 항체 (MAbs)와 배양하였다:

FITC-접합 항인간 CD29 MAb (eBioscience), PE 접합 항인간 CD73 MAb (Becton Dickinson), PE 접합 항인간 CD 105 MAb (eBioscience), PE 접합 항인간 CD90 MAb (Becton Dickinson), FITC-접합 항인간 CD45 MAb (IQProducts), PE-접합 항인간 CD 19 MAb (IQProducts), PE-접합 항인간 CD 14 MAb (IQProducts), FITC-접합 항인간 HLA-DR MAb (IQProduct), PE-접합 항인간 CD34 MAb (IQProducts), FITC-접합 항인간 CD31 MAb (eBioscience), FITC-접합 항인간 KDR MAb (R&D systems), 항인간 섬유아세포 마커 (D 7- FIB) MAb(ACRIS), FITC-접합 항인간 CD80 MAb (BD), FITC-접합 항인간 CD86 MAb (BD), FITC-접합 항인간 CD40 MAb (BD), FITC-접합 항인간 HLA-ABC MAb (BD), 이소유형 IgGl FITC-접합 (IQ Products), 이소유형 IgGl PE-접합 (IQ Products).

세포를 유세포 분석 완충액으로 두 번 세척하고, 500 μL 유세포 분석 완충액에 재현탁하고, FC-500 유세포 분석기 (Beckman Coulter)을 사용하여 유세포 분석하였다. 음성 대조군을 관련 이소유형 형광 분자로 제조하였다.

혼합 임파구 반응 (MLR)

2×10⁵ 말초혈액 (PB) 유래 MNC (공여자 A로부터)를 동량의 방사능 조사된 (300 Rad) PB 유래 MNC (공여자 B로부터)로 자극하였다. PLX-C를 증가하는 양으로 상기 배양물에 첨가하였다. 각 군의 세 가지 복제물을 96-웰 플레이트에 심었다. 세포를 20% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 배양하였다. 플레이트를 5일 배양의 마지막 18시간 동안 1 μC ³H-티미딘으로 자극하였다. 세포를 유리섬유 필터 상에서 수확하고 티미딘 흡수를 섬광계수기로 정량하였다.

CFSE 염색하기 위해, PB-MNC 세포를 CFSE (Molecular Probes)에 대하여 염색하여 배양전 증식을 측정하였다. 세포를 5일 수에 수집하고 CFSE 염색강도를 유세포 분석기로 검출하였다.

ELISA

ELISA를 전술한 바와 같이 실시하였다. 간략히, MNC (말초혈액으로부터 분리된) 을 PLX-C 존재하에서 5 μg/ml ConA (Sigma), 0.5 μg/ml LPS (Sigma) 또는 10 μg/ml PHA (Sigma)로 5% CO₂ 분위기 37℃에서 자극하였다. 상청액을 수집하고 INFγ (DIACLONE), TNFα(DIACLONE) 및 IL-10 (DIACLONE)에 대하여 ELISA 키트를 사용하여 사이토카인 분석하였다.

실험 결과

Plurix와 비교하여 Celligen으로 제조하는 데 있어서의 변화는 수 개의 주요 차이점을 결과하였다 (하기 표 4에 요약됨).

Plurix 시스템 및 Celligen 시스템 간의 비교

변수	실시예 1에 따른 세포 성장	본 발명의 교시	개선점
실행 부피(ml)	280	1500	공정의 규모확대. 본 발명의 고시에서 더 높은 생성 수눈 (2-8 개체수 배가)
담체의 무게 (gr)	1.4	30	공정의 규모 확대
층 형상	원추, 50 ml 칼럼	실린더 포장 층	본 발명의 교시 - 배지 및 영양분이 더 좋은 흐름. 실시예 1의 교시 - 원추 구조의 좁은 배출 형태로 인한 불충분한 흐름. 배지 흐름의 더 나은 균일성. 실시예 1의 교시에서 도관현상
심을 때의 세포 농도 (세포/ml)	3x106 세포/ gr 담체	5x106 세포/ gr 담체	본 발명의 교시에서 더 나은 세포 대 세포 상호작용
심을 때의 세포 농도 (세포/ml)	0.015x10⁶ 세포/ gr 담체	0.1x10⁶ 세포/ gr 담체	본 발명의 교시에서 더 나은 세포 대 세포 상호작용
심는 방법	낮은 배지 부피에서 24시간 심은 후, 배지를 최종 작동 부피로 첨가	교반하면서 최종 작동 부피에서 심음	실시예 1의 교시 - 담체 베드 내부에서 세포 배양물의 불균일적 분포. 처음 24시간 작동에서 불충분한 배지 부피. 비적합한 작동 조건으로 결과 (산성 환경).
생성기 기간	14-21일	4-10일	더 나은 생성물 품질. 효율적인 수확 공정. 더 나은 수율. 본 발명에서 더 낮은 가경 공정
작동 방식	반복배치 - 일주일에 두 번 배지 교환	관류 양태 - 속도는 글루코즈 농도에 따라 조절 (배지를 550±50 mg/L)의 글루코즈 농도에서 교환)	본 발명의 교시- 작동 전체에 걸쳐 배지에 관한 조건의 보통의 변화. 세포에 의해 생성되는 독성제제의 연속적 제거. 배치 양태에서 - 필수 영양분의 더 낮은 농도 (제한 인자). 더 낮은 세포부스러기.
수확 방법	50 ml 튜브에서 수확 트립신 처리 3 주기	생물반응기 내에서 수확 트립신 처리 1주기	본 발명의 교시 - 더 효율적인 공정 수확은 폐쇄 시스템에서 실행됨. 1 트립신 처리 주기 - 세포의 더 나은 품질
교반	연동펌프를 사용하여 저수조 내지 칼럼사이에 배지 순환	세포 리프트 임펠러	본 발명의 교시 - 포장된 베드를 통하여 배지가 유동한다 - 배양물로 더 나은 영양분과 산소 공급. 배지의 균일성. 다른 제어 루프를 향상시킴 (온도, DO, pH).
온도 조절	배양기 내에서 생성 실시 간접적 온도조절 (배양기 챔버의) 공기계면을 통한 열전달	온라인 직접 제어 물 자켓을 통한 열전달	본 발명의 교시 - 배양물 온도의 더 정확한 측정. 빠른 반응. 설정값에 도달하는 짧은 시간.
온도 모니터링	수동적으로 간접적 물 온도 모니터링	온라인 직접 모니터링	본 발명의 교시 - 공정의 더 나은 모니터링과 제어. 오기능에 대한 빠른 응답.
DO 모니터링	없음	온라인 모니터링	본 발명의 교시 - 공정의 더 나은 모니터링과 제어. 오기능에 대한 빠른 응답.
DO 조절	없음 공기만 유입	공기, O₂ 및 N₂을 하용한 특정 설정값의 온라인 제어	본 발명의 교시 - DO 수준의 더 나은 조절. 특정화된 작동 조건의 더 나은 유지
PH 모니터링 및 조절	오직 시각 모니터링 (배지의 일부분으로서 페놀레드)	온라인 제어 및 모니터링	본 발명의 교시 - pH 수준의 더 나은 조절. 특정화된 작동 조건의 더 나은 유지
공기유입	살포	적층 (조건적으로 살포)	실시예 1의 교시 - 살포로 인한 공기 유입은 세포를 손상시킬 수도 있는 거품을 발생시킨다

제조 방법에서의 변화는 수득한 3D 부착성 세포의 특성의 변화를 결과하였다. 이러한 차이들은 하기에 요약하였다.

Celligen에 의해 제조된 PLX-C에 대하여 Plurix에 의해 제조된 PLX의 세포 주기 분석 - Celligen에 의해 수득한 PLX-C 세포를 Plurix에 의해 얻은 PLX 세포와 비교하여 세포 주기의 상이한 위상 간의 세포 분포를 조사하였다. 도 9A-B에서 명백하게 나타난 바와 같이, Celligen으로 확장된 PLX-C 세포들은 전형적인 증식 양상 (세포 주기의 다른 위상 간에 세포 분포)을 보였다. 특히, 세포의 28%는 S 및 G2/M 상에 있었다 (도 9A). 이러한 결과들은 세포가 증식하는 동안 수확되었고 Celligen 생물반응기 조건이 세포 성장을 지지한다는 것을 나타내었다.

Plurix 및 Celligen 수득 세포 간의 마이크로어레이 비교 - 유전자 발현 어레이는 Plurix (PLX) 또는 Celligen (PLX-C)로 확장된, 인간 만삭 태반에서 유래한 부착성 세포의 전 게놈 발현 프로필을 동시에 나타내게 한다. 이러한 결과는 이러한 상이한 성장 방법에 의해 얻은 세포 간에서 표현형 변이하에 있는 분자적 기작을 평가할 수 있게 한다 (하기 표 5 참조).

[표 5]

Plurix 세포와 비교한 Celligen에서의 유전자 발현

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PLX-C 세포 상에서의 세포 마커의 발현 - PLX-C에 의해 발현된 표면 항원들을 단일클론 항체를 사용하여 조사하였다. 결과에 따르면, PLX-C는 양성 마커들: CD73, CD29 및 CD105 및음성 마커들: CD34, CD45, CD19, CD14 및 HLA-DR에 의해 특징지워진다 (데이터 미제시). 면역 표현형 시험 상세는 하기와 같이 설정되었다: > 90% 모든 양성 마커에 대하여 및 < 3% 모든 음성 마커에 대하여.

또한, 도 10A-B에 도시된 바와 같이, PLX-C 배양물은 두 개의 내피세포 마커 CD31 및 KDR에 대하여 음성 염색된 것 같이 내피세포 마커를 발현하지 않았다. 그러나, 섬유아세포-특이적 마커가 PLX-C 발현됨이 명백하였다 (D7-fib의 발현, 도 10C).

PLX-C 세포의 면역원성 및 면역조절 특성 - PLX-C가 태반으로부터 유도된 부착성 세포로 구성됨에 따라, HLA 타입 I을 발현할 것으로 예상되며, 이는 신체의 모든 세포에서 발현되는 것이며 이질반응성 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. HLA 타입 II 및 다른 공-자극성 분자들은 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에서만 전형적으로 발현된다.

수득한 PLX-C 세포의 면역원성을 조사하기 위해, 이러한 세포막의 표면 상에서 공자극 분자의 발현을 실시하였다. FACS 분석에 따르면, PLX-C 세포막 상에는 CD80, CD86 및 CD40이 없는 것으로 나타났다 (도 11A-C). 또한, PLX-C는 HLA A/B/C에 대하여 염색하여 검출했을 때 낮은 수준의 HLA Class I을 발현하였다 (도 11D). 자극성 및 공자극성 분자들의 발현은 골수 (BM) 유래 MSC에서와 유사하였다 (도 11A-D에서 도시된 바와 같이).

PLX-C 세포의 면역원성은 물론 면역조절 특성을 조사하기 위해, 혼합 임파구 반응 (MLR) 시험을 실시하였다. 도 12A-B에서 도시된 바와 같이, PLX-C 세포는 티미딘 혼입으로 측정되는 바와 같이, 이종인식을 회피하고 T 세포 반응을 감소시켰다. 또한, 임파구 증식에서의 감소 (CPM 측정으로 평가시)는 PLX-C 세포의 수가 증가됨에 따라 (용량 의존적 방식으로) 더 높아졌다. PLX-C는 또한 콘카나발린 A (Con A, 도 12B) 및 피토헤마글루티닌 (PHA)와 같이 유사분열성 자극, 및 항-CD3, 항-CD28에 의한 비특이적 자극 (데이터 미제시) 후에 임파구 증식을 감소시켰다. PLX-C가 임파구 증식을 면역조절하게 되는 작용의 기작을 조사하기 위해, 및 이러한 작용이 세포를 통해 세포간 상호작용 또는 사이토카인 분비를 매개하는지를 알기 위해, PB 유도 단핵구 (MNC)를 트랜스웰 방법 (이는 세포와 세포 접촉을 막지만 두 개 분획 간의 사이토카인 확산을 하게 한다)을 사용하여 PHA로 자극하였다. 결과에 의하면, 세포 대 세포 접촉이 저해되었을 때에도 증식 저해가 유지된다는 것을 나타낸다 (데이터 미제시).

사이토카인 분비 - 전술한 바와 같이, PLX-C는 임파구의 증식률을, 대개는 용해성 인자를 통해 감소시킨다. PLX-C에 반응하여 임파구에 의해 분비되는 사이토카인류를 더 조사하여 PLX-C의 작용의 기작을 설명하였다. 도 13A-B에서 도시된 바와 같이, 단핵구 세포를 PLX-C와 배양하면 친염증성 사이토카인 INFγ의 분비를 약간 감소시키며 TNFα의 분비를 극적으로 감소시킨다 (PLX-C가 적은 양 존재한다고 하더라도). 또한, 리포폴리사카라이드 (LPS) 자극 후에, IL-10의 PB 유도 MNC 분비가 PLX-C 존재하에서 증가하며 반면, TNFα의 분비 수준이 용량 의존적 방식으로 감소된다 (도 13C).

실시예 5

PLX-C의 생체분포

재료 및 실험 방법

루시페라제 발현벡터의 PLX-C 세포로의 형질전환

PLX-C 세포를 CMV 프로모터 하에서 루시페라제 유전자를 발현하는 렌티바이러스성 작제물로 안정적으로 감염시켰다 (도 14).

감염 바이러스의 생성

형질전환 전에, 293TN 제조 세포를 혈청과 항생제가 보강된 DMEM 배지 (Gibco)에서 2-3일간 배양하였다 (50-70% 밀집도). 패킹 플라즈미드 10 μg 및 발현 작제물 2 μg , 및 Plus^TM 시약 (Invitrogen) 20 μg 의 혼합물을 보충제가 없는 DMEM 400 μl에 첨가하였다. 혼합물을 15분간 실온 (RT)에서 항온처리하고 Lipofectamine^TM (DMEM 400 μl에 희석한 30 μl )을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 15분간 항온처리하였다. 293TN 세포를 세척하고 2% 혈청 배지에 옮기고 형질전환 혼합물을 첨가하였다. 세포를 CO₂ 배양기에서 37℃에서 밤새 배양하고 배지를 감염 후 24-60시간 후에 수집하였다. 최대 바이러스 생성은 48시간 후에 달성되었다. 배지를 모으고 실온에서 5 분간 3000 rpm으로 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화 시켰다. 원심분리 후, 상청액을 Millex-HV 0.45 μm PVDF 필터 (Millipore, Cat. #SLHVR25LS)를 통해 여과하였다.

PLX-C의 감염

PLX-C 세포를 완전배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 웰당 0.6-1×10³ 세포 밀도로 분배하였다. 24시간 후, 바이러스 현탁액 0.5 ml (폴리브렌을 함유한 완전 배지에 5-8 μg /ml의 최종농도로 희석)을 첨가하였다. 세포를 24시간 배양하고, 다음 배지를 완전 DMEM 배지로 교환하고, 세포를 37℃에서 5% CO₂하에 밤새 배양하였다. 4일째, 배양물은 밀집되었고, 1:3 내지 1:5로 분리하고, 세포가 완전 DMEM에서 48시간 성장하게 하고, 다음, 세포를 루시페라제 발현에 대하여 분석하였다.

감염의 효율은 거의 100%였다. 생세포 및 생마우스에서의 발광 평가는 루시페라제 발광 신호를 포획하는 고도의 민감성 CCD 카메라를 포함하는 IVIS Lmina Imaging System을 사용하여 실시되었다.

감염 2주 후에, 2×10⁶ 세포를 SCID/Beige, NOD/SCID, SCID 및 Balb/C 마우스로 IM 또는 IV 주사하였다. 주입된 세포를 IVIS 시스템을 사용하여 모니터하였다.

실험 결과

상기 결과로부터 명백한 바와 같이, CXL 세포는 감염 후 계속 분열하였고, 성장하는 세포에서의 루시페라제 발현 수준은 강하고 안정적으로 지속되었다 (도 15). 일단 PLX-C 세포가 Balb/C 마우스로 주입되면, 생체분포 양상을 조사하였다. 결과에서 명백히 나타난 바와 같이, 세포들은 IM 주사 72시간 후에 사라졌다 (데이터 미제시). 그러나, PLX-C 세포들은 시험관 내에서 3주간 넘게 루시페라제 발현의 높은 수준을 일정하게 유지하였다 (데이터 미제시).

도 16A-D에서 나타난 바와 같이, SCID/Beige 마우스 면역결핍 마우스로 주입된 세포는 주입 부위에서 5일까지 유지되었고 그 후에는 관찰되니 않았다. SCID/Beige 마우스로 IV 주입된 CXL 세포는 24시간 후에 폐로 옮겨갔고, 그 후 주입 위치로 옮겨졌다 (아마도 주입 위치로 귀소).

다음, 세포들은 점차적으로 사라졌고 3-4 주 후에는 관찰되지 않았다.

실시예 6

부착성 세포는 생체 내에서 사지 허혈을 치료할 수 있다

태반 유래 부착성 세포를 이식하면 허혈성 손상을 감소시키고 임상적 및 운동 기능을 향상시키는지 알기 위해, 뒷다리 허혈 모델을 하기와 같이 사용하였다.

재료 및 실험 방법

면역결핍이 아니고, 8-10주령이며, 체중 25 g±20%인 20 마리 수컷 Balb/c 마우스에 뒷다리 허혈을 유도하였다. 동물 취급은 NIH (National Institute of Health) 및 AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)의 지침에 따랐다. 동물을 표준 실험실 조건하에서 가두었다. 동물을 기후 조절된 환경에 유지시켰다. 온도는 20-24℃ 범위였고 상대 습도(RH)는 30-70%이고 12시간 밤과 낮의 주기로 설정되었다.

컴퓨터 발생 랜덤화 프로그램 "Research Randomizer"를 사용하여 동물들을 랜덤화하였고 10마리씩 2개 군으로 분리하였다. 하나의 군은 1×10⁶ 태반 유래 부착성 세포 (PLX-C)를 근육내 (IM) 주사하였고 다른 군은 대조군으로 사용하고, PBS를 주입하였다.

외과적 과정 - 서혜부의 피부에 1-1.5 cm 절개하였다. 대퇴부 동맥을 6-0 실크로 두 번 결찰하고 결찰부에서 멀리 절개하였다. 상처를 3-0 실크로 잡아매고, 마우스를 복구하도록 하였다. 대퇴부 동맥 수술 절개 5시간 후에, 마우스에 2개 투여 부위에서 총부피 50 μl로 1×10⁶ 태반 유래 부착성 세포 (PLX-C)를 IM 주사하였다. 대조군 동물은 동일하게 PBS (Gibco)로 주입하였다. 하기 표 6 참조.

마우스 뒷다리 허혈 모델에서 PLX-C의 실험적 연구

시험군	처치	군당 마우스 수	세포 투여량	로트	투여 후 21일째 희생 횟수
1	PLX-C i.m.	n=10 ♂	1x10⁶	C.G.13.0	n=10 ♂
2	PBS i.m.	n=10 ♂	0	N/A	n=10 ♂

추적검사 (follow up) - 양편으로부터 다리 상의 혈류를 수술 직후, 및 수술 후 6, 9, 14 및 21일째, 비접촉 레이저 도플러를 사용하여 3번 연속 측정하였고, 허혈성 사지에서의 혈류 대 정상 사지에서의 혈류 비율로 표현하였다 [Tokai. J. 등].

허혈 중증도의 거시적 평가 - 연구 종료시까지 1, 6, 9, 14, 21일째에, 괴사 부위에 대한 등급화된 형태적 척도를 사용하여 허혈 사지를 거시적으로 평가하였다; 등급 0: 무괴사, 등급 I: 발가락에 한정된 괴사 (발가락 손실), 등급 II: 발등까지 확장된 괴사 (다리 손실); 등급 III: 무릎까지 확장된 괴사 (무릎 손실); 등급 IV: 허벅지까지 손상된 괴사 (뒷다리 전부 손실) [Tokai, J. 등].

사지 기능 및 허혈 손상의 생체 내 평가 - 허혈성 사지의 손상된 사용에 대한 반정량적 평가를 하기와 같이 순차적으로 실시하였다: 3 = 다리의 끔, 2 = 끌지않고 족저굴곡 없음, 1 = 족저굴곡, 및 0 = 꼬리의 약한 수축에 저항하기 위해 발가락 굴곡 (Rutherford 등, 1997).

분자 및 생화학적 분석 - 임상 평가에 덧붙여, 분자 및 생화학적 샘플을 21일째에 얻고 분석하여 태반 유래 부착성 세포 (PLX-C) 주사 군에서 향상된 치유에 담겨있는 분자적 기작을 더 이해하고자 했다.

실험 결과

태반 유래 부착성 세포를 이식하면 허혈성 뒷다리 모델의 힙과 다리에서 혈류를 상당히 유도한다 - 생체 내 부착성 세포의 효율을 시험하기 위해, 마우스를 동맥 결찰한 후, 태반 유래 부착성 세포를 근육내 주입하였고, 처리 후 소정 시간에 비접촉성 레이저 도플러를 사용하여 힙과 발 (신체 양편)에서 혈류를 측정하였다. 도 17에서 나타난 바와 같이, PLX-C를 주입하면, 혈류 평가에서 결정되는 바와 같이, 손상된 사지로 혈류 (BF)를 현저히 향상시키고, 사지 기능을 증가시키고, 말초 혈관 밀도를 증가시키고, 산화성 스트레스를 감소시키고, 및 내피세포 손상을 감소시킨다. 혈류의 관점에서, 효과는 주입 후 9일 만에 증명되었고 전체 연구를 통틀어 관찰되었다. PLX-C 처리 군에서, BF는 24±2.3에서 80±4.7%로 증가한 반면, 담체-처리된 대조군에서는 BF는 힙/이식 부위에서 35±2 내지 54±4.5% 범위에 있었다 (각각 0일차 대 21일차). 힙 부위와 유사하게, 그러나, 더 적은 정도로, PLX-C 처리 마우스의 발 부위에서 BF 증가가 또한 증명되었다. 따라서, 도 17에서 나타난 바와 같이, 담체 처리된 군에서는 BF가 12±0.6에서 46±4.9%인 반면, PLX-C 군에서는 BF가 10±0.7에서 52±5.5%로 증가하였다 (각각 0일차 대 21일차).

부착성 세포는 생체 내에서 사지 기능을 개선시킬 수 있다 - 태반 유래 부착성 세포의 생체 내 효과를 더 평가하기 위해, 처리된 마우스의 사지 기능을 재료 및 실험 방법에서 설명된 점수 시스템을 사용하여 평가하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, 부착성 세포로 처리된 마우스는 사지 기능에서 상당한 향상을 나타냈다 (각각 2.5±0.2 대. 2.1±0.2 대조군 대 PLX-C 군, 처리 후 21일차에 현저한 효과를 주목). 그러나, 21일간 관찰 동안 사지 기능에서의 향상 정도는 비견될 만했고, 이는, 본 연구의 조건하에 있는 PLX-C가 기능 복구의 주요 변화를 나타내지 않는다는 것을 제시하고 있다. 허혈 중증도의 거시적 평가에 따르면, 담체 처리된 군인 대조군에서, 발가락에 한정된 괴사가 6일차에 두 마리 동물에게서 관찰되었다. PLX-C 처리 군에서는, 발가락에 한정된 괴사는 한 동물에서만 그리고 14일 이후에 나타났다. PLX-C로 처치된 사지를 희생 후 면역조직화학적으로 분석한 결과, 사지에 공급되는 새로운 모세혈관의 수가 상당히 증가한 것이 나타났고, 이는 PLX-C가 혈관 생성을 촉진하는 능력을 보유하는 것을 나타낸다 (도 9). 마지막으로, 처리된 동물에서 감소된 산화성 스트레스 및 내피세포 염증의 감소 (이는 향상된 내피세포 기증에 대한 대체 변수인)가 PLX-C 처리 마우스에서 발견되었다 (도 20A-B). 이것은 PLX-C 세포로 처리된 마우스에서 산소 공급이 증가로 인한 것으로 보이며, 그러나 PBS로 처리된 대조군 마우스에서는 나타나지 않는다. 결론적으로, PBS-처리된 마우스인 대조군에 비하여, PLX-C 주입된 마우스는 근육내 (i.m.) 세포 투여에 반응하여 임의의 임상적 부작용 징후나 증상을 보이지 않았다. 따라서, PLX-C는 혈류의 증가를 유도하고, 이는 손상된 사지의 조직학적 평가에 의해 지지되는 바와 같이 혈관생성으로 유래된 것이다. 또한, 괴사 전개의 지연 및 병소 동물 수의 차이는 임상적 반응을 제시하고 있다.

태반 유도 부착성 세포의 이식

상기 재료 및 방법란에서 설명된 바와 같이, 안전성 종말점을 포함하는 아들 효능 연구를 Balb/C 마우스에서 실시하였다 (즉, 선택된 기관의 총체적 괴사 및 조직병리학적 분석). 이러한 연구에서, 군당 10마리 수컷 Balb/c 마우스로 구성되는 7개 군 (허혈성 뒷다리)을 하기 표 7에 상세히 나타난 바와 같이 사용하였다. 10 마리의 단일 군은 허혈을 유도하지 않았다 (정상적인, 건강한 동물에서 전체적인 PLX-C 세포의 안전성 및 내성을 시험하기 위해). 허혈 유도 후, 대조군 완충액 또는 PLX-C 세포를 병소 사지에 근육내 투여하였고, 마우스를 투약 후 1달까지 동안 관찰하였다. 마우스 단일 군은 일 주 간격으로 (1일차 및 8일차) 병소 사지에 두 번 주사되었다. 혈류는 레이저 도플러 분석으로 모니터되었고, 허혈성 중증도는 투약 후 30일까지 거시적으로 및 행동적으로 평가되었고, 이때 마우스를 희생시키고 조직을 조직학적 분석을 위해 보관하였다.

마우스 뒷다리 허혈 모델에서 PLX-C의 효능 연구

시험군 번호	처치	세포 양 (투여량)	치료 수	로트	투약 후 30일에 희생된 수
1	PLX-C	1x10⁶	1	C.G.13.0	10 ♂
2	PLX-C	1x10⁶	1	C.G.25.0	10 ♂
3	PLX-C	1x10⁶	2	C.G.25.0	10 ♂
4	PLX-C	0.5x10⁶	1	C.G.13.0	10 ♂
5	PLX-C	0.1x10⁶	1	C.G.13.0	10 ♂
6	대조군 동결 배지	N/A	1	N/A	10 ♂
7*	PLX-C	1x10⁶	1	C.G.13.0 C.G.25.0	10 ♂

본 연구에서, 세 가지 농도의 상이한 PLX-C 배치를 투여하였다. 결과는 0.1×10⁶ 및 0.5×10⁶ PLX-C가 부차적인 치료 혜택을 가지는 것을 보이고 있다. 혈류에서의 현격한 개선은 1×10⁶로 처리된 동물에서 29일차까지 (실험 끝) 관찰되었다. 혈류에서의 이러한 개선은 담체 투여군인 대조군에 비하여 군 2M (배치 G.C. 25)에서 의미있는 것이다 (p<0.05). 추가로, 동일 배치의 세포를 두 번째 주입하면 단일 주입시보다 15일차에 현저히 BF를 향상시켰다 (각각 31±12.9 및 27±12.5%에 비하여 55±24). 허혈성 중증도의 거시적 평가에 의하렴, 담체 처리된 대조군 (6M)에 비하여 1×1O⁶ 을 받은 군 (1M & 2M)에서 개선 경향이 있다는 것을 나타냈다.

모두, 이러한 결과들은 뒷다리 허혈 마우스 모델에서 맥관화를 유도하는 데 (즉 혈류) 및 사지 기증을 향상시키는 데 있어서 부착성 세포의 효능을 보이며, 이러한 세포 (예, 태반 유도 부착성 세포)가 허혈성 사지 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 제시하고 있다.

실시예 7

뇌졸중 치료용 PLX-C

본 연구의 목적은 뇌졸중 치료에서 전신 (정맥내) 인간 PLX-C - 태반 유래 부착성 세포 이식의 치료 효능을 평가하기 위한 것이다.

재료 및 실험 방법

대상체, 수술 및 이식

고혈압, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 미소혈관 장애를 앓는 수컷의 본태성 고혈압 쥐를 사용하였다. 이 동물들을 온도, 공기 습도 및 명/암 주기에 관하여 일정한 조건하에서 유지시켰다. 대상체들을 무작위적으로 실험군에 편성하였다 (표 8 참조).

뇌졸중 치료의 래트 치료군

그룹 번호	처치	동물 수
1	PLX-C, 배치 1, 단일 투여	N=8
2	PLX-C, 배치 1, 이중 투여	N=7
3	PLX-C, 배치 2, 단일 투여	N=8
4	PLX-C, 배치 2, 이중 투여	N=7
5	대조군-담체 용액	N=12

동물들에게 상이한 배치의 1×10⁶ PLX-C가 단일 또는 이중 투약되었다. 모든 이식 과정은 정맥내에서 수행되었다. 이중 주사군은 뇌 허혈 후 10 및 24시간 만에 이식한 반면, 단일 투여군은 뇌졸중 때 24시간 내에 수행하였다. 모든 이식된 세포를 형광 염료 PKH26으로 예비 표지하였다.

실험 뇌 허혈은 우측 뇌동맥을 영구 폐색하여 수행되었다. 특기할 것은, 한 마리 동물이 마취 후 죽었다.

자기 공명 조사 (MRI)

1.5T 스캐너 (필립)을 사용하여 1, 8, 29 및 60일차에 병소 발달에 대한 MRI를 실시하였다. 경색 크기 및 뇌 장애를 관상 T2-서열을 사용하여 3개 맹검에 의해 얻은 값의 평균으로 측정하고 계산하였다.

행동 시험

기능적 변화를 두 개 의존적 행동 시험 어레이를 사용하여 측정하였다. 광선 걷기 (Beam Walk) 시험은 지각상-운동 결함을 정량하는 데 사용되는 통상적인 시험이다. 래트를 마지막에 래트의 홈 케이지에서 수평으로 걸쳐진 막대를 건너가도록 하였다. 횡단 시간을 다섯 번 측정하였고 일과의 평균값을 기록하였다. 광선에서의 매달림을 20초로 산정하고 떨어짐을 30초로 산정하였다. 측정은 첫 주간에서는 매일 하였고, 이후 관찰 끝까지 매 7일째 하였다.

두 번째 시험인, 변형된 신경적 중증도 평점 (mNSS)은 추가의 감각 운동 및 반사 항목을 포함하였다. mNSS의 결과는 1과 18 사이의 점수로 표현하며, 1과 6 사이의 점수는 가벼운, 7 내지 12는 보통의, 및 13 내지 18은 심각한 손상을 내포하였다. mNSS 점수의 평가는 뇌 허혈 후 1, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 및 56일차에 실시되었다.

조직학

실험기간 말에 연이어서, 모든 래트를 희생시키고 심장을 가로질러 4% 포르말린 용액으로 관류하였다. 추출된 뇌를 동결보관하고 30 μm 두께 절편으로 절단하였다. 신경교 반응의 평가를 위해, GFAP 대한 일차 항체로 면역조직화학 검사를 실시하였다. GFAP+ 세포의 밀도에 대한 경색 경계에 근접한 750 μm 넓은 지역을 조사하였다 (반정량적으로). 성상아교세포 반응성을 조사하기 위해, 평균 0.6 mm 공간을 두고 15개 부위를 살폈다.

통계

체중, MRI 분석 및 조직학적 조사에 관한 모든 데이터를 가우시안 분포도로 조사하고 ANOVA를 사용하고 따라서 ANOVA on ranks를 사용하여 통계적으로 유의한 차이점을 분석하였다.

광선 걷기 및 mNSS에서 얻은 데이터를 대상체의 반복 측정을 가능케 하고 개별적으로 대상체의 일시적 전개를 가능케 하는 (계층적 분석) 상세한 통계분석하에 두었다. 뇌손상에 대한 개별 간의 차이를 균형 잡기 위해, 무작위 간섭 모델을 사용하였다. 따라서, 광선 걷기 시험에서 수집한 데이터를 범주 체계 (categorical system)으로 전환시켜야만 했다. 여기서, 5초 미만의 시간 값은 범주 (0), 5 내지 10초는 범주 (1), 10 내지 15초는 범주 (2), 15 내지 20초는 범주 (3), 매달림은 범주 (4), 및 떨어짐은 범주 (5)로 취급하였다.

실험 결과

체중

주기적 체중 측정으로 대상체의 일반적 건강 상태를 잘 평가할 수 있었다. 마취 및 외과적 개입으로 인한 처음 체중 감소를 모든 군에서 관찰하였다 (데이터 미제시). 후속적으로, 실험의 끝까지 60일차에서 체중의 빠른 정상화 및 안정적인 코스를 관찰하였다 (데이터 미제시). 실험군들은 체중의 동질적 전개를 보였다.

광선 걷기 (Beam Walk) 시험

모든 실험 군은 실험 과정 중에 광선 걷기 범주에서 상당한 감소를 보였다 (데이터 미제시). 광선 걷기 카테고리의 심각한 감소가 대조군에 비하여 실험군 1 (PLX-C 배치 1, 단일 투여)에서 관찰되었다 (각각 -0.01247 대 -0.02931). 실험군 3 (PLX-C 배치 2 단일 투여) 및 대조군 간의 통계적으로 유의한 차이에 대한 증거가 없었다 (데이터 미제시).

변형된 신경학적 중증도 평점 (mNSS)

모든 실험군은 신경학적 평점 점수에서 유의한 감소를 보였다 (데이터 미제시). PLX-2 (PLX-C 이중 투여)로 처리된 대상체의 mNSS 결과와 비교하면, 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 우월성이 드러났다. 배치 2의 이중 이식 (군 3) 동일한 배치의 단일 주사에 비하여 mNSS 시험에서 유의한 향상을 보였다 (데이터 미제시).

경색 범위

자기공명이미지는 생체 내에서 뇌손상 및 조직 소실의 정도를 측정하는 매우 복잡한 방법이다. 개별적 차이를 감안하여, 경색 크기의 전개는 개인적으로 1일차에서 경색 부피의 백분율로 표시된다. 1일차의 경색 크기는 실험군 간에 유의하게 차이나지 않았다. 경색 크기의 일반적 전개는 1일차 및 8 일차 간에 약 50% 감소를 보였다. 이것은 주로 초기 뇌 부종의 감소로 인한 것이었다. MRI를 사용하여 생체 내에서 병소 전개를 조사하면, 군 4 (PLX-C 배치 2, 이중 투여) 대상체들은 60일차에 상당히 감소된 경색 지분을 보였다 (각각 0.48±0.02 대 0.60±0.03, 결과 미제시).

종합하면, 이러한 결과들은 PLX-C의 혈관내 투여가 뇌졸중 치료에서 양쪽 행동 시험에서 기능적 복구를 유의하게 향상시키는 결과를 낳는다는 것을 나타낸다. 더욱이, PLX-C 이중 이식의 상당한 및 통계적으로 유의한 우월성이 유사 단일 주사에 비하여 관찰되었다.

PLX-C로 두 번 처리된 대상체에서 측정된 행동적 향상은 MRI에 의해 명백히 나타난다. 더하여, 경색 범위 및 뇌 장애의 유의한 감소가 실험 끝에 관찰되었다. 더구나, 양쪽 기능 시험에서, 대조군 및 단일 주사시의 미확인 효과에 비하여 PLX-C의 두 번 투약 이식 후 기능적 회복의 안정적 향상이 관찰되었다.

실시예 8

결합조직 재생 및/또는 복구를 요하는 병리의 치료

본 발명의 부착성 세포를 사용한 뼈 재생 및/또는 복구를 요하는 병리의 치료

동물 모델 (예, 성숙된 뉴질랜드 흰 토끼)를 사용하여, 대퇴골에서 심각한 크기의 분절 결함을 치유하는 데 대한 본 발명의 부착성 세포 (태반 또는 지방조직으로부터 유래되고 3D 배양물로부터 얻은, 예 PLX-C 세포)의 효과를 조사하였다. 동물들을 무작위적으로 3군 중 하나에 배당하였다. 군 A의 동물들은 1-10×10⁶ 부착성 세포 (PLX-C 세포)로 결함 부위에 주사되었다. 군 B의 동물들은 PBS로 주사되었다. 군 C의 동물에서 결함은 처리되지 않고 그대로 두었다. 수술 직후 및 일 주 간격으로 방사선 사진을 찍었다. 12주차에, 동물을 희생시키고, 연루된 대퇴골을 제거하고, 및 결함부위 및 주위 뼈로부터 미탈회된 조직 부분을 준비하였다. 기계적, 조직학적 및 조직형태적 연구를 실시하여 결함의 치유 및 결합 부위 내 및 그 주위에서의 골형성을 조사하였다. 추가로, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 실시하여 유형-I 및 유형-II 콜라겐의 mRNA를 검출하였다.

본 발명의 부착성 세포를 사용한 힘줄 재생 및/또는 복구를 요하는 병리의 치료

동물 모델 (예, 골격적으로 성숙한 뉴질랜드 흰 토끼)를 사용하여 힘줄 치유에 대한 본 발명의 부착성 세포 (예 PLX-C 세포)의 효과를 검사하였다. 장무지건 (hallucis longus tendon)을 2.5-mm 직경 종골 터널로 옮겼다. 상기 골터널을 PLX-C로 처리하거나 처리하지 않았다. 동물들을 무작위적으로 3군 중 하나로 배속시켰다. 군 A의 동물들은 1-10×10⁶ PLX-C 세포로 결함 부위에, 또는 IV로 주사되었다. 군 B의 동물들은 PBS로 주사되었다. 군 C의 동물에서 결함부위는 처리되지 않고 그냥 두었다. 각 군으로부터 세 개 검체를 수술 후 2, 4 및 6주 만에 얻고, 힘줄 대 뼈 경계면을 치유하는 형태적 특성을 통상적인 조직학 및 콜라젠 타입 I, II 및 III의 면역조직학적 위치를 통해 실시하였다.

본 발명의 부착성 세포를 사용한 연골 재생 및/또는 복구를 요하는 병리 치료

동물 모델 (예, 골격적으로 성숙한 뉴질랜드 흰 토끼)를 사용하여 연골 치유에 대한 본 발명의 부착성 세포 (예, PLX-C 세포)의 효과를 조사한다. 좌측 원위 대퇴의 슬개골 홈의 관절 연골을 전체 두께에 걸쳐 결함시켰다. 대퇴사두근을 덥고 있는 근막으로부터 약 6 mm의 판을 제거하고 6-0 장선으로 상기 인공 결함부의 주변부에 봉합하였다. 동물들을 세 개 군 중 하나에 무작위적으로 배치하였다. 군 A의 동물의 결함 부위에 또는 IV로 1-10×10⁶ PLX-C 세포를 주입하였다. 군 B의 동물은 PBS로 주사하였다. 군 C의 동물에서 결함 부위를 처리하지 않고 그대로 두었다. 동물들을 희생시켰다. PLX-C 세포를 골연골체 결함부에 이식시킨 14주 후에, 원위 대퇴부를 절개하고 조직학적 평가를 수행하고, 검체를, 복구 조직의 우세적 특성, 매트릭스 염색, 표면의 일정성, 구조적 완전성, 복구 부위의 두께, 복구된 연골 및 주변 정상 연골 간의 부착, 복구 조직에서 퇴행적 징후의 부재, 및 주변 정상 연골의 퇴행적 변화 부재에 근거하여 반정량적으로 등급을 매겼다.

본 발명의 부착성 세포를 이용한 인대 재생 및/또는 복구를 요하는 병리의 치료

동물 모델 (예, 골격적으로 성숙한 뉴질랜드 흰 토끼)를 사용하여 인대 치유에 대한 본 발명의 부착성 세포 (예, PLX-C 세포)의 효과를 조사하였다. 지름 8 mm의 단피질성 원형 결함을 실시하였다. 동물들을 세 개 군 중 하나에 무작위적으로 배치하였다. 군 A의 동물의 결함 부위에 또는 IV로 1-10×10⁶ PLX-C 세포를 주입하였다. 군 B의 동물은 PBS로 주사하였다. 군 C의 동물에서 결함 부위를 처리하지 않고 그대로 두었다. PLX-C 세포를 상기 결함부에 이식한 14주 후에 동물을 희생시켰다. 조직학적 평가를 실시하였고 검체를, 복구된 조직의 우세적 특성에 근거하여 반정량적으로 등급을 매겼다.

개별 구체예의 맥락에서 명징성을 위해 설명된 본 발명의 특정 특징은 또한 복합적으로 단일 구체예에서 제공될 수 있음이 이해된다. 역으로, 간편성을 위해 단일 구체예의 맥락에서 설명된, 본 발명의 다양한 특징은, 분리적으로 또는 임의의 적절한 부차조합적으로 제공될 수 있다.

비록 본 발명이 이의 특정 구체예와 연계하여 설명되었다 하더라도, 많은 대안, 변형 및 변경이 당해 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 따라서, 모든 그러한 대안, 변경 및 변형을 포함하여 첨부된 청구범위의 사상 및 범위에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허와 특허 출원서, 및 GenBank 수탁번호들은 특별히 그리고 개별적으로 참조문헌으로 본 명세서에 기입되는 것을 명시한다. 추가로, 본 출원서에서의 임의의 참조문헌의 인용 및 확인은 그러한 참조문헌이 본 발명에 대한 선행기술로서 이용가능하다고 승인된 것으로 해석되어서는 안 된다.

[참조문헌]

(추가 참조문헌은 본 문에 인용됨)

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1 : 양액 저수조 2 : 가스 혼합물 공급기
3 : 필터 4 : 주입 포인트
5: 3D 캐리어가 놓여지는 칼럼 6: 플로우 모니터
6a: 플로우 밸브 7: 분리 컨테이너
8: 세포 성장 분석기 9: 연동 펌프
10 : 샘플링 포인트 11: 용해 O₂ 측정 전극
12 : pH 측정 전극 13: 제어 시스템
14 : 새로운 성장 배지 15 : 사용된 성장 배지

Claims

태반 또는 지방 조직에서 유래된 부착성 기질 세포를 유효성분으로 포함하는, 상처를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 부착성 기질 세포가 CD34의 음성 마커 발현을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 태반 또는 지방 조직에서 유래된 부착성 기질 세포가 3차원(3D) 배양 조건하에서 증식되었던 것인, 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 태반 또는 지방 조직에서 유래된 부착성 기질 세포가 3차원(3D) 배양 조건하에서 증식되기 전에 2차원(2D) 배양 조건하에서 배양되었던 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포의 적어도 10%가 증식기에 있는 것인, 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 3차원(3D) 배양이 3D 생물반응기를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포의 3차원(3D) 배양이 관류 하에서 실행되고, 배양 배지 내 일정한 글루코즈 농도를 유지하기 위하여 관류율이 조정되는 것인, 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 3차원(3D) 배양의 배양 조건이 폴리에스터 및 폴리프로필렌으로 구성되는 군으로부터 선택된 부착성 물질을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포가 CD73, CD90, CD29 및 CD105로 구성되는 군으로부터 선택된 양성 마커 발현을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 상처가 궤양인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포가 태반 세포인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포가 지방 세포인 것인, 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포가 상처를 치료하는데 사용되기 전에, 상기 3차원(3D) 배양으로부터 분리되는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부착성 기질 세포가 동종이계 세포인 것인, 약학적 조성물.