DE60107560T2

DE60107560T2 - Preadipozyten enthaltende biomaterialien zur regeneration von weichgewebe

Info

Publication number: DE60107560T2
Application number: DE60107560T
Authority: DE
Inventors: Dennis Von Heimburg; Alessandra Pavesio
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2001-05-03
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2021-05-04
Also published as: WO2001082991A2; DE60107560D1; JP3848164B2; CA2407925C; ATE283714T1; ES2233650T3; AU2001273992B2; JP2003531684A; CA2407925A1; EP1280562B1; US20040037810A1; AU7399201A; WO2001082991A3; EP1280562A2

Description

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Biomaterial zur Bindegewebe-Rekonstruktion, umfassend ein Trägermaterial, das einen Benzylester von Hyaluronsäure umfasst, und Preadipozytenzellen, die auf dem Trägermaterial ausgesät sind, ein injizierbares Präparat zum Auffüllen von Bindegewebsdefekten und -depressionen, das ein vollständig wasserlösliches Hyaluronsäurederivat oder ein partiell wasserlösliches Hyaluronsäurederivat und Preadipozytenzellen, die in dem Präparat suspendiert sind, umfasst, und die Verwendung dieser Trägermaterialien und injizierbaren Präparate.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Korrektur von Bindegewebedefekten ist eine bedeutende Herausforderung in der plastischen und rekonstruktiven Chirurgie. Seit mehr als 100 Jahren wird Fettgewebe als freies Transplantat zur Rekonstruktion von Bindegewebedefekten verwendet. Allerdings gab es einen Mangel an optimalem Implantatmaterial für Bindegewebeersatz. Freie Fettgewebetransplantate werden verwendet, allerdings sind die Resultate schlecht und nicht vorhersehbar. Die Transplantate werden in großem Umfang absorbiert und durch fibröses Gewebe und Ölzysten ersetzt. Die kürzlich wieder belebte Technik eines Injizierens von abgesaugten Fettfragmenten liefert ebenfalls unbefriedigende Resultate, die von 50%-iger Schrumpfung des Transplantats bis zur vollständigen Resorption reichen. Es wird davon ausgegangen, dass die schlechten Resultate einer freien Fettautotransplantation in der niedrigen Toleranz der Fettzellen gegenüber Ischämie und der langsamen Revaskularisierungsgeschwindigkeit liegen.
Fettvorläuferzellen, die im Stroma von Fettgewebe liegen, können isoliert und kultiviert werden. Diese Zellen zeigen eine Invitro-Differenzierung und Dedifferenzierung unter unterschiedlichen Bedingungen und sind infolge der Fähigkeit, sich zu vermehren und zu differenzieren, eine mögliche Quelle für eine Bindegewebsentwicklung. In einer vorläufigen Studie beobachteten wir, dass Preadipozyten nach einer Transplantation schnell revaskularisieren und Fett reakkumulieren. In neueren Studien differenzierten Ratten-Preadipozyten in PLGA-Gerüsten nach Transplantation.
In jüngerer Zeit wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs), die aus Erwachsenen-Knochenmark erhalten worden waren, zur Produktion verschiedener Gewebezelltypen eingesetzt. Diese isolierten Stammzellen sind nicht omnipotent, wie es embryonale Stammzellen sind, aber pluripotent und fähig, in Bindegewebe und seine Derivate zu differenzieren. Mesenchym ist eine Quelle nicht nur für Bindegewebe wie Muskeln, Sehne und Ligament, sondern auch für Blut, Knorpel, Knochen, Fettzellen und die äußeren Schichten von Blutgefäßen. Bis dato wurden MSCs erfolgreich zu Fettzellen, Chrondozytenzellen und Osteozytenzellen differenziert (Pittenger et al. (1999) Science 284:143–7).
Allerdings besteht noch ein Bedarf für einen guten biokünstlichen Bindegewebefüllstoff zur Gewebeentwicklung, einen, der idealerweise ein Abgabevehikel ist, um humane Preadipozyten in Transplantationsverfahren zu tragen. Das Material sollte eine Struktur zum Tragen von implantierten Zellen (Preadiposezellen) und eine Struktur, die es ermöglicht, dass die Zellen nach Transplantation eindringen und differenzieren, bereitstellen. Eine Einführung von Endothelzellen, die angiogenetisch sind, würde die Leistungsfähigkeit von biokünstlichem Bindegewebefüllstoffmaterial auch verstärken. In gut vaskularisiertem Fettgewebe (bzw. Adiposegewebe) wird eine größere Anzahl reifer Adipozyten gefunden, möglicherweise infolge des Einflusses, den Endothelzellen auf die Differenzierung von Preadipozyten und Adipozyten haben. Folglich sind Endothelzellen bei der Fettgewebeentwicklung, die auf Preadipozyten basiert, besonders nützlich. Die mechanische Stabilität des Trägers ist ebenfalls von Bedeutung und das Material/der Träger kann nach der Transplantation nicht zu schnell resorbiert werden.
Diese Erfordernisse werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt, die eine optimale Matrix für isolierte und kultivierte humane Preadipozyten, mesenchymale Stammzellen und Endothelzellen in vitro und in vivo bereitstellt. Die vorliegende Erfindung ist auch als biokünstliches Bindegewebe-Füllstoffmaterial, insbesondere als Gerüst für Preadipozyten, mesenchymale Stammzellen und/oder Endothelzellen mit der Fähigkeit, eine Invivo-Adipogenese zu unterstützen, einsetzbar.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Humane Preadipozyten 24 Stunden, nachdem sie auf HYAFF 11-Schwamm (HS+) gesät worden waren. Es kann eine gute Haftung lebensfähiger Zellen an dem Gerüst beobachtet werden. Es sind zytoplasmische Vakuolen zu sehen und diese speichern Lipid als typische morphologische Anzeichen einer Differenzierung (Toluidin-Blau, sc = Gerüst).
2: Makroskopisches Aussehen von explantierten HS-Transplantaten nach 3 Wochen in der nackten Maus. Ein dünnes gelbes Gewebe liegt an den Preadipozyten-Transplantaten mit neuer Gefäßbildung vor (rechts). Der kontralaterale Kontrollschwamm aus demselben Tier zeigte fast keine Veränderung am Schwamm und keine Gefäße (links).
3: Mikroskopische Ansicht des HS+-Abschnitts nach 3 Wochen in der nackten Maus. Differenzierte Adipozytencluster sind in den offenen Poren selbst in der Mitte des Schwamms zahlreicher. Beachte die intensive rote Färbung von Lipid, das reife Adipozyten enthält und die Gerüststruktur (Öl-Rot, sc = Gerüst).
4: Eingedrungene humane Zellen in Preadipozyten/Gerüst-Transplantaten HS+ in Gruppe A (3 Wochen in vivo). Beachte eine gute und homogene Verteilung von humanen Zellen im Gerüst (mah-vim-Färbung, sc = Gerüst).
5: Zellularität von Donor- und Wirtszellen in Preadipozyten/Gerüst-Konstrukten und Kontrollen.
6: Ultrastruktur von Preadipozyten in der non-woven-Matrix nach 3 Wochen in vivo. Die Zellen enthalten viele zytoplasmische Lipidtröpfchen. Die Fasern und Preadipozyten sind eng zusammengepackt. Beachte die HYAFF^®11-Faser in der linken oberen Ecke und die neue ECM dazwischen.
7: Differenzierte Adipozyten in einem Cluster in einem HYAFF^®11-Schwamm nach 8 Wochen in vivo. Die Zellen enthalten einzelne Lipidtröpfchen großer Größen (>50 μm) und zeigen ein typisches Siegelring-Aussehen. Beachte die neuen Kollagenfasern zwischen den Zellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Bindegewebedefektkorrektur kann durch plastische oder rekonstruktive Operation durch Implantation von isolierten und in Kultur vermehrten Adiposevorläuferzellen, MSCs und/oder Endothelzellen durchgeführt werden. Adiposevorläuferzellen differenzieren, wenn sie implantiert sind, zu Adipozyten, die Tierbindegewebszellen sind, die auf die Synthese und Speicherung von Fett spezialisiert sind. Obgleich MSCs in einigen Fällen zuerst eine Invitro-Manipulation zur Initiation einer Differenzierung erfordern, sind diese Zellen auch fähig, Adipozyten zu produzieren. Allerdings sind geeignete Träger oder Gerüste bei dieser Bindegewebeentwicklung notwendig, um eine Differenzierung und Proliferation von Vorläuferzellen, MSCs oder Endothelzellen zu ermöglichen und zu fördern.
In der vorliegenden Erfindung umfasst das Biomaterial zur Bindegewebe-Rekonstruktion (a) ein Trägermaterial, das einen Benzylester von Hyaluronsäure umfasst, und (b) Preadipozytenzellen, die auf dem Trägermaterial ausgesät sind. Das Trägermaterial kann ein Schwamm oder ein non-woven-Material sein. Alternativ ist das Biomaterial ein injizierbares Präparat zum Auffüllen von Bindegewebsdefekten und -depressionen, umfassend (a) ein vollständig wasserlösliches Hyaluronsäurederivat oder ein partiell wasserlösliches Hyaluronsäurederivat und (b) Preadipozytenzellen, die in dem Präparat suspendiert sind. Die Derivate sind insbesondere ein Benzylester oder ein Amidderivat. Benzylesterderivate mit 85% oder weniger Veresterung und das Dodecylamid von HA sind für injizierbare Präparate bevorzugt. Die Herstellung von solchen Benzylestern ist in EP 0 216 453 B1 beschrieben und die Herstellung von Amidderivaten ist in WO 00/01733 beschrieben.
Der Ausdruck „Hyaluronsäure" (im Folgenden auch als „HA" bezeichnet) wird in der Literatur verwendet, um ein saures Polysaccharid mit verschiedenen molekulargewichten, das durch D-Glucoronsäure- und N-Acetyl-D-glucosaminreste gebildet wird, zu bezeichnen, das natürlicherweise in zellulären Oberflächen, in den extrazellulären Grundsubstanzen des Bindegewebes von Vertebraten, in der Synovia der Gelenke, in der Glaskörperflüssigkeit des Auges, im Gewebe der humanen Nabelschnur und im Cocks-Kamm vorkommt.
Hyaluronsäure spielt in einem Organismus eine wichtige Rolle, zuerst als mechanischer Träger der Zellen vieler Gewebe, zum Beispiel der Haut, der Sehnen, der Muskeln und des Knorpels, und ist daher die Hauptkomponente der intrazellulären Matrix. Allerdings erfüllt Hyaluronsäure auch andere Funktionen in den biologischen Prozessen, zum Beispiel die Hydratisierung von Geweben, Schmierung, zelluläre Migration, Zellfunktion und -differenzierung (siehe zum Beispiel A. Balazs et al., Cosmetrics & Toiletries, Nr. 5/84, Seiten 8–17). Hyaluronsäure kann aus den oben genannten natürlichen Geweben, zum Beispiel Cocks-Kämmen, oder auch aus bestimmten Bakterien extrahiert werden. Heute kann Hyaluronsäure auch durch mikrobiologische Verfahren hergestellt werden. Das molekulargewicht der ganzen Hyaluronsäure, die durch Extraktion erhalten wird, liegt im Bereich von 813 Millionen. Allerdings kann die molekülkette des Polysaccharids unter dem Einfluss verschiedener physikalischer und chemischer Faktoren, wie zum Beispiel mechanische Einflüsse oder unter dem Einfluss von Strahlung, hydrolysierenden, oxidierenden oder enzymatischen Agentien, ziemlich einfach abgebaut werden. Aus diesem Grund werden in normalen Reinigungsverfahren oder ursprünglichen Extrakten abgebaute Fraktionen mit einem niedrigeren molekulargewicht erhalten (siehe Balazs et al., oben genannt). Hyaluronsäure, ihre molekülfraktionen und die entsprechenden Salze wurden als Medikamente verwendet, und ihre Verwendung wird auch in Kosmetika vorgeschlagen (siehe zum Beispiel den oben genannten Artikel von Balazs et al. und das französische Patent Nr. 2 478 468).
Als therapeutisches Mittel wurden Hyaluronsäure und ihre Salze speziell in der Therapie für Arthropathien, zum Beispiel in der Veterinärmedizin für die Heilung von Arthritis bei Pferden [Acta Vet. Scand. 167, 379 (1976)] eingesetzt. In der Augenchirurgie wurden Hyaluronsäure und ihre molekülfraktionen und ihre Salze als unterstützende und substitutionale therapeutische Mittel für natürliche Gewebe und Organe verwendet (siehe zum Beispiel Balazs et al., Modern Problems in Ophthalmology, Bd. 10, 170, S. 3- , E.B. Strieff S. Karger Herausg., Basel; Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, Artikel, präsentiert am Internationalen Kongress und Ersten Filmfestival über Intraokulare Implantation, Cannes, 1979; US-Patent Nr. 4 328 803 mit einer Zusammenfassung der Literatur über die Verwendungen von HY in der Ophthalmologie und US-Patent Nr. 4 141 973). Die europäische Pa tentpublikation Nr. 0 138 572 beschreibt eine molekülfraktion von Hyaluronsäure, die zum Beispiel als Natriumsalz für intraokulare und intraartikuläre Injektionen verwendet werden kann und die für den Ersatz von inneren Augenflüssigkeiten und in Arthropathie-Therapien geeignet sind.
Hyaluronsäure kann auch als Additiv für eine breite Vielzahl von Polymermaterialien, die für medizinische und chirurgische Gegenstände verwendet werden, zum Beispiel Polyurethane, Polyester, Polyolefine, Polyamide, Polysiloxane, Vinyl- und Acrylpolymere und Kohlenstofffasern, mit der Wirkung, diese Materialien biokompatibel zu machen, verwendet werden. In diesem Fall wird der Zusatz von HY oder einem ihrer Salze zum Beispiel durch Bedecken der Oberfläche solcher Materialien durch Dispersion in derselben oder durch diese beiden Verfahren durchgeführt. Solche Materialien können zur Herstellung verschiedener Hygieneartikel und medizinischer Artikel, zum Beispiel Herzklappen, intraokularer Linsen, Gefäßklipse, Herzschrittmacher usw. verwendet werden (siehe US-Patent Nr. 4 500 676).
Obgleich der Ausdruck „Hyaluronsäure" in einer unsachgemäßen Bedeutung verwendet wird, bezeichnet er, wie aus den obigen Ausführungen zu ersehen ist, eine ganze Reihe von Polysacchariden mit Alternationen aus D-Glucoronsäure- und N-Acetyl-D-glucosaminresten mit variierenden molekulargewichten oder sogar abgebauten Fraktionen derselben; obgleich die Pluralform „Hyaluronsäuren" geeigneter scheinen kann, soll die hierin geführte Diskussion unter Verwendung der Singularform fortgesetzt werden, um so Hyaluronsäure in ihren verschiedenen Formen, einschließlich ihrer molekülfraktionen, zu bezeichnen; die Abkürzung „HA" wird auch oft verwendet, um diesen Sammelbegriff zu beschreiben.
EP 0 216 453 B1 beschreibt vollständige oder partielle Ester bzw. Partialester von Hyaluronsäure mit einem Alkohol der aliphatischen oder araliphatischen Reihe oder ein Salz eines solchen Partialesters mit einer anorganischen oder organischen Base. Solche Ester besitzen interessierende bioplastische und pharmazeutische Eigenschaften und können auf verschiedenen Gebieten, einschließlich Kosmetik, Chirurgie und Medizin, verwendet werden. Im Fall von Hyaluronsäure, wo die neuen Produkte qualitativ dieselben oder ähnliche physikalisch-chemische, pharmakologische und therapeutische Eigenschaften besitzen, sind diese beträchtlich stabiler, speziell, was die Wirkung der natürlichen Enzyme angeht, die für den Abbau des Polysaccharidmoleküls im Organismus, speziell Hyaluronidase, verantwortlich sind und sie konservieren daher die oben genannten Eigenschaften über sehr lange Zeiträume.
WO 00/01733 beschreibt Hyaluronsäureamide und Derivate davon, die durch Umsetzung der Carboxygruppen oder Aminogruppen, die aus Deacetylierungsreaktionen stammen, mit Aminen und Säuren der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen Reihen und ohne Verwendung von Spacerketten erhalten werden. Diese Verbindun gen sind entweder wasserlöslich oder unlöslich, was von der Säure, dem Amin, dem prozentualen Gehalt an Amidbindung oder dem Hyaluronsäurederivat, das zur Herstellung des Amids verwendet wird, abhängt. Diese Amide können auf verschiedenen Gebieten wie der Chirurgie, bei der Prävention postoperativer Adhäsionen und hyperaktiver Narbenbildung, Kardiologie, Dermatologie, Ophthalmologie, Otorhinolaryngologie, Zahnmedizin, Orthopädie, Gynäkologie, Urologie, extrakorporaler Blutzirkulation und -oxygenierung, Kosmetik und Angiologie eingesetzt werden. Wie die oben beschriebenen Ester behalten diese Hyaluronsäureamide die Viskosität freier Hyaluronsäure bei, sind aber stabiler und länger beständig, bevor sie abgebaut werden.
WO 99/24070 beschreibt ein Biomaterial, das ein Benzylesterderivat von Hyaluronsäure in Kombination mit Zellen wie Stammzellen oder Adipozyten umfasst. Dieses Biomaterial ist zur Verwendung bei der Bindegeweberekonstruktion bestimmt.
WO 97/18842 beschreibt Zusammensetzungen, die ein Benzylesterderivat von Hyaluronsäure in Kombination mit mesenchymalen Stammzellen des Knochenmaterials zur Verwendung bei der Bindegeweberekonstruktion, zum Beispiel Hautrekonstruktion, umfassen.
WO 98/56897 beschreibt Zusammensetzungen von Hyaluronsäurederivaten, die Endothelzellen für Hauttransplantationen umfassen.
In der vorliegenden Erfindung wird der Ester von HA mit Benzylalkohol (der Benzylester) oder ein Amid von HA im Träger oder Gerüst für Adiposevorläuferzellen verwendet. Der in der Erfindung verwendete Benzylester von HA ist vorzugsweise ein „vollständiger Ester" (das heißt, ein Derivat, in dem alle Carboxylgruppen der HA mit Benzylalkohol verestert sind) oder ein 5-99%-Ester (das heißt, ein Derivat, in dem 5 bis 99% der Carboxylgruppen verestert sind und die restlichen Gruppen ein Salz gebildet haben). Diese Derivate liefern bevorzugte Gerüstträgermaterialien zur Kultivierung und zum Wachstum von humanen Preadipozyten, MSCs und/oder Endothelzellen. Diese Derivate können auch mit begleitenden Zellpopulationen (Preadipozyten, mesenchymale Stammzellen oder Endothelzellen) durch Injektion abgegeben werden. Hier wird beispielsweise ein Benzylester oder ein Amid von HA mit einer Population von Preadipozyten und/oder MSCs und/oder Endothelzellen vermischt und dann in eine Bindegewebsstelle, die eine Depression, einen Defekt, Falten oder Verformung enthält, injiziert. Hyaluronsäurederivate, speziell solche, in denen 85% oder weniger der Carboxylgruppen der HA mit Benzylalkohol verestert sind, und das Dodecylamid von HA sind besonders bevorzugt. Eine speziell bevorzugte Kombination ist das HA-Dodecylamid und Preadipozytenzellen.
Die Benzylester, wie sie oben genannt wurden, können nach den Verfahren hergestellt werden, die in EP 0 216 453 B1 beschrieben sind (siehe Beispiele 1–4). Die Amide können nach den Verfahren hergestellt werden, die in WO 00/01733 beschrieben sind (siehe Beispiele 5–24).
Die folgenden Beispiele 1 bis 24 sind präparative Beispiele, die lehren, wie die in der Erfindung verwendeten Hyaluronsäurederivate zu synthetisieren sind.
Beispiel 1 – Herstellung des Benzylesters von Hyaluronsäure (HY)
12,4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem molekulargewicht von 170.000, was 20 m.Äq. einer monomeren Einheit entspricht, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25°C solubilisiert, 4,5 g (25 m.Äq.) Benzylbromid und 0,2 g Tetrabutylammoniumiodid werden zugesetzt, die Lösung wird für 12 Stunden bei 30°C gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam unter konstanter Bewegung in 3.500 ml Ethylacetat gegossen. Es wird ein Präzipitat gebildet, das filtriert wird und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen wird und schließlich für 24 Stunden bei 30°C vakuumgetrocknet wird.
9 g des in der Überschrift genannten Benzylesterprodukts werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Estergruppen wird nach dem Verfahren, das auf den Seiten 169–172 von Siggia S. und Hanna J.G., „Quantitative organic analysis via functional groups", 4. Auflage, John Wiley and Sons, beschrieben ist, durchgeführt.
Beispiel 2 – Herstellung des Benzylesters von Hyaluronsäure (HY)
3 g des Kaliumsalzes von HY mit einem molekulargewicht von 162.000 werden in 200 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, 120 mg Tetrabutylammoniumiodid und 2,4 g Benzylbromid werden zugesetzt.
Die Suspension wird für 48 Stunden bei 30°C unter Rühren gehalten. Das resultierende Gemisch wird langsam unter konstantem Rühren in 1.000 ml Ethylacetat gegossen. Es wird ein Präzipitat gebildet, das filtriert wird und viermal mit 150 ml Ethylacetat gewaschen wird und schließlich für 24 Stunden bei 30°C vakuumgetrocknet wird.
Es werden 3,1 g des in der Überschrift genannten Benzylesterprodukts erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Estergruppen wird nach dem Verfahren durchgeführt, das auf den Seiten 169–172 von Siggia S. und Hanna J.G., „Quantitative organic analysis via functional groups", 4. Auflage, John Wiley and Sons, beschrieben ist.
Das Gerüst-Trägermaterial besteht aus einem schwammartigen Material, das aus dem HA-Benzylester besteht und wie folgt hergestellt werden kann.
Beispiel 3 – Herstellung eines schwammartigen Materials, hergestellt mit Hyaluronsäureestern
1 g Benzylester von Hyaluronsäure mit einem molekulargewicht von 170.000, in dem alle Carboxylgruppen verestert sind (erhalten zum Beispiel wie oben beschrieben), wird in 5 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Zu je 10 ml der hergestellten Lösung wird ein Gemisch aus 31,5 g Natriumchlorid mit einem Körnungsgrad, der 300 μ entspricht, 1,28 g Natriumbicarbonat und 1 g Zitronensäure gegeben und das Ganze wird in einem Mischer homogenisiert.
Das pastenartige Gemisch wird auf verschiedenen Wegen in Schichten auseinander gezogen, zum Beispiel mithilfe einer Krätze, die aus zwei Walzen besteht, die sich bei einem einstellbaren Abstand zwischen den beiden in entgegengesetzter Richtung drehen. Unter Regulierung dieses Abstands wird die Paste zusammen mit einem Streifen Silikonpapier, der als Träger für die so gebildete Schicht aus Paste wirkt, zwischen den Walzen durchgeführt. Die Schicht wird zu den gewünschten Abmessungen der Länge und Breite geschnitten, vom Silikon entfernt, in Filterpapier eingewickelt und in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Wasser, entwickelt. Die so erhaltenen Schwämme werden mit einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Wasser, gewaschen und gegebenenfalls mit Gammastrahlen sterilisiert.
Ein Gerüst-Träger, der aus einem non-woven-Material des HA-Benzylesters (auch bekannt als HYAFF^®11) besteht, kann nach den folgenden Arbeitsgängen, wie es im US-Patent 5 520 916 beschrieben ist, hergestellt werden.
Beispiel 4
Eine Lösung von HYAFF^®11 in Dimethylsulfoxid mit einer Konzentration von 135 mg/ml wird in einem Tank hergestellt und durch eine Zahnraddosierpumpe in eine Spinndüse zur Nassextrusion, die aus 3.000 Löchern, die jeweils 65 μm messen, besteht, geführt.
Die extrudierte Masse aus Fäden wird in ein Koagulationsbad geleitet, welches absoluten Ethanol enthält. Sie wird dann über Transportwalzen zu zwei aufeinander folgenden Spülbädern, die absoluten Ethanol enthalten, bewegt. Das Streckverhältnis der ersten Walze wird auf Null eingestellt, während das Streckverhältnis zwischen den anderen Walzen auf 1,05 eingestellt wird. Sobald sie durch die Spülbäder geführt worden ist, wird das Hank aus Fäden mit heißer Luft mit 45°–50°C trocken geblasen und mit einem Walzenschneider in 40 mm-Fasern geschnitten.
Die so erhaltene Fasermasse wird in eine Schrägrinne gekippt, welche zu einer Kardier/Kreuzläppmaschine führt, aus der sie als ein 1 mm dickes Gewebe mit einem Gewicht von 40 mg/m² austritt. Das Gewebe wird dann mit einer Lösung von HYAFF^®11 in Dimethylsulfoxid mit 80 mg/ml besprüht, in ein Ethanolkoagulationsbad, in eine Spülkammer und schließlich in eine Trocknungskammer gelegt.
Die endgültige Dicke des Materials ist 0,5 mm.
Beispiel 5
Herstellung von partiell N-deacetylierter Hyaluronsäure in Form des Natriumsalzes (DHA/Na).
Ein Gramm Natriumhyaluronat mit einem mittleren molekulargewicht von 600 kDa wird in 50 ml einer 1 %-igen Lösung von Hydrazinsulfat in Hydrazinmonohydrat solubilisiert. Dieses wird unter Rühren fünf Tage lang (120 Stunden) bei 55°C reagieren gelassen, wonach die Reaktion durch Zusatz von 100 ml Ethanol gestoppt wird. Das so gebildete Präzipitat wird durch ei nen Gooch-Frittentiegel filtriert, mit Ethanol gewaschen und dann bei Raumtemperatur bei reduziertem Druck getrocknet. Etwaiges Hydrazid von Hyaluronsäure, das wahrscheinlich während der Reaktion durch Hydrazinolyse gebildet wird, wird durch Reaktion mit HIO₃ (Iodsäure) zerstört. Da die Reaktion sehr kräftig sein kann, wird sie unter Kühlung des Reaktionsbehälters in Eiswasser durchgeführt. Das Hydrazinolyseprodukt wird in 50 ml einer 5%-igen Natriumacetatlösung solubilisiert und mit 25 ml einer 0,5 M Iodsäurelösung umgesetzt. Die Reaktion läuft für 30 Minuten unter rühren ab, wonach 5 ml einer 57%-igen HI-Lösung zugesetzt werden, um nicht umgesetztes HIO₃ zu zerstören. Das Iod, das sich gebildet hat, wird mit mindestens drei 30 ml-Aliquots-Ethylether extrahiert (bis zur vollständigen Entfärbung der wässrigen Phase). Die wässrige Lösung wird durch Zusatz einer 0,5 M NaOH-Lösung zum neutralen pH gebracht, worauf eine Behandlung mit 100 ml Ethanol folgt. Das erhaltene Präzipitat wird mit einem Gooch-Frittentiegel filtriert, mit Ethanol gewaschen und dann bei Raumtemperatur und bei reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene Produkt wird analytisch charakterisiert, um das Vorliegen von N-deacetylierten Gruppen in Prozent und das mittlere molekulargewicht zu bestimmen.

Ausbeute der Reaktion 90%

% N-Deacetylierung 26%

Mittleres molekulargewicht 130 kDa
Beispiel 6
Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure, das teilweise mit Tetrabutylammonium N-deacetyliert ist (DHA/TBA)
Ein Gramm (2,5 mmol) Hyaluronsäure-Natriumsalz, teilweise N-deacetyliert, wird in 60 ml Wasser solubilisiert und die Lösung wird durch eine Säule, gefüllt mit 25 ml eines Sulfonsäureharzes in Form des Tetrabutylammoniumsalzes (TBA), perlen gelassen. Das Sulfonsäureharz in H⁺-Form wird mit einer 40%-igen (G/V)-Lösung von TBAOH aktiviert. Das Eluat, das N-deacetyliertes Hyaluronsäure-TBA-Salz enthält, wird gesammelt und gefriergetrocknet.
Beispiel 7
Herstellung von p-NO₂-Phenylester von Benzoesäure (Acylierungsmittel)
Zehn Gramm (0,082 mol) Benzoesäure werden in 800 ml CH₂Cl₂ solubilisiert, wonach 11,4 g (0,082 mol) p-NO₂-Phenol und 16,9 g (0,082 mol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zugesetzt werden. Die Reaktion läuft 2 Stunden ab, während die Lösung unter Rückfluss gekocht wird. Anschließend wird der Dicyclohexylharnstoff der sich bildet, abfiltriert, und das filtrierte Produkt wird unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird durch wiederholte Kristallisation in Ethylacetat gereinigt. Die Kristalle werden filtriert und zum Trocknen bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck ausgelegt. Das Derivat wird durch TLC-Analyse (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/Ethylacetat, 90/10 und Rf = 0,77) und durch IR- und UV-Spektroskopie charakterisiert.

Ausbeute der Reaktion: 92%
Beispiel 8
Herstellung von p-NO₂-Phenylester von Zimtsäure (Acylierungsmittel)
Zwölf Gramm (0,082 mol) Zimtsäure werden in 800 ml CH₂Cl₂ solubilisiert, wonach 11,4 g (0,082 mol) p-NO₂-Phenol und 16,9 g (0,082 mol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zugesetzt werden. Die Reaktion läuft 2 Stunden ab, während die Lösung unter Rückfluss gekocht wird. Anschließend wird der Dicyclohexylharnstoff der sich bildet, abfiltriert, und das filtrierte Produkt wird unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird durch wiederholte Kristallisation in Ethylacetat gereinigt. Die Kristalle werden filtriert und zum Trocknen bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck ausgelegt. Das Derivat wird durch TLC-Analyse (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/Ethylacetat, 90/10 und Rf = 0,77) und durch IR- und UV-Spektroskopie charakterisiert.

Ausbeute der Reaktion: 89%
Beispiel 9
Herstellung von p-NO₂-Phenylester von Dodecansäure (Acylierungsmittel)
Sechzehn Gramm (0,082 mol) Dodecansäure werden in 1 Liter CH₂Cl₂ solubilisiert, wonach 11,4 g (0,082 mol) p-NO₂-Phenol und 16,9 g (0,082 mol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zugesetzt werden. Die Reaktion läuft 2 Stunden ab, während die Lösung unter Rückfluss gekocht wird. Anschließend wird der Dicyclohexylharnstoff der sich bildet, abfiltriert, und das filtrierte Produkt wird unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird durch wiederholte Kristallisation in Ethylacetat gereinigt. Die Kristalle werden filtriert und zum Trocknen bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck ausgelegt. Das Derivat wird durch TLC-Analyse (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/Ethylacetat, 90/10 und Rf = 0,77) und durch IR- und UV-Spektroskopie charakterisiert.

Ausbeute der Reaktion: 93%
Beispiel 10
Herstellung von p-NO₂-Phenylester von Stearinsäure (Acylierungsmittel)
23,3 Gramm Stearinsäure werden in 1 Liter CH₂Cl₂ solubilisiert, wonach 11,4 g (0,082 mol) p-NO₂-Phenol und 16,9 g (0,082 mol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zugesetzt werden. Die Reaktion läuft 2 Stunden ab, während die Lösung unter Rückfluss gekocht wird. Anschließend wird der Dicyclohexylharnstoff der sich bildet, abfiltriert, und das filtrierte Produkt wird unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird durch wiederholte Kristallisation in Ethylacetat gereinigt. Die Kristalle werden filtriert und zum Trocknen bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck ausgelegt. Das Derivat wird durch TLC-Analyse (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/Ethylacetat, 90/10 und Rf = 0,77) und durch IR- und UV-Spektroskopie charakterisiert.

Ausbeute der Reaktion: 87%
Beispiel 11
Herstellung von p-NO₂-Phenylester von o-Acetyl-Salicylsäure (Acylierungsmittel)
14,7 Gramm Acetyl-Salicylsäure werden in 1 Liter CH₂Cl₂ solubilisiert, wonach 11,4 g (0,082 mol) p-NO₂-Phenol und 16,9 g (0,082 mol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zugesetzt werden. Die Reaktion läuft 2 Stunden ab, während die Lösung unter Rückfluss gekocht wird.
Anschließend wird der Dicyclohexylharnstoff der sich bildet, abfiltriert, und das filtrierte Produkt wird unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird durch wiederholte Kristallisation in Ethylacetat gereinigt. Die Kristalle werden filtriert und zum Trocknen bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck ausgelegt. Das Derivat wird durch TLC-Analyse (Elutionsmittel: CH₂Cl₂/Ethylacetat, 90/10 und Rf = 0,77) und durch IR- und UV-Spektroskopie charakterisiert.

Ausbeute der Reaktion: 80%
Beispiel 12
Herstellung von partiell N-acetylierter Hyaluronsäure (mit dem Benzoesäurederivat)
Ein Gramm (1,6 mmol) DHA/TBA (26% Deacetylierung) wird in 50 ml DMSO solubilisiert, wonach 5 ml einer 10%-igen Lösung von Benzoesäure-p-NO₂-Phenylester (hergestellt gemäß Beispiel 7) in DMSO zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ab, wonach sie durch Zusatz von 2,5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung blockiert wird. Diese wird 30 Minuten reagieren gelassen und danach werden 100 ml Ethanol langsam zugegeben. Das so erhaltene Präzipitat wird durch eine Gooch-Fritte filtriert, mit Ethanol und Ethylether gewaschen und schließlich bei Raumtemperatur und reduziertem Druck getrocknet. Das Derivat wird durch TLC (nach Hydrolyse des Amids), kolorimetrischer Analyse des Prozentgehalts an freien NH₂-Gruppen und durch IR- und UV-Spektroskopie analysiert.

Ausbeute der Reaktion: 85%

% freies NH₂ 11%

% N-Acylierung 15%
Beispiel 13
Herstellung von partiell N-acetylierter Hyaluronsäure (mit dem Zimtsäurederivat)
Ein Gramm (1,6 mmol) DHA/TBA (26% Deacetylierung) wird in 50 ml DMSO solubilisiert, wonach 5 ml einer 10%-igen Lösung von Zimtsäure-p-NO₂-Phenylester (hergestellt gemäß Beispiel 8) in DMSO zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ab, wonach sie durch Zusatz von 2,5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung blockiert wird. Diese wird 30 Minuten reagieren gelassen und danach werden 100 ml Ethanol langsam zugegeben. Das so erhaltene Präzipitat wird durch eine Gooch-Fritte filtriert, mit Ethanol/Wasser, 9:1, Ethylether gewaschen und schließlich bei Raumtemperatur und reduziertem Druck getrocknet. Das Derivat wird durch TLC (nach Hydrolyse des Amids), kolorimetrischer Analyse des Prozentgehalts an freien NH₂-Gruppen und durch IR- und UV-Spektroskopie analysiert.

Ausbeute der Reaktion: 85%

% freies NH₂ 11%

% N-Acylierung 15%
Beispiel 14
Herstellung von partiell N-acetylierter Hyaluronsäure (mit dem Dodecansäurederivat)
Ein Gramm (1,6 mmol) DHA/TBA (26% Deacetylierung) wird in 50 ml NMP solubilisiert, wonach 5 ml einer 10%-igen Lösung von Dodecansäure-p-NO₂-Phenylester (hergestellt gemäß Beispiel 9) in NMP zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ab, wonach sie durch Zusatz von 2,5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung blockiert wird. Diese wird 30 Minuten reagieren gelassen und danach werden 100 ml Ethanol langsam zugegeben. Das so erhaltene Präzipitat wird durch eine Gooch-Fritte filtriert, mit Ethanol und Ethylether gewaschen und schließlich bei Raumtemperatur und reduziertem Druck getrocknet.
Das Derivat wird durch TLC (nach Hydrolyse des Amids), kolorimetrischer Analyse des Prozentgehalts an freien NH₂-Gruppen und durch IR- und UV-Spektroskopie analysiert.

Ausbeute der Reaktion: 88%

% freies NH₂ 10%

% N-Acylierung 16%
Beispiel 15
Herstellung von partiell N-acetylierter Hyaluronsäure (mit dem Stearinsäurederivat)
Ein Gramm (1,6 mmol) DHA/TBA (26% Deacetylierung) wird in 50 ml NMP solubilisiert, wonach 5 ml einer 10%-igen Lösung von Stearinsäure-p-NO₂-Phenylester (hergestellt gemäß Beispiel 10) in NMP zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ab, wonach sie durch Zusatz von 2,5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung blockiert wird. Diese wird 30 Minuten reagieren gelassen und danach werden 100 ml Ethanol lang sam zugegeben. Das so erhaltene Präzipitat wird durch eine Gooch-Fritte filtriert, mit Ethanol und Ethylether gewaschen und schließlich bei Raumtemperatur und reduziertem Druck getrocknet. Das Derivat wird durch TLC (nach Hydrolyse des Amids), kolorimetrischer Analyse des Prozentgehalts an freien NH₂-Gruppen und durch IR- und UV-Spektroskopie analysiert.

Ausbeute der Reaktion: 85%

% freies NH₂ 12%

% N-Acylierung 14%
Beispiel 16
Herstellung von partiell N-acetylierter Hyaluronsäure (mit dem Acetyl-Salicylsäurederivat)
Ein Gramm (1,6 mmol) DHA/TBA (26% Deacetylierung) wird in 50 ml NMP solubilisiert, wonach 5 ml einer 10%-igen Lösung von Acetyl-Salicylsäure-p-NO₂-Phenylester (hergestellt gemäß Beispiel 11) in NMP zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ab, wonach sie durch Zusatz von 2,5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung blockiert wird. Diese wird 30 Minuten reagieren gelassen und danach werden 100 ml Ethanol langsam zugegeben. Das so erhaltene Präzipitat wird durch eine Gooch-Fritte filtriert, mit Ethanol und Ethylether gewaschen und schließlich bei Raumtemperatur und reduziertem Druck getrocknet. Das Derivat wird durch TLC (nach Hydrolyse des Amids), kolorimetrischer Analyse des Prozentgehalts an freien NH₂-Gruppen und durch IR- und UV-Spektroskopie analysiert.

Ausbeute der Reaktion: 90%

% freies NH₂ 10%

% N-Acylierung 16%
Beispiel 17
Herstellung von Hyaluronsäurebenzylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) Tetrabutylammoniumsalz von Hyaluronsäure (HA/TBA) werden in 100 ml DMSO solubilisiert. Diese Lösung wird mit 3 ml feuchtem Säureharz in DMSO und 784 mg (4,8 mmol) 1,1-Carbonyldiimidazol ergänzt. Das Ganze wird unter Rühren 12 Stunden lang reagieren gelassen, wonach es durch eine Gooch-Fritte filtriert wird, um das Harz zu eliminieren, dann wird das filtrierte Produkt mit 1 ml (9,6 mmol) Benzylamin ergänzt. Dieses wird für 48 Stunden umsetzen gelassen und dann werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt und das Ganze wird für 30 Minuten unter Rühren gelassen. Es wird mit 200 ml Aceton ergänzt und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und bei reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 25%
Beispiel 18
Herstellung von Hyaluronsäurebenzylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) Tetrabutylammoniumsalz von Hyaluronsäure (HA/TBA) werden in 100 ml DMSO solubilisiert. Die Lösung wird mit 1 M HCl auf pH 3 eingestellt und dann werden 784 mg (4,8 mmol) 1,1-Carbonyldiimidazol zugesetzt. Das Ganze wird unter Rühren 12 Stunden reagieren gelassen, wonach es durch eine Gooch-Fritte filtriert wird, um das Harz zu eliminieren, dann wird das filtrierte Produkt mit 1 ml (9,6 mmol) Benzylamin ergänzt. Dieses wird für 48 Stunden umsetzen gelassen und dann werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt und es wird für 30 Minuten unter Rühren gelassen. Es wird mit 200 ml Aceton ergänzt und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und bei reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 15%
Beispiel 19
Herstellung von Hyaluronsäurebenzylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) Hyaluronsäure in Säureform werden in 100 ml DMF solubilisiert. Zu dieser Lösung werden 854 mg (5,2 mmol) 1,1-Carbonyldiimidazol zugegeben. Das Ganze wird unter Rühren 6 Stunden reagieren gelassen, wonach 1,13 ml (10,4 mmol) Benzylamin zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 48 Stunden ab und wird dann durch Zugabe von 200 ml Aceton blockiert. Das erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC charakterisiert.

% Amidierung 60%
Beispiel 20
Herstellung von Hyaluronsäurebenzylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) Hyaluronsäure in Säureform werden in 100 ml DMF solubilisiert. Zu dieser Lösung werden 2 ml Pyridin, 3,68 g (0,025 mmol) p-NO2-Phenol und Pyridinchlorid gegeben, bis ein pH von 7/8 erreicht ist. Schließlich werden 5,3 g (0,026 mol) DCC und 2,8 ml (0,026 mol) Benzylamid zugesetzt. Das Ganze wird für 16 Stunden unter Rühren gehalten, wonach es durch Zusatz von 200 ml Aceton blockiert wird. Das erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC charakterisiert.

% Amidierung 5%
Beispiel 21
Herstellung von Hyaluronsäurebenzylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) HA/TBA werden in 100 ml DMSO solubilisiert. In die Lösung wird gasförmiges HCl eingeblasen, bis das Reaktionsgemisch einen pH zwischen 4,5 und 5 erreicht. Anschließend werden 518 mg (3,2 mmol) Carbonyldiimidazol zugesetzt. Das Ganze wird unter Rühren für 1 Stunde reagieren gelassen, wonach 0,700 ml (6,4 mmol) Benzylamin zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 16–18 Stunden ab. Nach dieser Zeit werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt. Durch Zugabe von 200 ml Aceton erfolgt eine Präzipitation und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 50%
Beispiel 22
Herstellung von Hyaluronsäureoctylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) HA/TBA werden in 100 ml DMSO solubilisiert. In die Lösung wird gasförmiges HCl eingeblasen, bis das Reaktionsgemisch einen pH zwischen 4,5 und 5 erreicht. Anschließend werden 207 mg (1,28 mmol) Carbonyldiimidazol zugesetzt. Das Ganze wird unter Rühren für 1 Stunde reagieren gelassen, wonach 0,417 ml (3,2 mmol) Octylamin zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 16–18 Stunden ab. Nach dieser Zeit werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt. Durch Zugabe von 200 ml Aceton erfolgt eine Präzipitation und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 25%
Beispiel 23
Herstellung von Hyaluronsäuredodecylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) HA/TBA werden in 100 ml DMSO solubilisiert. In die Lösung wird gasförmiges HCl eingeblasen, bis das Reaktionsgemisch einen pH zwischen 4,5 und 5 erreicht. Anschließend werden 104 mg (0,64 mmol) Carbonyldiimidazol zugesetzt. Das Ganze wird unter Rühren für 1 Stunde reagieren gelassen, wonach 600 mg (3,2 mmol) Dodecylamin zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 16–18 Stunden ab. Nach dieser Zeit werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt. Durch Zugabe von 200 ml Aceton erfolgt eine Präzipitation und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 15%
Beispiel 24
Herstellung von Hyaluronsäurehexadecylamid
Zwei Gramm (3,2 mmol) HA/TBA werden in 100 ml DMSO solubilisiert. In die Lösung wird gasförmiges HCl eingeblasen, bis das Reaktionsgemisch einen pH zwischen 4,5 und 5 erreicht. Anschließend werden 52 mg (0,32 mmol) Carbonyldiimidazol zugesetzt. Das Ganze wird bei Raumtemperatur unter Rühren für 1 Stunde reagieren gelassen, wonach 780 mg (3,2 mmol) Hexadecylamin zugesetzt werden. Die Reaktion läuft für 16–18 Stunden ab. Nach dieser Zeit werden 5 ml einer gesättigten NaCl-Lösung zugesetzt. Durch Zugabe von 200 ml Aceton erfolgt eine Präzipitation und das so erhaltene Präzipitat wird filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Das trockene Derivat wird durch TLC, IR und HPLC analysiert.

% Amidierung 5%
Beurteilung der biologischen Eigenschaften
In dieser Studie wurden humane Preadipozyten isoliert und kultiviert. 10⁶ Preadipozyten wurden auf verschiedene Gerüste gesät und in 42 nackte Mäuse implantiert, um neue Materialien zu testen. Es wurden Schwämme und non-woven-Materialien auf der Basis von Hyaluronsäure, die durch Veresterung modifiziert war (HYAFF^®11) und Kollagenschwämme verwendet. Gerüste ohne Zellen dienten in demselben Tier als negative Kontrollen. Nach 3 und 8 Wochen wurden die Transplantate explantiert. Das makroskopische Aussehen, das Gewicht, die Dicke, die Mikroskopie, die Immunhistochemie und TEM (Gerüststruktur, Zellularität, Penetrationstiefe der ausgesäten Zellen, Vaskularisierung) wurden ermittelt und bezüglich Unterschieden bei Gerüst-Zell-Wechselwirkungen beurteilt.
Resultate: In vitro-Preadipozyten differenzierten früher, wenn sie an HYAFF^®11-Gerüste angeheftet waren. Makroskopisch sahen alle Preadipozyten-Konstrukte gelblich aus und zeigten zahlreiche Gefäße, die Kontrollen sahen weiß aus und avaskulär. Mikroskopisch zeigten HYAFF^®11-Konstrukte höhere Zelldichten als Kollagen-Konstrukte. Die Poren der Schwämme enthielten mehr differenzierte Adipozyten als das non-woven Material, während die nicht-differenzierten Preadipozyten im non-woven zahlreicher waren. Die Penetration von Adiposevorläuferzellen (bzw. Fettvorläuferzellen) war bei HYAFF^®11-Gerüsten tiefer und homogener. Alle Preadipozyten-Transplantate hatten eine bessere Vaskularisierung als die Kontrollen; die Gefäßbildung war um reife Adipozyten ausgeprägter. Eine Elektronenmikroskopie zeigte gut differenzierte Adipozyten und große Mengen an ECM um Preadipozyten in HYAFF^®11-Schwämmen.
Schlussfolgerung: In vitro kultivierte humane Preadipozyten differenzieren zu fettartigem Gewebe. Dieses viel versprechende Verfahren wird für die zukünftige Rekonstruktion von Bindegewebsdefekten verwendet. HYAFF^®11-Schwämme unterstützten die Expansion und Differenzierung der Adiposevorläuferzellen. Dieser Träger ist bezüglich der Adipozytendifferenzie rung dem non-woven-Material überlegen und bezüglich der Zellularität dem Kollagenschwamm überlegen.
Materialien und Verfahren
Gerüste
Kollagenschwämme (Kollagen sponges = CS)
Kollagenschwamm-Gerüste wurden durch ein gerichtetes Verfestigungsverfahren, das von Heschal et al., Possible applications of directional solidification techniques in cryobiology, beschrieben wird, hergestellt. Bei P. Kittel (Herausgeber), Advances of Cryogenic Engineering, Bd. 41, New York: Plenum Press, 1996, wurde eine Suspension von Rinderkollagen vom Typ I (1,8 Gew.-%) (Dr. Otto Suwelack GmbH, Deutschland) gefroren und anschließend gefriergetrocknet; siehe WO 99/27315. Die restlichen Poren entsprechend der vorherigen Eiskristallstruktur mit einer durchschnittlichen Porengröße von 50 μm, wie es von Schoof et al., Einfluss des Einfriervorgangs auf die Porenstruktur gefriergetrockneter Kollagenschwämme, Ki-Luft und Kältetechnik, 34, 1998, beschrieben ist.
HYAFF^®11-Schwämme (HS)
HYAFF^®11 (ein lineares Derivat von Hyaluronsäure ist durch vollständige Veresterung der Carboxylfunktion der Glucuronsäure mit Benzylgruppen modifiziert)-Schwämme wurden hergestellt, wie es oben und von Rastrelli et al., Hyaluronic acid esters, a new class of semisynthetic biopolymers: chemical and physico-chemical properties. Clin. Implant. Mater. 9: 199, 1990, beschrieben wurde. Die HS-Struktur hat offene, unter einander verbundene Poren, die durch eine Technologie erhalten werden, welche einen Phasenumkehrprozess mit einem Niederdruckgasverfahren kombiniert. Die Porengröße variiert zwischen 50 bis 340 μm.
HYAFF^®11-non-woven-Material (HV)
HV besteht aus non-woven-Fasern (20 μm dick) aus Hyaluronanbenzylester mit einem spezifischen Gewicht von 100 g/m², der ebenfalls wie oben beschrieben hergestellt worden war. Für die Experimente wurden alle sterilisierten Materialien in Proben (0,75 cm × 0,75 cm × 0,5 cm) geschnitten.
Zellkulturen und Biohybride in vitro
Preadipozyten wurden aus frisch sezerniertem humanen subkutanen Fettgewebe (0,4–0,7 g) von jungen Erwachsenen (Alter: 18–29 Jahre) am Department of Plastic Surgery and Hand Surgery – Burn Center, in dem elektive Operationen (zum Beispiel Mammareduktionsplastik) durchgeführt wurden, isoliert. Das Fasergewebe wurde entfernt, das Fettgewebe wurde in Stücke geschnitten und durch Kollagenase, 0,1 E ml^–1/Dispase, 0,8 E ml^–1 (Boehringer Mannheim, Deutschland) in einem Wasserbad bei 37°C 60 Minuten unter permanentem Schütteln verdaut.
Der Verdau wurde durch Zusatz von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 15% FCS enthielt (Biochrom, Berlin, Deutschland) gestoppt und es folgte eine Inkubation in Erythrocyten-Lyse-Puffer (154 mmol 1^–1 NH₄Cl, 10 mmol 1^–1 KHCO₃, 1 mmol 1^–1 EDTA, 10 Minuten). Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (200xg bei 17°C für 10 min.) und die Zellen wurden auf Gewebekulturschalen (63,6 cm², Greiner, Solingen, Deutschland) mit DMEM-15% FCS (zugegeben 100 E ml^–1 Penicillin, 100 μg ml^–1 Streptomycin) mit einer Impfdichte bzw. Aussäedichte von 3 × 10⁴ Zellen/cm² ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C bei 10% CO₂ kultiviert, das Medium wurde am Tag 2 ausgetauscht und mit EGF (epidermaler Wachstumsfaktor, 10 ng ml^–1, Sigma) ergänzt. Preadipozyten des zweiten Durchgangs mit Konfluenz wurden trypsiniert, resuspendiert und in einem Hämocytometer gezählt. 100 μl Suspension, die 1 × 10⁶ ± 5 × 10⁴ Zellen enthielt (Preadipozytenpool), wurden durch leichtes Tropfen auf das durch FCS angefeuchtete Gerüst (auf die obere Oberfläche) gesät (FCS-Einweichen der Gerüste dauerte 24 Stunden bei 37°C vor Beimpfen mit den Zellen) und für 24 Stunden im Inkubator belassen, um eine Zellanhaftung zu ermöglichen.
Experimentelles In vivo-Modell
Nackte Mäuse ohne Thymus (8 Wochen alt, NMRI nu/nu) wurden unter aseptischen Bedingungen und Inhalationsnarkose (Enflurane^®) operiert. 42 hergestellte Preadipozyten/Gerüst(+)-Konstrukte und 42 negative (–) Kontrollen (Gerüst ohne Zellen, 24 h in DMEM eingeweicht) wurden transplantiert. Jedes Tier erhielt ein Preadipozyten/Gerüst-Konstrukt subkutan im linken skapularen Bereich und seine entsprechende Kontrolle an der kontralateralen Stelle durch getrennte Einschnitte. Der Boden der Konstrukte wurde an der Muskelfascia angeordnet. Alle Tierexperimente wurden nach dem deutschen Gesetz über den Tierschutz durchgeführt. Nach 3 Wochen (Gruppe A, 21 Tiere, die 7 CS+ und 7 CS, 7 HS+ und 7 HS–, 7 HV+ und 7 HV– trugen) und 8 Wochen (Gruppe B, 21 Tiere, 7 CS+ und 7 CS–, 7 HS+ und 7 HS–, 7 HV+ und 7HV–) wurden die Mäuse durch Überdosis an gasförmigem Anästhetikum getötet. Die Proben wurden zur makroskopischen (Farbe, Gefäße, Einwachsen) und mikroskopischen Analyse entfernt. Das Gewicht jedes Schwamms wurde vor Transplantation und nach Explantation ermittelt.
Histologie und Immunhistochemie
Ein Teil der vertikal halbierten Proben wurde in 4% gepufferter Formaldehydlösung fixiert und später in Paraffin eingebettet, die andere Hälfte wurde kryofixiert. Beide wurden vertikal geschnitten. Von In vitro- (3 Proben) und In vivo-Proben (6 Proben) wurden Ultraschallbilder erhalten. Gewebeschnitte mit 6 μm (Paraffinproben) wurden hergestellt und mit Hämatoxylin-Eosin und Giemsa gefärbt. Die kryofixierten Fragmente wurden zur Identifizierung von Lipidvakuolen mit Öl rot gefärbt. Paraffinschnitte der beimpften Matrices und der unbeimpften Kontrol len wurden durch monoklonale Antikörper, die für humanes Vimentin spezifisch sind (mahv, Klon V9, Code Nr. M 0725, Charge 057, DAKO, Dänemark), in einer Verdünnung von 1:10 gefärbt. Drei Prüfer, die nicht wussten, zu welcher Gruppe die Schnitte gehörten, beurteilten die histologischen Schnitte unabhängig. Wenn Unterschiede zwischen beiden Beurteilungen bestanden, wurde der Mittelwert errechnet.
Die nicht-spezifische Zellularität (Donor und Wirt) wurde durch Zählen aller Giemsagefärbten Zellkerne in 5 definierten mikroskopischen Bereichen der Querschnitte bei einer Vergrößerung von 200x ermittelt.
Die spezifische Zellularität (Donor = Mensch) wurde durch Zählen aller human-Vimentinpositiven Zellen in 5 definierten makroskopischen Gebieten mit einer Vergrößerung von 200x beurteilt.
Die Penetrationstiefe von Donorzellen wurde in 3 definierten mikroskopischen Gebieten bei einer Vergrößerung von 200x unter Verwendung eines intraokularen Mikrometers (Zeiss) gemessen.
Die Vaskularisierung der Transplantate wurde in den Querschnitten bestimmt. Wenn keine Gefäße vorhanden waren, wurde dies mit „–" gekennzeichnet, Gefäße in einer oder mehreren Oberflächenregionen wurden mit „+" gekennzeichnet, Gefäße im zentralen Bereich wurden mit „++" gekennzeichnet und eine homogene Verteilung der Gefäße innerhalb des Transplantats wurde mit „+++" gekennzeichnet.
Die Ultrastruktur der Transplantate wurde nach Postfixierungsbehandlung ermittelt und mit einem Philips EM 400-Elektronenmikroskop sichtbar gemacht.
Statistische Beurteilung
Daten für das Gewicht und die Dicke der Transplantate, der Gesamtzellularität in den Transplantaten und die Penetrationstiefe der eingeimpften humanen Preadipozyten wurden als Mittelwert und + Standardabweichung ausgedrückt. Die Signifikanz von Differenzen zwischen unterschiedlichen Implantationszeiträumen und zwischen den Preadipozyten/Gerüst-Konstrukten und der negativen Kontrollen wurden durch den Wilcoxon-Bewertungstest beurteilt. Differenzen mit p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Resultate:
Kultur
24 Stunden nach dem Aussäen bzw. nach dem Impfen hafteten die Zellen gut an den Ge 66666 rüsten (1). Die Penetration der Zellen in vitro wurde nur an den Gerüstoberflächenbereichen beobachtet. Unmittelbar vor Transplantation zeigten die Adiposevorläufer in HS+ und HV+ eini ge cytoplasmatische Vakuolen und eine runde Gestalt als Anzeichen einer Differenzierung ( 1) bei der Histologie und Ultrastruktur. Dies wurde in CS+-proben nicht beobachtet.
Makroskopisch sichtbare Morphologie
Alle Proben wurden einfach identifiziert. Die makroskopisch sichtbare Gestalt der CS+- und HS+-Proben war nach 3 und 8 Wochen fast unverändert. CS–- und HS–-Proben zeigten runde Ränder und sahen kleiner aus als CS+ und HS+. HV+ zeigte eine große Schwankungsbreite zwischen den Proben, HV–-Gerüste zeigten die höchste Verformung und Schrumpfung. Alle Preadipozyten/Gerüst-Konstrukte waren von dicht anhaftenden Schichten aus makroskopisch gelbem Gewebe und neuen Gefäßen an der Oberseite bedeckt (2). Die Kontrolltransplantate sahen weiß und fast avaskulär aus (2).
Gewichtsänderungen als Funktion der Zeit (Tabelle 1)
CS+- und CS–-Gewichte: Nach 24 Stunden in vitro gab es keinen Unterschied in Gewicht zwischen den Kollagengerüsten, die Preadipozyten tragen, CS+ und solchen ohne Zellen, CS–. Nach 3 Wochen in vivo gab es einen deutlichen Gewichtsverlust für CS+ und CS–. CS+ wies ein signifikant höheres Gewicht als CS– auf. Die Gewichtsverringerung zwischen Woche 3 und Woche 8 war geringer als die Gewichtsverringerung zwischen Implantation und Woche 3.
HS+- und HS–-Gewichte: Nach 24 Stunden in vitro war das Gewicht der Preadipozyten/Gerüst-Konstrukte HS+ höher als das der Kontrollen HS–. Nach 3 Wochen in der nackten Maus gab es eine Gewichtszunahme bei HS+, während es eine Gewichtsverringerung bei den Kontrollen HS– gab. Die Differenz war signifikant. Nach 8 Wochen hatte HS+ noch ein deutlich höheres Gewicht als die Kontrollen.
HV+- und HY–-Gewichte: Die non-woven-Matrix mit Preadipozyten zeigte zu allen Zeiten höhere Gewichte als die Kontrollen. Eine geringe Gewichtszunahme mit einer deutlichen Variation bei HV+ war nach 8 Wochen in vivo zu sehen.
Bei einem Vergleich der drei Gerüste miteinander (CS, HS und HV) zeigte HV das geringste Gewicht der untersuchten Gerüste und die größte Schwankung zwischen den Proben. Die Transplantate mit Preadipozyten hatten zu jeder Zeit in allen Transplantaten ein höheres Gewicht, was für HS+ und HV+ signifikant war. Eine signifikante Gewichtszunahme wurde nur bei HS+, die Preadipozyten trugen, beobachtet, was dem fettartigen Gewebe entsprach, das sich in diesem Gerüst entwickelte.
Histomorphologische Chronologie der Transplantate:
Übersicht
Jede explantierte Probe war von einer dünnen Faserkapsel umgeben, die das Gerüst mit dem nachgebildeten fettartigen Gewebe vom umgebenden Wirtsgewebe trennte. Eine mikrosko pische Untersuchung der Preadipozyten/Gerüst-Konstrukte zeigte, dass an den Oberflächen der Gerüste unter der Kapsel lebensfähiges Fettgewebe war. In den Bereichen unterhalb der Oberfläche wurden reife Adipozyten gefunden. Im zentralen Bereich der Schwämme wurden keine differenzierten Adipozyten beobachtet. In dem neu gebildeten Fettgewebe zeigten sich viele neue Gefäße. In den Kontrolltransplantaten wurden überhaupt keine Adipozyten gefunden. Die Poren schienen in HV (gequollene Fasern und verengte Poren) und in CS (eingebrochene Bereiche und verstopfte Poren) zusammengebrochen zu sein. Nur in HS war die poröse Struktur gut erhalten. In diesen HS+-Bereichen bestand Fettgewebe aus Adipozytenclustern (3).
Zellurarität
Die nicht-spezifische (Donor und Wirt) Zellurität in Kollagenproben war nach 3 und nach 8 Wochen in den CS+-Transplantaten größer als in den CS–, während es bei CS+ und bei CS– eine Verringerung der nicht-spezifischen Zellularität gab (Tabelle 2).
In den HYAFF^®11-Proben gab es eine höhere nicht-spezifische Zellularität in den Kontrolltransplantaten (HS– und HV–) als in den Preadipozyten tragenden Proben (HS+ und HV+). Zwischen Woche 3 und Woche 8 gab es eine leichte Verringerung der nicht-spezifischen Zellularität bei HS+, HV+ und HV– (Tabelle 2).
Eine Färbung auf humanes Vimentin zeigte, dass Zellen in CS+-, HS+- und HV+-Proben stark positiv waren, was humanen Ursprung beweist (4). Es gab keine positive Färbung bei den CS–-, HS–- und HV–-Proben. Diese spezifische (Donor-) Zellularität zeigte bei den drei verschiedenen Gerüsten interessante Resultate (Tabelle 2). Bei HS+ gab es keinen Unterschied zwischen Woche 3 und Woche 8; die nicht-spezifische Zellularität war höher als die spezifische Zellularität. Bei CS+ gab es eine leichte Verringerung zwischen Woche 3 und Woche 8. Bei HV+ gab es signifikante Differenzen zwischen Woche 3 und Woche 8. Die höchste spezifische Zellularität aller Gerüste wurde in Woche 3 bei HV+ (115 Zellen/Bereich) beobachtet, allerdings war bei HV+ 8 Wochen nach Implantation die Zahl der humanen Zellen auf die niedrigste Zahl aller Gerüste verringert (26 Zellen/Bereich).
Penetrationstiefe
Die Penetrationstiefe der humanen Adiposevorläuferzellen nach 3 Wochen in vivo war für jedes der Materialien unterschiedlich (Tabelle 3, 5). Die beste Penetration wurde bei HS+ gefunden. Nach 3 Wochen zeigten die meisten der HS+-proben eine vollständige Penetration der Zellen, nach 8 Wochen war die Penetration bei allen HS+ vollständig. Die Penetrationstiefe war bei HV+ nach 3 Wochen ¾ der Gerüstdicke und bei HV+ nach 8 Wochen vollständig. Bei CS+ gab es nach 3 Wochen eine partielle Penetration mit zunehmender Tiefe, diese war nach 8 Wochen aber noch partiell.
Reife Adipozyten wurden nur in einigen Bereichen gefunden. Die höchste Zahl an reifen Adipozyten penetrierte bei HS+ 1800 μm (3), die geringste Zahl an reifen Adipozyten penetrierte nur 280 μm bei HV+ (Tabelle 3, 5). In keinem der Kontrolltransplantate wurden Adipozyten gefunden.
Gefäßneubildung (Neovaskularisierung)
Es gab eine deutlich bessere Gefäßneubildung in den Preadipozyten/Gerüst (+Median)-Konstrukten als bei den negativen Kontrollen (–Median), und zwar bei allen Materialien (Tabelle 4). In den offenen untereinander verbundenen Poren von HS war die Gefäßneubildung am besten (++). In keinem der explantierten Transplantate gab es eine homogene und starke Gefäßverteilung (+++).
Ultrastruktur der Transplantate:
Elektronenmikroskopie gab detailliert humane Adiposevorläuferzellen und ihre Wechselwirkung mit den Gerüsten an. Nach 3 Wochen in vivo wurden in allen Preadipozyten zahlreiche zytoplasmische Lipidtröpfchen gefunden. Bei HV+ wurden hauptsächlich spindelförmige Preadipozyten mit vielen kleinen Lipidtröpfchen gefunden (6), was eine unvollständige Differenzierung anzeigt. Nicht-differenzierte fibroblastenartige Vorläufer waren tief im Inneren des non-woven-Materials (HV+) in engen Poren fest an das Trägermaterial gebunden. Bei HV+ wurden nach 3 Wochen viel mehr Zellen als in den Preadipozyten-Gerüst-Konstrukten gefunden. Viele Histiocyten und Riesenzellen traten in den negativen Kontroll-HV–-Transplantaten auf. Bei HS+ wurden hauptsächlich runde Zellen mit einzelnen großen Lipidtröpfchen mit adipozytentypischem Siegelring-Aussehen gefunden (7). In der Nähe der Preadipozyten und Adipozyten befanden sich viele Kapillaren. In enger Nachbarschaft zum Gerüst wurden viele neue Kollagenfibrillen gefunden. Adipozyten waren eng an das Gerüst gebunden und dazwischen wurden Bündel neuer Kollagenfibrillen gefunden (7). Nach 8 Wochen war die in vivo-Morphologie der Adipozyten ähnlich der der 3 Wochen-Proben. Die Gerüste zeigten eine unregelmäßigere Struktur und verstopfte Poren durch kollabierte Gerüstreste. Es gab einige Riesenzellen und neu gebildete ECM, die hauptsächlich aus Kollagenfasern bestand.
Tabelle 1: Mittlere Gewichte der verschiedenen Gerüste in vitro (24 Stunden) und nach Implantation in nackte Mäuse mit (+) und ohne (–) angeheftete humane Preadipozyten. CS (Kollagenschwämme), HS (HYAFF^®11-Schwämme) und HV (HYAFF^®11-non-woven).
Tabelle 2: Zellularität (mittlere) bei verschiedenen Gerüsten, implantiert in nackte Mäuse mit (+) und ohne (–) angeheftete humane Preadipozyten. „Nicht-spezifisch" umfasst alle Zellen, die mit Giemsa (Donor und Wirt) gefärbt werden, „spezifisch" umfasst alle Zellen humanen Ursprungs, die mit MAH-Vim (Donor) gefärbt werden.
Tabelle 3: Penetrationstiefe (mittlere) von nicht-differenzierten humanen Preadipozyten, gefärbt durch MAH-Vim in den verschiedenen Preadipozyten/Gerüst-Konstrukten, die in nackte Mäuse implantiert waren. Differenzierte Adipozyten, die mit Öl-Rot gefärbt waren, wurden nur in einigen Bereichen gefunden, die maximale Tiefe ist angegeben.
Tabelle 4: Gefäßneubildung in verschiedenen Gerüsten, implantiert in nackte Mäuse mit (+) und ohne (–) angeheftete humane Preadipozyten. „–" keine Gefäße, „+" Gefäße in einem oder mehreren Oberflächenbereichen, „++" Gefäße in zentralen Bereichen, „+++" homogene Gefäßverteilung (mittlere).
Ein im Gewebe entwickeltes Fettgewebe hat das Potential, kongenitale, idiopathische oder traumatische Bindegewebsdefekte in allen Bereichen des Körpers zu korrigieren, ohne einen wesentlichen Donordefekt zu erzeugen. Die vorliegende Studie bewegt die Machbarkeit der Entwicklung eines fettartigen Gewebes durch Transplantieren kultivierter Preadipozyten, gefolgt von einer Differenzierung nach Implantation.
Bei 3-wöchigen und 8-wöchigen In vivo-Studien erwies sich der Hyaluronanbenzylester (HYAFF^®11)-Schwamm als ein besseres Gerüst als der Kollagenschwamm und das Hyaluronanbenzylester (HYAFF^®11)-non-woven-Material, und zwar, was konstantes Gewicht, homogene Verteilung überlebender Donorvorläuferzellen und schließlich die Höchstmenge an differenziertem Gewebe angeht. Der Hyaluronanbenzylester-Schwamm zeigte nicht nur ein konstantes Gewicht, sondern auch das höchste Gewicht aller untersuchten Gerüste. Konstantes Gewicht und konstante Größe eines Bindegewebefüllmaterials sind für eine klinische Verwendung die wichtigsten Kriterien.
Die anfängliche spezifische Zellularität (nach 3 Wochen in vivo) war bei Hyaluronanbenzylester-non-woven (HV+) zweimal so hoch wie die bei Kollagen (CS+)- und Hyaluronan-Schwämmen (HS+). Die endgültige spezifische Zellurarität pro Bereich (nach 8 Wochen in vivo) war bei den Schwämmen (CS+, HS+) zweimal so hoch wie die bei non-woven-Material (HV+). Die spezifische Zellularität zeigt die ausgesäten (bzw. eingeimpften) humanen mesenchymalen Vorläuferzellen an. Es ist wahrscheinlich, dass ein Kollabieren des nonwoven-Materials (gequollene Fasern und verengte Poren) den Raum, der für die Preadipozyten zur Differenzierung zur Verfügung stand, verringerte. Zusammengebrochene Bereiche und verstopfte Poren des Kollagengerüsts zeigten nach 8 Wochen keine differenzierten Adipozyten (CS+). In Hyaluronanbenzylester-Schwämmen (HS+) war die poröse Struktur nach 8 Wochen noch vorhanden und in diesen Bereichen bestand das Fettgewebe aus Adipozytenclustern.
Alle Explantaten mit angehefteten humanen Preadipozyten schienen im Vergleich zu Kontrollgerüsten ohne Zellen vaskularisiert. Die Kontrollen sahen weiß aus und fast ohne Gefäße. Dieses Resultat wird wahrscheinlich einer extrazellulären Matrix zugeschrieben, die durch kultivierte Adiposevorläufer produziert wird und ein wirksamer Inducer der Gefäßneubildung ist. Die Gefäße innerhalb der Proben bestätigten die makroskopische Morphologie. Die Gefäßneubildung war in Preadipozyten/Gerüst (+)-Konstrukten viel ausgeprägter.
Die nicht-spezifische Zellularität in Hyaluronanbenzylester-Gerüsten ohne Adiposevorläuferzellen (HS–, HV–) war höher als die bei HS+ und HV+. In den negativen Kontrollen wurden Histiocyten und mehrkernige Riesenzellen in größerer Anzahl beobachtet, was angibt, dass eine Gewebereaktion (Fremdkörperreaktion) viel stärker war. Diese Beobachtungen standen im Gegensatz zu der nicht-spezifischen Zellularität bei Kollagengerüsten. Diese Resultate können nach unserem heutigen Wissensstand nicht erklärt werden. Sie könnten einer Preadipozytensekretion von Inhibitorfaktor zugeordnet werden, wenn sie auf Hyaluronanbenzylestermaterial wachsen gelassen werden und transplantiert werden. Diese Beobachtung muss in weiteren Experimenten untersucht werden.
Die Penetrationtiefe von Zellen in eine Matrix ist ein guter Parameter für die Gerüst/Zell-Wechsewirkungsanalyse bei der Gewebeentwicklung. In der vorliegenden Studie waren bei allen Gerüsttypen humane Zellen noch nach 8 Wochen in der nackten Maus vorhanden. Über diesen Zeitraum gab es bei den Schwämmen eine zunehmende Penetration der Zellen. Diese biologisch abbaubaren schwammartigen Hyaluronsäureträger unterstützen die Expansion und Differerenzierung der Vorläuferzellen. Eine homogenere Verteilung der eingeimpften Zellen führte zu einer weniger konzentrierten Anzahl in den untersuchten Bereichen, was mit einer besseren Penetration in das Transplantat verbunden war.
Humane Preadipozyten drangen in das Gerüst in vivo zu einer mittleren Tiefe von 2227 ± 706 μm bei HS+ ein, reife Adipozyten wurden bis zu einer mittleren Tiefe von 520 μm (Maximum 1800 μm) gefunden. Wir schließen daraus, dass Preadipozyten ausreichend porösen Raum brauchen, um zu reifen Adipozyten zu differenzieren. Das optimale Material und die optimale Gerüstarchitektur, die bei der Fettgewebeentwicklung eingesetzt werden, muss definiert werden. Das ideale Gerüst enthält gemäß den vorliegenden Resultaten große (>120 μm) untereinander verbundene Poren und hat verringerte Quelleigenschaften. Der HYAFF^®11-Schwamm erwies sich als dem HYAFF^®11-non-woven und dem Kollagenschwamm in den vorliegenden Experimenten als überlegen.
Eine neue Strategie für die angewandte chemische Forschung sollte die In vitro-Rekonstruktion von Geweben und ganzen Organen, erhalten durch eine gesteuerte In vitro-Proliferation von autologen Zellen desselben Patienten, sein. Die dreidimensionale Struktur eines Gerüsts, das mesenchymale Zellen trägt, ist für die Abscheidung extrazellulärer Matrix von Bedeutung. Die Qualität der Matrix ist für die Regulierung der zellulären Aktivitäten und für die Qualität der extrazellulären Matrix von Bedeutung um ähnliche Eigenschaften des Ersatzstoffes wie die des nativen Gewebes zu erreichen. Daher ist es wichtig, den Einfluss verschiedener Matrices auf das In vitro- und In vivo-Verhalten der eingeimpften Zellen zu untersuchen. Auf dem Gebiet der Gewebeentwicklung wurden im Verlauf der letzten zehn Jahre viele Materialien untersucht. Gerüste auf Kollagenbasis als einem der ersten biologisch abbaubaren Träger und Gerüste auf Hyaluronanbasis als neues Material bei der Gewebeentwicklung wurden in der vorliegenden Studie untersucht. Die poröse Kollagenmatrix kann ein zelluläres Einwachsen und die Synthese neuer Matrix unterstützen. Ein Kollagengerüst stellt eine gute Matrix für Fibroplasten dar, die vollständig differenzieren und zeigen in vivo eine normale Morphologie und einen normalen Metabolismus. Hyaluronsäure liegt in der extrazellulären Matrix vieler Gewebe vor und kommt im mesenchymalen Gewebe im Fötus reichlich vor und es wird davon ausgegangen, dass Biomaterialien auf der Basis von HA für die Entwicklung der Progenitorzelle tragend sind und eine Gewebereparatur unterstützen. Während der Adipozytendifferenzierung erwerben Vorläuferzellen die Charakteristika von Adipozyten und es treten drastische Veränderungen in der Zellmorphologie auf. Die physikalische Verbindung zwischen extrazellulärer Matrix und der Kernmatrix einerseits und der Qualität der extrazellulären Matrix andererseits beeinflusst die Adipozytendifferenzierung wesentlich. ECM des losen Bindegewebes des nativen Fettgewebes verbindet die Adipozyten untereinander und induziert eine Fettzellanhäufung in vivo. Es wird daher der Schluss gezogen, dass Hyaluronal, das in allen Bindegeweben vorliegt, in vivo die Fettumwandlung positiv beeinflusst. Da Cluster aus reifen Adipozyten nur in HYAFF®11- Schwämmen und nicht in HYAFF^®11-nonwoven gefunden werden, wird der Schluss gezogen, dass die Qualität des Gerüstes ebenso wichtig ist wie die Architektur. In der vorliegenden Studie lieferten schwammartige Hyaluronalbenzylestergerüste die besten Resultate der untersuchten Materialien.

Claims

Biomaterial zur Bindegewebe-Rekonstruktion, umfassend: (a) ein Trägermaterial, das einen Benzylester von Hyaluronsäure umfasst, und (b) Preadipozytenzellen, die auf dem Trägermaterial ausgesät sind.
Biomaterial nach Anspruch 1, das außerdem mindestens ein Glied der Gruppe, die aus mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen besteht, umfasst.
Biomaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Benzylester von Hyaluronsäure ein 100%-Ester ist, in dem alle Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit einem Benzylalkoholrest verestert sind.
Biomaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Benzylester von Hyaluronsäure ein 5- bis 99%-Ester ist, in dem 5 bis 99% der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit einem Benzylalkoholrest verestert sind und die restlichen Gruppen ein Salz gebildet haben.
Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Trägermaterial ein Gerüst in Form eines schwammartigen oder „non-woven"-Materials ist.
Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens ein Glied der Gruppe aus Preadipozytenzellen, mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen humane Zellen sind.
Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Behandlung einer Bindegewebsschädigung.
Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur rekonstruktiven Behandlung einer Bindegewebsschädigung.
Injizierbares Präparat zum Auffüllen von Bindegewebsdefekten und -depressionen, umfassend (a) ein vollständig wasserlösliches Hyaluronsäurederivat oder ein partiell wasserlösliches Hyaluronsäurederivat und (b) Preadipozytenzellen, die in dem Präparat suspendiert sind.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9, das außerdem mindestens ein Glied aus der Gruppe, bestehend aus mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen, umfasst.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9 oder 10, wobei das vollständig wasserlösliche Hyaluronsäurederivat ein Amid von Hyaluronsäure ist.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9 oder 10, wobei das vollständig wasserlösliche Hyaluronsäurederivat ein Dodecylamid von Hyaluronsäure ist.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9 oder 10, wobei das partiell wasserlösliche Hyaluronsäurederivat ein 5- bis 99%-Ester ist, wobei 5 bis 99% der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit einem Benzylalkoholrest verestert sind und die restlichen Gruppen ein Salz gebildet haben.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9 oder 10, wobei das partiell wasserlösliche Hyaluronsäurederivat ein 85%-Ester ist, wobei 85% der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit ei nem Benzylalkoholrest verestert sind und die restlichen Gruppen ein Salz gebildet haben.
Injizierbares Präparat nach Anspruch 9 oder 10, wobei mindestens ein Glied der Gruppe aus Preadipozytenzellen, mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen humane Zellen sind.
Präparat nach einem der Ansprüche 9 bis 15 zum Auffüllen von Bindegewebsdefekten und -depressionen.
Präparat nach einem der Ansprüche 9 bis 16 zum Auffüllen von Bindegewebedefekten, -depressionen, -falten und Missbildungen bei einem Patienten, der dessen bedarf.
Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder injizierbares Präparat nach einem der Ansprüche 9 bis 15 zur Verwendung bei der rekonstruktiven Behandlung von Bindegewebsschädigung.