DE69917339T2

DE69917339T2 - Poröse polymere stützgewebe für gewebetechnologie

Info

Publication number: DE69917339T2
Application number: DE69917339T
Authority: DE
Inventors: B. Joachim KOHN; B. Howard LEVENE; M. Christelle LHOMMEAU
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2019-04-17
Also published as: AU768478B2; JP2002541925A; EP1173235A1; MXPA01010530A; DE69917339D1; CA2370810C; EP1173235B1; AU3566399A; ATE266435T1; CA2370810A1; ES2222700T3; WO2000062829A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch abbaubare poröse Polymergerüste, die für den Gewebeaufbau und die Gewebe geleitete Regenerierung brauchbar sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung biologisch abbaubare poröse Polymergerüste mit einer bimodalen Verteilung von Größen offener Poren, die ein hohes Ausmaß an miteinander Verbundensein ergeben, einer hohen inneren Oberfläche und linear aufgereihte Poren entlang der Wände der größeren Poren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der Gerüste, um die ordentliche bimodale Porenverteilung zu erhalten.
STAND DER TECHNIK
Synthetische biologisch abbaubare Polymergerüste sind als ein neues Mittel des Gewebeneuaufbaus und -reparatur vorgeschlagen worden. Die Gerüste dienen sowohl als physikalischer Träger als auch als adhäsives Substrat für isolierte Zellen während der in vitro-Kultivierung und der anschließenden in vivo-Implantierung. Die Gerüste werden verwendet, um Zellen zu gewünschten Stellen im Körper zu befördern, um einen potentiellen Raum für aufgebautes Gewebe zu definieren und den Vorgang der Gewebsentwicklung zu führen. Die Zelltransplantation auf Gerüste ist für die Regenerierung von Haut, Nerven, Leber, Pankreas, Knorpel, und Knochengewebe unter Verwendung von verschiedenen biologischen und synthetischen Materialien erforscht worden.
Bei einer alternativen Vorgehensweise werden abbaubare Polymergerüste unmittelbar in einen Patienten ohne vorherige in vitro-Kultivierung von Zellen implantiert. In diesem Fall muss das anfänglich zellfreie Gerüst in einer solchen Weise konstruiert werden, dass Zellen aus dem umgebenden lebenden Gewebe sich an das Gerüst anlagern und darin hineinwandern können, wodurch funktionelles Gewebe innerhalb des Innenbereichs des Gerüstes gebildet wird.
Eine Vielzahl von synthetischen biologisch abbaubaren Polymeren kann zur Herstellung von Gewebeaufbaugerüsten verwendet werden. Poly(glykolsäure) (PGA), Poly(milchsäure) (PLA) und deren Copolymere sind die am häufigsten verwendeten synthetischen Polymere in der Gewebeaufbautechnologie. Jedoch kann prinzipiell irgendein biologisch abbaubares Polymer verwendet werden, das nicht-toxische Abbauprodukte erzeugt. Die potentielle Nützlichkeit eines Polymers als gewebeaufbauendes Substrat ist vorwiegend davon abhängig, ob es leicht zu einem dreidimensionalen Gerüst verarbeitet werden kann. Daher ist die Entwicklung von Verarbeitungstechniken zur Herstellung von porösen Gerüsten mit sehr miteinander verbundenen Porennetzwerken zu einem wichtigen Forschungsgebiet geworden.
Lösungsmittelgießen ist eines der im größten Umfang verwendeten Verfahren zur Herstellung von Gerüsten aus biologisch abbaubaren Polymeren (siehe Mikos et al., Polymer, 35, 1068–77, (1994); de Groot et al., Colloid Polym. Sci., 268, 1073–81 (1991); Laurencin et al., J. Biomed. Mater. Res., 30, 133–8 (1996)). Die US-A-5 514 378 offenbart die grundlegende Verfahrensweise, bei der eine Polymerlösung über ein Bett von Salzkristallen gegossen wird. Die Salzkristalle werden anschließend durch Wasser in einem Auswaschverfahren weggelöst. De Groot et al. offenbaren ein modifiziertes Auswaschverfahren, bei dem die Zugabe eines Co-Lösungsmittels bei der Abkühlung durch Flüssigkeits/Flüssigkeits-Entmischung eine Phasentrennung des Systems induziert. Zwar führt dieser Trennungsmechanismus zur Bildung von runden Poren, die in die Polymermatrix eingebettet sind, jedoch haben die meisten Poren eine unzureichende Größe, um ein sehr miteinander verbunde nes Netzwerk zwischen den größeren Poren zu bilden, die durch die Auswaschung gebildet wurden.
Die bestehenden Verarbeitungsverfahren erzeugen schlechte Gerüste mit einem geringen Miteinanderverbundensein, insbesondere wenn ein grundlegendes Auswaschverfahren wie das in der US-A-5 514 378 offenbarte Verfahren verwendet wird. Teilchen sind, wenn sie in einer Polymerlösung dispergiert sind, vollständig durch die Lösung bedeckt, was das Miteinanderverbundensein der Poren innerhalb der Gerüste einschränkt.
Die US-A-5 686 091 offenbart ein Verfahren, bei dem biologisch abbaubare poröse Polymergerüste hergestellt werden, indem eine Lösungsmittellösung des Polymers unter eine spinodale Zersetzung erlaubenden Bedingungen geformt wird, gefolgt von Abschreckung der Polymerlösung in der Form und Sublimieren des Lösungsmittels aus der Lösung. Es ist eine einheitliche Porenverteilung offenbart. Eine bimodale Porenverteilung würde das Ausmaß des Miteinanderverbundenseins durch Erzeugung zusätzlicher Kanäle zwischen den Poren erhöhen, wobei dadurch die Gesamtporosität- und Oberfläche erhöht wird.
Die US-A-5 723 508 offenbart ein Verfahren, bei dem biologisch abbaubare poröse Polymergerüste hergestellt werden, indem eine Emulsion aus dem Polymer, einem ersten Lösungsmittel, in dem das Polymer löslich ist, und einem zweiten Polymer, das mit dem ersten Lösungsmittel nicht mischbar ist, gebildet wird und dann die Emulsion unter Bedingungen gefriergetrocknet wird, die die Emulsion nicht brechen oder das Polymer nicht aus der Lösung aus der Lösung entfernen. Jedoch erzeugt dieses Verfahren auch eine einheitliche Porengrößeverteilung, wobei der größere Teil der Poren im Bereich eines Durchmessers von 9 bis 35 μm liegt.
Daher bleibt ein Bedarf an biologisch abbaubaren porösen Polymergerüsten für die Gewebeaufbautechnologie, die eine bimodale Porengrößeverteilung aufweisen und ein miteinander in hohem Ausmaß verbundenes Porennetzwerk ergeben, sowie an Verfahren, mit denen diese Gerüste hergestellt werden können. Auf der Grundlage einer fortgeschritteneren wissenschaftlichen Begründung haben Polymergerüste mit einer bimodalen Porengrößeverteilung signifikante Vorteile. Poren in dem Größenbereich des Durchmessers von 50 bis 500 μm sorgen für einen ausreichend offenen Raum für die Bildung von von funktionalem Gewebe innerhalb des Gerüstes, wohingegen das Vorhandensein einer großen Anzahl von kleineren Poren, die Kanäle zwischen den größeren Poren bilden, den Zell/Zell-Kontakt, die Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff zu den Zellen, die Entfernung von Stoffwechselausscheidungsprodukten aus den Zellen und der Oberflächenstruktur zur Führung der Zellen erhöhen würde. Dieses neue Aufbaukonzept für abbaubare Polymergerüste erfordert die Anwesenheit einer bimodalen Porengrößeverteilung mit größeren Poren mit einem Durchmesser von 50 bis 500 μm und kleineren Poren, die Kanäle zwischen den größeren Poren bilden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dieser Bedarf wird durch die vorliegende Erfindung erfüllt. Es wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Herstellung von Polymergerüsten mit neuen Strukturen für die Gewebeaufbautechnologie durch eine Kombination von Phasentrennungs- und Auslaugungsverfahren ermöglicht.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein biologisch abbaubares und biologisch verträgliches poröses Gerüst bereitgestellt, das eine im Wesentlichen kontinuierliche Polymerphase mit einer in hohem Maße verbundenen bimodalen Ver teilung von gerundeten großen und kleinen offenen Porengrößen aufweist, bei denen die großen Poren einen Durchmesser von zwischen etwa 50 und etwa 500 μm aufweisen und die kleinen Poren einen Durchmesser von weniger als 20 μm aufweisen, wobei die kleinen Poren in einer ordentlichen linearen Weise innerhalb der Wände der großen Poren aufgereiht sind. Das Miteinanderverbundensein der Poren wird durch das Vorhandensein der kleinen Poren stark erhöht, die Kanäle zwischen den großen Poren bilden. Dies führt zu einer Porosität von größer als etwa 90% und einer hohen spezifischen Porenoberfläche von mehr als 10 m²/g.
Das Netzwerk von kleinen Poren wird in den Wänden der großen Poren gebildet und ist in unerwarteter Weise in einer linearen Anordnung genau orientiert. Dies ergibt eine Oberflächenstruktur um das Zellwachstum in dem gesamten Gerüst zu führen. Dieser spezifische Aufbau ergibt auch eine große Oberfläche und inneres Volumen, das für die Zellbildung, das Zellwachstum und die Erzeugung von extrazellulären Matrizes ideal ist. Ferner ermöglicht das hohe Miteinanderverbundensein der Poren eine Verteilung der Poren über das gesamte Gerüst, eine Übermittlung von Zell/Zell-Signalmolekülen über die Gerüste hinweg, eine Diffusion von Nährstoffen über die gesamte Struktur und eine Strukturgebung der Oberfläche, um das Zellwachstum zu führen. Der Porendurchmesser und die miteinander verbundene Struktur sind für die Gefäßbildung und die Gewebeeinwachsung wesentlich.
Die offene Porosität der dreidimensionalen Struktur maximiert die Diffusion und ermöglicht das Einwachsen von Gefäßen in das implantierte Gerüst. In idealer Weise wird das Polymer mit der Zeit vollständig resorbiert, wobei lediglich das neu gebildete Gewebe zurückbleibt.
Die erfindungsgemäßen Polymergerüste werden aus homogenen Lösungen von biologisch abbaubaren Polymeren in einer Mischung aus einem ersten Lösungsmittel, in dem das Polymer löslich ist, und einem zweiten Lösungsmittel, in dem das Polymer unlöslich ist, das aber mit dem ersten Lösungsmittel mischbar ist, hergestellt. Die homogenen Lösungen werden auf wasserlösliche Teilchen gegossen, die einen Durchmesser zwischen etwa 50 und etwa 500 μm aufweisen, und dann durch Abschrecken bei einer niedrigen Temperatur phasengetrennt und gefriergetrocknet, gefolgt von Auslaugen. Die bimodale Verteilung der Porendurchmesser resultiert von den größeren Poren, die durch Auslaugen gebildet werden, und den kleineren Poren, die durch Kristallisation bei der Phasentrennung des Lösungsmittels gebildet werden, in dem das Polymer löslich ist.
Daher wird gemäß einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von biologisch abbaubaren und biologisch verträglichen porösen Polymergerüsten bereitgestellt, bei dem ein biologisch verträgliches Polymer in einer Mischung aus mischbaren Lösungsmitteln aus einem ersten Lösungsmittel, in dem das Polymer löslich ist, und einem zweiten Lösungsmittel, in dem das Polymer unlöslich ist, gelöst, wobei das Verhältnis des ersten Lösungsmittels zu dem zweiten Lösungsmittel in einem Bereich liegt, in dem sich das Polymer unter Bildung einer homogenen Lösung löst, und das erste Lösungsmittel einen Schmelzpunkt zwischen etwa –40 und etwa 20°C aufweist. Die homogene Lösung wird dann in einer Form angeordnet, die wasserlösliche nicht-toxische Teilchen enthält, die in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind und einen Durchmesser zwischen etwa 50 und etwa 500 μm aufweisen. Die Lösung wird dann mit einer Rate abgeschreckt, die wirksam ist, zur Kristallisation des ersten Lösungsmittels zu führen, bevor die Flüssig-Flüssig-Entmischung der Polymerlösung eintritt. Die Lösungsmittel werden dann aus der Polymerphase sublimiert, wonach die Teilchen durch Auslaugen mit einem Lösungsmittel entfernt werden, in dem die Teilchen löslich sind und das Polymer unlöslich ist.
Es wird angenommen, dass die lineare Mikrostruktur aus der Kristallisation des ersten Lösungsmittels in Gegenwart des zweiten Lösungsmittels an der Oberfläche der Teilchen resultiert. Dies führt zu hochporösen Gerüstschäumen, die eine große Oberfläche und ein großes inneres Volumen aufweisen.
Die zuvor genannten und weiteren Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen leicht ersichtlich, die im Folgenden angegeben sind, wenn sie in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung betrachtet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine mikroskopische Aufnahme (SEM) eines Schaums, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurde.
BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wendet eine thermisch induzierte Phasentrennung an, um hochporöse biologisch abbaubare Gerüste mit optimierten Eigenschaften für die Gewebeaufbautechnologie herzustellen. In Abhängigkeit von der Thermodynamik, der Kinetik und der Abkühlungsrate tritt eine Phasentrennung entweder durch Lösungsmittelkristallisation oder Flüssig-Flüssig-Entmischung auf. Diese Erfindung verwendet Lösungsmittel und Verarbeitungsbedingungen, unter denen eine Lösungsmittelkristallisation als Phasentrennungsmechanismus vorherrscht, um ein poröses Polymergerüst mit einer bimodalen Porendurchmesserverteilung zu erhalten, die ein hohes Ausmaß von miteinander ver bundenen Poren und eine in hohem Maße linear angeordneten Struktur von kleinen Poren innerhalb der Wände der großen Poren bereitstellt.
Die Auswahl von Lösungsmitteln und Verarbeitungsbedingungen sind kritisch, damit die Lösungsmittelkristallisation vor der Flüssig-Flüssig-Entmischung auftritt. Es wird eine Mischung von zwei Lösungsmitteln verwendet, wobei das Polymer in einem davon löslich ist (hier zum Zwecke der Klarheit als "erstes Lösungsmittel" bezeichnet) und das Polymer in einem davon unlöslich ist (hier zum Zwecke der Klarheit als "zweites Lösungsmittel" bezeichnet). Das erste und das zweite Lösungsmittel müssen mischbar sein und müssen Mischungen bilden, in denen das Polymer trotz seiner Unlöslichkeit in dem zweiten Lösungsmittel löslich ist. Die Mengen von Polymer, erstem Lösungsmittel und zweitem Lösungsmittel werden ausgewählt, um eine gleichförmige, homogene Lösung bereit zu stellen.
Das erste Lösungsmittel sollte einen Schmelzpunkt von zwischen etwa –40 und etwa 20°C aufweisen. Innerhalb dieses Bereichs ist die Kristallisation bei einer hohen Abkühlungsrate der bevorzugte Phasentrennungsmechanismus. Ein Schmelzpunkt zwischen etwa –20 und etwa +20°C ist bevorzugt. Ein Lösungsmittel, das in idealer Weise diese Anforderungen erfüllt, ist 1,4-Dioxan. Es hat einen Schmelzpunkt von 12°C und eine geringe Kristallisationsenergie.
Ohne sich auf eine spezielle Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die Kristallisation durch das zweite Lösungsmittel ausgelöst wird, wobei angenommen wird, dass es als Keimbildungsmittel fungiert. Lösungsmittel, in denen das Polymer unlöslich ist und die für die Verwendung als zweites Lösungsmittel geeignet sind, schließen Wasser und Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, tert.-Butanol und 1,3-Propandiol ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Es ist kritisch, dass das Polymer, in der Lösungsmittelmischung löslich ist.
Das am meisten bevorzugte Paar von erstem und zweitem Lösungsmittel besteht aus 1,4-Dioxan und Wasser. Wenn die Abkühlungsrate hoch ist, wird angenommen, dass die Kristallisation von 1,4-Dioxan begünstigt wird. Außerdem wird angenommen, dass die Kristallisation von 1,4-Dioxan durch Wasser ausgelöst wird, wobei angenommen wird, dass es als Keimbildungsmittel für die Kristallisation fungiert.
Polymere, die für Gewebeaufbautechnologiegerüste verwendet werden, müssen biologisch verträglich und biologisch abbaubar sein, zusätzlich dazu dass sie als adhäsive Substrate für Zellen fungieren, das Zellwachstum fördern und die Retention von differenzierter Zellfunktion ermöglichen. Diese Materialien müssen auch physikalische Eigenschaften besitzen, die hohe Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen, mechanische Festigkeit und eine leichte Verarbeitung zu komplexen Formen wie Knochenersatzteile ermöglichen. Die resultierende polymere Vorrichtung sollte auch steif genug sein, um die gewünschte Form unter in vivo-Bedingungen aufrecht zu erhalten.
Polymere, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im Wesentlichen biologisch abbaubar, nicht-toxisch und physiologisch verträglich. Das Polymer muss hinsichtlich der biologischen Verträglichkeit zum Zeitpunkt des Einpflanzens ausgewählt werden, und die Produkte seines Abbauverfahrens müssen auch biologisch verträglich sein. Zusätzliche Parameter, die eine bedeutende Rolle spielen, schließen die mechanischen Eigenschaften des Materials, insbesondere seine mechanische Steifigkeit ein. Eine verhältnismäßig hohe Steifigkeit ist vorteilhaft, sodass das Gerüst zu sammenziehenden Kräften widerstehen kann, die durch innerhalb des Gerüstes wachsende Zellen ausgeübt werden. Ebenso wichtig sind die thermischen Eigenschaften, insbesondere die Glasübergangstemperatur T_g, die hoch genug sein muss, sodass das Netzwerk von Poren in dem Gerüst nicht bei der Entfernung von Lösungsmittel zusammenbricht. Es ist auch wichtig, dass die Kinetik des biologischen Abbaus des Polymers sich der Geschwindigkeit des Heilungsprozesses anpasst.
Beispiele von geeigneten Polymeren schließen α-Hydroxycarbonsäuren und Copolymere derselben ein, die PGA, PLA und Copolymere derselben einschließen, das Polyethylenoxid/Polyethylenterephthalat, das von Reed et al., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., Seite 109 (1977) offenbart ist, und die Copolymere von Milch- oder Glykolsäure oder Kombinationen der beiden mit flexiblen Ketten mit Hydroxyende, vorzugsweise Poly(alkylenglykole) mit unterschiedlichen Molekulargewichten, die in der US-A-4 826 945 offenbart sind. Weitere geeignete Polymere schließen biologisch abbaubare und biologisch verträgliche Polycaprolactone, Polyhydroxybutyrate und Copolymere von Polyestern, Polycarbonaten, Polyanhydriden und Poly(orthoestern) ein.
Polyphosphoester auf Basis von Bisphenol-A sind auch für die Verwendung in einem biologisch abbaubaren Gerüstaufbau vorgeschlagen worden. Diese Polymere schließen Poly(bisphenol-Aphenylphosphat), Poly(bisphenol-A-ethylphosphat), Poly(bisphenol-A-ethylphosphonat), Poly(bisphenol-Aphenylphosphonat), Poly[bis(2-ethoxy)hyroxyphosphonisches Terephthalat], und Copolymere von Poly(phosphoestern) auf Basis von Bisphenol-A ein. Diese Polymere sind zwar in der US-A-5 686 091 vorgeschlagen worden, jedoch macht die bekannte Zytotoxizität von Bisphenol-A sie zu weniger bevorzugten Kandidaten für eine Implantierung. Andererseits sind ein wei teres nützliches Polymersystem die Copolymere von Polyethylenoxid/Polyethylentere-phthalat.
Besonders bevorzugte Polymere für die Durchführung der Erfindung sind Polymere von von Thyrosin abgeleiteten Diphenolverbindungen. Verfahren zur Herstellung der von Thyrosin abgeleiteten Diphenolmonomere sind in der US-A-5 587 507 und der US-A-5 670 602 offenbart. Die bevorzugten Diphenolmonomere sind des-Aminotyrosyl-tyrosin(DT)-Ester. Diese Monomere haben eine freie Carbonsäuregruppe, die verwendet werden kann, um eine seitenständige Kette anzuhängen. Üblicherweise werden verschiedene seitenständige Alkylesterketten verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden der Ethylester als DTE, der Butylester als DTB, der Hexylester als DTH, der Octylester als DTO, der Benzylester als DTBn usw. bezeichnet.
Die von Tyrosin abgeleiteten Diphenolverbindungen können als monomere Ausgangsmaterialien für Polycarbonate, Polyiminocarbonate, Polyarylate, Polyurethane, Polyether, und dergleichen verwendet werden. Polycarbonate, Polyiminocarbonate und Verfahren zur Herstellung sind in der US-A-5 099 060 und der US-A-5 198 507 offenbart. Polyacrylate und Verfahren zur Herstellung sind in der US-A-5 216 115 offenbart. Blockcopolymere von Polycarbonaten und Polyarylaten mit Poly(alkylenoxiden) und Verfahren zur Herstellung sind in der US-A-5 658 995 offenbart. Genau alternierende Poly(alkylenoxidether)copolymere und Verfahren zur Herstellung sind in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US98/23737 offenbart, die am 6. November 1998 eingereicht wurde.
Weitere besonders bevorzugte Polymere schließen die Polycarbonate, Polyiminocarbonate, Polyarylate, Polyurethane, genau alternierende Poly(alkylenoxidether) und Poly(alkylenoxid)blockcopolymere ein, die aus Dihydroxymonomeren polymerisiert worden sind, die aus α-, β- und γ-Hydroxysäuren und Derivaten von Tyrosin hergestellt wurden. Die Herstellung der Dihydroxymonomere und Verfahren zur Polymerisation sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/U598/036013 offenbart.
Polycarbonate, Polyiminocarbonate, Polyarylate, Poly(alkylenoxid)blockcopolymere und Polyether der Diphenol- und Dihydroxytyrosinmonomere, die Iodatome enthalten oder die seitenständige Ketten mit freier Carbonsäure enthalten, können ebenso verwendet werden. Iod enthaltende Polymere sind radioopak. Diese Polymere und Verfahren zur Herstellung sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US98/23777 offenbart, die am 6. November 1998 eingereicht wurde. Polymere, die seitenständige Ketten mit freier Carbonsäure enthalten und Verfahren zur Herstellung sind in der US-A-6 120 491 offenbart.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der biologischen abbaubaren Gerüste für die Gewebetechnologie wird das Polymer zuerst in der Mischung aus mischbaren Lösungsmitteln gelöst. Die Menge des zweiten Lösungsmittels sollte diejenige Menge sein, die wirksam ist, eine Phasentrennung beim Abkühlen auszulösen, jedoch geringer als die Menge, die wirksam ist, eine Phasentrennung vor dem Beginn des Vorgangs auszulösen. Das Volumenverhältnis des ersten Lösungsmittels zum Gesamtvolumen an Lösungsmittel liegt vorzugsweise zwischen etwas 1 bis etwa 40 V/V und insbesondere zwischen etwa 5 bis etwa 15% V/V.
Die Polymerkonzentration in der Lösungsmittelmischung beträgt vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 25 Gew.-% und insbesondere zwischen etwa 10 und etwa 20 Gew.-%. Die Konzentration des Polymers im Lösungsmittel sollte ausgewählt werden, um eine angemessene Diffusion der Polymerlösung durch die Teilchen für die Bildung der größeren Poren sicherzustellen.
Die Teilchen sind im Wesentlichen aus irgendeiner nichttoxischen biologisch verträglichen kristallinen Substanz, die leicht wasserlöslich und unlöslich in organischen Lösungsmitteln ist. Beispiele für geeignete Teilchen schließen biologisch annehmbare Alkalmetall- und Erdalkalimetallhalogenide, -phosphate, -sulfate und dergleichen ein. Kristalle von Zuckern können ebenso verwendet werden wie Mikrokügelchen von wasserlöslichen Polymeren, oder Proteinen wie Albumin. Natriumchlorid ist ein besonders bevorzugtes Teilchen. Die Teilchen sollten danach ausgewählt werden, dass sie den Durchmesser aufweisen, der für die großen Poren der bimodalen Verteilung von Porengrößen erwünscht ist. Teilchen, die einen Teilchengrößendurchmesser zwischen etwa 50 und etwa 500 μm aufweisen, sind bevorzugt und Durchmesser zwischen etwa 200 und etwa 400 μm sind bevorzugter.
Die Lösung aus Polymer und Lösungsmittel wird auf Teilchen gegossen, die auf den erwünschten Durchmesser zwischen etwa 50 und etwa 500 μm gesiebt sind. Die Teilchen befinden sich in einer geeigneten Form wie beispielsweise einer Schale.
Nach der Diffusion der Polymerlösung durch die Teilchen wird der Inhalt der Schale rasch mit einer Rate abgekühlt, die wirksam ist, um Kristallisation des ersten Lösungsmittels vor dem Einsetzen der Flüssig-Flüssig-Entmischung der Polymerlösung auszulösen. Beispielsweise kann die Schale in flüssigen Stickstoff oder eine gleichwertige kryogenische Flüssigkeit eingetaucht und in dem flüssigen Stickstoff für eine schnelle und vollständige Abschreckung des Systems gehalten werden.
Die Schale wird dann in einem Gefäß angeordnet, das mit einer Vakuumpumpe für die Zeitdauer verbunden wird, die für das vollständige Sublimieren der Lösungsmittel erforderlich ist. Diese Stufe ermöglicht die Entfernung des Lösungsmittels durch Sublimation aus den gefrorenen Materialien, sodass sie eine poröse Struktur zurücklässt. Das System ist nach wie vor gefroren und das Polymer entspannt sich während der Entfernung des Lösungsmittels nicht.
Schließlich werden die Teilchen mit einem Lösungsmittel ausgelaugt, in dem sie löslich sind und das Polymer löslich ist, beispielsweise das zweite Lösungsmittel oder insbesondere Wasser, unabhängig davon, ob es als zweites Lösungsmittel verwendet wird oder nicht. Das Auslaugungslösungsmittel wird mehrmals ausgetauscht, um eine vollständige Entfernung der Teilchen sicherzustellen. Die resultierenden Gerüste werden aus dem Auslaugungslösungsmittel entfernt und zu einem konstanten Gewicht getrocknet.
Das Verfahren stellt eine bimodale Verteilung von großen und kleinen Porengrößen bereit. Die großen Poren sind die Formhöhlungen der Teilchen, auf die die Polymerlösung gegossen wird. Wie oben angemerkt, haben die großen Poren einen durchschnittlichen Porendurchmesser zwischen etwa und 50 und etwa 500 μm. Die kleinen Poren werden gebildet, wenn die Polymerlösung einer Phasentrennung unter Abkühlung eingeht, und haben einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als etwa 20 μm. Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren liefern die kleinen Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als etwa 10 μm. Die Gestalt der größeren Poren kann durch die Zugabe von Wasser zu der Polymerlösung geglättet werden, wenn Wasser das Nicht-Lösungsmittel ist.
Die Porosität der resultierenden Gerüste ist größer als etwa 90%. Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren liefern Gerüstschäume mit einer Porosität von größer als etwa 95%. Die Gerüste haben eine spezifische Porenoberfläche von über 10 m²/g, und bevorzugte Verfahren ergeben die Bildung von speziellen Porenoberflächen von über 20 m²/g.
Die Gerüste können auch nach der Herstellung weiter modifiziert werden. Beispielsweise können die Gerüste mit biologisch aktiven Substanzen beschichtet werden, die als Rezeptoren oder Chemoattraktoren für eine gewünschte Population von Zellen wirken. Die Beschichtung kann durch Absorption oder chemische Bindung aufgebracht werden.
Besonders bevorzugte Gerüste führen Additive für die anschließende Freigabe in einer kontrollierten Weise ein. Das Additiv kann durch eine Bioerosion der Polymerphase oder durch Diffusion aus der Polymerphase freigesetzt werden. Alternativ kann das Additiv zu der Polymeroberfläche der Gerüststruktur wandern, wo es wirksam ist.
Das Polymer und die ersten und zweiten Lösungsmittel können vorgemischt werden, bevor das Additiv darin gelöst wird. Alternativ kann das Additiv in dem Lösungsmittel gelöst werden, in dem es am meisten löslich ist, wobei danach das erste und das zweite Lösungsmittel und das Polymer vereinigt werden.
Das Additiv kann in einem physiologisch annehmbaren Träger, Hilfsmittel, Stabilisator usw. bereitgestellt werden und kann in Formulierungen mit verzögerter oder zeitlich gesteuerter Freisetzung bereitgestellt werden. Die Additive können auch Mittel einarbeiten, um ihre Abgabe zu erleichtern, wie Antikörper, Antikörperfragmente, Wachstumsfaktoren, Hormone oder andere Zielteile, an die die Additive gekoppelt sind.
Annehmbare pharmazeutische Träger für die therapeutische Verwendung sind auf dem pharmazeutischen Gebiet wohl bekannt und sind beispielsweise in Remingston's Pharmaceutical Science, Mac Publishin Co., (A. A. Gennaro edt. 1985) beschrieben. Solche Materialien sind in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für Empfänger nicht toxisch und schließen Verdünnungsmittel, Lösungsvermittler, Schmiermittel, Suspendiermittel, einbettende Mittel, Lösungsmittel, Verdickungsmittel, Dispergiermittel, Puffermittel wie Phosphat, Citrat, Acetat und andere Salze organischer Säuren, Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure, Konservierungsmittel, Peptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Gruppen) wie Polyarginin, Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline, hydrophile Polymere wie Poly(vinylpyrrolidinon), Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Cellulose oder ihren Derivaten, Glucose, Mannose oder Dextrine, chelatisierende Mittel wie EDTA, Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit, Gegenionen wie Natrium und/oder nichtionische Tenside wie Tween, Pluronics oder PEG.
Das Additiv kann an die Polymere kovalent gebunden sein, die seitenständige freie Carbonsäuregruppen aufweisen. Ausführliche chemische Verfahrensweisen für die Anlagerung von verschiedenen. Gruppen an Polymer gebundene freie Carbonsäuregruppen sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe beispielsweise die US-A-5 219 564 und die US-A-5 660 822; Nathan et al., Bio. Cong. Chem. 4, 54–62 (1992) und Nathan, Macromolecules, 25, 4476 (1992). Diese Veröffentlichungen offenbaren Verfahrensweisen, durch die Polymere mit seitenständigen freien Carbonsäuregruppen mit Anteilen umgesetzt, die reaktive funktionelle Gruppen aufweisen oder die derivatisiert sind um wirksame funktionelle Gruppen zu enthalten, um ein Polymerkonjugat zu bilden.
Hydrolytisch stabile Konjugate werden verwendet, wenn das Additiv in konjugierter Form wirksam ist. Hydrolysierbare Konjugate werden verwendet, wenn das Additiv in konjugierter Form unwirksam ist.
In das poröse Polymergerüst wird eine Menge an Additiv eingearbeitet, die eine optimale Wirksamkeit an das Subjekt vermittelt, das der Behandlung bedarf, typischerweise ein Säugetier. Die Dosis und die Verabreichungsweise können von Subjekt zu Subjekt variieren und sind von solchen Faktoren wie der Art des zu behandelnden Säugetieres, seinem Geschlecht, seinem Gewicht, seiner Diät, gleichzeitiger medikamentöser Behandlung, dem klinischen Gesamtzustand, den speziellen verwendeten Verbindungen, der speziellen Verwendung, für die diese Verbindungen eingesetzt werden, und weiteren Faktoren abhängig, die Fachleute erkennen. Die porösen Polymergerüste können in vivo als Gewebeaufbautechnologie- und gewebegesteuertes Regenerationsgerüst in Säugetieren wie Primaten einschließlich Menschen, Schafen, Pferden, Rindern, Schweinen, Hunden, Katzen, Ratten und Mäusen oder in vitro verwendet werden. Die Polymer/Wirkstoff-Kombinationen dieser Erfindung können für die Lagerung unter Bedingungen hergestellt werden, die für die Konservierung der Arzneimittelwirksamkeit sowie die Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Polymere geeignet sind, und sind typischerweise für die Lagerung bei Umgebungs- oder Kühltemperaturen geeignet. Die porösen Polymergerüste, die für die Gewebeaufbautechnologie und die gewebegesteuerte Regeneration zu verwenden sind, müssen auch steril sein. Die Sterilität kann leicht durch konventionelle Verfahren wie Bestrahlung oder Behandlung mit Gasen oder Wärme erreicht werden.
Additive, die für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen biologisch oder pharmazeutisch wirksame Verbindungen ein. Beispiele für biologisch wirksame Verbindungen schließen Zellanlagerungsmediatoren wie die Peptid enthaltenden Variationen der "RGD" Integrinbindungssequenz, die bekanntlich die zelluläre Anlagerung beeinflusst, biologisch wirksame Liganden und Substanzen ein, die spezielle Arten von zellulärer oder Gewebeeinwachsung fördern oder ausschließen. Diese Substanzen schließen beispielsweise osteoinduktive Substanzen wie knochenmorphogene Proteine (BMP), epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor) (PDGF), insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF-I und II), TGF-β und dergleichen ein.
Beispiele für pharmazeutisch wirksame Verbindungen schließen beispielsweise Aciclovir, Cephradin, Malfalen, Procain, Ephedrin, Adriomycin, Daunomycin, Plumbagin, Atropin, Quanin, Digoxin, Quinidin, biologisch wirksame Peptide, Chlorin e₆, Cephalotin, Prolin und Prolin-Analoga wie cis-Hydroxy-L-prolin, Penicillin V, Aspirin, Ibuprofen, Steroide, Nikotinsäure, Chemodeoxycholsäure, Chlorambucil und dergleichen ein. Therapeutisch wirksame Dosierungen können entweder durch in vitro- oder in vivo-Verfahren ermittelt werden. Für jedes spezielle Additiv können einzelne Bestimmungen folgen, um die optimale benötige Dosierung zu ermitteln. Die Bestimmung von wirksamen Dosierhöhen, d. h. die Dosierhöhen, die zum Erreichen des gewünschten Ergebnisses notwendig sind, liegen im Bereich des Wissens eines Fachmanns. Die Freisetzungsrate der Additive kann auch innerhalb des Routinekönnens in der Technik variiert werden, um ein vorteilhaftes Profil in Abhängigkeit von den zu behandelnden therapeutischen Bedingungen zu ermitteln.
Eine typische Additivdosierung kann im Bereich von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 1000 mg/kg, vorzugsweise von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 100 mg/kg und insbesondere von etwa 0,10 mg/kg bis etwa 20 mg/kg liegen. Die Additive können allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen oder diagnostischen Mitteln verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen porösen Polymergerüste werden durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Quecksilberporosimetrie charakterisiert. Spezielle Beispiele werden unten aufgeführt.
Die porösen Polymergerüste werden zu Gegenständen für Gewebeaufbautechnologie- und gewebegesteuerte Regenerationsanwendungen einschließlich konstruktiver Chirurgie geformt. Die Struktur des Gerüstes ermöglicht ein großzügiges zelluläres Einwachsen, das die Notwendigkeit eines zellulären Vorkeimens (preseeding) beseitigt. Die porösen Polymergerüste können auch geformt werden, um äußere Gerüste für die Unterstützung von der in vitro-Kultivierung von Zellen für die Erzeugung von externen Trägerorganen zu bilden.
Das Gerüst imitiert die extrazellulären Matrizes (ECM) des Körpers. Das Gerüst dient sowohl als physikalischer Träger als auch als adhäsives Substrat für isolierte Zellen während der in vitro-Kultivierung und anschließenden Implantierung. Da die transplantierten Zellpopulationen wachsen und die Zellen normal funktionieren, beginnen sie mit der Abscheidung ihres eigenen ECM-Trägers. Das Gerüstpolymer wird zum Abbau ausgewählt, da der Bedarf an einem künstlichen Träger abnimmt.
Bei der Rekonstruktion von strukturellen Geweben wie Knorpel und Knochen ist die Gewebeform für die Funktion wesentlich, was das Formen des porösen Polymergerüstes zu Gegenständen mit variierender Dicke und Gestalt erfordert. Beliebige Risse, Öffnungen oder Verfeinerungen, die in der dreidimensionalen Struktur erwünscht sind, können erzeugt werden, indem Teile der Matrix mit einer Schere, einem Skalpell, einem Laserstrahl oder irgendeinem anderen Schneidinstrument entfernt werden. Gerüstanwendungen schließen die Regenerierung von Geweben wie Nerven-, Muskelskelett-, Knorpel-, Sehnen-, Leber-, Pankreas-, Augen-, Haut-, arteriovenösen, Harnweggeweben oder irgendwelchen anderen Gewebe bildenden festen oder hohlen Organen ein.
Das Gerüst kann auch bei der Transplantierung als Matrix für dissozierte Zellen wie Chondrozyten oder Hepatozyten verwendet werden, um ein dreidimensionales Gewebe oder Organ zu erzeugen. Irgendeine Art von Zellen kann dem Gerüst für die Kultivierung und mögliche Implantierung zugegeben werden, die Zellen der Muskel- und Skelettsysteme wie Chondrozyten, Fibroblasten, Muskelzellen und Osteozyten, Parenchymalzellen wie Hepatozyten, Pankreaszellen (einschließlich Inselzellen), Zellen von intestinalem Ursprung und weitere Zellen wie Nervenzellen und Hautzellen, wie sie entweder von Donoren, von anerkannten Zellkulturlinien oder sogar vor oder nach der genetischen Veränderung und Stammzellen, die von menschlichen embryonalen Stammzellen verschieden sind, einschließen. Es können auch Gewebeteile verwendet werden, die eine Reihe von verschiedenen Zelltypen in derselben Struktur bereitstellen können.
Die Zellen werden aus einem geeigneten Donor oder dem Patienten erhalten, in den sie implantiert werden sollen, unter Verwendung von Standardverfahren dissoziiert und auf dem oder in dem Schaumgerüst gekeimt. Die in vitro-Kultivierung kann optional vor der Implantierung durchgeführt werden. Altetrnativ wird das Schaumgerüst implantiert, vaskularisieren gelas sen und dann Zellen in das Gerüst injiziert. Verfahren und Reagenzien für die in vitro-Kultivierung von Zellen und der Implantierung eines Gewebegerüstes sind Fachleuten bekannt.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die erfindungsgemäßen porösen Polymergerüste können zu brauchbaren Gegenständen für Gewebeaufbautechnologie- und gewebsgesteuerte Regenerierungsanwendungen verarbeitet werden, die die rekonstruktive Chirurgie einschließen. Gerüste können auch geformt werden, um ein äußeres Gerüst für die Unterstützung der in vitro-Kultivierung von Zellen für die Erzeugung von externen Trägerorganen zu bilden. Die Gerüste können auch bei einer Transplantation als Matrix für dissoziierte Zellen verwendet werden.
Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele, die anschließend angegeben sind, veranschaulichen bestimmte Aspekt der Erfindung. Sämtliche Teile und Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben, und sämtliche Temperaturen sind in °C angegeben.
BEISPIELE
Beispiele 1–6: Herstellung von Gerüsten aus verschiedenen Polymeren
Poröse Gerüste wurden aus den in Tabelle 1 aufgeführten Polymeren hergestellt:
TABELLE 1
BEISPIEL 1: Herstellung von poly(DTE c)-Gerüsten
Materialien
Poly(DTE-carbonat (M_w = 206 000) wurde unter Verwendung des in der US-A-5 099 060 offenbarten Verfahrens hergestellt. 1,4-Dioxan (zertifizierter ACS-Grad) und Natriumchlorid (NaCl)-kristalle wurden von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) bezogen. Die Kristalle wurden mit US-Standardprüfsieben (ASTM-El1, Tyler, Mentor, OH) mit einer Öffnung von 212 μm (n_j70) und 425 μm (n_j40) gesiebt. Das in der Porosimetrie-Untersuchung verwendete Quecksilber wurde 3-fach destilliert (Bethlehem Apparatus, Hellertown, PA).
Gerüstherstellung
Das Gerüst wurde durch das folgende Verarbeitungsverfahren hergestellt:
0,2 g poly(DTE-carbonat) wurden in der Mischung von 3 ml 1,4-Dioxan und 0,3 ml Wasser unter Magnetrühren bei Raumtemperatur aufgelöst. Nach der Auflösung des Polymers wurde die klare Lösung auf 7 g von gesiebten Natriumchloridsalzen (durchschnittliche Größe: ~200 μm bis ~400 μm in einer geeigneten Schale gegossen. Nach der Diffusion der Polymerlösung durch das Salzbett wurde die Schale in flüssigem Stickstoff eingetaucht und für ein vollständiges Gefrieren des Systems darin gelassen. Die Schale wurde dann in einem mit einer Vakuumpumpe verbundenen Gefäß für die Zeitdauer angeordnet, die für die vollständige Sublimation des Lösungsmittels benötigt wurde, wobei eine poröse Struktur zurückblieb. Das Polymer entspannte sich während der Lösungsmittelentfernung nicht.
Schließlich wurde das Salz in Wasser ausgelaugt. Das Wasser wurde mehrmals ausgetauscht, bis der empfindliche Silbernitrattest keine weitere Freisetzung von Chloridionen in das Wasser zeigte. Die resultierenden Gerüste wurde aus dem Wasser entfernt und für mehrere Tage bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
SEM Rasterelektronenmikroskops
SEM wurde zur Bewertung der Morphologie der Gerüste durchgeführt. Die Proben wurden durch Kryobruch der Gerüste in flüssigem Stickstoff (–196°C) hergestellt. Der Kryobruch erfolgt an nassen Proben. Die Gerüste wurden einer Reihe von Druckbeaufschlagung/Druckablassen unterzogen, um die Füllung der Poren mit Wasser sicherzustellen. Wenn keine Blasen aus den Gerüsten austraten und die Proben auf den Boden des Fläschchens absanken, wurden sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht.
Dann wurden die Proben unter Vakuum gründlich getrocknet und auf Metallnasen unter Verwendung von Klebebändern befestigt. Sie wurden unter Verwendung eines Balzers SCD004-Zerstäubungsbeschichtungsgerätes (BAL-TEC) mit Silber beschichtet. Das Gasdruck wurde auf 3 bis 10 × 10^–2 mbar eingestellt und die Stromstärke betrug 30 mA für eine Beschich tungszeit von 120 s. Ein Hitachi S450-SEM bei 15 kV wurde für die Prüfung verwendet.
Bildanalyse
Die Größe der Poren der mit der SEM erhaltenen digitalen Bilder wurde unter Verwendung der NIH Image 1.6 Software analysiert. Die Porenfläche, der Umfang, die Haupt- und Nebenachse der Ellipse waren die geprüften Bildparameter. Die Einstellung der Digitalbilder war vor der Porenprüfung notwendig. Um eine gleichwertige Einstellung für sämtliche Bilder sicher zu stellen, wurde ein Pascal-Makro entsprechend dem Bildmaßstab geschrieben, der für die untersuchte Porengröße verwendet wurde.
Die nummerierten Poren wurden mit dem tatsächlichen digitalen Bild verglichen, um den Porenort zu bestätigen. Bestimmte Porenzahlen, die nicht genau wiedergegeben wurden, wurden von der statistischen Datenanalyse ausgenommen. Für jedes Gerüst wurden drei verschiedene Digitalbilder bei zwei unterschiedlichen Vergrößerungen (geringe Vergrößerung (Skalenstrich von 200 μm) und hohe Vergrößerung (Skalenstrich von 10 μm)) analysiert (n = 3).
Quecksilberporosimetrie
Die getrockneten Gerüste waren sehr weich und konnten wegen der hohen Gesamtporosität und des geringen Polymermoduls leicht deformiert werden. Außerdem würden die größten Poren, die erwartungsgemäß einen mittleren Durchmesser um 300 μm herum aufwiesen (am Ende vorhandene Eindrücke des Salzes), durch dieses Verfahren unterbewertet werden. Aus diesen Gründen wurden die Gerüste analysiert, wenn sich das Salz noch innerhalb der Polymermatrix befand.
Das Porenvolumen und die Porengrößeverteilung wurden durch Aufzeichnung des Quecksilberintrusionsvolumens in die Gerüste bei verschiedenen Drücken mit einem Quecksilberporosimeter Modell 9540 (Micrometirics, Norcross, GA) bestimmt. Der Fülldruck wurde bis zu 3.000 psia aufgezeichnet. Dieser Druck entspricht der Energie, die zur Intrusion von Quecksilber in Poren von 0,06 μm oder größer erforderlich ist. Die Porendurchmesser- und Porositätswerte beziehen sich auf gleichwertige zylindrische Poren mit einem Durchmesser von kleiner als 310 μm.
Die Werte wurden aus der Washburn-Gleichung bestimmt. D = –(1/P) 4 γ cos f,in der D der Porendurchmesser in μm ist, p der aufgebrachte Druck (psia) ist, γ die Oberflächenspannung zwischen Quecksilber und der Gerüstoberfläche ist (dyn/cm) und ϕ der Kontaktwinkel ist (Grad).
Die für die Oberflächenspannung und die Kontaktwinkel empfohlenen Werte sind:
g = 485 dyn/cm
ϕ 130°
Die Ergebnisse werden als Kurve der inkrementalen Quecksilberintrusion (ml/g) in Funktion des berechneten mittleren Porendurchmessers dargestellt. Für jedes Gerüst wurden die Proben dreifach geprüft (n = 3).
Diskussion der Ergebnisse Tabelle II: Ergebnisse aus der SEM-Bildanalyse für ein Poly(DET-carbonat)-Gerüst
Das poly(DTE-carbonat)-Gerüst ist durch eine bimodale Verteilung von offenen Porengrößen gekennzeichnet, die aus verschiedenen Verfahren resultieren (1). Die größten Poren mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser zwischen 200 μm und 400 μm sind die Abdrücke der Salze, auf die die Lösung gegossen wird. Die kleinsten Poren mit einer durchschnittlichen Größe von weniger als 20 μm werden gebildet, wenn die Polymerlösung bei Abkühlung einer Phasentrennung unterliegt. Die kleinsten Poren treten an den Wänden der größten Poren und in der Polymerphase zwischen den größten Poren auf.
Das Netzwerk von Poren ist in hohem Maße miteinander verbunden. Eine interessante Beobachtung aus der Quecksilberporosimetrie liegt darin, dass die kleinsten Poren durch sich selbst im hohen Maße miteinander verbunden sind. Sogar wenn die größten Poren mit den NaCl-Salzen für die Messungen gefüllt sind, scheint es, dass es möglich ist, die meisten der kleinsten Poren zu erreichen, wenn höhere Drücke aufgebracht werden. Außerdem wird das Miteinanderverbundensein zwischen den größten Poren durch das Vorhandensein der kleinsten Poren erhöht, die Kanäle zwischen den größten Poren bilden. Die Porosität der resultieren Gerüste ist größer als 90%. Das Netzwerk der kleinen Poren, die in den Wänden der größten Poren gebildet werden, ist erstaunlicherweise in einer linearen Anordnung wohl orientiert.
BEISPIEL 2: Herstellung von Gerüsten aus Poly(DTE-carbonat) mit niedrigem Molekulargewicht
Ein Gerüst wurde aus einem Poly(DTE-carbonat) mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt, um seine spezifische Gesamtoberfläche zu bestimmen und seine Porosität abzuschätzen.
Materialien
Das Poly(DTE-carbonat) (M_w = 89000) wurde wie in Beispiel 1 hergestellt.
Gerüstherstellung
0,3 g des Poly(DTE-carbonats) mit niedrigem Molekulargewicht wurde in einer Lösung von 1,4-Dioxan und Wasser (91/9% V/V) gelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
BET-Messungen: Messungen der spezifischen Gesamtoberfläche
Die spezifische Oberfläche wurde unter Verwendung des Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Verfahrens unter Verwendung eines Quantasorb (Quantachrome, Boyton Beach, FL) untersucht. Das BET-Gerät bestimmt die spezifische Gesamtoberfläche der Probe durch Berechnung der Menge an Stickstoff, die auf der Oberfläche adsorbiert wird.
Porositätsabschätzung
Bei Gerüsten mit großen Porengrößen (wie solche, die in dieser Untersuchung verwendet wurden) bewertet das Hg-Porosimeter die Porosität unter. Eine genauere Bestimmung der Porosität ist durch Messung des Gewichts, der Höhe und des Durchmessers von jeder Probe möglich. Aus diesen Messungen kann die scheinbare Dichte des Gerüstes (ρ*) berechnet und die Porosität (ε) bestimmt werden durch: ε = 1 – ρ*/ρPDTEC,worin ρ_PDTEC die Polymerdichte ist (1,2778).
Ergebnisse
Die Gesamtporenoberfläche des Poly(DTE-carbonat)-Gerüstes betrug nahezu 20 m²/g. Dieser Wert ist zehnmal höher als der Wert (erhalten durch Quecksilberporosimetrie), der für Gerüste berichtet wird, die durch Sprühen von PLLA-Lösungen in Naphthalin hergestellt wurden. Dieser Wert liegt im Bereich von Werten (16 bis 99 m²/g) (erhalten durch Quecksilberporosimetrie), die für Gerüste berichtet werden, die mit einem Emulsionsverfahren aus einer PLGR-Lösung in Methylenchlorid hergestellt wurden, aber mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 50 μm. Die abgeschätzte Porosität betrug 97%.
BEISPIEL 3: Herstellung von Poly(DTE co 30% DT-carbonat)-Gerüsten
In diesem Beispiel wird die in Beispiel 1 illustrierte Methodik verwendet, um Gerüste aus einem freien Säure-Copolymer herzustellen: Poly(DTE co 30% DT-carbonat).
Materialien
Poly(DTE co 30% DT-carbonat) (M_w = 96000) wurde unter Verwendung des in der US-A-6 120 491 offenbarten Verfahrens hergestellt, auf deren Offenbarungsgehalt hier Bezug genommen wird.
Gerüstherstellung
0,289 g Poly(DTE co 30% DT-carbonat) wurden in 1,4-Dioxan/Wasser (91/9% V/V) gelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
SEM, Quecksilberporosimetrie und Bildanalyse
Das Poly(DTE co 30% DT-carbonat)-Gerüst wurde mit dem Poly(DTE-carbonat)-Gerüsten aus Beispiel 1 verglichen.
Ergebnisse
Aus den SEM-Bildanalyse- und den Quecksilberporosimetrieergebnissen kann gefolgert werden, dass die Gerüste, die aus Poly-(DTE-carbonat) und Poly(DTE co 30% DT-carbonat) hergestellt wurden, eine ähnliche Porengrößeverteilung zeigen. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gerüsten beobachtet. Von dem Gesichtspunkt der Verfahren, die zur Charakterisierung der Gerüste eingesetzt werden, ist es durch Kontrolle der Viskosität der Polymerlösung möglich, Gerüste mit einer ähnlichen Porengrößenverteilung aus Poly(DTE-carbonat) und Poly(DTE co 30% DT-carbonat) herzustellen.
BEISPIEL 4: Herstellung von Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat)-Gerüsten
In diesem Beispiel wird die in Beispiel 1 illustrierte Methodik verwendet, um Gerüste aus einem Copolymer von PEG und Poly(DTE-carbonat), Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat) herzustellen.
Materialien
Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat) (M_w = 88000) wurde unter Verwendung des in der US-A-5 658 995 offenbarten Verfahrens hergestellt.
Gerüstherstellung
0,246 g Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat) wurden in 3,3 ml 1,4-Dioxan/Wasser (91/9%, V/V) gelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
SEM, Quecksilberporosimetrie und Bildanalyse
Das Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat)-Gerüst wurde mit den Poly(DTE-carbonat)-Gerüsten aus Beispiel 1 verglichen.
Ergebnisse
Aus den SEM-Bildanalyse- und den Quecksilberporosimetrieergebnissen kann gefolgert werden, dass die aus Poly(DTE-carbonat) und Poly(DTE co 5% PGE 1000-carbonat) hergestellten Gerüste eine ähnliche Porengrößeverteilung zeigen. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gerüsten beobachtet. Vom Gesichtspunkt der zur Charakterisierung der Gerüste verwendeten Verfahren ist es durch Kontrollieren der Viskosität der Polymerlösung möglich, Gerüste mit ähnlicher Porengrößenverteilung aus Poly(DTE-carbonat) und Poly(DTE co 5% PEG 1000-carbonat) herzustellen.
BEISPIEL 5: Herstellung von Poly(DTB-succinat)-Gerüsten
In diesem Beispiel wurde die in Beispiel 1 illustrierte Methodik verwendet, um Gerüste aus einem Polyarylat anstelle eines Polycarbonats herzustellen. Poly(DTB-succinat) ist durch eine niedrigere T_g (65°C) im Vergleich zum Poly(DTE-carbonat) (92°C) von Beispiel 1 gekennzeichnet.
Materialien
Poly(DTB-succinat) (M_w = 108000) wurde unter Verwendung des in der U5-A-5 216 115 offenbarten Verfahrens hergestellt.
Gerüstherstellung
0,3 g Poly(DTB-succinat) wurden in 3,3 ml einer Lösung von 1,4-Dioxan und Wasser (91/9%, V/V) gelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
SEM
Das Poly(DTB-succinat)-Gerüst wurde mit dem Poly(DTE-carbonat)-Gerüst aus Beispiel 1 verglichen.
Ergebnisse
Von der SEM-Beobachtung her zeigt das Poly(DTB-succinat) dieselben morphologischen Eigenschaften wie das Poly(DTE-carbonat)-Gerüst aus Beispiel 1 (siehe Ergebnisse und Diskussion aus Beispiel 1).
BEISPIEL 6: Herstellung von Poly(L-milchsäure)(PLLA)-Gerüsten
In diesem Beispiel wurde die in Beispiel 1 illustrierte Methode verwendet, um Gerüste aus einem PLLA anstelle eines Polycarbonats herzustellen.
Gerüstherstellung
0,3 g PLLA (M_w = 108000) (Medisorb polymers, Alkermes, Inc., Cincinnati, OH) wurden in 1,4-Dioxan/Wasser (91/9% V/V) gelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
SEM
Das PLLA-Gerüst wurde mit dem Poly(DTE-carbonat)-Gerüst aus Beispiel 1 verglichen.
Ergebnisse
Von der SEM-Beobachtung her zeigt das PLLA-Gerüst dieselben morphologischen Eigenschaften wie das Poly(DTE-carbonat)-Gerüst aus Beispiel 1 (siehe Ergebnisse und Diskussion aus Beispiel 1).
BEISPIEL 7: Gerüstherstellung aus Lösungen mit zunehmenden Mengen an Wasser
Untersuchungen wurden unter Verwendung des Verfahrens dieser Anmeldung durchgeführt, um die Morphologie der porösen Gerüste durch Zugabe von zunehmenden Mengen an Wasser in die Polymerlösung zu optimieren.
Gerüstherstellung
0,3 g des Poly(DTE-carbonats) aus Beispiel 1 wurden in 3,3 ml 1,4-Dioxan/Wasser (85/15% V/V) aufgelöst. Die Lösung wurde zu einem Gerüst wie in Beispiel 1 verarbeitet.
SEM
Dieses Gerüst wurde mit dem in Beispiel 1 hergestellten Gerüst verglichen.
Ergebnisse
Wasser fungiert wie ein Keimbildungsmittel in dem 1,4-Dioxan-Kristallisationsverfahren. Wasser erhöht die Keimbildungsdichte in dem Initiierungsschritt der Kristallisation des Lösungsmittels, wenn die Polymerlösung in dem flüssigen Stickstoff abgeschreckt wird. Da sich die Keimbildungsdichte erhöht, ist die Größe der resultierenden Kristalle immer kleiner. Dies könnte die feinere Mikrostruktur erklären, die zwi schen den größten Poren beobachtet wird, wenn sich der Anteil an Wasser erhöht. Der Anteil im Volumen der sehr kleinen Poren (mittlerer Durchmesser von weniger als 5 μm) erhöht sich mit der Menge an Wasser in der Lösung.
Wasser wird zugegeben, um die Phasentrennung der Polymerlösung unter Abkühlung zu fördern. Mit der Erhöhung der Wassermengen wird die Polymerlöslichkeit in dem Lösungsmittel schrittweise verringert. Wenn die Lösung abgeschreckt wird, wird die L-L-Entmischung der Polymerlösung früher induziert. Es können sich mehr Keim bilden und diese können in der Polymermatrix vor dem vollständigen Gefrieren des Systems wachsen. Daher sind viel mehr runde Poren (die sich aus der L-L-Entmischung ergeben) in den endgültigen Gerüsten vorhanden.
Das Vorhandensein von Wasser in der Lösung trägt auch zur Auflösung der NaCl-Salze bei, auf die die Lösung gegossen wird. Es wird eine Entwicklung in der Form der größten Poren beobachtet, wenn der Wasseranteil ansteigt. Offensichtlich sind die NaCl-Salze durch das Verfahren ausgewaschen worden. Aus diesem Grund beobachten wir einen signifikanten Anstieg des Miteinanderverbundenseins zwischen den größten Poren, wenn der Wassergehalt in der Lösung ansteigt.
BEISPIEL 8: In vivo-Zellwachstum in die Gerüste
Die hochporösen Gerüste wurden in einem in vivo-Tiermodell geprüft. 32 skelettförmig ausgewachsene männliche New Zealand White-Kaninchen wiesen Gerüste auf, die beidseitig in ihren Kalvaria (Schädel) implantiert waren.
Die Gerüste wurden wie in Beispiel Nr. 2 hergestellt. Nach der Herstellung wurden die Gerüste im Vakuum getrocknet, in Sterilisationsbeutel verschlossen und dann in einem automati schen belüfteten Sterilisator an Anprolen AN72c für die Sterilisation durch Ethylenoxideinwirkung angeordnet. Nach der Sterilisation wurden die Proben in Umgebungsluft mindestens 2 Wochen lang ins Gleichgewicht bringen gelassen, um die Entfernung von Ethylenoxid sicherzustellen.
Für jede Operation wurden die Kaninchen unter Verwendung von vollständig sterilen Verfahren präpariert. Zwei Implantate wurden bei jeder Operation implantiert. Jedes Implantat wurde in einem der beiden Defekte mit 8 mm Durchmesser angeordnet.
Die implantierten Gerüste hatten einen Durchmesser von 8 mm bei einer Dicke von 2 bis 3 mm, um den Kaninchen-Kalvaria Abmessungen zu entsprechen. Die Gerüste wurden nicht mit Zellen vorgeimpft. Nach 2, 4, 8 und 16 Wochen wurden die Gerüste entnommen und histologisch analysiert. Bei der Hälfte des Zeitpunkts (z. B. 2 Wochen für den 4 Wochen-Zeitpunkt) und vor der Euthanisierung wurde Oxatetracyclin in die Kaninchen injiziert, welches die Knocheneinwachsung markiert. Die Proben wurden in Wasser/Alkohol-Lösungen mit 70%, 80%, 95% und 100% Ethanol entwässert, mit einem histologischen Klärungsmittel (Hemo-De von Fisher) geklärt und dann in einer polymerisierenden Lösung von Methylmethacrylat (Fisher) befestigt, sodass die Probe in einem festen Block von Polymethylmethacrylat eingebettet wurde. Die Proben wurden horizontal und vertikal geschnitten, um einen horizontalen und vertikalen Querschnitt zu ergeben. Die Schnitte wurden montiert, zerkleinert und zu einer Dicke von 1 bis 3 Zellschichten poliert. Die Proben wurden unter ultraviolettem Licht betrachtet und hinsichtlich der Einwachsung analysiert. Die Proben wurden mit Stevenel's Blau und Van Geison's Picro-Fuchsin angefärbt. Bei dieser Anfärbung waren der Knochen rot, das Fasergewebe blau und das Osteoid grün. Bei beiden Anfärbungen wurde die Probe für die visuelle Betrachtung und Bildanalyse photographiert.
Die Tiefe der Knocheneinwachsung wurde gemessen, um die Wirkung der hochporösen Gerüststruktur wiederzugeben, und mit einer vorhergehenden Untersuchung verglichen. Die vorhergehende Untersuchung lieferte Daten für Gerüste, die ohne die Poren von 1 bis 10 μm gebildet wurden. Die älteren Gerüste wurden aus demselben Polymer gebildet, jedoch wurden sie unter Verwendung eines unterschiedlichen Lösungsmittels mit einem Auslaugungsverfahren ohne einen raschen Abkühlschritt gebildet.
Bei dem Zeitpunkt von 3 bis 4 Wochen war ein messbarer Unterschied zwischen den beiden Schwammarten ersichtlich. Die hochoporösen Träger zeigten ein größeres Ausmaß der Knocheneinwachsung. Außerdem beeinflusste die geordnete Anordnung der Poren von 1 bis 10 μm die zelluläre Ausrichtung. Es wurde beobachtet, dass die Zellen sich in dem Schema anordneten, das durch die Poren gebildet wurde. Die Zellen mineralisierten auch genauso entlang des Schemas.
Die hochporösen Gerüste waren den vorhergehenden Gerüsten dahingehend überlegen, dass sie die Zelleinwachsung und die gesteuerte Zellproliferation über das Maß hinaus förderten, das für bisherige Gerüstarten zu erwarten wäre.
Beispiel 9: In vivo-Zellwachstum in die Gerüste. Eine Vergleichsuntersuchung
In einer Vergleichsuntersuchung der in vivo-Implantierung, die das Kaninchen-Schädel-Defektmodell von Beispiel 8 verwendete, wurden zwei unterschiedliche Gerüststrukturen hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, das Wachstum von neuem Kno chen in die Gerüste zu unterstützen. Die beiden Gerüststrukturen hatten eine einheitliche Porengröße (200 bis 500 μm) gegenüber einer bimodalen Porenverteilung wie in dieser Erfindung beschrieben. Zwar waren die Gerüste in sämtlichen Aspekten identisch, abgesehen von der Porengrößeverteilung, jedoch wiesen die Gerüste mit bimodalen Verteilungen eine größere Knochenheilung auf.
Die vorhergehenden Beispiele und Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform sollten eher als veranschaulichend als die vorliegende Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, einschränkend aufgefasst werden. Wie leicht zu erkennen ist, können zahlreiche Variationen und Kombinationen der oben angegebenen Merkmale verwendet werden, ohne von der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Ansprüchen angegeben ist, abzuweichen. Diese Variationen werden nicht als Abweichung von dem Umfang der Erfindung angesehen, und sämtliche Variationen sollen in den Bereich der folgenden Ansprüche eingeschlossen sein.

Claims

Biologisch abbaubares und biologisch verträgliches poröses Gerüst, das durch eine im wesentlichen kontinuierliche Polymerphase mit einer in hohem Ausmaß miteinander verbundenen bimodalen Verteilung von Größen offener Poren gekennzeichnet ist, die gerundete große offene Poren mit 50 bis 500 μm Durchmesser und kleine gerundete Poren mit weniger als 20 μm in der Größe umfassen, wobei die kleinen Poren in einer ordentlichen linearen Weise innerhalb der Wände der großen Poren aufgereiht sind.
Gerüst nach Anspruch 1, das ferner durch eine – Porosität größer als 90% und/oder – eine spezifische Porenoberfläche größer als 10 m²/g gekennzeichnet ist.
Gerüst nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß – das Polymer in Wasser unlöslich aber in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel löslich ist.
Gerüst nach Anspruch 3, das ferner dadurch gekennzeichnet ist, das – das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus biologisch verträglichen und biologisch abbaubaren Polycarbonaten, Polyarylaten, Blockcopolymeren von Polycarbonaten mit Poly(alkylenoxiden), Blockcopolymeren von Polyarylaten mit Poly(alkylenoxiden), α-Hydrocarbonsäuren, Poly(caprolactonen), Poly(hydroxybutyraten), Polyanhydriden, Poly(orthoestern), Polyestern und auf Bisphenol-A basierenden Poly(phosphoestern).
Gerüst nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß – das Polymer eine wirksame Menge einer biologisch wirksamen Substanz ausgewählt aus osteoinduktiven Substanzen, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor) (PTGF), insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF-I und II) und TGF-β umfaßt und/oder – das Polymer eine wirksame Menge einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung umfaßt.
Gerüst nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Gerüst Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hepatozyten, pankreatischen Inselzellen, Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, exokrinen Zellen, Zellen intestinalen Ursprungs, Gallengangzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Schilddrüsenzellen, Zellen der Nebennieren-Hypothalamus-Hypophysen-Achse, Herzmuskelzellen, Nierenepithelzellen, Nierentubuluszellen, Nierenbasalmembranzellen, Nervenzellen, Blutgefäßzellen, Zellen, die Knochen und Knorpel bilden, glatte Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, Augenzellen, Integumentzellen, Keratinozyten und von menschlichen, embryonalen Stammzellen verschiedenen Stammzellen umfaßt, und vorzugsweise sind diese Zellen kultivierte Gewebezellen.
Verfahren zur Herstellung von biologisch abbaubaren und biologisch verträglichen porösen Polymergerüsten, das durch Auflösen von 0,5 bis 25 Gew.-% eines biologisch verträglichen Polymers in einer mischbaren Lösungsmittel mischung aus einem ersten Lösungsmittel, in dem das Polymer löslich ist, und einem zweiten Lösungsmittel, in dem das Polymer unlöslich ist, wobei das Verhältnis des ersten Lösungsmittels zu dem zweiten Lösungsmittel in einem Bereich liegt, in dem das Polymer sich unter Bildung einer homogenen Lösung löst, wobei das erste Lösungsmittel einen Schmelzpunkt zwischen –40 und 20°C aufweist, Anordnen der Polymerlösung in einer Form, die wasserlösliche nicht-toxische Teilchen enthält, die in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind und einen Durchmesser zwischen 50 und 500 μm aufweisen, Abschrecken der Lösung mit einer Rate, die wirksam ist, zur Kristallisation des ersten Lösungsmittels zu führen, bevor die flüssig-flüssig-Entmischung des ersten und des zweiten Lösungsmittels eintritt, Sublimieren des Polymers zur Entfernung der ersten und zweiten Lösungsmittel, Auslaugen des Polymers mit einem Lösungsmittel, in dem die Teilchen löslich sind und das Polymer unlöslich ist, um die Teilchen aus dem Polymer zu entfernen, und Trocknen des Polymers gekennzeichnet ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des ersten Lösungsmittels zu dem gesam ten Lösungsmittelvolumen zwischen 1% und 40% Volumen/Volumen liegt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Lösungsmittel 1,4-Dioxan ist und das zweite Lösungsmittel Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus biologisch verträglichen und biologisch abbaubaren Polycarbonaten, Polyarylaten, Blockcopolymeren von Polycarbonaten mit Poly(alkylenoxiden), Blockcopolymeren von Polyarylaten mit Poly(alkylenoxiden), α-Hydroxycarbonsäuren, Poly(caprolactonen), Poly(hydroxybutyraten), Polyanhydriden, Poly(orthoestern), Polyestern und auf Bisphenol-A basierenden Poly(phosphoestern).
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß – die Teilchen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkalimetall- und Erdalkalimetallhalogeniden, -phosphaten und -sulfaten, Zuckerkristallen, in Wasser löslichen Polymermikrokügelchen und Proteinmikrokügelchen, wobei die Teilchen vorzugsweise Natriumchloridkristalle sind, und/oder – das Abschrecken ein Eintauchen der Lösung in flüssigen Stickstoff umfaßt, und/oder – das Polymer mit Wasser ausgelaugt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß – das Polymer eine wirksame Menge einer biologisch wirksamen Substanz ausgewählt aus osteoinduktiven Substanzen, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor) (PGF), insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF-I und II) und TGF-β und/oder – das Polymer eine wirksame Menge einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung umfaßt.