JP2002542326A - 多孔性ハイドロゲル製品の製造 - Google Patents

多孔性ハイドロゲル製品の製造

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、最初にゲル中にガスポケットを作り、次いでこのガスを除去することによる、多孔性ハイドロゲル物質の形成のための新規試みに関する。ガスの除去は多孔性物質を取り込み、十分なガスの最初の取り込みは開口、相互連結孔構造の物質を作ることを可能にする。得られる物質の有利な性質は、その相互連結孔構造に加えて、孔構造が長時間維持され、ゲルが、物質の破壊または圧縮なしに細胞シーディングおよび移植を可能にする高い機械的完全さを維持することを含み得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、１９９９年４月９日に出願の仮出願番号６０／１２８,６８１の優先
権を主張しており、その内容全体を引用して本明細書に包含させる。
【０００２】 アルギネートおよび他のハイドロゲルは、細胞移植およびドラッグデリバリー
を含む、種々の生物医学的適用に魅力的な物質である。多くのこれらの適用中、
細胞の物質への接種、または体内への移植に続く細胞性侵入を可能にすることを
望む。しかし、アルギネートは典型的に小さい孔(nmサイズ規模)のハイドロゲル
の物理的形で使用され、これは物質の中または外での細胞移動を可能にしない。
本発明は、最初にゲル中にガスポケットを作り、次いでこのガスを除去すること
による、多孔性ハイドロゲル物質を作る新しい試みに関する。ガスの除去は多孔
性物質を作り、十分なガスの最初の取り込みは、開口、相互連結孔構造の物質を
作ることを可能にする。得られる物質の有利な性質は、その連結した多孔性構造
に加えて、孔構造が長期間に渡り維持され、ゲルが高い機械的完全性を維持し、
これは物質の破壊または圧縮無しの細胞のシーディングおよび移植を可能にする
。
【０００３】 本発明は、多孔性性質が物質再水和により損失するおよび／または物質が加工
により著しく弱くなる、他のこれらのタイプの物質の多孔性構造の達成に典型的
に使用される他のプロセッシングアプローチ(例えば、凍結乾燥)と対照的である
。
【０００４】 アルギネートゲルへのガス泡の形成および続く除去のためのアプローチは、先
に記載されている(Gotoh et al., Cytotechnology 11, 35 (1993))。しかしなが
ら、この文献に記載されている方法は、十分な程度の多形性の形成を導かず、ま
たは十分な開口相互連結孔構造を導かなかった。
【０００５】 本明細書に記載の方法は、Gotoh et al.法の相当な改良であり、そこに記載の
範囲外の条件で行う。本発明の目的は、孔がその中への細胞性輸送を可能にする
のに十分に開口され、大きさを有する、十分なマクロ多孔性および開口孔構造を
有する、生体適合性ハイドロゲル物質、例えばアルギネート物質の提供である。
これは、組織工学適用に使用した時、血管新生および周りの組織との構造的統合
を促進する。したがって、マクロ多孔性ハイドロゲルは好ましくは少なくとも１
μm、特に１０から１０００μmの孔を有する。限定はしないが、総多孔性率は好
ましくは３０から９０％、より好ましくは３５から７５％である。全表面接近可
能相互連結多孔性は、好ましくは３０−８０％、より好ましくは３５−７０％で
ある。
【０００６】 発明の詳細な説明および特許請求の範囲の更なる研究により、本発明の更なる
目的および利点が当業者に明らかとなるであろう。
【０００７】 本発明の目的は： ａ)ハイドロゲル形成物質、界面活性剤および所望によりガス産生成分の溶液を
提供し、該溶液は(添加するか、ガス産生成分により産生された)ガスの存在下混
合され、溶液中にガスを取り込み、安定な泡を形成する； ｂ)溶液をガスの存在下で混合することによるおよび／または、ガス産生成分が
存在する場合、溶液をガス産生成分からのガスの産生をもたらす条件または薬剤
に付すことによる安定な泡を形成する； ｃ)安定な泡を、ハイドロゲル形成物質のゲル化をもたらし、ガス泡をその中に
含むハイドロゲルを形成する条件および／または薬剤に曝露する； ｄ)例えば、真空に付すことによりハイドロゲルからガス泡を放出させ、マクロ
多孔性開口孔多孔性を有するハイドロゲル物質を形成させる： ことを含む、マクロ多孔性開口孔多孔性を有するハイドロゲルの製造法により達
成できる。
【０００８】 ステップｂ)およびｃ)は、同時にまたは連続して行い得る。
【０００９】 開口孔物質の製造を可能にする泡をもたらすことにおいて望ましい効果を提供
できる任意のハイドロゲル形成物質を、本発明で使用できる。ハイドロゲルを形
成できる物質の例は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡポリマー、アルギ
ネートおよびアルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然お
よび合成ポリサッカライド、ポリペプチド、特にポリ(リジン)のようなポリアミ
ノ酸、ポリヒドロキシブチレートおよびポリ−ε−カプロラクトンのようなポリ
エステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ア
ルキレンオキサイド)、特にポリ(エチレンオキサイド)、ポリ(アリルアミン)(Ｐ
ＡＭ)、ポリ(アクリレート)、ポリ(４−アミノメチルスチレン)のような修飾ス
チレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ(ウロン酸)、
ポリ(ビニルピロリドン)および、上記のグラフトコポリマーを含むコポリマーを
含む。
【００１０】 ハイドロゲルの好ましい物質は、アルギネートまたは修飾アルギネート物質で
ある。アルギネート分子は、(１−４)架橋β−Ｄ−マンヌロン酸(Ｍ単位)および
α―Ｌ−グルロン酸(Ｇ単位)モノマーを含み、これはポリマー鎖に沿って比率お
よび連続的分散が変化する。アルギネートポリサッカライドは、２価カチオン(
例えば、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｂａ＋２)に強い親和性を有し、これらの分子に
曝されたとき安定なハイドロゲルを形成する多価電解質システムである。Martin
sen A., et al., Biotech. & Bioeng., 33 (1989) 79-89参照。カルシウム架橋
アルギネートハイドロゲルは、歯科用印象(Hanks C.T., et al, Restorative De
ntal Materials; Craig, R. G., ed., Ninth Edition, Mosby (1993))、創傷被
覆材(Matthew I.R. et al., Biomaterials, 16 (1995) 265-274)、軟骨細胞移植
のための注射用送達媒体(Atala A., et al., J. Urology, 152 (1994) 641-643)
および生存細胞用固定化マトリックス(Smidsrod O., et al., TIBTECH 8 (1990)
71-78)を含む、多くの生物医学的適用に使用されている。
【００１１】 別の態様は、好ましくは溶解後、サイズがヒトによるクリアランスの腎臓閾値
である、低分子量のアルギネートまたは他のポリサッカライドを使用する。好ま
しくは、アルギネートまたはポリサッカライドは１０００から８０,０００、よ
り好ましくは１０００から６０,０００ダルトン、特に好ましくは１０００から
５０,０００ダルトンの分子量に減少させる。高グルロネート含量のアルギネー
ト物質の使用がまた、マヌロネート単位と逆に、グルロネート単位が２価カチオ
ンを介してポリマーをゲル化させるためにイオン架橋する部位を提供するので、
有用である。
【００１２】 アルギネートは制御された形式でγ照射され、ポリマー鎖の無作為分裂および
適当な低分子量アルギネートフラグメントの産生をもたらすことができる[Hartm
an et al., Viscosities of cacia and sodium alginate after sterization by
cobald-60. J. Pharm. Sci.: 1975, 64(5): 802-805; King K., Changes in th
e functional properities and molecular weight of sodium alginate followi
ng γ-irradiation. Food Hydrocoll. 1994; 8(2):83-96; Delincee H., Radiol
ytic effects in food. In: Proceedings of the international workshop on f
ood irradiation. 1989, p.160-179]。これらのアルギネートのγ照射を使用し
た分解の先の記載において、使用された条件は、分子量２００kDの物質を産生す
るのに必要な範囲の外であるか、バルク物質よりもアルギネート溶液を使用して
いた。アルギネートの制御された分解の他の方法も利用可能であるが[Kimura et
al., Effects of soluble alginate on cholesterol excretion and glucose t
olerance in rats. J. Ethnopharm.; 1996, 54:47-54; Purwanto et al., Degra
dation of low molecular weight fragments of pectin and alginates by gamm
a-irradiation. Acta Alimentaria; 1998, 27(1):29-42]、γ照射は低分子量ア
ルギネートの産生のために信頼でき単純な技術である。分子量の減少は、また酸
性条件での加水分解、または酸化により行うことができ、所望の分子量を提供す
る。加水分解はHaug et al. (Acta. Chem. Scand., 20, p. 183-190 (1966), an
d Acta. Chem. Scand., 21, p. 691-704 (1967))の修飾法に従って行い得、それ
は本質的にマンヌロン酸単位を欠く低分子量のナトリウムポリ(グルロネート)を
もたらす。低分子量への酸化は、好ましくは過ヨウ素酸酸化剤、特に過ヨウ素酸
ナトリウムで行う；ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６８９０参照。
【００１３】 予期されるとおリ、低分子量アルギネートから調製したアルギネート溶液は、
減少した粘性を有し、安定な泡を形成するためにはより濃厚な溶液が必要であっ
た。低および高分子量アルギネートから形成されたビーズの全空隙容量の差は、
低分子量アルギネートにおいて安定な泡を形成するのに必要な増加したアルギネ
ートの濃度によるものであるようである。
【００１４】 アルギネート物質に関して、例えば、３から１０％w:w(水の重量に基づいた重
量)、より好ましくは３から５％w:wの量のアルギネート塩の出発溶液を使用する
のが好ましい。他の物質に関して、出発溶液で使用する量は使用する物質に依存
するが、出発溶液において少なくとも３％w:wを使用するのが好ましい。これは
、アルギネートまたは他のハイドロゲル形成物質の、泡立たせるべき溶液におけ
る３％以上、特に３−１０％、より特には３−５％の濃度をもたらす。
【００１５】 ハイドロゲル形成物質はハイドロゲルの前駆、非ゲル形である。ある条件また
は薬剤の適用によりゲル化することができるハイドロゲルの可溶性形である。例
えば、アルギン酸ナトリウムのようなアルギネートは、塩化カルシウムに存在す
るカルシウムのような２価カチオンの存在下でゲル化する。他の物質は、例えば
ｐＨまたは温度の変化によりゲル化可能であり得る。
【００１６】 界面活性剤に関して、溶液中のガス泡の形成および安定化を、方法の他の段階
を干渉せずに促進する任意の界面活性剤が使用できる。その有用な例は、ウシ血
清アルブミン(ＢＳＡ)、界面活性剤のプルロニッククラス(例えば、Ｆ１０８お
よびＦ６８)、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールアルギネー
ト界面活性剤を含む。使用する界面活性剤の量は形成されるハイドロゲルの量お
よびタイプに依存し、および溶液中のガス泡の形成および安定化を促進し、当該
方法の他の段階阻害しない量を使用する。
【００１７】 特に好ましいのは、元々使用されるウシ血清アルブミンがインビボで外来物体
反応を誘発し得るため、プルロニック界面活性剤である。プルロニックは非イオ
ン性界面活性剤であり、それらの泡立ち特性は酸化エチレン含量の増加と共に増
加する。同様の傾向が、疎水性部分の分子量が固定酸化エチレン含量で増加する
として観察される(Alexandridis et al., Micellization of poly(ethylene oxi
de)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)triblock copolymers in aqu
eous solutions: thermodynamics of copolymer association. Macromolecules;
1994, 27:2414-2425)。特定のプルロニック、Ｆ１０８およびＦ６８は同じ酸化
エチレン含量(８０％(w/w))を有するが、平均分子量が異なる(各々１４,６００
および８,４００ダルトン)。Ｆ１０８で形成されたビーズの増加した多孔性はＦ
６８で形成されたビーズと比較して、その泡立ち能力と一致する。プルロニック
界面活性剤は臨界見せる濃度(ＣＭＣ)でミセル化しないが、変わりに広範囲の濃
度にわたり凝集する(ＡＣＲ)ことも知られている。限界凝集濃度(ＬＡＣ)は界面
活性剤が飽和に達する点であり、それはより一般的なＣＭＣに対応する。Ｆ１０
８のＡＣＲは４００−５,０００ppmの範囲である(上記のAlexandridis参照)。こ
の界面活性剤のＬＡＣまたはＣＭＣは各々＞５０,０００ppmまたは４.５％w/vと
報告されている(上記のAlexandridis参照)。したがって、高い界面活性剤濃度が
、ビーズにおいて形成される多孔性に直接作用するプレミセル凝集物を導き得る
ことはもっともらしいと考えられる。
【００１８】 特に好ましい態様において、ハイドロゲル形成物質は低分子量アルギネートお
よび界面活性剤はプルロニック界面活性剤である。
【００１９】 界面活性剤としてのＢＳＡの使用に関して、本方法は、泡立てる最終溶液にお
いて０.０５−１％重量の濃度のＢＳＡを使用して行い得る。使用する量は使用
するアルギネートまたは他のハイドロゲル物質の量に依存する。１から１０％重
量ＢＳＡ水溶液のＢＳＡ貯蔵溶液はこの目的で使用できる。例えば、２グラムの
３から５％w:wのアルギネート、２４０から４００mgのＢＳＡの１５％溶液の使
用が特に有用であることが判明している。ＢＳＡ対アルギネートの重量比はある
適用に関しては１：１０から１：６０、好ましくは１：１０から１：２０であり
得るが、これに限定はされない。
【００２０】 ガス産生成分を供給する場合、緩和な酸、例えば酢酸に曝露されたとき、二酸
化炭素ガスを放出する重炭酸ナトリウムの使用が好ましい。この目的で、少なく
とも重炭酸ナトリウムから放出される二酸化炭素と等モルの酢酸を提供する１０
％容量酢酸溶液を使用し得る。例えば、ビカーボネートを粉末形として、または
０.１Ｍから２.０Ｍのビカーボネート溶液として添加し、泡立てる溶液において
０.５から５.０重量％の濃度を提供する。アルギネートハイドロゲルとＢＳＡを
使用したとき、更に、ＢＳＡ対ビカーボネートの比率が生産物に影響することが
判明している。この場合、１５重量％ＢＳＡ溶液対１.０から２.０Ｍビカーボネ
ート溶液の重量比が２：１から１：１であるのが好ましい。真空の適用により放
出可能であり、そうでなければ調製を妨害しない、ハイドロゲル中でガス泡の形
成をもたらす限り、ある条件または薬剤の適用によりガスを放出する他の物質が
使用できる。
【００２１】 ハイドロゲル形成物質と界面活性剤の溶液をガスの存在下で混合し、得られる
ハイドロゲルに適当なガス泡を提供できる場合、ガス産生成分は必要でないこと
がある。好ましくは、溶液を空気の存在下で混合し、ハイドロゲルがゲル化した
とき、泡立ちおよび続く空気の泡の形成をもたらす。ガス産生成分を使用すると
き、ハイドロゲルは混合およびガス産生成分によりもたらされるガス泡により提
供される空気のガス泡を有し得る。適当な泡立ちをもたらす任意の混合手段を使
用できる。
【００２２】 上記溶液の混合からもたらされる安定な泡を、例えば、ゲル化剤との接触また
はｐＨまたは温度の変化による、ハイドロゲル形成物質に依存した方法によりゲ
ル化する。アルギネートハイドロゲルに関して、ゲル化は溶液中の２価カチオン
、例えば、０.１から１.０Ｍ、好ましくは約０.５Ｍの塩化カルシウム溶液との
接触により行う。２価カチオンはイオン的にアルギネートを架橋させるために働
く。溶液をゲル化剤または条件に曝す方法は、得られる多孔性ハイドロゲル物質
の所望の形に依存する。例えば、ハイドロゲルビーズは、安定な泡のスケールア
ップ適用用のシリンジまたはシリンジポンプを介してのようなゲル化剤への溶液
に、添加により提供できる。同様の方法で、安定な泡を連続的にシリンジ装置を
介して提供し、繊維状形の多孔性ハイドロゲルを提供し得る。安定な泡はまた所
望の形に成型し得、ゲル化剤またはゲル化条件に付して成形品を提供し、それは
組織再生適用に特に有用であり得る。物質の他の形は、当分野で利用可能な手段
を使用して製造し得る。
【００２３】 得られるハイドロゲルはガス泡を含み、その真空への曝露は捕らえたガス泡を
除き、開口孔マクロ多孔性ハイドロゲルを創製する。
【００２４】 好ましい態様において、方法は最初にアルギン酸ナトリウムの水溶液の提供を
含む。重炭酸ナトリウムおよびウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を次いでこの溶液に
添加し、混合して得られる溶液への空気泡の取り込みを可能にし、安定な泡を作
る。この溶液を次いでシリンジに入れ、塩化カルシウムと酢酸の水溶液(ゲル化
溶液)に滴下的に押し出す。カルシウムイオンはアルギネートのゲルに作用し、
一方作酸はビカーボネートと反応してハイドロゲル中に二酸化炭素ガスを産生さ
せる。ミクロビーズの形のゲル化アルギネートを溶液から別々に回収する。アル
ギネートを次いで真空に曝し、含まれるガス泡(空気と二酸化炭素の両方)を出し
、開口孔構造を作る。
【００２５】 ハイドロゲルの特性が変わるように、最適条件が変わることに注目するのは重
要である。例えば、低分子量アルギネートの利用は溶液粘性を減少させ、高アル
ギネート濃度および／または高界面活性剤濃度を必要にし、逆もまた同様である
。アルギネートのグルロン酸含量の変化はハイドロゲルの強度を変え、ガス泡の
除去に増加した真空を必要とするか、減少した出発アルギネート濃度を必要とす
る。
【００２６】 本発明の方法により調製した物質は、広範囲の利用性を示す。それらは、特に
開口孔構造の多孔性ハイドロゲルを必要とする任意の使用に適用し得る。例えば
、物質はその中に細胞を移動できるマトリックスまたは骨格として有用であり、
細胞はその中で適合性であり、生育し、組織置換のようなそれらの意図される機
能を達成し、最終的にその生物分解性に依存してマトリックスを置きかえる。更
に、物質は既に細胞に結合しているマトリックスを提供でき、それは次いで外科
的に体内に移植し得る。更に、物質を、徐放性医薬送達システムとして、創傷治
癒マトリックス物質として、インビトロ細胞培養試験用マトリックスとして、ま
たはそれらと同様の使用に使用できる。本発明の物質の安定な構造は、理想の細
胞培養条件を提供する。
【００２７】 本発明の物質はまた肝細胞(D.J. Mooney, P.M. Kaufmann, K. Sano, K.M. McN
amara, J.P. Vacanti, and R. Langer, "Transplantation of hepatocytes usin
g porous biodegradable sponges," Translpantaion Proceedings, 26, 3425-34
26 (1994); D.J. Mooney, S. Park, P.M. Kaufmann, K. Sano, K. McNamara, J.
P. Vacanti, and R. Langer, "Biodegradable sponges for hepatocyte transpl
antation," Journal of Biomedical Matrials Research, 29, 959-965 (1995)参
照)、軟骨細胞および骨芽細胞(S.L. Ishaug, M.J. Yaszemski, R. Biciog, A.G.
Mikos; "Osteoblast Function on Synthetic Biodegradable Polymers", J. of
Biomed. Mat. Res., 28, p.1445-1453 (1994)参照)を含む、細胞移植における
適用を有し得る。
【００２８】 平滑筋細胞は、特に適当な細胞付着リガンドがこれらの孔構造内のハイドロゲ
ル構造に結合している場合、本発明により製造した物質に容易に付着し、三次元
組織を作り得る；したがって、それらは細胞増殖の適当な環境を提供する。加え
て、これらの物質は成長因子の取り込みの可能性を有する。
【００２９】 本発明のポリマーマトリックスの他の有用な適用は、誘導組織再生(ＧＴＲ)の
ためである。この適用は、組織再生を担う先祖細胞が下にある健康組織にあり、
欠損部への移動および損失組織の再生を誘導できるという前提に基づく。ＧＴＲ
のための物質の重要な特性は細胞の物質への輸送、孔サイズ分布および孔連続性
、即ち、相互連結性により影響される性質である。物質は所望の細胞が物質内に
侵入できるが、他の細胞型の接近を防止しなければならない。
【００３０】 上記および下記の全ての出願、特許および刊行物の全記載を、引用して本明細
書に包含させる。
【００３１】 前記および後記の実施例において、全ての温度は摂氏で未補正である；特記し
ない限り、すべての部およびパーセントは重量である。
【００３２】 実施例 材料 アルギン酸ナトリウム(ＭＶＧ)はPronova Biopolymers, Inc.(Porthsmountn,
NJ)から、製造者により報告されたように約７０％で全体的グルロン酸(Ｇブロッ
ク)含量で購入した。重炭酸ナトリウムおよび塩化カルシウムはFisher Scientif
ic(Pittsburgh, PA)から、エタノール(９５％)はMcCormick Distilling Company
, Inc.(Weston, MO)から購入した。プルロニックＦ６８およびＦ１０８はBASF C
orporation(Mount Olive, NJ)から得た。３−(４,５−ジメチルチアゾール−２
−イル−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(ＭＴＴ)、氷酢酸、ウシ血
清アルブミンフラクションＶ(ＢＳＡ)、ヘマトキシリン、エオシンおよび１０％
中性緩衝化ホルマリンはSigma(St. Louis, MO)から得た。リン酸緩衝化食塩水(
ＰＢＳ ｐＨ＝７.２)、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、ダルベッコ修飾イーグル培地(
ＤＭＥＭ)およびペニリシン−ストレプトマイシンはLife Technologies(Grand I
sland, NY)から購入した。全ての化学物質は購入したまま使用した。
【００３３】 方法 ＧＰＣ測定 分子量および分布を室温で、イソクラティック(isocratic)ポンプ(P1000, The
rmo Separation Products)、レーザー屈折率測定器(LR40)および２重検出器(T60
、差粘度計およびRALLS)を含む３重検出器システム(Viscotek)を備えたシステム
を使用して室温で測定した。０.１Ｍ ＮａＮＯ３緩衝液(ｐＨ６.３)を移動相と
して使用し、流速は０.７ml／分であった。二つのＴＳＫゲルガラム(G4000PWXL
およびG3000PWXL)のセットを使用した。サンプルを移動相に溶解し、濾過し、１
００μl注入ループを備えたRheodyneバルブ(Model 7010)を介して注入した。
【００３４】 実施例１(比較)：先に記載のGotoh刊行物に記載の条件を最初に試験し、それら
が多孔性アルギネートマトリックスの創製に使用できるかを測定した。多孔性ア
ルギネートの形成に必要であると主張されている先の刊行物に記載の条件は： 出発溶液 アルギネート：１−１.５％(w:w) ＢＳＡ：０.０１−０.０３％(w:w) 重炭酸ナトリウム：０.１−０.５Ｍ ゲル化溶液 ０.１Ｍ塩化カルシウム １０％(v:v)酢酸 であった。
【００３５】 我々は、多孔性ビーズを作る試みにおいて最初にこれらの範囲内の多くの条件
を使用したが、これらの条件の組合わせは、相互連結した多孔性構造の形成を導
かなかった。元の明細書において利用されたものと同等の特性のアルギネートを
これらの試験で使用したことに注目することは重要である。使用したアルギネー
トは約７０％のグルロン酸含量および１９０kDの分子量を有した。
【００３６】 我々は、変数の以下の組合わせを使用し、失敗した： １．１.５w:w％アルギネート、０.５Ｍビカーボネート、０−１.５％ＢＳＡ(こ
の範囲の内の広い範囲のBSA濃度を試験した)の出発溶液は、泡沫溶液の形成をも
たらさなかった(溶液中のガス泡がないことを示す)。 ２．１.０−１.５w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネート、０.５−１.５％
ＢＳＡの出発溶液は、泡沫溶液の形成をもたらさなかった(溶液中のガス泡がな
いことを示す)。
【００３７】 実施例２(比較)：先に記載の条件の外の条件の範囲もまた試験し、多孔性、相互
連結構造の形成を導かなかった。 １．１.５−５.０w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネート、０.５−１.０％
ＢＳＡの出発溶液は、泡沫溶液の形成をもたらさなかった(溶液中のガス泡がな
いことを示す)。
【００３８】 実施例３：最初の二つの実施例で見られた失敗の結果に基づいて、この作業工程
の二つの決定的な面は、ガス泡形成および続く安定化であると結論付けた。ＢＳ
Ａ界面活性剤およびビカーボネートガス産生成分を使用した態様において、ＢＳ
Ａ対ビカーボネート溶液の一定比率が泡沫溶液の発生に必要である。ガス泡の安
定化は出発アルギネート溶液の粘性およびＢＳＡの濃度に依存する。低粘性溶液
は捕らえたガス泡を安定化できず、一方高すぎる粘性は強すぎ、ガス泡を真空段
階において容易に除去できないゲルを導く。加えて、ＢＳＡはアルギネート溶液
におけるガス泡の安定化に働き、適当なＢＳＡ濃度を有することは、ガス泡を含
む安定な泡の形成を可能にするために重要である。
【００３９】 特に、以下の状況は開口、相互連結多孔性ハイドロゲルの形成を導かなかった
。 １．３w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＢＳＡ溶液および
０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４０】 ２．３w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＢＳＡ溶液および
０.２４ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４１】 ３．４w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.３２ｇのＢＳＡ溶液および
０.１６ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４２】 ４．４w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.３４ｇのＢＳＡ溶液および
０.３４ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４３】 ５．５w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.４ｇのＢＳＡ溶液および０.
２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４４】 ６．５w:w％アルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.４ｇのＢＳＡ溶液および０.
４ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４５】 ７．５w:w％アルギネート、１.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.４ｇのＢＳＡ溶液および０.
２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４６】 要するに、以下の範囲の条件が、この態様により相互連結孔構造の形成に好ま
しいことが判明した： ３、４および５w:w％(水の重量に基づいた重量％)アルギネートと１.５％ＢＳ
Ａおよび１.０Ｍから２.０Ｍビカーボネート溶液の出発溶液は、泡立った溶液の
発生を導いた。ＢＳＡ溶液対ビカーボネート溶液の重量比は好ましくは２：１か
ら１：１である。使用するそれらの量は、アルギネート溶液の濃度に依存する。
【００４７】 実施例４：我々はまたタンパク質ＢＳＡを置きかえるために、界面活性剤として
プロピレングリコールアルギネートを使用した。 １．等量のアルギネートとプロピレングリコールアルギネートをｄｄ水に溶解し
、３％w:w溶液を産生した。２ｇのこの溶液を０.１２ｇのビカーボネート溶液と
混合し、泡立った溶液を産生した。
【００４８】 実施例５：我々はまたゲル化溶液の組成を、Gtotohと比較して変えた。Gotohに
おける報告されている１０vol％酢酸含有０.１Ｍ ＣａＣｌ２は、アルギネート
の十分に早いゲル化を導かなかった。ビーズは粘性であるように見え、ビーズは
他のビーズと接触したとぎ、互いに融合する傾向にある。ＣａＣｌ２の濃度を０
.５Ｍまで上げた。
【００４９】 実施例６：実施例３で形成したビーズの多孔性の指標を、水性溶液に懸濁したビ
ーズの観察により得た。真空に曝す前のビーズは不透明であり、表面に浮かぶよ
うに見える(大量の捕らえられたガスから予測されるように低密度を示す)。真空
への曝露に続き、ビーズは透明であり、溶液の底に沈むように見える(ガスのよ
り高密度の水性溶液での置換による増加した密度を示す)。
【００５０】 実施例７：実施例３で形成されたビーズの多孔性を視覚的に試験し、それらの多
孔性を確認した。ビーズのゲル化溶液からの単離に続き、大量のガス泡がアルギ
ネートマトリックス内に観察された。ガス泡の除去に続き、開口孔構造が観察さ
れた。
【００５１】 実施例８：マトリックスの相互連結孔構造を、多孔性アルギネートビーズ上へ懸
濁細胞溶液を播き、続いてこれらの細胞をＭＴＴ(３−(４,５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを使用し
て可視化することにより評価した。簡単に、３Ｔ３線維芽細胞をダルベッコ修飾
イーグル培地に懸濁させた(２００万細胞／ml)。アルギネートビーズをその水溶
液から除去し、紙にブロットして、孔内の水を毛管現象により除去することを可
能にした。次いで、ビーズを細胞懸濁液に入れた。１時間後、ビーズを細胞懸濁
液から除去し、培地で洗浄した。ビーズを０.５mg／ml ＭＴＴ含有培地に入れ
た。ＭＴＴは細胞により取り込まれ、ミトコンドリア中で、顕微鏡試験で容易に
目に見える不溶性青色生産物に還元される。非多孔性ビーズは細胞を取り込まず
、したがって染色細胞は大孔(直径約１０ミクロンより大きい)を含むビーズ中に
存在しない。多孔性であるマトリックスは細胞を取り込み、染色細胞の分散がマ
トリックスにおける相互連結孔の量の確認を可能とする。
【００５２】 実施例９：孔構造が長時間に渡り安定なままであるかを決定するために、多孔性
ビーズを水性溶液中、種々の時間(１日から２週間)保持し、続いて実施例８のよ
うな細胞のシーディングおよび可視化により分析した。細胞の取り込みおよび分
布、したがってマトリックスの多孔性は、貯蔵後に未変化であった。
【００５３】 実施例１０：孔構造がインビボでそのまま残るかを決定するために、多孔性アル
ギネートビーズをラットの皮下ポケットに移植した。ビーズを１および２週間後
回収し、固定し、区分けし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。マクロ
ファージおよび線維芽細胞の侵入は１週間でマトリックスを通して顕著であり、
２週間でより多くの細胞が存在し、細胞の侵入によりビーズにおけるより大きな
新規コラーゲン付着であった。この結果は、多孔性ビーズがその構造をインビボ
で維持し、細胞侵入を可能にすることを確認する。ビーズはその元の形および寸
法を維持し、その機械的特性はインビボで働く圧力に抵抗するのに十分であるこ
とを示す。
【００５４】 実施例１１：多孔性アルギネートマトリックスを作る方法は、大量のこれらの物
質の製造を可能にするために大規模化されている。大量の最初の溶液において気
泡を取り込むために、溶液を高速ミキサー(例えば、Sunbeam hand mixer, Model
2484)で激しく混合する。シリンジポンプを使用して半自動形態で大量の再現性
のある同じ大きさのビーズを産生する。
【００５５】 実施例１２：多孔性であるだけでなく、移植後分解を示す物質の製造が、種々の
生物医学的適用で非常に望まれている。アルギネートの一つの主用な欠点は、イ
ンビボでの分解性の欠失である。哺乳類はアルギネートの分解に必要な適当な酵
素を持たず、生理学的条件での加水分解的分解は殆ど考慮できない。一つの魅力
ある代替は、腎臓からの物質の排泄を可能にするのに十分低い平均分子量のアル
ギネートの使用である。この分子量は通常約５０kDより小さいと見なされる。
【００５６】 したがって、我々は、酸加水分解(溶液)、熱処理(溶液およびバルク)およびγ
照射(溶液およびバルク)を利用した、アルギネートの、５０kDより小さい物質を
産生するための制御された分解を試験している。平均分子量、数平均分子量(Ｍ
ＷおよびＭＮ)、およびその多分散性指数に関する低分子量アルギネートフラグ
メントの特徴をＧＣＰ(ゲル浸透クロマトグラフィー)を使用して測定し、以下の
表に示す。
【００５７】 低分子量アルギネートの製造 １．酸加水分解 アルギネート溶液(２％(w:w))を０.３Ｍ ＨＣｌ中で種々の時間環流した。続
いて、オートクレーブ処理サンプルの分子量をＧＰＣ測定により測定した。オー
トクレーブ処理ポリマーのゲル化行動も測定した。全てのサンプルはカルシウム
イオン存在下でゲル化した。
【００５８】 表１．０.３Ｍ ＨＣｌ中での加水分解を介して分解したアルギネート溶液
【表１】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００５９】 ２．熱処理 アルギネート(溶液およびバルク)をオートクレーブ処理(１.０３４バール、１
２１℃)し、低平均分子量のアルギネートを産生した。サンプルを各々１時間、
２時間、および２.５時間オートクレーブ処理した。続いて、オートクレーブ処
理サンプルの分子量をＧＰＣ測定により測定した。オートクレーブ処理ポリマー
のゲル化行動も測定した。全てのサンプルはカルシウムイオン存在下でゲル化し
た。
【００６０】 表２．１２１℃、１.０３４バールでの熱処理を介して分解したアルギネート(溶
液およびバルク)
【表２】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００６１】 ３．γ照射 アルギネートは種々の条件でγ照射により分解した。続いて、オートクレーブ
処理サンプルの分子量をＧＰＣ測定により測定した。実験の第１セット(表３)は
アルギネート溶液(２および３％)の照射により行った。オートクレーブ処理ポリ
マーのゲル化行動も測定した。全てのサンプルはカルシウムイオン存在下でゲル
化した。
【００６２】 表３．ガンマ照射を介したアルギネート溶液の分解
【表３】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００６３】 表４．一定ガンマ投与量でのガンマ照射を介したアルギネート粉末の分解
【表４】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００６４】 表５．一定ガンマ投与時間でのガンマ照射を介したアルギネート粉末の分解
【表５】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００６５】 表６．一定照射量でのガンマ照射を介したアルギネート粉末の分解
【表６】 １平均分子量＜５０kDの平均分子量のポリマーの重量フラクション。２ ０.０３Ｍ ＣａＣｌ２中のイオン性架橋。
【００６６】 実施例１３：高分子量アルギネートは、種々の方法を使用して低分子量フラグメ
ントに破壊された。各方法は５０kDより小さい分子量のアルギネートをもたらす
条件を提供した。加えて、全てのアルギネートフラグメントはまだカルシウムイ
オン存在下でゲルを形成する。その使用の容易さに基づいて、５.０Mradで２.８
３時間のガンマ照射を使用してアルギネートフラグメントの産生をした。多孔性
アルギネートビーズは本明細書の最初の部分に記載の方法により形成した。
【００６７】 １．８％w:wアルギネート、２.０Ｍビカーボネートおよび１.５％ＢＳＡを出発
溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＢＳＡ溶液および
０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００６８】 実施例１４：我々はまたプルロニックＦ１０８およびＦ６８のような他の界面活
性剤の使用も試験した。全ての界面活性剤は泡立った溶液を産生し、安定な相互
連結多孔性ハイドロゲルを導いた。
【００６９】 １．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ１０８の１０％w:w
溶液を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＦ１０
８溶液および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生し
た。
【００７０】 ２．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ６８の１.５％w:w溶
液を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＦ６８溶
液および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００７１】 ３．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ６８の５％w:w溶液
を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.２４ｇのＦ６８溶液
および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生した。
【００７２】 実施例１５：泡立った溶液の産生に必要な界面活性剤の量をまた界面活性剤とし
てＦ１０８を使用して試験した。
【００７３】 １．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ１０８の１０％w:w
溶液を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.１２ｇのＦ１０
８溶液および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生し
た。
【００７４】 ２．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ１０８の１０％w:w
溶液を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.０６ｇのＦ１０
８溶液および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合し、泡立った溶液を産生し
た。
【００７５】 ３．８％w:wアルギネート、２.０ＭビカーボネートおよびＦ１０８の１０％w:w
溶液を出発溶液として使用した。２ｇのアルギネート溶液を０.０３ｇのＦ１０
８溶液および０.１２ｇのビカーボネート溶液と混合した。この組成物は安定で
十分泡立った溶液をもたらさなかった。
【００７６】 実施例１６：これらのビーズの多孔性をまた実施例４および５に記載の様に試験
した。更に、環境制御型走査電子顕微鏡(ＥＳＥＭ)を使用し、アルギネートビー
ズの多孔性に関する情報を獲得した。サンプルを水蒸気の飽和蒸気圧で湿潤試験
した。ＥＳＥＭデータをサンプルの表面および断面から得た。更に、総多孔性率
を試験した。
【００７７】 アルギネートフラグメントから形成されたアルギネートビーズの相互連結多孔
性構造(ＭＮ＝８９２０、ＭＷ＝１６８００)を、懸濁細胞の溶液をアルギネート
ビーズ上に播き、続いてこれらの細胞をＭＴＴ(３−(４,５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを使用して
可視化して評価した。簡単に、３Ｔ３線維芽細胞をダルベッコ修飾イーグル培地
に懸濁させた(２００万細胞／ml)。アルギネートビーズをその水溶液から除去し
、紙にブロットして、孔内の水を毛管現象により除去することを可能にした。次
いで、ビーズを細胞懸濁液に入れた。１時間後、ビーズを細胞懸濁液から除去し
、培地で洗浄した。ビーズを０.５mg／ml ＭＴＴ含有培地に入れた。ＭＴＴは
細胞により取り込まれ、ミトコンドリア中で、顕微鏡試験で容易に目に見える不
溶性青色生産物に還元される。非多孔性ビーズは細胞を取り込まず、したがって
染色細胞は大孔(直径約１０ミクロンより大きい)を含むビーズ中に存在しない。
多孔性であるマトリックスは細胞を取り込み、染色細胞の分散がマトリックスに
おける相互連結孔の量の確認を可能とする。全てのビーズは全ビーズを通して均
質な細胞分散の高い程度の細胞取り込みを示した。
【００７８】 孔構造がインビボでそのまま残るかを決定するために、アルギネートフラグメ
ント(ＭＮ＝８９２０、ＭＷ＝１６８００)から作られた多孔性アルギネートビー
ズをラットの皮下ポケットに移植した。ビーズを１および２週間後回収し、固定
し、区分けし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。マクロファージおよ
び線維芽細胞の侵入は１週間でマトリックスを通して顕著であり、２週間でより
多くの細胞が存在し、細胞の侵入によりビーズにおけるより大きな新規コラーゲ
ン付着であった。この結果は、多孔性ビーズがその構造をインビボで維持し、細
胞侵入を可能にすることを確認する。ビーズはその元の形および寸法を維持し、
その機械的特性はインビボで働く圧力に抵抗するのに十分であることを示す。
【００７９】 アルギネートビーズの表面多孔性を下記のようにＥＳＥＭで定量した： 物質 ８％低分子量アルギネート(２ｇ／バイアル) ２Ｍ ＮａＨＣＯ３(１２０mg／バイアル) 界面活性剤 １０％w:wプルロニックＦ１０８ Prill(種々のmg／バイアル) または １.５％w:wＢＳＡ(２４０mg／バイアル)
【００８０】 表７
【表７】
【００８１】 全体的ビーズ多孔性の測定を下記のように行った： ・固体アルギネートビーズの計算理論容量 ・(４／３)ＰｉＲ３＝(４／３)Ｐｉ(１.５)３＝１４mm３ ・凍結乾燥多孔性アルギネートビーズ ・重量乾燥アルギネートビーズ (Ｖ固体ビーズ−Ｖ乾燥多孔性ビーズ)／Ｖ固体ビーズ＝全体的ビーズ多孔性％
【００８２】 表８
【表８】
【００８３】 実施例１７−２０の実験 アルギン酸ナトリウム(ＭＧＶ)の分解 １.７×１０５の数平均分子量(Ｍｎ)および２.３の多分散性指数(ＰＤＩ)のＭ
ＶＧをガンマ(γ)照射を使用して低分子量フラグメントに破壊した。アルギネー
ト粉末をコバルト６０源を使用して２.８３時間、５.０Mradのガンマ投与量で照
射した。分子量および対応する重量フラクションをＧＰＣを使用して測定した。
【００８４】 多孔性ビーズ 製造：水性アルギネート溶液(ＭＶＧまたはアルギネートフラグメントから調製)
、界面活性剤(０.１５％(w/w)ＢＳＡまたは０.１４−１.０２％(w/w)Ｆ１０８)
、および０.９％(w/w)重炭酸ナトリウムを撹拌し、安定な泡(２相液体／ガスシ
ステム)が得られ、容量が約２倍になるまで(〜３０分)空気を包含させた。界面
活性剤の種々の濃度は豹９に示す。ビーズの形成に使用した溶液中のアルギネー
ト濃度は、非分解アルギネートに関して１.７５％(w/w)、および低分子量アルギ
ネートに関して７％(w/w)であった。次いで、ビーズを、１０％(v/v)酢酸含有０
.１Ｍ ＣａＣｌ２溶液への泡の滴下的押し出しにより形成させた。酢酸と重炭
酸ナトリウムが反応し、二酸化炭素が放出する(ＮａＨＣＯ３＋ＣＨ３ＣＯＯＨ
→ＣＨ３ＣＯＯＮａ＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２↑)。ビーズを回収し、脱イオン水で洗浄
し、続いて＜４００Paの真空に曝露した。真空に曝露する前は、ガスは表面に僅
かな開口を伴う殆ど密閉された孔中に包含される。真空はガスを引き出し、表面
に多くの開口部を伴う開口多孔性構造を導く。
【００８５】 多孔性：ビーズの多孔性を、３つの異なる方法を使用して評価した。第１の方法
は、環境走査電子顕微鏡(ＥＳＥＭ)(ElectroScan Model E3, FEI Company, Hill
sboro, OR)を使用して表面多孔性を測定した。サンプルを試験しながら、水蒸気
の飽和圧で水和した(６６５Ｐａ、５℃)。ＥＳＥＭデータをビーズの表面および
断面から得、多孔性をコンピューター処理イメージ分析を使用して計算した(Sci
on Image, Version 1.62)。ビーズの３つのバッチを作り、バッチ内およびバッ
チ間の多孔性の変化を測定した。相互連結し、表面に接近可能な(即ち、表面接
近可能相互連結多孔性)であるビーズ内の孔の容量を、次ぎに、多孔性ビーズの
全容量および孔要素を満たすのに必要な溶媒の量の測定により測定した。簡単に
、個々のビーズを既知の容量のエタノール(Ｖ１)を満たした目盛りシリンダーに
入れた。ビーズを浸した後の全容量を記録した(Ｖ２)。ビーズを孔に捕らえられ
た溶媒と共に除去し、目盛りシリンダーに残ったエタノールの容量を表示した(
Ｖ３)。ビーズの全量(ＶＴ)を下記式(１)により計算した。
【数１】 ＶＴ＝Ｖ２―Ｖ３ (１)
【００８６】 表面接近可能相互連結多孔性χを式(２)を使用して計算した。
【数２】
【００８７】 最終法を使用して、ビーズの総多孔性率または全体的空隙容量(ε)を、多孔性
ビーズと固体ビーズの重量の比較により測定した。実験的に産生した多孔性ビー
ズを測定して、その半径(ｒ)を測定し、続いて乾燥させてその質量(ｍｐ)を測定
した。次ぎに、同じ直径の固体ビーズの理論的質量(ｍｓ)を、測定したビーズ半
径(Ｖ＝４／３πｒ３)および、ゲルが９０％水より大きいという理由に基づいた
理論的密度である１ｇ／mlの複合密度を使用して測定した。空隙容量を式(３)を
使用して計算した。
【数３】
【００８８】 表９．多孔性ビーズの相互連結孔容量(％)および全孔容量(％)
【表９】 １ビーズをＭＶＧ−アルギネートから形成させた(２％(w/w))２ ビーズを低分子量アルギネートから形成させた(８％(w/w))３ 泡が形成されなかった。
【００８９】 ＭＴＴアッセイ：マトリックスの相互連結孔構造を、懸濁細胞の溶液を多孔性ア
ルギネートビーズ上に播き、続いてこれらの細胞をＭＴＴ(３−(４,５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイ
を使用して可視化することにより定量的に評価した。簡単に、３Ｔ３線維芽細胞
をＤＭＥＭに懸濁した(２００万細胞／ml)。アルギネートビーズをその水溶液か
ら除去し、紙にブロットして、孔内の水を毛管現象により除去することを可能に
した。次いで、ビーズを細胞懸濁液に入れた。１時間後、ビーズを細胞懸濁液か
ら除去し、培地で洗浄した。ビーズを０.５mg／ml ＭＴＴ含有培地に入れた。
ＭＴＴは細胞により取り込まれ、ミトコンドリア中で、顕微鏡試験で容易に目に
見える不溶性青色生産物に還元される。非多孔性ビーズは細胞を取り込まず、し
たがって染色細胞は大孔(直径約１０ミクロンより大きい)を含むビーズ中に存在
しない。多孔性であるマトリックスは細胞を取り込み、染色細胞の分散がマトリ
ックスにおける相互連結孔の量および均質性の確認を可能とする。
【００９０】 インビボ実験：多孔性アルギネートビーズを巾着法(purse string procedure)を
使用して作った皮下ポケットに移植した(Greene et al., The purse string mod
el as a method of implanting and localizing cellular constructs. Proceed
ings of the Third North Carolina Tissue Engineering Group Meeting, 1999,
Charlotte, North Carolina.)。ポケットを最初に１００−１５０ｇ Lewisラ
ット(Charles River)の背中上の環状路中を縫合糸で縫うことにより輪郭を描く
。縫合糸の二つの端を続いてたるみなく引っ張り、結んで、このように、自己充
足の安定なポケットを形成させる。小切開をポケットの頂上に作り、多孔性アル
ギネートビーズを移植した。小切開を続いて縫合し、閉じた。移植は移植後２週
間で回収し、標準法を使用して１０％中性緩衝化ホルマリンに固定し、脱水し、
パラフィン中に包埋させた。次いで切片を切断し、マウントし、ヘマトキシリン
およびエオシンで染色した。全ての動物法は、University Committee on the Us
e and Care of Animalsにより確立されたガイドラインに従って行った。
【００９１】 実施例１７ 実験の最初のセットを使用して、多孔性マトリックスの形成に適当な条件の範
囲を測定した。１.７５％(w/w)ＭＶＧアルギネート、０.１５％(w/w)ＢＳＡおよ
び０.９％(w/w)ＮａＨＣＯ３から成る混合物は、安定な泡を形成し、続いて相互
連結孔構造の多孔性ビーズの形成に利用した。電子顕微鏡を使用して、ビーズの
内部は、表面よりもより相互連結し、開口孔構造であることが示された。全孔容
量は７８±３％と計算され、相互連結、表面接近可能多孔性は３９±１％と測定
された。これらの多孔性測定の差は、ビーズの外部表面に相互連結していない密
閉孔構造を有する孔のためである。ビーズの相互連結孔構造を確認するために、
細胞をビーズに播き、染色し、ＭＴＴアッセイによりそれらの分布を目立たせた
。線維芽細胞はこのレベルの試験で、全ビーズを通して均質に分散することが判
明した。
【００９２】 実施例１８ ビーズを低分子量アルギネートから調製した。第１に、商品として入手可能な
アルギネート粉末(ＭＮ＝１７０kD、ＰＤＩ＝２.３)を、５Mradの投与量で２.８
３時間γ照射した。これらの条件は、その９２％が５０kDより小さい分子量を有
する、大きな分子量減少を伴う(ＭＮ＝９,３７０ダルトン、ＰＤＩ＝２.５)アル
ギネート断片化およびポリマー鎖を導く。このような処理の前および後の分子量
分布およびフラクションを各々図１ａおよび１ｂに示す。これらのアルギネート
フラグメントの実質的に低い分子量にもかかわらず、それらはまだＣａ２＋イオ
ンの存在下で三次元ネットワークを形成した。アルギネートフラグメントは、上
記の方法を使用して多孔性ビーズを形成した。唯一の行った変化は、１.７５％(
w/w)溶液の代わりの７％(w/w)アルギネートの使用であった。相互連結孔の割合
は、高(３９±１％)および低(４１±１％)分子量アルギネートから調製したビー
ズで同等であった。しかし、全体的空隙容量は、低分子量アルギネート(４６±
３％)と比較して、高分子量アルギネート(７８±３％)で調製したビーズで有意
に高かった。
【００９３】 実施例１９ 工程中のガス泡形成を安定化させる界面活性剤の役割を試験した。この仕事に
おいて、処理に続いてビーズに残る残余ＢＳＡが次ぎの移植に炎症性応答を誘発
する可能性があるため、ＢＳＡを他の適当な界面活性剤に置きかえるのが、特に
興味深かった。ポリ(エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)−ポリ
(エチレンオキサイド)(プルロニックＦ１０８およびＦ６８)を、これらの界面活
性剤が種々の生物学的適用において広範囲に使用されているため、ＢＳＡの代わ
りに使用した。両方の界面活性剤とも工程中のガス泡の安定化ができ、低分子量
アルギネートから多孔性ビーズを形成するのに使用できた。プルロニックＦ１０
８の資料は対応するビーズの増加した多孔性をもたらし、この界面活性剤を全て
の今後の試験に使用した。Ｆ１０８の量を変え(０.１４−１.０２％)、界面活性
剤の異なる量がビーズの多孔性にどのように影響するかを試験した。０.５４％(
w/w)Ｆ１０８は最大の相互連結孔容量(５４±２％)および全体的孔容量(７４±
１％)を示すビーズをもたらした(表９)。相互連結孔構造を再びビーズ中へ線維
芽細胞を播き、細胞をＭＴＴアッセイを使用して可視化することにより確認した
。均質細胞分布が全ビーズ容量を通して再び示され、ビーズの相互連結孔構造を
確認した。
【００９４】 実施例２０ これらの構造の一つの利用性の試験は、孔構造がインビボでそのまま残り、細
胞侵入を可能にするかを測定することに関する。これを試験するために、Ｆ１０
８を界面活性剤として使用し、低分子量アルギネートから作った多孔性アルギネ
ートビーズをインビボで皮下ポケットに移植した。重要なことにに、ビーズはそ
の多孔性構造を維持し、インビボで細胞侵入を可能にした。マクロファージおよ
び線維芽細胞の侵入は、移植２週間後にマトリックスを通して示された。更に、
赤血球を含む血管がポリマー内部で観察され、したがって、多孔性がアルギネー
トビーズの血管新生を可能にするのに十分大きいことを証明した。マトリックス
の内部を通しての顆粒組織の存在は、孔の相互連結ネットワークと一致する。
【００９５】 前記から、当業者は本発明の必須の特徴を容易に確認でき、その精神および範
囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適合させるために本明細書の
種々の変化および修飾をできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 処理の前および後のアルギネートの分子量分布およびフラクショ
ンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クレイグ・ハルバースタット アメリカ合衆国28270ノースカロライナ州 シャーロット、ハンプトン・オークス・レ イン9416番 (72)発明者 デイビッド・ムーニー アメリカ合衆国48103ミシガン州アナーバ ー、ヒューロン・コート3657番 (72)発明者 ジュリア・イェー アメリカ合衆国48103ミシガン州アナーバ ー、ブルース・ストリート811番 (72)発明者 レイチェル・ラトバラ アメリカ合衆国49829ミシガン州エスカナ ーバ、フォース・ストリート312番 (72)発明者 ジョン・エイ・ローリー アメリカ合衆国48105ミシガン州アナーバ ー、ケロッグ・ナンバー125、436番 Ｆターム(参考） 4C076 BB32 EE30 FF02 FF70 GG11 4F074 AA97 BA03 CA32 CA35 DA53

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ)ハイドロゲル形成物質、界面活性剤および所望によりガ
    ス産生成分の溶液を提供し、該溶液はガスの存在下混合され、溶液中にガスを取
    り込み、安定な泡を形成する溶液である； ｂ)溶液をガスの存在下で混合することによるおよび／または、ガス産生成分が
    存在する場合、溶液をガス産生成分からのガスの産生をもたらす条件または薬剤
    に付すことによって安定な泡を形成し； ｃ)安定な泡を、ハイドロゲル形成物質のゲル化をもたらし、ガス泡をその中に
    含むハイドロゲルを形成する条件および／または薬剤に曝露し； ｄ)ハイドロゲルからガス泡を放出させ、マクロ多孔性開口孔多孔性を有するハ
    イドロゲル物質を形成する： ことを含む、マクロ多孔性開口孔多孔性を有するハイドロゲル物質の製造法。
  2. 【請求項２】 ハイドロゲルがアルギネートハイドロゲルである、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 ハイドロゲル形成物質がアルギネート溶液、界面活性剤がＢ
    ＳＡ、重炭酸ナトリウムであるガス産生成分を使用し、塩化カルシウムおよび酢
    酸の水溶液を各々ゲル化剤およびガス産生成分からのガスの産生のための薬剤と
    して使用する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 アルギネート溶液が３から５％w:wアルギン酸ナトリウム溶
    液であり、ＢＳＡが水中１.０から１０重量％溶液として提供され、重炭酸ナト
    リウムが１.０Ｍから２.０Ｍ溶液として提供され、ＢＳＡ溶液と重炭酸ナトリウ
    ム溶液を、ＢＳＡ溶液対重炭酸ナトリウム溶液２：１から１：１の重量比で混合
    し、塩化カルシウムと酢酸の水溶液は０.１から１.０Ｍの塩化カルシウム濃度お
    よび約１０容量％の酢酸を有する、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 アルギネートが１０００から８０,０００ダルトンの減少し
    た分子量を有するアルギネートである、請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 界面活性剤がＢＳＡ、プルロニック界面活性剤またはプロピ
    レングリコールアルギネート界面活性剤である、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 溶液がガス産生成分を含む、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 安定泡を、シリンジ開口を通したゲル化溶液への滴加により
    ハイドロゲル形成物質のゲル化をもたらし、ミクロビーズを形成する条件および
    ／または薬剤に曝す、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 安定泡を、シリンジ開口部を通したゲル化溶液への滴加によ
    りハイドロゲル形成物質のゲル化をもたらし、ミクロビーズを形成する条件およ
    び／または薬剤に曝す、請求項３記載の方法。
  10. 【請求項１０】 滴加をシリンジポンプにより行う、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 安定泡の形成のために混合する溶液が３−１０重量％アル
    ギネート、０.０５−１.０重量％ＢＳＡおよび０.５から５.０重量％重炭酸ナト
    リウムを含む、請求項３記載の方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１に従って製造したマクロ多孔性、開口孔ハイドロ
    ゲル物質。
  13. 【請求項１３】 ミクロビーズの形の、請求項１２のマクロ多孔性、開口孔
    ハイドロゲル物質。
  14. 【請求項１４】 アルギネートが１,０００から５０,０００ダルトンの減少
    した分子量を有するアルギネートである、請求項２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 界面活性剤がプルロニック界面活性剤である、請求項１記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 界面活性剤がプルロニック界面活性剤である、請求項１４
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１μm幅であり、３５から７５％の総多孔性率
    である、マイクロ多孔性、相互連結開口孔多孔性を有する、ビーズ形のハイドロ
    ゲル物質。
  18. 【請求項１８】 １０から１０００μm幅の孔を有する、請求項１７記載の
    ビーズの形のハイドロゲル物質。
  19. 【請求項１９】 更にその孔中に包含された生存可能細胞を含む、請求項１
    ７記載のビーズの形のハイドロゲル物質。
  20. 【請求項２０】 更にその孔中に包含された生存可能細胞を含む、請求項１
    ２記載のハイドロゲル物質。
  21. 【請求項２１】 アルギネート物質である、請求項１７記載のハイドロゲル
    物質。
  22. 【請求項２２】 アルギネート物質である、請求項１９記載のハイドロゲル
    物質。
  23. 【請求項２３】 アルギネート物質である、請求項２０記載のハイドロゲル
    物質。
  24. 【請求項２４】 少なくとも１μm幅であり、３０−８０％の表面接近可能
    、相互連結多孔性であるマクロ多孔性、相互連結開口孔多孔性を有するビーズ形
    のハイドロゲル物質。
  25. 【請求項２５】 ガス泡の放出、段階(ｄ)をハイドロゲルを真空に曝すこと
    により行う、請求項１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ガス産生成分が重炭酸ナトリウムである、請求項７記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 段階ｂ)およびｃ)を実質的に同時に行う、請求項１記載の
    方法。
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