DE69737654T2

DE69737654T2 - Materialien und verfahren zur immobilisierung von bioaktiven substanzen auf biologisch abbaubare polymere

Info

Publication number: DE69737654T2
Application number: DE69737654T
Authority: DE
Inventors: Alonzo D. Flagstaff COOK; Paul D. Flagstaff DRUMHELLER
Original assignee: Gore Enterprise Holdings Inc
Current assignee: Gore Enterprise Holdings Inc
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-02
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2017-06-03
Also published as: EP0918550A1; WO1997046267A1; AU3229897A; US5916585A; DE69737654D1; CA2256648A1; EP0918550B1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Modifikation von bioabsorbierbaren Polymeren, um die absorbierbaren Polymere stärker hydrophil zu machen und funktionelle Anlagerungs- bzw. Haftstellen für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf den absorbierbaren Polymersubstraten bereitzustellen.
TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Implantierbare Polymermaterialien, die durch den Körper abgebaut und absorbiert werden können, sind seit vielen Jahrzehnten in Gebrauch. Diese biologisch abbaubaren Materialien werden oft als strukturelle Träger eingesetzt, wie z. B. als Gerüste zur Führung von Geweberegeneration, als Nähte, Klammern und Netze, als Schutzbarrieren während der Wundheilung oder als Mittel zur kontrollierten Abgabe therapeutischer Substanzen an einen Empfänger.
Der Abbau dieser Polymere in vivo kann durch verschiedene Mechanismen erfolgen. Zum Beispiel können die kovalenten Bindungen in einem biologisch abbaubaren Polymer instabil gegen enzymatische Spaltung oder nichtenzymatische Hydrolyse sein. Das Produkt der Hydrolyse kann in Wasser löslich oder nicht löslich sein. Wasserlösliche Produkte werden oft direkt aus dem Körper ausgeschieden oder nach dem Durchgang durch einen bestimmten Stoffwechselweg aus dem Körper entfernt. Für wasserunlösliche Produkte kann die phagozytotische Aktivität von Zellen, wie z. B. von Makrophagen und/oder Fremdkörperriesenzellen, eine bedeutende Rolle beim Abbau und der Beseitigung der Produkte spielen. Ein solcher phagozytotischer biologischer Abbau erfordert gewöhnlich die Aktivierung einer entzündlichen Reaktion auf das biologisch abbaubare Material durch den Empfänger.
Wenn biologisch abbaubare Materialien in einen Empfänger implantiert und als strukturelle Träger verwendet werden, erfolgt mit dem Abbau und der Entfernung des Materials aus dem Körper des Empfängers oft ein Einwachsen von Zellen des Empfängers in den durch das Material eingenommenen Raum. Unter gewissen Umständen können auf diese Weise ziemlich komplexe, dreidimensionale Gewebestrukturen gezüchtet werden. Ein Beispiel ist die Regeneration von Knorpelgewebe, die ausgeführt wird, indem ein abbaubares Fasernetz mit Chondrozyten vorbeimpft und nach mehrwöchiger Kultivierung der Zellen in vitro die Konstrukte in einen Empfänger implantiert werden (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5041138, erteilt an Vacanti et al.). Ein weiteres Beispiel ist die Hautregeneration unter Verwendung von Fibroblasten, mit denen ein abbaubares Polymergerüst beimpft wird (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5443950, erteilt an Naughton et al.).
Um eine kontrollierte Freisetzung eines therapeutischen Mittels von einem biologisch abbaubaren Polymer zu bewirken, wird das therapeutische Mittel gewöhnlich dem jeweiligen biologisch abbaubaren Polymer während der Herstellung des Materials für die kontrollierte Freisetzung beigemischt. Nach der Implantation des Materials in einen Empfänger wird das therapeutische Mittel während des Abbaus des Polymers durch den Körper des Empfängers von dem biologisch abbaubaren Polymer freigesetzt (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4389330, erteilt an Tice et al.). Die Abbaugeschwindigkeit eines biologisch abbaubaren Polymers ist von der chemischen Zusammensetzung des Polymers, der Kristallinität der Probe, der Porosität und der Benetzbarkeit abhängig. Zum Beispiel zersetzen sich hydrophobe biologisch abbaubare Polymere gewöhnlich langsamer als hydrophile biologisch abbaubare Polymere.
Da die meisten biologisch abbaubaren Materialien, wie zum Beispiel Poly(α-hydroxyester), relativ hydrophob sind, kann es wünschenswert sein, die Materialien zu modifizieren, um ihre Oberflächen stärker hydrophil zu machen. Indem die Oberflächen stärker hydrophil gemacht werden, kann die Abbaugeschwindigkeit des Polymers erhöht werden, die Zellenanlagerung kann verbessert werden, oder Proteinabscheidungsstrukturen können so verändert werden, daß die Biokompatibilität oder Zellantwort auf das Polymer verbessert wird.
Hydrophobe Oberflächen sind Niedrigenergieflächen, die durch Fluide mit niedriger Oberflächenspannung, wie zum Beispiel niedermolekulare Kohlenwasserstoffe oder Alkohole und die meisten niedermolekularen organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Benzol, Aceton, Toluol und Dioxan usw., leicht benetzt werden können. Hydrophile Oberflächen sind andererseits Hochenergieflächen, die durch Fluide mit hoher Oberflächenspannung leicht benetzt werden können. Beispiele von Fluiden mit hoher Oberflächenspannung schließen beispielsweise ein, sind aber nicht beschränkt auf flüssiges Wasser, wäßrige Salz- und Proteinlösungen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Hexamethylphosphortriamid, Formamid und Ethylenglycol.
In Tabelle 1 sind Beispiele von Polymermaterialien in der Reihenfolge zunehmender Oberflächenspannung aufgeführt, wobei repräsentative Werte der Oberflächenspannung (dyn/cm) für jedes Material bei 20°C gemessen werden (Polymer Handbook, 3. Aufl., J. Brandrup, E.H. Immergut, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., S. VI 411–VI 426, 1989). Im allgemeinen liegt die Oberflächenspannung von Polymermaterialien im Bereich von etwa 10 bis 70 dyn/cm. Viele Polymere haben dazwischenliegende Oberflächenenergien, und das Benetzungsverhalten von Fluiden mit hoher Oberflächenspannung auf diesen Polymeren ist, außer von der Oberflächenspannung der Polymeroberfläche, von Faktoren wie z. B. funktionellen Gruppen, Oberflächenrauhigkeit, Verunreinigung und Oberflächenbeweglichkeit abhängig. TABELLE 1

Quelle: Polymer Handbook, 3. Aufl., J. Brandrup, E.H. Immergut, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., S. VI 411–VI 426, 1989). Die Werte wurden bei 20°C bestimmt.

Ein Verfahren zum Vergleich der Hydrophobie einer nichtporösen festen Oberfläche eines Materials mit der nichtporösen festen Oberfläche eines anderen Materials besteht darin, das Material horizontal auszurichten und ein Tröpfchen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des Materials aufzubringen. Der Winkel, den der Rand des Wassertröpfchens mit der Oberfläche bildet, ist der Ausbreitungskontaktwinkel oder einfach der "Kontaktwinkel". Für die meisten hydrophoben Materialien ist der Kontaktwinkel größer als 90°. Zum Beispiel beträgt der Kontaktwinkel von Wasser auf Poly(tetrafluorethylen) etwa 120°. Für die meisten hydrophilen Materialien ist der Kontaktwinkel kleiner als etwa 30°. Zum Beispiel beträgt der Kontaktwinkel von Wasser auf Poly(hydroxyethylmethacrylat) etwa 15°. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Feststoffe, die mit einer oder mehreren Schichten aus hydrophilen Polymeren modifiziert worden sind, als stärker hydrophil gemacht angesehen, wenn der Kontaktwinkel um 10° oder mehr abnimmt. Ein bevorzugtes Ergebnis wäre ein resultierender Kontaktwinkel von weniger als 30°.
Für poröse Materialien besteht ein einfacher Test zum Vergleich der Benetzbarkeit eines Materials mit einem anderen darin, das Material horizontal anzuordnen und ein Tröpfchen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des Materials aufzubringen. Bei den meisten hydrophoben porösen Materialien bleibt das Wassertröpfchen auf der Oberfläche. Bei den meisten hydrophilen porösen Materialien dringt das Wassertröpfchen sofort in die Poren der Probe ein. Die Fasern oder Polymerstränge, welche die Seiten der Poren bilden, wirken als hydrophile Oberflächen, auf denen sich das Wasser ausbreitet. Die Poren ziehen das Wassertröpfchen durch Kapillarwirkung an. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden poröse Materialien, die innerhalb 1 Sekunde nach Einwirkung eines Wassertröpfchens benetzt werden, als hydrophil angesehen. Poröse Materialien, die nicht spontan benetzt werden, d. h. die mehr als 1 Sekunde zum Benetzen benötigen oder mechanische Bewegung zum gründlichen Benetzen erfordern, werden als hydrophob angesehen.
Bekannt ist die Behandlung von nicht biologisch abbaubaren Materialien, wie zum Beispiel Polytetrafluorethylen, mit Tensiden oder anderen hydrophilen Polymeren, um die Oberflächen dieser Materialien stärker hydrophil und oft mit flüssigem Wasser benetzbar zu machen. Eine derartige Oberflächenbehandlung ist jedoch in Anbetracht der Tatsache, daß das Tensid im Gebrauch leicht aus dem hydrophoben Material ausgelaugt wird, oft instabil. Eine stabilere Tensidbeschichtung kann auf hydrophoben Materialien hergestellt werden, indem die Tensidkomponenten auf dem Material miteinander vernetzt werden (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4113912, erteilt an Okita).
Eine stabile Beschichtung aus einem hydrophilen Material auf einem hydrophoben biologisch abbaubaren Material wäre jedoch nicht wünschenswert, da das vernetzte hydrophile Material in einem Empfänger nach dem Abbau und der Ausscheidung des biologisch abbaubaren Materials, auf das es ursprünglich aufgebracht wurde, aus dem Körper des Empfängers höchstwahrscheinlich intakt bleiben würde. Zum Beispiel ist von Mooney et al. (Mooney, D.J., Park, S., Kaufmann, P.M., Sano, K., McNamara, K., Vacanti, J.P., Langer, R., "Biodegradable sponges for hepatocyte transplantation" (Biologisch abbaubare Schwämme für Leberzellentransplantation), J. Biomed. Mat. Res., 29:959–965 (1995)) ein Verfahren beschrieben worden, um biologisch abbaubare Polymere benetzbarer zu machen. Poröse Schwämme, die aus Poly(L-milchsäure) (PLA) bestanden, wurden durch Zusatz des Tensids Poly(vinylalkohol) (PVA) auf die Innenflächen der porösen PLA-Schwämme stärker hydrophil gemacht. Der Zusatz von PVA erhöhte die Benetzbarkeit des Polymerschwamms und führte zu einer vollständigeren Infiltration und einer extensiveren Beimpfung des Schwamms mit Leberzellen als bei unbehandelten Schwämmen. Mooney et al. beschrieben auch die Verwendung von im Handel erhältlichen PVA-Schwämmen als Zelltransplantationselementen, aber dieses Verfahren wurde wegen der nicht abbaubaren Natur des kovalent gebundenen PVA als ungeeignet verworfen. Verfahren zur reversiblen Vernetzung oder auf andere Weise vorübergehenden Stabilisierung der PVA-Beschichtung auf dem PLA-Schwamm wurden nicht beschrieben.
Die Hydrophobie von biologisch abbaubaren Polymeren stellt auch ein Problem dar, wenn man eine bioaktive Spezies auf der Oberfläche eines biologisch abbaubaren Materials immobilisieren möchte, statt die bioaktive Spezies in das biologisch abbaubare Material einzubauen. Bei dem einfachsten Verfahren wird z. B. eine bioaktive Spezies auf der Oberfläche eines biologisch abbaubaren Polymers mittels einfacher physikochemischer Adsorption (Physisorption) immobilisiert. Die Physisorption von bioaktiven Spezies ist jedoch oft kinetisch und thermodynamisch instabil, hochgradig reversibel, und wird durch Reaktanten, Produkte oder Nährstoffe in der Lösungsphase kompetitiv verdrängt. Daher ist die Physisorption von bioaktiven Spezies an biologisch abbaubaren Materialien gewöhnlich kein geeignetes Immobilisierungsverfahren.
Der Begriff "immobilisieren" und seine Ableitungen, wie sie hier gebraucht werden, bezeichnen die Anlagerung einer bioaktiven Spezies direkt an ein biologisch abbaubares Trägerelement oder über mindestens eine Zwischenkomponente an ein biologisch abbaubares Trägerelement. Der Begriff "anlagern" und seine Ableitungen bezeichnen eine Adsorption, wie z. B. Physisorption oder Chemisorption, Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung, kovalente Bindung, Wasserstoffbindung oder Ionenbindung einer polymeren Substanz oder einer bioaktiven Spezies an ein biologisch abbaubares Trägerelement.
"Bioaktive Spezies" sind beispielsweise Enzyme, organische Katalysatoren, Ribozyme, metallorganische Verbindungen, Proteine, Glycoproteine, Peptide, Polyaminosäuren, Antikörper, Nucleinsäuren, Steroidmoleküle, Antibiotika, Antimykotika, Zytokine, Kohlenhydrate, oleophobe Substanzen, Lipide, Interzellularmatrix und/oder ihre einzelnen Komponenten, Pharmazeutika und Therapeutika. Zellen, wie z. B. Säugetierzellen, Reptilienzellen, Amphibienzellen, Vogelzellen, Insektenzellen, Planktonzellen, Zellen von nicht säugetierartigen marinen Wirbeltieren und Wirbellosen, Pflanzenzellen, Mikrobenzellen, Einzeller, gentechnisch veränderte Zellen, und Organellen, wie z. B. Mitochondrien, sind gleichfalls bioaktive Spezies. Außerdem werden nichtzelluläre biologische Gebilde, wie z. B. Viren, Virinos und Prionen, als bioaktive Spezies angesehen.
Bioaktive Spezies könnten an ein hydrophobes biologisch abbaubares Polymer durch chemisch funktionelle Gruppen an den Komponenten des Polymers angelagert werden. Viele biologisch abbaubare Polymeren weisen jedoch überhaupt keine oder so wenige freie chemisch funktionelle Gruppen auf, daß daran keine siginifikanten Mengen von bioaktiven Spezies immobilisiert werden können. Zum Beispiel enthalten die biologisch abbaubaren Polymere Polymilchsäure) und Poly(glycolsäure) gar keine chemisch funktionellen Gruppen entlang der Kohlenwasserstoffhauptkette der Materialien, an die bioaktive Spezies kovalent gebunden werden können. Eine Strategie, die zum Einbau funktioneller Gruppen in Polymilchsäure) vorgeschlagen wurde, ist die Copolymerisation von Lactid mit einem cyclischen Monomer von Milchsäure und der Aminosäure Lysin, um Poly(milchsäure-co-lysin) zu erzeugen (siehe US-Patent Nr. 5399665, erteilt an Barrera et al.). Dieses Copolymer stellt Seitenketten bereit, die in Aminogruppen (NH₂) enden. Diese Aminogruppen können als Anlagerungsstellen für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies verwendet werden. Da dieses Verfahren das Polymer chemisch verändert, unterliegen viele Eigenschaften des Polymers einer Änderung. Zum Beispiel können die Abbaurate und die Zugfestigkeit durch die Veränderung des Polymers beeinflußt werden. Die Verarbeitung des Polymers kann durch Veränderung der Kohlenwasserstoffhauptkette des Polymers gleichfalls beeinflußt werden.
Prisell et al. haben in US-Patent Nr. 5740829 versucht, Proteine auf der Oberfläche eines biologisch abbaubaren Materials zu immobilisieren, indem das Protein zunächst auf dem biologisch abbaubaren Material physisorbiert wurde und anschließend die Proteine auf der Oberfläche miteinander vernetzt wurden. Bei dem Verfahren wurden Proteine, wie z. B. morphogenetisches Knochenprotein (BMP) oder der Rezeptor für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF-1-Rezeptor), auf biologisch abbaubaren Polymeren adsorbiert, wie z. B. Poly(glycolsäure) (PGA) oder Poly(milchsäure) (PLA), und unter Verwendung von Imidocarbonaten, Carbonaten, Oxiranen, Aziridin, aktivierten Doppelbindungen oder Halogenen an Ort und Stelle vernetzt. Dieses Verfahren führt jedoch oft zu einer sehr ineffizienten Immobilisierung. Außerdem weisen die vernetzten bioaktiven Spezies häufig eine deutliche Abnahme der Bioaktivität auf. Folglich ist dieses Verfahren gewöhnlich für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf einem biologisch abbaubaren Trägerelement ungeeignet.
Stabile Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf einem hydrophoben Trägerelement, wie z. B. porösem Polytetrafluorethylen, wird von Drumheller in der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/660698, eingereicht am 3. Juni 1996, gelehrt. Bei diesem Verfahren werden unter anderem hydrophobe Oberflächen hydrophil und mit flüssigem Wasser benetzbar gemacht, indem ein Tensidmaterial an die hydrophobe Oberfläche angelagert und vernetzt wird, wodurch eine erste Schicht darauf ausgebildet wird. Weitere Schichten aus hydrophilben Polymeren werden an die erste Schicht angelagert, um die Anzahl der chemisch funktionellen Gruppen zu vergrößern, die für die anschließende Immobilisierung von bioaktiven Spezies darauf verfügbar sind. Es wäre nicht wünschenswert, eine bioaktive Spezies auf einem implantierbaren biologisch abbaubaren Material gemäß dem Verfahren von Drumheller stabil zu immobilisieren, da die bioaktive Spezies und ihr Immobilisierungsgerüst sehr häufig in einem Empfänger intakt bleiben, nachdem der biologisch abbaubare Träger, auf dem sie aufgebracht wird, abgebaut und aus dem Körper des Empfängers entfernt worden ist.
Brauchbar wäre ein normalerweise hydrophobes biologisch abbaubares Material mit Oberflächen, die mit einem hydrophilen Material, das zunächst auf der Oberfläche des biologisch abbaubaren Materials stabil ist, aber nach der Implantation in einem Empfänger selbst abgebaut wird, stärker hydrophil gemacht werden. Ein derartiges Material mit darauf immobilisierten bioaktiven Spezies wäre gleichfalls brauchbar. Idealerweise wären Konstrukte, die verwendet werden, um hydrophobe biologisch abbaubare Materialien hydrophil und für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies darauf zugänglich zu machen, von transitorischer Natur und würden im Körper eines Empfängers nicht länger intakt bleiben als das biologisch abbaubare Material. Es besteht daher ein Bedarf für ein biologisch abbaubares Material mit hydrophoben Oberflächen, die mit hydrophilen polymeren Materialien, die biologisch abbaubar sind und auf denen bioaktive Spezies leicht immobilisiert werden können, stärker hydrophil gemacht werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein biologisch abbaubares Material zur Immobilisierung von bioaktiven Spezies darauf bereitgestellt, wobei das Material aufweist:
ein poröses hydrophobes biologisch abbaubares Trägerelement;
eine erste Schicht, die aus mindestens einer Spezies eines Polymertensids besteht, das an dem Trägerelement adsorbiert und darauf mit einem Vernetzungsmittel vernetzt wird,
wobei die vernetzte erste Schicht chemische Bindungen aufweist, die unter In-vivo-Bedingungen abgebaut werden,
wobei sich das Polymertensid von dem porösen hydrophoben biologisch abbaubaren Trägerelement chemisch unterscheidet,
wobei sich das Vernetzungsmittel von dem Trägerelement und dem Polymertensid chemisch unterscheidet, und
wobei die erste Schicht chemisch reaktionsfähige Gruppen zur Anlagerung mindestens einer bioaktiven Spezies daran aufweist.
Nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Materials zur Immobilisierung bioaktiver Spezies darauf bereitgestellt, wobei das Verfahren aufweist:
Bereitstellen eines porösen hydrophoben biologisch abbaubaren Trägerelements;
Adsorbieren einer ersten Schicht, die aus mindestens einem Polymertensidtyp besteht, an dem Trägerelement, wobei das Polymertensid sich von dem Trägerelement chemisch unterscheidet; und
Vernetzen des Polymertensids mit sich selbst mittels chemischer Bindungen, die in einem Empfänger abgebaut werden.
Die vorliegende Erfindung ist auf hydrophobe biologisch abbaubare Polymermaterialien oder Trägerelemente gerichtet, bei denen zumindest ein Teil mindestens einer Oberfläche durch Anlagern mindestens einer Schicht eines hydrophilen Polymers stärker hydrophil gemacht wird. Die erste hydrophile Polymerschicht wird mit einem biologisch abbaubaren Vernetzungsmittel oder mit einem Vernetzungsschema von transienter bzw. vorübergehender und nichtkovalenter Natur vernetzt. Bioaktive Spezies werden an chemisch funktionellen Gruppen der ersten hydrophilen Polymerschicht oder an nicht in Reaktion getretenen chemisch funktionellen Gruppen des bei der Bildung der ersten Schicht verwendeten Vernetzungsmittels immobilisiert. In einer Ausführungsform kann die bioaktive Spezies durch abbaubare chemisch funktionelle Bindungen reversibel immobilisiert werden. Wahlweise können weitere Schichten von hydrophilen Polymeren an die erste hydrophile Polymerschicht angelagert und bioaktive Spezies auf mindestens einer der zusätzlichen Schichten immobilisiert werden. Das Ergebnis ist eine implantierbare Konstruktion mit immobilisierten bioaktiven Spezies, die Strukturelemente aufweist, die alle im Körper eines Empfängers abgebaut werden.
Der biologische Abbau der erfindungsgemäßen Strukturelemente erfolgt durch enzymatische Spaltung oder nichtenzymatische Hydrolyse der vernetzenden Verbindungen oder durch Umkehr der nichtkovalenten Bindungen des Vernetzungsmittels in einen unvernetzten Zustand. Wahlweise können auch die Komponenten des hydrophilen Polymers biologisch abbaubar sein. Vorzugsweise können die biologischen Abbauprodukte durch normale physiologische Prozesse ausgeschieden werden, wie z. B. durch Ausscheidung in den Nieren oder der Lunge oder durch Abbaustoffwechsel in der Leber.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Polymertensid an ein Trägerelement angelagert, das aus einem biologisch abbaubaren Material besteht. Das Tensid wird mit einem Vernetzungsmittel vernetzt, das spaltbare kovalente Bindungen zwischen den Tensidpolymeren bildet, wodurch eine erste Schicht auf dem Trägerelement gebildet wird. Alternativ wird das Tensid unter Verwendung von transienten nichtkovalenten Vernetzungsschemata auf dem Trägerelement vernetzt, um darauf eine erste Schicht zu bilden. Anschließend an die Vernetzung ist die erste Schicht zunächst physikalisch und chemisch stabil. Die erste Schicht macht die hydrophobe Oberfläche eines biologisch abbaubaren Trägerelements stärker hydrophil. Bioaktive Spezies werden mittels der chemisch funktionellen Gruppen des Tensidpolymers der ersten Schicht (siehe 1) oder durch nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels (siehe 2) immobilisiert. Unter In-vivo-Bedingungen werden sowohl die erste Schicht als auch das biologisch abbaubare Trägerelement abgebaut und/oder ausgeschieden.
Wahlweise können zusätzliche Schichten aus hydrophilem Material, das aus mindestens einem hydrophilen Polymertyp besteht, an die erste Schicht angelagert werden, und bioaktive Spezies können auf mindestens einer der Schichten immobilisiert werden. Die hydrophilen Polymere der zusätzlichen Schichten können durch chemisch funktionelle Gruppen des Tensidpolymers oder durch nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels an die erste Schicht angelagert werden. Bioaktive Spezies werden durch chemisch funktionelle Gruppen an den Polymeren auf mindestens einer der zusätzlichen hydrophilen Polymerschichten immobilisiert (Siehe 3). Außer als Substrat für die Immobilisierung einer bioaktiven Spezies zu dienen, können zusätzliche hydrophile Polymerschichten zur Verstärkung der hydrophilen Eigenschaften der Konstruktion und/oder als durchlässige Schutzabdeckung für die bioaktiven Spezies dienen.
Wie aus 1 erkennbar, ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (10) auf ein biologisch abbaubares Material mit immobilisierten bioaktiven Spezies gerichtet, das aufweist: ein biologisch abbaubares Trägerelement (12); eine erste Schicht (14), die aus mindestens einer Art eines Polymertensids besteht, das an dem Trägerelement adsorbiert und mit einem Vernetzungsmittel vernetzt ist, das spaltbare kovalente Bindungen in der ersten Schicht bildet; und mindestens einen Typ einer bioaktiven Spezies (16), die an die erste Schicht angelagert ist. Alternativ kann das Polymertensid durch ein reversibles, nichtkovalentes Vernetzungsschema vernetzt werden.
Die vorliegende Erfindung findet zwar breite Anwendung, eignet sich aber besonders für die transiente bzw. vorübergehende Immobilisierung von insulinabscheidenden Pankreasinselzellen oder gentechnisch veränderten insulinabscheidenden Zellen. Die transiente Immobilisierung solcher Zellen kann nützlich sein, um die Transplantation oder Implantation der Zellen in einen Empfänger als Mittel zur Behandlung oder Verbesserung von Diabetes mellitus zu erleichtern. Die vorliegende Erfindung eignet sich auch für die transiente Immobilisierung von Nierenepithel- oder -interstitialzellen zur Verwendung bei der Therapie von Nierenversagen. Weitere Anwendungen sind unter anderem die kontrollierte Freisetzung von immobilisierten bioaktiven Spezies, beispielsweise einschließlich, aber nicht beschränkt auf gerinnungshemmende Faktoren, wie z. B. Heparin, Heparansulfat, tPA, Protein S, Urokinase und Protein C usw., auf einen synthetischen Gefäßersatz, einer Gefäßprothese oder Gefäßprothese/-ersatz zur Verbesserung der Gefäßdurchgängigkeit; und die Immobilisierung von Prokoagulatorfaktoren, wie z. B. Gewebefaktor, von Willebrand-Faktor, Faktor XIII, Kininogen und Thrombin usw., an chirurgischen Nähten, chirurgischen Netzmaterialien oder anastomotischen Schlingen. Die vorliegende Erfindung eignet sich außerdem für die transiente Immobilisierung von adhäsionsabhängigen oder adhäsionsunabhängigen Zelllinien, die gentechnisch veränderte Zellen zur Verwendung in der genetischen Therapie aufweisen; die transiente Immobilisierung von adhäsionsabhängigen oder adhäsionsunabhängigen Zelllinien zur Verwendung in der Transplantationstherapie; die transiente Immobilisierung von proadhäsiven Liganden, wie zum Beispiel des Tripeptids Arg-Gly-Asp, von Kollagenen und Fibronectin, zum Beispiel um die Adhäsion, Ausbreitung und/oder Migration von zellulären bioaktiven Spezies zu fördern; die transiente Immobilisierung von morphogenetischem Knochenprotein und anderen Morphogenen oder Wachstumsfaktoren, zum Beispiel um die Proliferation oder Differenzierung von zellulären bioaktiven Spezies zu fördern; die transiente Immobilisierung von antiadhäsiven Liganden, wie z. B. Dextran, Albumin und Polyethylenglycol, zum Beispiel um die unspezifische zelluläre Adhäsion an biologisch abbaubaren Materialien zu reduzieren, wie etwa an chirurgischen Nähten, chirurgischen Netzen und anastomotischen Schlingen; die transiente Immobilisierung von antimikrobiellen Mitteln, um gerätegebundene Infektionen zu verhindern; und die transiente Immobilisierung von Bakterien oder Hefezellen zur Verwendung in der biologischen Sanierung und der Biotechnologie. Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für die transiente Immobilisierung von Stroma- und/oder Parenchymzellen für die geführte Geweberegeneration von Organen und Geweben wie zum Beispiel Leber, Haut, Zahnfleisch, Knorpel, Knochen, Zahnwurzelhaut, Blutgefäßen, Luftröhre, Speiseröhre, Nerven, Harnleiter und Darm. Außer der transienten Immobilisierung von bioaktiven Spezies eignet sich die vorliegende Erfindung zur Verwendung als temporäres Gerüst für die Zelltransplantation.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber gegenwärtig verfügbaren Materialien ist die Fähigkeit zur Anlagerung von pharmazeutischen Mitteln an ein biologisch abbaubares Trägerelement, um für eine lokale oder systemische Abgabe von Medikamenten zu sorgen oder um beispielsweise eine bakterielle Infektion oder Entzündung zu bekämpfen. Die Anlagerung von Pharmazeutika durch spaltbare chemische Immobilisierungsverbindungen ermöglicht die kontrollierte Freisetzung des Pharmazeutikums und anschließenden Abbau und Entfernung der übrigen Komponenten der vorliegenden Erfindung aus dem Empfänger, ohne daß ein chirurgischer Eingriff nötig ist.
Die vorliegende Erfindung ist verwendbar bei der Gestaltung eines implantierbaren künstlichen Hybridorgans als eines temporären Gerüsts für Zellen. Die vorliegende Erfindung ist auch bei extrakorporalen organunterstützenden Geräten als physischen Trägern für Zellen anwendbar. In diesen Systemen stellt das erfindungsgemäße Material, während die Zellen reifen und auf die Bedürfnisse des Körpers reagieren, zunächst einfach einen physischen Träger bereit. Im Lauf der Zeit zersetzt sich der Polymerträger, und die Zellen synthetisieren extrazelluläre Matrixproteine. Die Zellen ersetzen das biologisch abbaubare Trägerelement durch extrazelluläre Matrixproteine, die dann als ihr darunterliegender physischer Träger dienen.
Die vorliegende Erfindung zielt außerdem auf Verfahren ab, um die Oberflächen eines hydrophoben biologisch abbaubaren Materials hydrophil zu machen, indem die Oberflächenenergie dieser Materialien erhöht wird, um die Benetzung und Ausbreitung von Fluiden mit hoher Oberflächenspannung auf den Oberflächen zu unterstützen. Die vorliegende Erfindung richtet sich außerdem auf Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von bioaktiven Spezies an den hydrophilen Oberflächen, die auf dem biologisch abbaubaren Material gebildet werden.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Erhaltung der mechanischen Eigenschaften des darunterliegenden Trägers. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Bereitstellung funktioneller Gruppen für die spätere Anlagerung von bioaktiven Spezies (z. B. Barrera, US-Patent Nr. 5399665) bewirkt die vorliegende Erfindung keine Veränderung der Molekülketten des Trägerpolymers, die zu einer Verringerung der mechanischen Integrität führen kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (10) mit einer Schicht (14), die an einem Trägerelement (12) adsorbiert ist, wobei bioaktive Spezies (16) direkt an chemisch funktionellen Gruppen der ersten Schicht immobilisiert sind. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind.
2 zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (20) mit einer ersten Schicht (24), die an einem Trägerelement (22) adsorbiert ist, wobei der Buchstabe "x" anzeigt, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind, und wobei das Symbol "O" (26) nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen anzeigt, an die bioaktive Spezies (28) angelagert sind.
3 zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (30) mit einer ersten Schicht (34), die an einem Trägerelement (32) adsorbiert ist, wobei eine zweite Schicht (38) aus hydrophilen Polymeren an die erste Schicht angelagert ist und an der zweiten Schicht bioaktive Spezies (39) immobilisiert sind. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind, und das Symbol "O" (36) zeigt überschüssige chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels an, an denen die zweite Schicht angelagert ist.
4a zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (40) mit einer ersten Schicht (44), die an einem Trägerelement (42) adsorbiert ist, wobei zwischen der ersten Schicht und einer bioaktiven Spezies (49) eine Abstands- bzw. Spacer-Verbindung (48) eingefügt ist. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind. Das Symbol "O" stellt überschüssige chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels dar, über welche die Spacer-Verbindung angelagert ist.
4b zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (40) mit einer ersten Schicht (44), die an einem Trägerelement (42) adsorbiert ist, wobei zwischen der ersten Schicht und einer bioaktiven Spezies (49) eine Spacer-Verbindung (48) eingefügt ist. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind. Die Spacer-Verbindung ist über chemisch funktionelle Gruppen der ersten Schicht an die erste Schicht angelagert.
4c zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (40) mit einer ersten Schicht (44), die an einem Trägerelement (42) adsorbiert ist, wobei eine zweite Schicht (46) aus hydrophilen Polymeren durch überschüssige chemisch funktionelle Gruppen, die durch das Symbol "O" dargestellt werden, an die erste Schicht angelagert ist. An die zweite Schicht ist eine Spacer-Verbindung (48) angelagert, und an die Spacer-Verbindung ist eine bioaktive Spezies (49) angelagert.
5 zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (50), wobei eine erste Schicht (54) so an einem Trägerelement (52) adsorbiert ist, daß die Anzahl chemisch funktioneller Gruppen, die aus der ersten Schicht für die Immobilisierung einer bioaktiven Spezies (51) verfügbar sind, durch Hinzufügen einer zweiten Schicht (58) erhöht wird. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind. Das Symbol "O" (56) stellt überschüssige chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels dar. Das Symbol "-A" in dem Bereich, der die erste Schicht abbildet, zeigt chemisch funktionelle Gruppen der Bestandteile der ersten Schicht an, die während der Bildung der ersten Schicht verbraucht worden sind und nicht mehr für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies verfügbar sind. Der Buchstabe "A" (59) auf der zweiten Schicht stellt nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen der Bestandteile der zweiten Schicht dar, die für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies oder die Anlagerung von weiteren Schichten aus hydrophilen Materialien verfügbar sind.
6 zeigt eine Schnittdarstellung der vorliegenden Erfindung (60) mit einer ersten Schicht (62), die an einem Trägerelement (61) adsorbiert ist, wobei an die erste Schicht eine zweite Schicht (64) angelagert ist. Der Buchstabe "x" zeigt an, daß die Bestandteile der ersten Schicht miteinander vernetzt sind, und das Symbol "O" (63) zeigt überschüssige chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels an, an die eine zweite Schicht (64) angelagert ist. An die zweite schickt ist eine zusätzliche Schicht (66) aus hydrophilen Polymeren angelagert, wobei an der zusätzlichen Schicht bioaktive Spezies (68) immobilisiert sind. Die Anlagerung der zusätzlichen Schicht aus hydrophilen Polymeren an die zweite Schicht ist durch mehrere senkrechte Linien dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie im Abschnitt "Technischer Hintergrund" beschrieben, sind ältere Verfahren zur Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf Trägerelementen problematisch, die aus Materialien auf der Basis von hydrophoben biologisch abbaubaren Polymeren bestehen. Die vorliegende Erfindung löst die oben beschriebenen Probleme mit einer Konstruktion, die eine hydrophile Polymerschicht oder erste Schicht für ein biologisch abbaubares Trägerelement bereitstellt, die zunächst stabil ist. Die erste Schicht ist unter In-vivo-Bedingungen zusammen mit dem Trägerelement einem biologischen Abbau ausgesetzt. Indem die hydrophilen Polymere mit einem geeigneten Vernetzungsmittel miteinander vernetzt werden, wird der ersten Schicht Stabilität verliehen. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein geeignetes kovalentes Vernetzungsmittel ein Mittel, das kovalente Bindungen zwischen den hydrophilen Polymeren der ersten Schicht bildet, die unter In-vivo-Bedingungen oder unter Bedingungen, die eine In-vivo-Umgebung simulieren, spaltbar sind. Alternativ wird eine nichtkovalente Vernetzung der hydrophilen Polymere durch Herbeiführen transienter nichtkovalenter Vernetzungen unter Anwendung von Verfahren wie z. B. Komplexbildung, Koazervierung und Wasserstoffbindung erreicht. Dann werden bioaktive Spezies durch chemisch funktionelle Gruppen der hydrophilen Polymerschicht oder durch nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels an der ersten Schicht immobilisiert.
Für poröse Trägerelemente, die aus hydrophoben biologisch abbaubaren Materialien auf Polymerbasis bestehen, ermöglicht die vorliegende Erfindung außerdem, bioaktive Spezies leicht auf den Flächen zu immobilisieren, welche die porösen Bereiche des Trägerelements definieren, ohne die Porosität des Trägerelements wesentlich zu reduzieren. Das Ergebnis ist ein biologisch abbaubares Trägerelement, das in seinem gesamten Volumen Flächen aufweist, die hydrophil und durch Fluide mit hoher Oberflächenspannung benetzbar gemacht worden sind und an denen mindestens ein Typ einer bioaktiven Spezies immobilisiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Konstruktion aus den folgenden Komponenten zusammengesetzt: einem Trägerelement, das aus einem biologisch abbaubaren Polymermaterial besteht; einer ersten Schicht, die sich aus mindestens einer Art eines Polymertensids oder eines multifunktionellen Copolymers zusammensetzt, das aus mindestens einem Bereich, der eine physikochemische Affinität zu dem Trägerelement aufweist, um eine physikochemische Adsorption des Polymers an der Oberfläche des Trägerelements zu ermöglichen, und mindestens einem weiteren Bereich besteht, der chemisch reaktionsfähig ist, um eine kovalente Vernetzung mit einem geeigneten Vernetzungsmittel zu ermöglichen; einem geeigneten Vernetzungsmittel und einer bioaktiven Spezies. Alternativ wird eine Vernetzung durch die oben aufgeführten nichtkovalenten Mittel erreicht.
Wahlweise können weitere Schichten aus hydrophilem Material an die erste Schicht angelagert werden. Vorzugsweise besteht das hydrophile Material aus einem oder mehreren hydrophilen Tensiden, Homopolymeren oder Copolymeren, die chemisch funktionelle Gruppen enthalten, die mit nicht in Reaktion getretenen Vernetzungsgruppen aus der ersten Schicht reagieren können. Außerdem wird bevorzugt, daß das hydrophile Material zusätzliche chemisch funktionelle Gruppen aufweist, um eine erhöhte Hydrophilie für die Konstruktion und für eine wahlweise Anlagerung von bioaktiven Spezies daran bereitzustellen.
Geeignete Materialien für ein hydrophobes polymeres biologisch abbaubares Trägerelement schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyglycolid (PGA), Glycolid-Copolymere, Glycolid/L-Lactid-Copolymere (PGA/PLLA), Lactid/Trimethylencarbonat-Copolymere (PLA/TMC), Glycolid/Trimethylencarbonat-Copolymere (PGA/TMC), Polylactide (PLA), PLA-Stereo-Copolymere, Poly-L-Lactid (PLLA), Poly-DL-lactid (PDLLA), L-Lactid/DL-Lactid-Copolymere, PLA-Copolymere, Lactid/Tetramethylglycolid-Copolymere, Lactid/α-Valerolacton-Copolymere, Lactid/ε-Caprolacton-Copolymere, Hyaluronsäure und ihre Derivate, Polydepsipeptide, PLA/Polyethylenoxid-Copolymere, asymmetrische 3,6-substituierte Poly-1,4-dioxan-2,5-dione, Poly-β-hydroxybutyrat (PHBA), PHBA/β-Hydroxyvalerat-Copolymere (PHBA/HVA), Poly-p-dioxanon (PDS), Poly-α-valerolacton, Poly-ε-caprolacton, Methylmethacrylat-N-Vinylpynolidon-Copolymere, Polyesteramide, Oxalsäure-Polyester, Polydihydropyrane, Polyalkyl-2-cyanoacrylate, Polyurethane, Polyvinylalkohol, Polypeptide, Poly-β-hydroxybernsteinsäure (PMLA), Poly-β-alkansäuren, Polybutylenoxalat, Polyethylenadipat, Polyethylencarbonat, Polybutylencarbonat und andere Polyester, die Silylether, Acetale oder Ketale enthalten, Alginate und Gemische oder andere Kombinationen der oben erwähnten Polymere. Außer den oben erwähnten Polymeren mit aliphatischer Bindung können auch andere aliphatische Polyester für die Herstellung von aromatischen/aliphatischen Polyester-Copolymeren geeignet sein. Dazu gehören aliphatische Polyester, die aus der Gruppe von Oxalaten, Malonaten, Succinaten, Glutaraten, Adipaten, Pimelaten, Suberaten, Azelaten, Sebacaten, Nonandioaten, Glycolaten und deren Gemischen ausgewählt sind. Diese Materialien sind von besonderem Interesse als biologisch abbaubare Trägermembranen in Anwendungen, die einen temporären Träger bei einer Gewebe- oder Organregeneration erfordern. Ein bevorzugtes Material für die Verwendung als biologisch abbaubares Trägerelement ist Poly(glycolsäure).
Zum Aufbau der vorliegenden Erfindung wird eine erste Schicht auf einem Trägerelement durch Adsorption eines Polymertensids an den Oberflächen des Trägerelements und anschließende Vernetzung des Tensids mit sich selbst ausgebildet. Für ein poröses Trägerelement wird die erste Schicht wahlweise an einem Material adsorbiert, das auch die Porenräume des Trägerelements definiert. Zum Beispiel wird eine Lösung eines Polymertensids, wie z. B. Poly(vinylalkohol), in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Konzentration von etwa 0,001% bis etwa 99,9%, vorzugsweise etwa 0,01% bis etwa 50%, stärker bevorzugt von etwa 1,0% bis etwa 25%, und am stärksten bevorzugt von etwa 0,25% bis etwa 5% hergestellt und zunächst an den Oberflächen und wahlweise in den Porenräumen eines porösen Trägerelements adsorbiert, indem das Trägerelement einfach etwa 0,05 Minuten bis etwa 20 Minuten in die Lösung eingetaucht wird, um eine Physisorption des Tensids an den Oberflächen des Trägerelements zu ermöglichen. Geeignete Materialien für die erste Schicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Dextran, Agarose, Alginat, Polyacrylamid, Polyglycidol, Polyvinylalkohol-co-polyethylen, Poly(asparaginsäure), Poly(ethylenglycol-co-propylenglycol), Poly(vinylacetat-co-vinylalkohol), Polyacrylsäure, Poly(β-hydroxybernsteinsäure), Polyamid, Polylysin, Polyethylenimin, Polyvinylpyrrolidon und Polysaccharide oder ihre Copolymere, entweder allein oder in Kombination. Vorzugsweise enthält das Polymer, das die erste Schicht bildet, chemisch funktionelle Seitengruppen an jeder Monomereinheit und ist durch Hydrolyse oder enzymatische Spaltung der Polymerhauptkette biologisch abbaubar. Wenn das Polymer, das die erste Schicht bildet, nicht durch Hydrolyse oder durch enzymatische Spaltung in vivo biologisch abbaubar ist, aber ein Molekulargewicht von weniger als etwa 70000 g/mol, vorzugsweise von weniger als etwa 45000 g/mol, stärker bevorzugt von weniger als etwa 10000 g/mol aufweist und durch Vernetzungen gebunden wird, die reversibel oder biologisch abbaubar ist, dann können diese Komponenten der ersten Schicht gewöhnlich über die Nieren aus dem Körper des Empfängers ausgeschieden werden (Park, K., Shalaby, W.S.W., Park, H., Hrsg., Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery (Biologisch abbaubare Hydrogele zur Medikamentenabgabe), Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, S. 236–237 (1993)).
Wenn Copolymere zur Bildung der ersten Schicht verwendet werden, dann sind bevorzugte Copolymere zur Bildung der ersten Schicht Copolymere, die aus mindestens einer Komponente, die physikochemisch an dem Trägerelement adsorbiert werden kann, einer Komponente, die mit einem geeigneten Mittel chemisch modifiziert werden kann, und einer Komponente bestehen, die in Wechselwirkung mit Fluiden mit hoher Oberflächenspannung treten kann. Diese Komponenten können so gewählt werden, daß eine Komponente alle diese Funktionen gleichzeitig ausübt, zwei Funktionen ausübt oder nur eine Funktion ausübt.
Geeignete Lösungsmittel für die hydrophilen Polymere der ersten Schicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methanol, Ethanol, Isopropanol, Tetrahydrofuran, Trifluoressigsäure, Aceton, Wasser, Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Benzol, Hexan, Chloroform, Methylenchlorid, superkritisches Kohlendioxid oder andere Verbindungen, welche die erste Schicht anlösen.
Wenn das für die erste Schicht ausgewählte Polymer sich nur in Lösungsmitteln mit hoher Oberflächenspannung löst, sollte das biologisch abbaubare Trägerelement mit einem mischbaren Lösungsmittel mit niedriger Oberflächenspannung vorbenetzt werden, um eine Adsorption des Polymers für die erste Schicht zu bewirken. Für poröse biologisch abbaubare Trägerelemente kann überschüssiges adsorbiertes Tensid von der Oberfläche des Trägerelements mit frischem Lösungsmittel abgespült werden, um zu verhindern, daß in der Masse abgeschiedenes Tensid Poren des Trägerelements teilweise verstopft. Dieser Schritt ist zwar wahlfrei, wird aber bevorzugt, um sicherzustellen, daß die Poren eines porösen biologisch abbaubaren Trägerelements nicht mit Tensid verstopft werden.
Das Polymertensid der ersten Schicht wird unter Verwendung eines geeigneten Vernetzungsmittels mit sich selbst vernetzt, um oberflächengebundene ebene Moleküle von extrem hohem Molekulargewicht zu erzeugen. Diese Moleküle mit sehr hohem Molekulargewicht dienen dazu, die Möglichkeit einer Desorption oder Migration des Tensids stark zu reduzieren oder zu beseitigen. Das vernetzte Polymertensid bildet zunächst eine stabile Materialschicht, an der später bioaktive Spezies immobilisiert werden. Ein Schlüsselmerkmal der vorliegenden Erfindung ist die biologische Abbaufähigkeit der vernetzten ersten Schicht.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polymertensid mit kovalenten Bindungen vernetzt wird, müssen die kovalenten Bindungen unter geeigneten Bedingungen spaltbar sein, um biologisch abbaubar zu sein. Zu diesen Bedingungen gehören In-vivo-Bedingungen, Bedingungen, die In-vivo-Bedingungen simulieren, und die Einwirkung von Enzymen oder anderen hydrolytischen Bedingungen in vitro. Die Vernetzungen, welche die Komponenten der ersten Schicht miteinander verbinden, werden in vivo durch enzymatische oder nichtenzymatische Hydrolyse aufgespalten. Die Vernetzungen müssen aufgespalten werden, damit die erste Schicht durch normale physiologische Prozesse aus dem Körper des Empfängers entfernt werden kann. Die In-vitro-Simulation von In-vivo-Bedingungen kann beispielsweise die ständige Wiederauffüllung einer wäßrigen Umgebung, die Anwendung mechanischer Beanspruchungen, um Belastungssituationen zu simulieren, oder die Verwendung von proteolytischen oder nicht proteolytischen Enzymen beinhalten, um die Aufspaltung der Vernetzungen zu verstärken.
Geeignete Reagenzien zur Bildung von spaltbaren kovalenten Vernetzungen zwischen Polymer-Grundeinheiten oder Struktureinheiten eines Polymertensids, das an ein biologisch abbaubares Trägerelement angelagert ist, sind Verbindungen, die aus mindestens zwei, entweder homofunktionellen oder heterofunktionellen, chemisch funktionellen Gruppen bestehen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Aldehyde, Epoxide, Acylhalogenide, Alkylhalogenide, Isocyanate, Amine, Anhydride, Säuren, Alkohole, Halogenacetale, Arylcarbonate, Thiole, Ester, Imide, Vinyle, Azide, Nitrogruppen, Peroxide, Sulfone und Maleimide, aufgelöst in Lösungsmitteln, welche die adsorbierte Schicht benetzen. Außerdem können als Vernetzungsmittel auch Vinylsulfon, Succinylchlorid, Polyanhydride, Poly(β-hydroxybernsteinsäure), Ethylenglycolbis[succinimidylsuccinat], Succinimidylsuccinat-Polyethylenglycol und Succinimidylsuccinamid-Polyethylenglycol verwendet werden.
Lösungsmittel, die zur Auflösung des Vernetzungsmittels geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Aceton, Wasser, Alkohole, Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Benzol, Acetonitril und Dioxan. Weitere Vernetzungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf freie Radikale, Anionen, Kationen, Plasmabestrahlung, Elektronenbestrahlung und Photonenbestrahlung. Ein bevorzugtes Vernetzungsmittel ist Ethylenglycolbis[succinimidylsuccinat]. Ein bevorzugtes Reaktionsschema zur Immobilisierung von funktionellen Gruppen an einem biologisch abbaubaren Träger ist die Vernetzung von Polylysin mit Ethylenglycolbis[succinimidylsuccinat] zur Bildung von hydrolysierbaren Esterbindungen.
Unabhängig davon, welches Vernetzungsmittel eingesetzt wird, wird das Vernetzungsmittel wahlweise im Überschuß zugesetzt, d. h. in einer solchen Menge, daß eine ausreichende Menge nicht in Reaktion getretener chemisch funktioneller Gruppen des Vernetzungsmittels vorhanden sind, um im Anschluß an den Vernetzungsschritt als Bindungsstellen für die bioaktive Spezies oder eine wahlfreie zweite Schicht aus hydrophilen Polymeren zu dienen. Daher hat das Vernetzungsschema zwei Funktionen. In einer Funktion bildet die Vernetzung oberflächengebundene ebene Moleküle mit extrem hohem Molekulargewicht aus, die kovalente Bindungen aufweisen, welche die Moleküle miteinander verbinden und unter den oben beschriebenen geeigneten Bedingungen spaltbar sind. In einer anderen Funktion liefert die Vernetzung chemisch funktionelle Gruppen, an welche die bioaktive Spezies oder eine wahlfreie zweite Schicht anschließend gebunden wird. Der Vernetzungsgrad kann von etwa 5% bis etwa 100% variieren. Dadurch wird ein Bereich von biologischen Abbauraten für die erste Schicht bereitgestellt.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Polymertensid der ersten Schicht auf einem biologisch abbaubaren Trägerelement mit Methoden vernetzt werden, die keine kovalenten Bindungen zwischen den Komponenten des Polymertensids ausbilden. Zum Beispiel können sich Polymertenside, die zahlreiche Nitrilgruppen enthalten, spontan selbst zu einer stabilen konformen Beschichtung organisieren, wenn sie auf einem biologisch abbaubaren Trägerelement adsorbiert werden. Die Stabilität der Beschichtung leitet sich aus der physikalischen Vernetzung von benachbarten Polymerketten über polare Cyano-Wechselwirkungen her.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Polymertensid unter Verwendung eines geeigneten Mittels durch Säure-Base-Koazervation nichtkovalent vernetzt werden; zum Beispiel kann eine erste Schicht aus einem kationischen Polymertensid durch Aufbringen eines anionischen Mittels physikalisch vernetzt werden. Außerdem kann sich ein amphoteres Polymertensid durch interne Säure-Base-Koazervation spontan selbst zu einer konformen Beschichtung organisieren.
Weitere nichtkovalente chemische Vernetzungsmechanismen schließen beispielsweise ein, sind aber nicht beschränkt auf Carbonsäure-Ether-Komplexbildung, Ionenkomplexbildung, Ionenwechselwirkungen, Metallkomplexbildung und alkoholische Wasserstoffbindung. Carbonsäure-Ether-Komplexbildung kann wie folgt durchgeführt werden: Poly(acrylsäure) kann an einem biologisch abbaubaren Träger adsorbiert werden, gefolgt von einer Schicht aus Poly(ethylenglycol). Die Sauerstoffatome innerhalb der Ether-Hauptkette von PEG bilden einen Wasserstoffbindungskomplex mit den Carbonsäure-Funktionalitäten der Poly(acrylsäure)-Hauptkette. Die Ionenkomplexbildung kann unter Verwendung von mehrwertigen Elementen, wie z. B. Metallen oder Bor, erreicht werden. Durch Zugabe von Natriumborax (Na₂B₄O₇) zu PVA bildet zum Beispiel jedes Boratom einen Ionenladungskomplex mit vier ionisierten Sauerstoffatomen aus den freien Hydroxylgruppen. Ionenwechselwirkungen zwischen anionischen und kationischen chemischen Bausteinen können transient stabile Bindungen erzeugen. Alkoholische Wasserstoffbindung kann z. B. durch wiederholtes Gefrieren und Auftauen von PVA erreicht werden.
Der Grad der kovalenten Vernetzung der ersten Schicht kann durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) eingeschätzt werden. Zum Beispiel sind mit FTIR die freien Hydroxylgruppen von Poly(vinylalkohol) (PVE) vor der Vernetzung bei etwa 3349 cm^–1 nachweisbar. Nach der Vernetzung verschiebt sich der Peak zu etwa 3383 cm^–1, und seine Intensität nimmt ab. Als positive interne Kontrolle verändert der Peak bei etwa 2942 cm^–1, der auf die CH₂-Gruppen zurückzuführen ist, seine Position oder Intensität als Ergebnis der Vernetzung nicht. Daher läßt eine Verschiebung der Peakposition der Hydroxylgruppe (OH) von etwa 3349 cm^–1 nach etwa 3383 cm^–1 zusammen mit einer Abnahme der Peakintensität auf den Vernetzungsgrad der ersten Schicht schließen. Im Fall von abbaubaren Polymeren, bei denen der darunterliegende Träger Sauerstoff enthält, wäre zu erwarten, daß Verfahren mit größerer Oberflächenempfindlichkeit, wie z. B. FTIR mit abgeschwächter Totalreflexion (ATR), die Gegenwart von Hydroxylgruppen vor und nach der Vernetzung demonstrieren.
Die Anlagerung einer ersten oder zweiten Schicht aus Poly(lysin) an einen Poly(glycolsäure)-(PGA-)Träger oder ein PVA-beschichtetes Trägerelement kann durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) nachgewiesen werden. Die Anlagerung von Aminogruppen (NH₂-Gruppen) an die Oberfläche kann durch Stickstoffmessung nachgewiesen werden. Stickstoff ist weder in PGE noch in PVA vorhanden. Entsprechend kann die Anlagerung von Zelladhäsionspeptiden, wie z. B. der Arg-Gly-Asp-Aminosäuresequenz, an einen Träger aus PGA oder PLA mit Verwendung von PVA als erster Schicht, an der die Peptide angelagert werden, durch XPS oder Elementaranalyse nachgewiesen werden.
Im Fall einer dreidimensionalen Vorrichtung, wie z. B. eines Schaumstoffs oder Schwamms, wird die Gegenwart von Poly(lysin) oder von Zelladhäsionspeptiden, die in der Masse an PVA auf einem PGA-Trägerelement angelagert sind, vorzugsweise durch Elementaranalyse nachgewiesen.
Die Gegenwart von aminhaltigen ersten oder zweiten Schichten auf einem PGA-Träger kann durch kolorimetrische Analysen mit Farbstoffen wie z. B. Ninhydrin, Ponceau S-Färbemittel oder Sulfo-SDTB nachgewiesen werden.
Die Gegenwart von ersten oder zweiten Schichten, die Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthalten, kann auch durch Anwendung der statischen Sekundärionenmassenspektroskopie (SIMS) nachgewiesen werden, die Molekülgruppen erfaßt.
Die Zusammensetzung der wahlfreien zweiten Schicht aus hydrophilen Polymeren wird so gewählt, daß die zweite Schicht sowohl mit der ersten Schicht zusammenwirken kann, um die Benetzung des hydrophoben Trägerelements mit Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung zu fördern, als auch verschiedene, auf der ersten Schicht nicht vorhandene chemisch funktionelle Gruppen bereitstellen kann, an denen bioaktive Spezies immobilisiert werden können. Es versteht sich, daß weitere Schichten aus hydrophilen Polymeren an die zweite Schicht angelagert werden können, um auf dem Trägerelement mehrere Schichten aus hydrophilen Polymeren zu bilden (Siehe z. B. 6). Bei der Bildung einer zusätzlichen Schicht können verschiedene hydrophile Polymere zur Verwendung bei der Herstellung der Schicht ausgewählt werden. Unterschiedliche hydrophile Polymere liefern verschiedene chemisch funktionelle Gruppen zur Auswahl bei der Anlagerung von bioaktiven Spezies an die zweite Schicht oder an eine zusätzliche Schicht (siehe 5). Als Ergebnis bestimmen die chemisch funktionellen Gruppen der zweiten Schicht den Typ und die Anzahl von funktionellen Gruppen, die für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies daran zur Verfügung stehen. Außerdem wird durch Anlagerung einer zweiten Schicht an die unverbrauchten Komponenten des Vernetzungsmittels die Anzahl der chemisch funktionellen Gruppen, die für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies zur Verfügung stehen, auf viel größere Zahlen erhöht, als bei Verwendung ausschließlich der ersten Materialschicht auf dem Trägerelement möglich wäre.
Auf der ersten Schicht wird eine zweite Schicht gebildet, indem ein hydrophiles Polymer durch nicht in Reaktion getreten chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels (siehe 3) oder durch nicht in Reaktion getretene chemisch funktionelle Gruppen des vernetzten Polymertensids an das vernetzte Polymertensid der ersten Schicht angelagert wird. Vorzugsweise sind die hydrophilen Polymere kovalent an chemisch funktionelle Gruppen der ersten Schicht gebunden. Bei einem Verfahren wird die zweite Schicht an die erste Schicht angelagert, indem ein biologisch abbaubares Trägerelement, das eine adsorbierte und vernetzte erste Schicht aufweist, in eine Lösung eines hydrophilen Polymers der zweiten Schicht mit einer Konzentration von etwa 0,001% bis etwa 49,9%, vorzugsweise etwa 0,01% bis etwa 50%, stärker bevorzugt etwa 1,0% bis etwa 25%, und am stärksten bevorzugt etwa 0,25% bis etwa 5% eingetaucht wird. Die Lösung des hydrophilen Polymers kann einen geeigneten Katalysator enthalten, wie z. B. organische Säuren oder Basen, anorganische Säuren oder Basen, Lewis-Säuren oder -Basen, metallorganische Katalysatoren, organische und/oder anorganische Salze, Hitze, Druck, Elektronenstrahlung, Photonenstrahlung, Plasmastrahlung, Koronaentladung oder einen pH-Wert, um die Anlagerung an die chemisch funktionellen Gruppen der ersten Schicht zu bewirken. Geeignete hydrophile Polymere zur Verwendung bei der Bildung der zweiten Schicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyvinylalkohol, Polylysin, Polyacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol, Alginat, Sepharose, Agarose, Polyethylenimin, Polyallylamin, Polyornithin, Poly(β-hydroxybernsteinsäure), Polysulfon oder deren Copolymere, entweder allein oder in Kombination. Polylysin wird bevorzugt. Geeignete Lösungsmittel zum Auflösen der hydrophilen Polymere schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Alkohole, Aceton, Dioxan, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und Acetonitril usw.
Sobald die erste und die wahlfreie zweite Schicht aus hydrophilem Material auf einem biologisch abbaubaren Trägerelement ausgebildet ist, werden bioaktive Spezies unter Anwendung schonender, dem Fachmann bekannter Biokonjugationsverfahren darauf immobilisiert (siehe zum Beispiel K. Mosbach, Immobilized Enzymes and Cells (Immobilisierte Enzyme und Zellen), Teil B, Academic Press (Orlando, FL) (1987); G.T. Hermanson, A.K. Mallia, P.K. Smith, "Immobilized Affinity Ligand Techniques" (Verfahren mit immobilisierten Affinitätsliganden), Academic Press, San Diego (1992); und S.F. Karel, S.B. Libicki, C.R. Robertson, "The Immobilization of Whole Cells; Engineering Principles" (Immobilisierung intakter Zellen: Technische Grundlagen), Chemical Eng. Sci, 40: 1321 (1985)). Schonende Biokonjugationssysteme werden für die Immobilisierung von bioaktiven Spezies bevorzugt, um Schäden an der Struktur des biologisch abbaubaren Trägerelements, des Polymertensids der ersten Schicht, des hydrophilen Polymers der wahlfreien zweiten Schicht und der bioaktiven Spezies zu beseitigen oder zu minimieren.
Außer der Bereitstellung von Variabilität in Anzahl und Identität von chemisch funktionellen Gruppen, die zur Immobilisierung von bioaktiven Spezies verwendet werden können, kann die Variabilität in Anzahl und Identität der funktionellen Gruppen der wahlfreien zweiten hydrophilen Polymerschicht genutzt werden, um die Benetzbarkeit des biologisch abbaubaren Trägerelements mit Flüssigkeiten von hoher Oberflächenspannung zu erhöhen. In einer Ausführungsform wird ein poröses, hydrophobes, biologisch abbaubares Trägerelement nur an seiner Oberfläche durch ein dünne erste und zweite Schicht modifiziert, und das Material, das die Porenhohlräume des Trägerelements definiert, bleibt unmodifiziert und hydrophob. In einer anderen Ausführungsform können die ersten und zweiten Schichten auch auf dem Material gebildet werden, das die inneren Porenhohlräume des porösen, biologisch abbaubaren Trägerelements definiert, und bioaktive Spezies können darauf immobilisiert werden. In dieser Ausführungsform kann eine kontinuierliche Wasserphase, die durch die Poren des biologisch abbaubaren Trägerelements hindurchgeht, leicht hergestellt und aufrechterhalten werden und führt zu einem guten Transport beispielsweise von Reaktionsprodukten oder Nährstoffen durch das poröse Trägerelement. Dünne Beschichtungen werden für poröse biologisch abbaubare Trägerelemente besonders bevorzugt, da die dünnen Beschichtungen die Porosität des Trägerelements nicht merklich vermindern.
Unter bestimmten Umständen kann die Wechselwirkung eines Reaktanten in der Lösungsphase mit einer immobilisierten bioaktiven Spezies suboptimal sein. Zum Beispiel können sterische Hinderungen zwischen der ersten Schicht und der immobilisierten bioaktiven Spezies die Annäherung des Reaktanten in der Lösungsphase an die bioaktive Spezies begrenzen. Außerdem können auch die physikalische Masse, elektrostatische Abstoßung oder unzweckmäßige Positionierung der bioaktiven Spezies zur verminderten Effizienz der immobilisierten bioaktiven Spezies beitragen. Dementsprechend kann es wünschenswert sein, zwischen den chemisch funktionellen Gruppen der ersten Schicht oder der wahlfreien zweiten Schicht und den bioaktiven Spezies eine oder mehrere zusätzliche Verbindungen als "Spacer" (Abstandshalter) oder Tether bzw. "Halteseile" anzuordnen, um den Abstand zwischen der Schicht und den bioaktiven Spezies zu vergrößern. Zur Verwendung als Spacer geeignete Verbindungen schließen beispielsweise ein, sind aber nicht beschränkt auf Ethylenglycol-bis-[succinimidylsuccinat], Bernsteinsäure, Diaminohexan, Glyoxylsäure, kurzkettiges Polyethylenglycol und Glycin. Es versteht sich, daß die wahlfreie zweite Schicht selbst als Spacerarm dienen kann, ohne die Verwendung einer separaten Spacerverbindung notwendig zu machen, oder daß überschüssige chemisch funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels auch als Spacerverbindung dienen können.
Die kovalente Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf Trägerelementen gemäß der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen reversibel, d. h. die bioaktiven Spezies werden mit der Zeit von der ersten oder wahlfreien zweiten Schicht des biologisch abbaubaren Trägerelements auf kontrollierte oder vorhersagbare Weise freigesetzt. Außerdem sorgen Spacer oder Tether, die immobilisierte bioaktive Spezies selektiv freisetzen können, für einen anderen Grad der kontrollierten Freisetzung von bioaktiven Spezies. Diese Konstruktionen sind von Nutzen in Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen, bei der Identifikation von Molekülen und Charakterisierung von Antikörper/Antigen-Komplexen sowie der selektiven Reinigung von Zellensubpopulationen usw.
Die selektive Freisetzung der bioaktiven Spezies wird durchgeführt, indem die Spacerverbindung unter Reaktionsbedingungen aufgespalten wird, zu denen beispielsweise Photonenbestrahlung, enzymatischer Abbau, Dekomplexierung, Säure-Base-Neutralisation, Zerstörung von Wasserstoffbindungen, Oxidation/Reduktion oder Hydrolyse gehören, die aber nicht darauf beschränkt sind. Die selektive Spaltung und Freisetzung von immobilisierten bioaktiven Spezies kann durch Anwendung von Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe zum Beispiel H.R. Horton & H.E. Swaisgood, "Covalent immobilization of proteins by techniques which permit subsequent release" (Kovalente Immobilisierung von Proteinen durch Verfahren, die eine spätere Freisetzung zulassen), Meth. Enzymology, 135: 130 (1987); S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991); und US-Patent Nr. 4745160, erteilt an Churchill et al., das hier durch Verweis einbezogen wird). Geeignete Verbindungen zur Verwendung als spaltbare Tether oder spaltbare Spacer schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyhydroxysäuren, Polyanhydride, Polyaminosäuren, Tartarate und Cystein-Linker, wie z. B. Lomants Reagenz.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen mit einer ersten Schicht und einer wahlfreien zweiten Schicht beschränkt. In anderen Ausführungsformen können zusätzliche Schichten von hydrophilen Polymeren an vorhandene Schichten auf dem Trägerelement angelagert werden, um Konstruktionen mit mehreren, daran angelagerten Schichten aus hydrophilem Material zu bilden.
Ohne eine Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu beabsichtigen, veranschaulichen die folgenden Beispiele, wie die vorliegende Erfindung hergestellt und genutzt werden kann.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Ausbildung einer ersten Schicht von reversibel vernetzten Polymertensiden auf einem vernetzten Poly(glycolsäure)-co-Poly(milchsäure)-(PGA:PLA) Trägerelement in Form eines PGA:PLA-Fasernetzes (z. B. Vicryl^TM-Geflecht, Ethicon, Somerville, N.J., 90:10 PGA:PLA). Das Verfahren ist wie folgt. Zwei 2 × 2 cm-Stücke Vicryl^TM-Geflecht wurden 30 Sekunden mit Isopropanol (IPA) gespült, dann 10 Minuten in eine 0,5%-ige wäßrige Polylysinlösung (0,053 g Polylysin HCL, Aldrich, in 10 ml Carbonatpuffer 0,05 M, pH 9,6, eingestellt mit NaOH) eingelegt. Die Polylysinlösung wurde von den Fasern abgespült, indem das Fasernetz 5 Minuten in Carbonatpuffer, pH 9,6, und dann 5 Minuten in Dimethylsulfoxid (DMSO) eingeweicht wurde. Die zwei Fasernetzstücke wurden dann 2 Stunden in eine Lösung von Ethylenglycolbis-[succimidylsuccinat] (0,10 g EGS, Pierce, in 15 ml wasserfreiem DMSO, Aldrich) eingelegt, um die Polylysinmoleküle zu vernetzen und sie auf diese Weise stabiler zu machen. Das Fasernetz wurde dann zweimal jeweils 5 Minuten mit destilliertem Wasser gespült.
Das Fasernetz wurde gespült, indem das Netz 30 Sekunden in Isopropylalkohol (IPA) eingeweicht wurde, und dann an der Luft getrocknet. Die Benetzbarkeit des Fasernetzes wurde mit einem unbehandelten Fasernetz verglichen, indem ein kleiner Tropfen Wasser auf das Netz aufgebracht wurde, während das Netz horizontal in der Luft schwebend gehalten wurde. Das Wassertröpfchen blieb in tropfenähnlicher Halbkugelform auf dem unbehandelten PGA:PLA-Netz, während auf dem erfindungsgemäß behandelten PGA:PLA-Netz das Wassertröpfchen sofort durch das Netz hindurchfiel.
Ein 5 × 5 mm großer Netzabschitt wurde mit Ponceau S-Färbemittel (Sigma, 0,04 g Ponceau S-Färbemittel in 575 ml konzentrierter Essigsäure in 100 ml destilliertem Wasser) gefärbt und zeigte die Anwesenheit von Aminogruppen durch die Bildung einer schwachen Rosafärbung des Netzes an. Ein Abschnitt von 1 × 1 cm des Netzes wurde verwendet, um die Anzahl verfügbarer Aminogruppen auf dem Netz mit dem Sulfo-SDTB-Test (Pierce) zu messen. Siehe Beispiel 2 zu den Ergebnissen des Sulfo-SDTB-Tests.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt die Verstärkung der ersten Polylysin-Schicht mit einer zweiten Polylysin-Schicht auf der in Beispiel 1 beschriebenen Probe. Eines der zwei PGA:PLA-Netze von Beispiel 1 wurde nochmals 15 Minuten in die 0,5%-ige Polylysinlösung eingelegt (vor dem Spülen mit destilliertem Wasser oder IPA). Die Probe wurde dann 5 Minuten in 20 ml destilliertem Wasser gespült, 30 Sekunden mit IPA gespült und an der Luft getrocknet.
Die Benetzbarkeit des Fasernetzes wurde mit unbehandelten Fasern verglichen, indem ein kleiner Tropfen Wasser auf das Netz aufgebracht wurde. Das Wassertröpfchen blieb in tropfenähnlicher Halbkugelform auf dem unbehandelten PGA:PLA-Netz, während das Wassertröpfchen auf dem erfindungsgemäß behandelten PGA:PLA-Netz sofort durch das Netz hindurchfiel.
Ein 5 × 5 mm großer Abschnitt der Probe wurde mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt und zeigte eine sehr gleichmäßige, dunkle Rosafärbung. Drei 1 × 1 cm-Segmente des Netzes mit zwei Polylysin-Schichten wurden durch den Sulfo-SDTB-Test analysiert.
Zur Durchführung des Sulfo-SDTB-Tests wurde eine Stammlösung hergestellt, indem 10,6 mg Sulfo-SDTB und 0,444 ml DMF in 3,55 ml Natriumbicarbonatlösung aufgelöst wurden. Eine Standardkurve wurde erstellt, indem 0,02 ml Stammlösung mit 2 ml 35%-iger Perchlorsäure vermischt wurden. Aus dieser Ausgangslösung wurden sieben 1:2-Verdünnungen hergestellt und bei 498 nm auf einem UV-VIS-Spektrophotometer gemessen, um eine Eichkurve aufzustellen. Die Proben wurden 10 Minuten in 0,25 ml Stammlösung eingeweicht. Die Stücke wurden dann zweimal jeweils 5 Minuten mit 4 ml destilliertem Wasser gespült. Jedes Stück wurde dann 10 Minuten in 2 ml 35%-ige Perchlorsäure eingelegt. Ein ml Perchlorsäurelösung von jedem der Stücke wurde auf dem UV-VIS-Spektrophotometer bei 498 nm im Vergleich zu einer Perchlorsäure-Blindlösung gemessen. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Eichkurvengleichung in Einheiten von nmol/cm² umgerechnet. Die Differenz in der Anzahl der Aminogruppen zwischen der ersten und der zweiten Schicht zeigt die Verstärkungswirkung an. Keine Aminogruppen-Differenz zwischen der Vicryl-Kontrolle und der ersten Schicht kann darauf zurückzuführen sein, daß die Sulfo-SDTB-Reagenzien keinen Zugang zu der geringen Anzahl unvernetzter Aminogruppen gewinnen konnten, während die Aminogruppen an den Seitenketten des Polymers der zweiten Schicht imstande waren, mit den freien Aminogruppen der ersten Schicht zu reagieren.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung eines Dünnschichtträgerelements, das aus Poly(d,1-milchsäure):Poly(glycolsäure)-Copolymer (d,1-PLA:PGA-Copolymer) im Verhältnis von 85:15 PLA zu PGA bestand (Birmingham Polymers, Birmingham, AL), mit einer Schicht aus Polyethylenamin (PEI, Sigma), um es stärker wasserbenetzbar zu machen und funktionelle Gruppen an der Oberfläche der Schicht einzubauen.
Bei dem Verfahren wurde ein PLA:PGA 85:15-Polymerfilm von etwa 2 cm mal 2 cm mal 20 μm aus einem größeren Film ausgeschnitten, der durch Foliengießen des Polymers aus Aceton unter Verwendung einer Auszieh-Foliengießvorrichtung (BYK Gardner, Silver Springs, MD, Modell AG-3860) hergestellt wurde. Der Polymerfilm wurde 0,5 min in Isopropanol eingelegt. Überschüssiges Isopropanol wurde durch Abschütteln des Überschusses entfernt, ohne den Film vollständig trocknen zu lassen. Der Film wurde 10 Minuten in eine wäßrige Lösung von 0,5% PEI (in Carbonatpuffer, pH 9,6) eingelegt, 5 Minuten in Carbonatpuffer gespült, dann in destilliertem Wasser gespült und 20 Minuten in eine Lösung von 1% Glutaraldehyd in Carbonatpuffer eingelegt, um hydrolytisch instabile Azomethin-(Imin-)Bindungen zu bilden. Die Probe wurde zweimal je 5 Minuten in destilliertem Wasser gespült und dann getrocknet, indem die Probe 30 Sekunden in Isopropanol angefeuchtet und an der Luft getrocknet wurde.
Auf das Material wurden Wassertröpfchen aufgebracht und mit einem Goniometer gemessen und zeigten eine Zunahme des Kontaktwinkels um etwa 10°. Ein 5 × 5 mm-Abschnitt des Films wurde mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt und zeigte eine schwache Rosafärbung. Ein Teil der Probe wurde für eine Analyse durch Sulfo-SDTB aufbewahrt (Siehe Beispiel 4 zu den Sulfo-SDTB-Ergebnissen).
BEISPIEL 4
Eine zweite Schicht aus PEI (Sigma) wurde an die erste Schicht eines Stücks des in Beispiel 3 hergestellten Materials angelagert, indem die Probe 30 Minuten in eine 0,5%-ige wäßrige PEI-Lösung eingetaucht wurde (vor dem Spülen mit IPA), dann zweimal je 5 Minuten in destilliertem Wasser gespült wurde. Die Probe wurde gespült, indem die Probe 30 Sekunden in Isopropanol getaucht und dann an der Luft getrocknet wurde. Ein Stück der Probe wurde durch Eintauchen in Ponceau S-Färbemittel gefärbt. Es wurde eine Dunkelosafärbung beobachtet. Drei Stücke von 1 × 1 cm der Probe wurden durch den Sulfo-SDTB-Test analysiert. Die Ergebnisse der Sulfo-SDTB-Analysen waren:
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Anlagerung einer zweiten Schicht aus Polyethylenimin an eine erste Schicht aus Polylysin auf einem porösen PGA:PLA-(Vicryl^TM-) Fasernetzträger. Die Probe wurde 30 Sekunden in Isopropanol eingelegt, dann 10 Minuten in eine 0,4%-ige Polylysinlösung (0,04 g Polylysinhydrochlorid, Aldrich, in 10 ml Carbonatpuffer, pH 9,6) eingelegt. Die Probe wurde dann 5 Minuten in Carbonatpuffer und anschließend 5 Minuten in Aceton gespült. Dann wurde die Probe 2 Stunden in eine Lösung von 0,4% Ethylenglycolbis-[succinimidylsuccinat] (0,057 g EGS, Pierce, in 15 ml Aceton, Aldrich) eingelegt. Die Probe wurde 20 Minuten in 20 ml destilliertem Wasser gespült, dann wurde die Probe 30 Sekunden durch Einweichen in Isopropanol gespült, und ein Abschnitt von 5 × 5 mm wurde an der Luft getrocknet. Der getrocknete Abschnitt der Probe wurde mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt, das eine gleichmäßige Rosafärbung zeigte.
Um die Beschichtung zu verstärken, wurde der übrige Teil der Probe sofort 15 Minuten in 0,5%-ige PEI-Lösung eingelegt, bevor er mit destilliertem Wasser oder IPA gespült wurde. Die Probe wurde zweimal 5 Minuten je Spülung mit destilliertem Wasser gespült, dann 30 Sekunden mit Isopropanol gespült und an der Luft getrocknet. Ein Stück von 5 × 5 mm der Probe wurde mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt, das eine Dunkehosafärbung zeigte. Die Sulfo-SDTB-Analyse der verfügbaren Aminogruppen lieferte die folgenden Ergebnisse:
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung eines nichtporösen PLA:PGA-Films mit einer ersten PEI-Schicht und einer zweiten Schicht aus Polylysin. Ein Film aus 85:15 PLA:PGA (Birmingham Polymers) wurde 30 Sekunden in IPA gespült und dann 10 Minuten in eine 0,5%-ige PEI-Lösung eingelegt. Die Probe wurde zweimal mit Carbonatpuffer gespült (5 Minuten je Spülung) und dann 20 Minuten in eine 1%-ige Glutaraldehydlösung in Carbonatpuffer eingelegt. Die Probe wurde dann zweimal mit destilliertem Wasser gespült (5 Minuten je Spülung). Ein Teil eines Abschnitts der Probe wurde 30 Sekunden in IPA gespült, an der Luft getrocknet und mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt und ergab eine schwache Rosafärbung. Ein weiterer Teil der Probe wurde durch Sulfo-SDTB analysiert. Der Rest der Probe wurde 30 Minuten in eine 0,4%-ige Polylysinlösung in Carbonatpuffer eingelegt, um die Aminogruppen zu verstärken. Die verstärkte Probe wurde zweimal in destilliertem Wasser gespült (5 Minuten je Spülung), 30 Sekunden in IPA gespült und an der Luft getrocknet. Ein Abschnitt der verstärkten Probe wurde in Ponceau S-Färbemittel eingeweicht und zeigte eine mittlere Rosafärbung. Ein Abschnitt der verstärkten Probe wurde durch Sulfo-SDTB analysiert. Die Sulfo-SDTB-Ergebnisse waren:
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung der Stabilität der Beschichtung auf einem PGA:PLA-Gerüst. Eine Probe von 2 cm × 2 cm eines 90:10 PGA:PLA-Fasernetzes (Vicryl^TM) wurde 30 Sekunden mit IPA befeuchtet, 10 Minuten in 10 ml 0,5%-igem Polylysin in Carbonatpuffer eingeweicht, 3 Minuten in 20 ml Carbonatpuffer (0,05 M, pH 9,6) gespült und 20 Minuten in 15 ml einer 1%-igen Glutaraldehydlösung in Carbonatpuffer (0,05 M, pH 9,6) eingelegt. Die Probe wurde entnommen, zweimal mit destilliertem Wasser gespült, ein Abschnitt wurde zum Färben mit Ponceau S entfernt, und der Rest wurde 4 Stunden in die 0,5%-ige Polylysinlösung zurückgelegt, wodurch auf der Probe zwei Polylysinschichten entstanden. Die Probe wurde dann zweimal in 20 ml destilliertem Wasser gespült (5 Minuten je Spülung), 30 Sekunden in IPA gespült und an der Luft getrocknet.
Ein Teil der Probe wurde zum Färben mit Ponceau S entnommen, das eine gleichmäßige Rotfärbung zeigte, was auf die Gegenwart von Aminogruppen schließen ließ. Die Probe wurde eine Woche lang bei 37°C in 15 ml phosphatgepufferte Salzlösung (Dulbeccos PBS, pH 7,2, Gibco/BRL) eingelegt. Jeden Tag wurde die Probe in frischen Puffer eingelegt und ein Teil wurde entnommen und mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Beschichtung sieben Tage lang intakt blieb, wie durch einen visuellen Vergleich der gleichmäßigen Rotfärbung aller Proben angezeigt wird. Unbehandelte Kontrollen zeigten keine Färbung.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel zeigt einen Vergleich von behandelten und unbehandelten Proben zur Einschätzung der Zelltoxizität. In einer sterilen Laminarbox wurde ein PGA:PLA-Fasernetzpaket (Vicryl^TM) geöffnet, ein Stück von 5 × 5 cm wurde zugeschnitten und als Kontrolle in einen sterilen Behälter eingebracht. Ein weiteres Stück von 5 × 5 cm wurde zugeschnitten und entsprechend dem folgenden Protokoll beschichtet (das ausschließlich in der sterilen Box ausgeführt wurde, wobei alle Becher und Geräte vor der Verwendung im Autoklav behandelt wurden). Das Netz wurde 30 Sekunden in 40 ml IPA eingelegt, 10 Minuten in 20 ml 0,5%-iger steriler gefilterter PEI-Lösung in Carbonatpuffer eingeweicht, 5 Minuten in 60 ml Carbonatpuffer gespült, 3 Minuten in 25 ml Aceton gespült, dann 2 Stunden unter Rühren in eine EGS-Lösung (0,202 g EGS in 30 ml Aceton) eingebracht. Nach 2 Stunden wurde die Probe 15 Minuten in die ursprüngliche PEI-Lösung eingelegt, um die Beschichtung zu verstärken, dann wurde die Probe zweimal 5 Minuten mit 60 ml sterilem Wasser gespült.
Ein Abschnitt von 5 × 5 mm wurde entnommen und mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt, um die Anlagerung von Aminogruppen zu bestätigen. Der Rest der Probe wurde 30 Sekunden mit IPA gespült, an der Luft getrocknet und in einen sterilen Behälter eingebracht, bevor die Probe aus der Laminarbox entnommen wurde. Das Ponceau S-Färbemittel zeigte eine gleichmäßige Rotfärbung, was auf die Gegenwart von transient immobilisierten Aminogruppen schließen ließ.
Die sterile Kontrolle und die behandelten Proben wurden gemäß den USP-Richtlinien für Zelltoxizität mittels Elutionstest geprüft. Die Proben wurden 24 Stunden bei 37°C in einem Verhältnis von 30 cm² pro 5 ml in Minimalmedium-Behälter (MEM-Behälter) eingebracht. Eine Teilmenge von 2 ml des MEM wurde dann 48 Stunden bei 37°C auf eine Wachstumskultur von L929-Zellen aufgebracht. Nach 48 Stunden wurden die Zellen auf Zellauflösung und die Gegenwart von diskreten intrazytoplasmatischen Körnchen analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die unbehandelte Kontrolle und die behandelte Testprobe beide nichttoxisch waren. Positive (toxische) und negative (MEM allein) Kontrollen wurden benutzt, um die Gültigkeit des Tests sicherzustellen.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Messung der Biokompatibilität einer biologisch abbaubaren Probe, die durch Anlagerung eines hydrophilen Tensids modifiziert wird, um erhöhte Benetzbarkeit und chemisch funktionelle Gruppen bereitzustellen. Die bei diesem Testverfahren verwendbaren Materialien sind diejenigen, die in den Beispielen 1 bis 6 beschrieben wurden. Proben von jedem der Testmaterialien werden durch Gammabestrahlung mit weniger als 4 mrad sterilisiert. Die Proben werden in Ratten implantiert. Gewebeexplantate werden durch histologische Verfahren untersucht, um Abnormitäten in der Gewebereaktion nachzuweisen. Histologisch werden keine Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Materialien erwartet.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Züchten von Knorpel für rekonstruktive Chirurgie. Menschliche Chondrozyten (Knorpelzellen) werden von einem Patienten entnommen. Die Zellen werden gesammelt und in ein Konstrukt eingeimpft, das aus einem Poly(glycolsäure)-Netz besteht, das mit reversibel vernetztem Polylysin beschichtet ist. Das Konstrukt und die Zellen werden zwei Wochen bei 37°C in einer befeuchteten Umgebung inkubiert. Das Konstrukt und die Zellen werden in den Defektbereich implantiert. Der Abbau des Polymers erfolgt gleichzeitig mit der Bildung einer neuen extrazellulären Matrix durch die Zellen. Es wird die Bildung von funktionsfähigem Knorpel erwartet.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel beschreibt die Bestimmung der Abbaurate eines Polymerkonstrukts durch beschleunigte Alterung. Kontrollproben waren ein unbehandeltes PGA:PLA-Netz (Vicryl^TM). Die Testproben wurden auf die folgende Weise hergestellt. Proben von 2,5 cm × 2,5 cm aus PGA:PLA-Netz (Vicryl^TM) wurden 30 Sekunden in 60 ml IPA eingeweicht und dann 10 Minuten in 135 ml 0,5%-ige PEI-Lösung eingelegt. Die Proben wurden 5 Minuten mit 150 ml Carbonatpuffer (pH 9,7) gespült, 3 Minuten mit 150 ml Aceton gespült und dann 2 Stunden in eine Lösung von EGS in Aceton (1,014 g EGS, Pierce, in 150 ml Aceton) unter Stickstoff eingelegt. Die Proben wurden dann 15 Minuten in 135 ml einer 0,5%-igen PEI-Lösung übertragen, um die Beschichtung zu verstärken. Das Molekulargewicht einer repräsentativen Probe wurde zum Zeitpunkt 0 gemessen, indem die Eigenviskosität (IV) des in Hexafluorisopropanol (HFIP) gelösten Materials bestimmt wurde. Die Proben wurden bei 57°C in phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2, eingelegt. Während der Dauer der Untersuchung wurde der Puffer zweimal täglich von jeder Probe entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Zweimal täglich wurden Proben entnommen, indem der Puffer entfernt wurde und man die übrigen Polymerstücke trocknen ließ. Der Molekulargewichtsverlust der gesammelten Proben wurde durch Bestimmung der Eigenviskosität in HFIP analysiert. Die Ergebnisse zeigten einen annähernd gleichen Molekulargewichtsverlust für die behandelten Proben und die unbehandelten Kontrollen.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der langfristigen In-vivo-Biokompatibilität einer Probe, wie z. B. derjenigen, die in Beispiel 8 beschrieben wurde. Dieses Verfahren ist so angelegt, daß es die chronische Reaktion auf das Material ermittelt. Eine Probe wird gemäß Beispiel 8 hergestellt, durch Gammabestrahlung sterilisiert und aseptisch unter der Haut von Kaninchen eingesetzt. Nach 1 Monat, 2 Monaten und 4 Monaten werden Proben zusammen mit umgebenden Geweben entnommen und histologisch untersucht, um die Reaktion des Körpers auf die Vorrichtung zu untersuchen. Es werden keine langfristigen schädlichen Wirkungen erwartet.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Abgabe biologischer Wirkstoffe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen. Als Ergebnis der in Beispiel 5 beschriebenen Behandlung wird das PGA-Fasernetz mit reversibel vernetzten Polylysin- und PEI-Molekülen beschichtet, die dem Polymer größere Hydrophilie verleihen und einige freie Aminogruppen liefern. An die freien Hydroxylgruppen werden unter Verwendung reversibler Vernetzungsmittel entzündungshemmende Medikamente angelagert.
Es wird erwartet, daß durch die Verwendung von entzündungshemmenden Medikamenten der mit der implantierbaren Vorrichtung verbundene Entzündungsgrad vermindert wird.
BEISPIEL 14
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Anlagerung von Zelladhäsionspeptiden an eine Vorrichtung wie diejenigen, die in den Beispielen 1 und 3 beschrieben wurden. Das Fasernetz oder der aus einem Lösungsmittel gegossene Film mit einer einzigen Schicht wird eine Lösung eingebracht, die ein Vernetzungsmittel enthält. Nach 10 Minuten wird die Probe aus der ersten Lösung entnommen und gespült, um überschüssige Vernetzungsmittel zu entfernen. Die Probe wird dann in eine Lösung eingebracht, die Zelladhäsionspeptide enthält, die mit dem an das Polymer der ersten Schicht angelagerten Vernetzungsmittel reagieren. Die Gegenwart von Zelladhäsionspeptiden wird durch eine Zunahme der Zellausbreitung von Endothelzellen in serumfreien Medien nachgewiesen. Es wird erwartet, daß durch die Verwendung von Zelladhäsionspeptiden die Anlagerung von Zellen, die zusammen mit der Vorrichtung implantiert werden, an die Membran verlängert wird.
BEISPIEL 15
Dieses Beispiel beschreibt eine Tierstudie zum Testen der Wirksamkeit eines biologischen Wirkstoffs, der an ein Polymergerüst angelagert wird. Eine Membran, die aus Lösungsmittel gegossenen PGA:PLA-Film und PGA-Fasern (z. B. Resolut^®-Membran, W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ) enthält, wird mit reversibel vernetztem PEI beschichtet. An die freien Aminogruppen des PEI wird ein entzündungshemmendes Mittel kovalent gebunden. Die Proben werden in die Mandibula eines Hunds eingesetzt. Die Entzündung in der Nähe von Testproben wird mit der Entzündung von Kontrolltieren verglichen. Es wird erwartet, daß der Entzündungsgrad an der Implantationsstelle durch die Gegenwart von entzündungshemmenden Medikamenten vermindert wird.
BEISPIEL 16
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Knochenregeneration unter einer resorbierbaren Membran bei der Behandlung einer Zahnwurzelhauterkrankung. Es ist gezeigt worden, daß die Verwendung einer Membran die Regeneration des Knochens verbessert. Im vorliegenden Beispiel wird die Verwendung einer Membran mit der Freisetzung eines Wachstumsfaktors kombiniert, der die Knochenneubildung stimuliert. Rekombinantes morphogenetisches Menschenknochenprotein (rhBMP-2) wird nach reversibler Vernetzung des PEI mit einem porösen Faserabschnitt einer Membran, die aus PGA-Fasern und einem nichtporösen Film aus PLA:PGA besteht (z. B. Resolut^®-Membran, W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ) an die freien Aminogruppen von PEI angelagert. Nach 2, 4, 6 und 12 Wochen wird der Defekt sondiert, um die Knochenregeneration zu ermitteln. Es wird erwartet, daß durch die Gegenwart von rhBMP-2 die Knochenbildungsgeschwindigkeit im Vergleich zu Kontrollen erhöht wird.
BEISPIEL 17
Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Gelenkknorpelschädigung. Die vorliegende Erfindung in Form eines PGA-Fasernetzes, das mit PEI behandelt und reversibel mit EGS vernetzt wird, wird als Träger von körpereigenen Knorpelzellen verwendet, die vorher geerntet wurden, und dann mit den Zellen auf den Fasern in einem Inkubator beimpft, um die Bildung von neuem Knorpelgewebe zu fördern. Nach zwei Wochen wird das Konstrukt in den Gelenkknorpelgewebedefekt implantiert. Eine abbaubare Membran wird verwendet, um das Konstrukt gegen Eindringen weicher Gewebezellen zu schützen. Es wird erwartet, daß funktionsfähiges Gelenkknorpelgewebe gebildet wird.
BEISPIEL 18
Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung der vorliegenden Erfindung als chirurgisches Netz. Ein PGA:PLA-Fasernetz (z. B. Vicryl^TM-Geflecht, Ethicon, Somerville, N.J.) wird mit PEI behandelt und mit EGS vernetzt, um reversible Vernetzungen zu bilden. An die freien Aminogruppen des PEI wird das antimikrobielle Mittel Gentamicin angelagert. Das Netz wird auf eine Operationswunde aufgelegt, um Infektion zu bekämpfen und die Adhäsion von zwei weichen Gewebetypen zu verhindern. Es wird erwartet, daß durch den Zusatz des antimikrobiellen Mittels das Auftreten von bakteriellen Informationen an der Implantationsstelle verhindert wird.
BEISPIEL 19
Dieses Beispiel beschreibt die Aufnahme von Medikamenten auf die Oberfläche einer Vorrichtung, die als anastomotische Schlinge verwendet wird, um der Membran eine antiproliferative Fähigkeit zu vermitteln. Die PGA:PLA-Schlinge (z. B. Vicryl^TM) wird mit PEI beschichtet, um funktionelle Stellen für das Anpfropfen des antiproliferativen Medikaments an die Membran bereitzustellen. Mycophenolsäure (Sigma) wird über eine Carbonsäurefunktionalität auf die folgende Weise an die freien Aminosäuregruppen des PEI mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, Pierce, Rockford, IL) angelagert. Der PEI-beschichtete PGA-PLA-Träger wird 30 Sekunden in IPA eingetaucht, bis er vollständig befeuchtet ist. Als nächstes wird die Probe unter Rühren in eine Lösung von 0,5 M Mycophenolsäure getaucht. Eine Halterung wird in die Lösung eingebracht, um die Probe von einem Rührstab fernzuhalten. Die Lösung wird auf –10°C abgekühlt. Als nächstes wird Dicyclohexylcarbodiimid (0,5 M in Ethanol), gleichfalls auf –10°C abgekühlt, in die gerührte Lösung getropft. Die Temperatur wird auf –10°C gehalten, bis die gesamte DCC-Lösung zugesetzt ist. Die Temperatur läßt man langsam auf 4°C ansteigen, und die Reaktion dauert über Nacht an. Als nächstes werden einige Tropfen Essigsäure zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 10 Minuten gerührt. Das Polymer wird mit frischem Ethanol, Wasser und Ethanol gewaschen und getrocknet. Der PEI-beschichtete PGA-PLA-Träger wird perianastomotisch um arteriell vaskuläre Anastomosen geschlungen, um Pharmazeutika zur Verhinderung von anastomotischer Hyperplasie abzugeben. Das Medikament wird von der Copolymerschlinge freigesetzt, während die Esterbindungen zwischen dem Medikament und vernetztem PEI hydrolysiert werden. Anschließend diffundiert das Medikament von der Vorrichtung. Es wird erwartet, daß die Freisetzung einer antiproliferativen Verbindung mit dem Abbau der Membran die Entstehung von Hyperplasie bei Gefäßtransplantaten verhindert.
BEISPIEL 20
Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren zur reversiblen Stabilisierung einer ersten Schicht aus PVA auf einem abbaubaren Polymerträger. Ein PGA:PLA-Netz (z. B. Vicryl^TM) wird 0,5 Minuten mit Isopropanol gespült, dann in eine wäßrige Lösung von 1% PVA eingetaucht. Überschüssiges PVA wird zweimal 5 Minuten in destilliertem Wasser von dem Netz abgespült. Das PGA-Netz mit PVA wird in eine Lösung von Natriumtetraboratdecahydrat (Na₂B₄O·10H₂O) (Aldrich) mit einem pH-Wert von 8 eingelegt. Jedes Boratom bildet einen nichtkovalenten Ladungskomplex mit vier freien Hydroxylen. Es wird erwartet, daß die PVA-Schicht die Benetzbarkeit des Netzes erhöht.
BEISPIEL 21
Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren zur reversiblen Stabilisierung einer ersten und einer zweiten Schicht aus einem Poly(anion) und einem Poly(kation) auf einem biologisch abbaubaren Polymerträger. Eine Probe von 2 × 2 cm eines PGA:PLA-Fasernetzträgers (Vicryl^TM) wurde 30 Sekunden mit Isopropanol gespült und 15 Minuten in eine Lösung von 2% Poly(acrylsäure) eingelegt (5,0 g 40 Gew.-% Poly(acrylsäure):Natriumsalz, Aldrich, in 95 ml destilliertem Wasser). Der pH-Wert wurde mit HCl auf 2,5 eingestellt. Überschüssige Poly(acrylsäure) wurde mit destilliertem Wasser von dem Träger abgespült (1 Minute), und der Träger wurde 20 Stunden in eine Lösung von 0,05% Poly(lysin) (Aldrich) in destilliertem Wasser eingelegt. Der pH-Wert der Polylysinlösung wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt. Das Polylysin koazervierte mit der adsorbierten Poly(acrylsäure), um eine transient vernetzte Poly(lysin)-Schicht zu bilden. Die Benetzbarkeit des Fasernetzes wurde mit einem unbehandelten Fasernetz verglichen, indem ein kleiner Tropfen Wasser auf das Netz aufgebracht wurde, während das Netz in der Luft horizontal schwebend gehalten wurde. Das Wassertröpfchen blieb in tropfenähnlicher Halbkugelform auf dem unbehandelten PGA:PLA-Netz, während auf dem erfindungsgemäß behandelten PGA:PLA-Netz das Wasser sofort durch das Netz hindurchfiel, wodurch eine Zunahme der Hydrophilie der behandelten Membran im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle demonstriert wurde.
BEISPIEL 22
Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren zur reversiblen Stabilisierung einer Schicht von Poly(vinylalkohol) (PVA) auf einem abbaubaren Polymerträger und weist ein Verfahren zum Gefrieren und Auftauen des PVA auf. Bei dem Verfahren wird eine Probe von 2 cm × 2 cm PGA:PLA (Vicryl) 30 Sekunden in IPA eingeweicht und 10 Minuten in eine 1%-ige wäßrige Lösung von PVA (Spectrum) eingelegt. Der Träger wurde dann bei –20°C in einen Gefrierschrank eingebracht. Nach 6 Stunden wurde die Probe aus dem Gefrierschrank entnommen und ihre Erwärmung auf Raumtemperatur abgewartet. Nach 6 Stunden wurde die Probe wieder bei –20°C in einen Gefrierschrank eingelegt. Nach 11 Stunden wurde die Probe wieder auf Raumtemperatur gebracht. Nach 3 Stunden wurde die Probe zweimal 5 Minuten in destilliertes Wasser eingelegt. Die Probe wurde 30 Sekunden in IPA gespült und an der Luft getrocknet.
Durch diesen Prozeß wurden Wasserstoffbindungen zwischen den Hydroxylgruppen des PVA erzeugt. Die Benetzbarkeit des Fasernetzes wurde mit einem unbehandelten Fasernetz verglichen, indem ein kleiner Tropfen Wasser auf das Netz aufgebracht wurde, während das Netz horizontal in der Luft hängend gehalten wurde. Das Wassertröpfchen blieb in tropfenähnlicher Halbkugelform auf dem unbehandelten PGA:PLA-Netz, während auf dem erfindungsgemäß behandelten PGA:PLA-Netz das Wasser in das Netz einsickerte und innerhalb von 50 Sekunden vollständig absorbiert wurde, wodurch eine Zunahme der Hydrophilie der behandelten Membran im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle demonstriert wurde.
BEISPIEL 23
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Nachweis des Vernetzungsgrades von Poly(vinylalkohol) (PVA) auf einem biologisch abbaubaren Trägerelement. Zum Nachweis der freien Hydroxylgruppen des PVA vor und nach der Vernetzung, wie in Besispiel 22 beschrieben, wurde Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Totalreflexion (ATR-FTIR) angewandt. Eine Verschiebung der Peakposition der Hydroxylgruppe (OH) von etwa 3349 cm^–1 nach etwa 3383 cm^–1 bei Abnahme der Peakintensität ist proportional zum Vernetzungsgrad. Eine Abnahme der Peakintensität von etwa 50% und eine Verschiebung von etwa 3349 cm^–1 nach etwa 3383 cm^–1 wird erwartet, wenn etwa 50% der Hydroxylgruppen des PVA vernetzt sind.
BEISPIEL 24
Dieses Beispiel veranschaulicht die vorliegende Erfindung mit einem biologisch abbaubaren Trägerelement, das aus einer Dünnschicht aus Poly(milchsäure): Poly(glycolsäure)-(PLA:PGA-) Copolymer in einem Verhältnis von 85:15 PLA zu PGA besteht, die eine metallische Gefäßprothese (Stent) bedeckt, um einen Verbundstoff zu bilden. Zum Aufbau des Verbundstoffs wird ein Nitinoldraht-Stent mit dem PLA:PGA-Filmträgerelement bedeckt. Nach dem Aufbau wird das Verbundelement in Isopropylalkohol getaucht, um das Trägerelement vorzunetzen. Anschließend wird es etwa 5 Minuten in eine wäßrige Lösung von etwa 1 % Polyethylenimin (PEI) in Aceton getaucht und danach etwa 10 Minuten in destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Massecopolymerat zu entfernen. Das adsorbierte PEI wird vernetzt, wie ausführlich in Beispiel 3 beschrieben, um eine erste Schicht auf der Trägerelement-Komponente des Stent-Verbundelements zu bilden. Eine gewünschte bioaktive Spezies, wie z. B. Heparin, wird dann auf der ersten Schicht immobilisiert. Es wird erwartet, daß durch die Gegenwart des bioaktiven Mittels die mit dem Element verbundene Thrombusbildung verringert wird.
BEISPIEL 25
Dieses Beispiel beschreibt die Anlagerung von antiadhäsiven Verbindungen an resorbierbare Materialien, um frühe entzündliche Ereignisse in Verbindung mit Fremdkörperreaktionen in vivo zu verhindern. Polyethylenglycol (PEG) wird über verfügbare funktionelle Gruppen an PEI-beschichtete PGA:PLA-Membranen angelagert. Es wird erwartet, daß die Gegenwart von PEG-Molekülen die Adsorption von Proteinen verhindert und daß dadurch die Anlagerung von Zellen an die Membran verhindert wird.
BEISPIEL 26
Dieses Beispiel beschreibt die Anlagerung eines Proteins an ein resorbierbares Gerüst, um die Beladung der Membran gegenüber der Beladung einer unbehandelten Membran zu erhöhen. Als Modellprotein zur Verwendung in diesem Beispiel wurde Rinderserumalbumin (BSA) gewählt. BSA (Fraktion V, Sigma) wurde gemäß dem folgenden Protokoll mit ¹²⁵I markiert: Ein mit Silicon behandeltes 1,5 ml-Mikrozentrifugenglas (Fisher) wurde vorher durch Füllen mit 200 ml Lösung von 20 mg/ml Iodo-Gen-Reagenz und Trocknenlassen über Nacht mit Iodo-Gen-Reagenz (Pierce) beschichtet. Das Glas wurde bis zum Gebrauch bei 4°C gelagert. Am Tag der Iodierung wurde das Reaktionsglas mit PBS (Gibco/BRL) gespült, dann wurden 30 mg BSA (7,5 ml BSA mit 4 mg/ml), 5 ml Na¹²⁵I (1 mCi, Amersham) und 44 ml PBS, pH 7,2, in den Reaktionsbehälter gegeben. Das Glas wurde 25 Minuten leicht geschüttelt, dann wurde die gesamte Lösung in eine NAP-5-Reinigungssäule (Pharmacia) umgefüllt, die mit PBS, pH 7,2, voräquilibriert worden war. Zehn 200 ml-Fraktionen wurden durch Schwerkraft-Abtropfen aufgefangen, wobei jeweils 200 ml Elutionsmittel zugesetzt wurden und abgewartet wurde, bis die Säule aufgehört hatte zu tropfen, bevor der Prozeß fortgeführt wurde. Um die Fraktionen mit iodiertem Protein zu identifizieren, wurde 1 ml von jeder Fraktion 33 ml BSA-Lösung (10 mg/ml in PBS) zugesetzt, der 333 ml Trichloressigsäure-(TCA-)Lösung (100 mg/ml in destilliertem Wasser) zugesetzt wurden. Die Proben wurden 1 Stunde bei 4°C inkubiert und bildeten eine trübe Lösung. Die Proben wurden zentrifugiert, die flüssigen Fraktionen wurden in ein neues Glas umgefüllt, und die Radioaktivität sowohl der festen als auch der flüssigen Fraktionen wurde gemessen. In den Proben 5, 6 und 7 wurde signifikante Radioaktivität (>95%) in der festen Fraktion gefunden. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und bei 4°C gelagert, bis sie gebraucht wurden.
Die Trägerpolymerproben wurden auf die folgende Weise hergestellt: zwei 2 × 2 cm-Stücke PGA:PLA-Netz (Vicryl^TM) wurden zugeschnitten und 30 Sekunden in 30 ml IPA eingelegt, 10 Minuten in 10 ml einer 0,5%-igen PEI-Lösung in Carbonatpuffer, pH 9,6, eingeweicht, 5 Minuten in 30 ml Carbonatpuffer gespült, 3 Minuten in 10 ml Aceton gespült, dann 2 Stunden unter. Rühren in eine EGS-Lösung gegeben (0,122 g EGS in 15 ml Aceton). Nach 2 Stunden wurden die Proben 15 Minuten unter Rühren in die ursprüngliche PEI-Lösung eingelegt, um die Beschichtung zu verstärken, dann wurden die Proben zweimal 5 Minuten mit 30 ml destilliertem Wasser gespült. Schließlich wurden die Proben 30 Sekunden mit 30 ml IPA gespült und an der Luft getrocknet. Ein Abschnitt von 5 × 5 mm von jeder Probe wurde entnommen und mit Ponceau S-Färbemittel gefärbt, um die Anlagerung von Aminogruppen zu bestätigen. Das Ponceau S-Färbemittel zeigte eine gleichmäßige Rotfärbung, was auf die Gegenwart von transient immobilisierten Aminogruppen schließen ließ. Eine der Proben wurde in vier 1 × 1 cm-Stücke geschnitten, wovon drei zur Messung der Konzentration von Aminogruppen durch den Sulfo-SDTB-Test verwendet wurden. Die Ergebnisse waren:
Die andere Probe wurde zur Immobilisierung von ¹²⁵I-BSA verwendet. Sechs PEI-beschichtete Segmente wurden zugeschnitten (je 5 × 5 mm), zusammen mit sechs unbehandelten Proben (5 × 5 mm), und nach dem folgenden Schema zur Reaktion gebracht:
Die Proben wurden 10 Minuten in 0,2 ml BSA-Lösung eingelegt (entnommen aus 50 ml von 4 mg/ml BSA in PBS, pH 7,2, versetzt mit 100 ml ¹²⁵I-BSA, spezifische Aktivität 156 cpm/mg), dann wurden 80 ml Sulfo-EGS-Lösung (4,5 mg Sulfo-EGS in 900 ml PBS, pH 7,2) den Gruppen 2 und 4 zugesetzt, und 80 ml PBS wurden den Gruppen 1 und 3 zugesetzt. Die Lösungen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, die Membranen wurden entnommen und individuell zweimal in 0,5 ml PBS gewaschen. Die nach dem Spülen an den Membranen angelagerte Proteinmenge wurde bestimmt und ist nachstehend dargestellt:

angelagertes Protein

Gruppe (mg/cm²)

1 6,2 ± 1,4

2 8,5 ± 0,2

3 23,6 ± 1,4

4 21,9 ± 3,5
BEISPIEL 27
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Aminogruppen durch die Gegenwart des Elements Stickstoff nach Modifikation eines Trägers zur Anlagerung von Polylysin- oder Polyethylenimin-Schichten an den Träger. Proben, die keinen Stickstoff in dem Träger enthalten (z. B. PLA und PGA), werden durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie analysiert, um Stickstoff in der ersten und/oder zweiten Schicht nachzuweisen. Es wird erwartet, daß die Analyse von Oberflächen, die Polylysin oder Polyethylenimin enthalten, die Gegenwart von Stickstoff demonstriert.
BEISPIEL 28
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Hydroxylgruppen durch die Gegenwart von -OH-Gruppen (Molekulargewicht: 17 g/mol) auf der Oberfläche. Zur Analyse der Oberfläche von modifizierten Proben wurde statische Sekundärionenmassenspektroskopie (statische SIMS) angewandt. Es wird erwartet, daß die Gegenwart eines Peaks bei 17 Atommasseeinheiten (amu) die Gegenwart von Hydroxylgruppen auf einem Träger anzeigt, der normalerweise keine Hydroxylgruppen enthält.

Claims

Biologisch abbaubares Material (10) zur Immobilisierung von bioaktiven Spezies auf diesem, wobei das Material umfaßt: ein poröses hydrophobes biologisch abbaubares Trägerteil (12); eine erste Schicht (14), die aus mindestens einer Spezies eines Polymertensids besteht, das in das Trägerteil adsorbiert und auf diesem mittels eines Vernetzungsmittels vernetzt ist, wobei die erste vernetzte Schicht chemische Bindungen hat, die dem Abbau unter In-vivo-Bedingungen ausgesetzt sind, wobei sich das Polymertensid von dem porösen hydrophoben biologisch abbaubaren Trägerteil chemisch unterscheidet, wobei sich das Vernetzungsmittel von dem Trägerteil (12) und dem Polymertensid chemisch unterscheidet und wobei die erste Schicht (14) eine chemisch reaktionsfähige Gruppe (26) zur Anlagerung mindestens einer bioaktiven Spezies auf dieser hat.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, ferner umfassend mindestens einen bioaktiven Speziestyp (28), der auf der ersten Schicht (14) angelagert ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei die vernetzten chemischen Bindungen durch enzymatische Spaltung oder nichtenzymatische Hydrolyse abgebaut werden.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei die vernetzten chemischen Bindungen der ersten Schicht (14) durch Säure-Basen-Koazervation, Carboxylsäure-Ether-Komplexierung, Ionenkomplexierung, Ionenwechselwirkungen, Metallkomplexierung oder Alkoholwasserstoffbindung ausgebildet werden.
Biologisch abbaubares Material (10) nach Anspruch 2, wobei die bioaktive Spezies (28) ein rekombinantes morphogenetisches Menschenknochenprotein-2 (rhBMP-2) ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Trägerteil (12) aus einem Bestandteil der Gruppen ausgewählt ist, die aus folgendem bestehen: Polyglycolid (PGA), Glycolid-Copolymeren, Glycolid/L-Lactid-Copolymeren (PGA/PLLA), Lactid/Trimethylencarbonat-Copolymeren (PLA/TMC), Glycolid/Trimethylencarbonat-Copolymeren (PGA/TMC), Polylactiden (PLA), PLA-Stereo-Copolymeren, Poly-L-Lactid (PLLA), Poly-DL-Lactid (PDLLA), L-Lactid/DL-Lactid-Copolymeren, PLA-Copolymeren, Lactid/Tetramethylglycolid-Copolymeren, Lactid/α-Valerolacton-Copolymeren, Lactid/ε-Caprolacton-Copolymeren, PLA/Polyethylenoxid-Copolymeren, Poly-β-Hydroxybutyrat (PHBA), PHBA/β-Hydroxyvalerat-Copolymeren (PHBA/HVA), Poly-p-Dioxanon (PDS), Poly-α-Valerolacton, Poly-ε-Caprolacton, Methylmethacrylat-N-Vinylpyrrolidon-Copolymeren, Oxalsäure-Polyestern, Polyalkyl-2-Cyanacrylaten, Polyurethanen und Mischungen aus den vorstehend erwähnten Polymeren.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Trägerteil (12) aus einem Bestandteil der Gruppen ausgewählt ist, die aus folgendem bestehen: Polybutylenoxalat, Polyethylenadipat, Polyethylencarbonat und Polybutylencarbonat und Mischungen aus den vorstehend erwähnten Polymeren.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Trägerteil (12) aus einem Bestandteil der Gruppen ausgewählt ist, die aus Polyestern, die Silylether enthalten, und Mischungen aus den vorstehend erwähnten Polymeren bestehen.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Polymertensid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Dextran, Agarose, Alginat, Polyacrylamid, Polyglycidol, Polyvinylalkohol-Copolyethylen, Poly(vinylacetat-Covinylalkohol), Polyamid, Polylysin, Polyethylenimin, Poly-β-Malinsäure, Hyaluronsäure, Derivate der Hyaluronsäure und Polyvinylpyrrolidon allein oder in Kombination.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Polymertensid ein Polysaccharid umfaßt.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Vernetzungsmittel eine Verbindung mit mindestens zwei chemisch funktionellen Gruppen umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Aldehyden, Epoxiden, Acylhaliden, Alkylhaliden, Isocyanaten, Aminen, Anhydriden, Säuren, Alkoholen, Haloacetalen, Arylcarbonaten, Thiolen, Esters, Imiden, Vinylen, Aziden, Nitros, Peroxiden, Sulfonen und Maleimiden.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, wobei das Vernetzungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Vinylsulfon, Succinylchlorid, Polyanhydriden, Succinimidylsuccinat-Polyethylenglycol und Succinimidylsuccinamid-Polyethylenglycol.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 1, ferner umfassend: eine zweite Schicht (46), die aus mindestens einer Spezies eines Polymertensids besteht, das auf der ersten Schicht angelagert ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 13, ferner umfassend mindestens einen bioaktiven Speziestyp (49), der auf der zweiten Schicht angelagert ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 14, wobei die bioaktive Spezies (49) rekombinantes morphogenetisches Menschenknochenprotein-2 (rhBMP-2) ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 13, wobei das Polymertensid der zweiten Schicht (46) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Polyvinylalkohol, Polylysin, Polyacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol, Alginat, Agarose, Poly-β-Malinsäure, Hyaluronsäure, Hyaluronsäurederivaten, Polyethylenimin, Polyallylamin, Polyornithin und deren Copolymeren, entweder allein oder in Kombination.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 2, wobei eine Spacer-Verbindung (48) zwischen der ersten Schicht und der bioaktiven Spezies angeordnet ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 17, wobei die Spacer-Verbindung (48) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bernsteinsäure, Diaminohexan, Glyoxylsäure, kurzkettigem Polyethylenglycol und Glycin besteht.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 17, wobei die Spacer-Verbindung (48) spaltbar ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 19, wobei die spaltbare Spacer-Verbindung (48) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyhydroxysäuren, Polyanhydriden, Polyaminosäuren, Tartaraten und Cystein-Linkern besteht.
Biologisch abbaubares Material (10) nach Anspruch 1, wobei das poröse Trägerteil (12) Poly(glycolsäure) umfaßt; und die erste Schicht (14) Poly(ethylenimin) umfaßt, das in das Trägerteil adsorbiert ist, wobei das Poly(ethylenimin) mittels eines Vernetzungsmittels, das kovalente Bindungen bildet, die einer enzymatischen Spaltung oder nichtenzymatischen Hydrolyse ausgesetzt sind, mit sich selbst vernetzt ist.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 21, ferner umfassend eine zweite Schicht (46), die auf der ersten Schicht angelagertes Poly(ethylenimin) umfaßt.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 21, ferner umfassend eine auf der ersten Schicht (14) angelagerte bioaktive Spezies (28), wobei die bioaktive Spezies ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die Arginin, Glycin und Asparaginsäure umfaßt.
Biologisch abbaubares Material nach Anspruch 22, ferner umfassend ein auf der zweiten Schicht (46) angelagerte bioaktive Spezies (48), wobei die bioaktive Spezies ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die Arginin, Glycin und Asparaginsäure umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Materials zur Immobilisierung bioaktiver Spezies auf diesem, wobei das Verfahren umfaßt: Bereitstellen eines porösen hydrophoben biologisch abbaubaren Trägerteils; Adsorbieren einer ersten Schicht, die aus mindestens einem Polymertensidtyp besteht, in das Trägerteil, wobei das Polymertensid sich vom Trägerteil chemisch unterscheidet; und Vernetzen des Polymertensids mit sich selbst mittels chemischer Bindungen, die dem Abbau im Empfänger ausgesetzt sind.
Verfahren nach Anspruch 25, ferner umfassend: Anlagern mindestens eines bioaktiven Speziestyp auf der ersten Schicht.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die bioaktive Spezies rekombinantes morphogenetisches Menschenknochenprotein-2 (rhBMP-2) ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polymertensid mittels eines Vernetzungsmittels vernetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polymertensid mittels nichtkovalenter Bindungen vernetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Polymertensid durch eines von folgendem vernetzt ist: polare Cyanwechselwirkungen, Säure-Basen-Koazervation, Carboxylsäure-Ether-Komplexierung, Ionenkomplexierung, Metalkomplexierung oder Alkohol-Wasserstoff-Bindung.
Verfahren nach Anspruch 25, ferner umfassend: Anlagern einer zweiten Schicht bestehend aus mindestens einem Polymertensidtyps auf der ersten Schicht.
Verfahren nach Anspruch 31, ferner umfassend: Anlagern mindestens eines bioaktiven Speziestyp auf der ersten Schicht.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die bioaktive Spezies rekombinantes morphogenetisches Menschenknochenprotein-2 (rhBMP-2) ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Polymertenside aus einem Bestandteil der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgendem besteht: Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Dextran, Agarose, Alginat, Polyacrylamid, Polyglycidol, Polyvinylalkohol-Copolyethylen, Poly(ethylenglycol-Copropylenglycol) Poly(vinylacetat-Covinylalkohol), Polytetrafluorethylen-Covinylalkohol), Poly(acrylnitril-Coacrylamid), Poly(acrylnitril-Coacrylsäure-Acrylamidin), Polyacrylsäure, Polylysin, Polyethylnimin, Polyvinylpyrrolidon, Poly-β-Malinsäure, Hyaluronsäure, Derivaten der Hyaluronsäure, Polyhydroxyethylmethacrylat und Polysaccharide und deren Copolymeren, entweder allein oder in Kombination.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Polymertenside der zweiten Schicht aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgendem besteht: Polyvinylalkohol, Polylysin, Polyacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol, Alginat, Agarose, Poly-β-Malinsäure, Hyaluronsäure, Hyaluronsäurederivaten, Polyethylenimin, Polyallylamin, Polyornithin und deren Copolymeren, entweder allein oder in Kombination.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Vernetzungsmittel aus einem Bestandteil der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Vinylen, Imidazolen, Carbamaten, Aldehyden, Epoxiden, Acylhaliden, Akylhaliden, Isocyanaten, Aminen, Anhydriden, Säuren, Alkoholen, Thiolen, Esters, Imiden und Maleimiden.
Verfahren nach Anspruch 28, ferner umfassend: Verwenden einer ausreichenden Vernetzungsmittelmenge beim Vernetzen der Polymertenside, so daß nicht in Reaktion getretene chemisch reaktionsfähige Gruppen des Vernetzungsmittels vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 28, ferner umfassend: Vernetzen der Polymertenside mittels eines Vernetzungsmittels unter Bedingungen, die keine Polymerisation des Vernetzungsmittels hervorrufen.
Verfahren nach Anspruch 28, ferner umfassend: Verwenden eines Katalysators mit dem Vernetzungsmittel, der sich nach dem Vernetzungsschritt zu einem Gas entwickelt.