DE10036907B4

DE10036907B4 - Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem mit Gold bedampften Glassubstrat, Beschichtung hergestellt nach diesem Verfahren und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10036907B4
Application number: DE10036907A
Authority: DE
Inventors: Dipl.-Chem. Gedig Erk; Dr.rer.nat. Haalck Lutz
Original assignee: Xantec Bioanalytics GmbH
Current assignee: Xantec Bioanalytics GmbH
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2012-03-22
Anticipated expiration: 2020-07-29
Also published as: GB2381482B; GB2381482A; US20050042455A1; WO2002010759A3; GB0304305D0; WO2002010759A2; DE10036907A1; AU2001282034A1; US8012587B2

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem mit Gold bedampften Glassubstrat, wobei das Substrat mit einer Lösung aus 0,1% Poly(ethylen-co-maleinsäureco-maleinsäuremono(carboxymethylethylsulfid)ester) in Wasser überschichtet und 1 h lang geschwenkt wird und das Substrat durch einstündige Beaufschlagung mit 20 mM N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und 10 mM N-Hydroxysuccinimid in 0,1 M Natrium 2-Morpholino-ethansulfonatpuffer pH 6,0 in die aktiven NHS Ester überführt wird und das getrocknete Substrat mit wenigen μl einer Lösung aus 20% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa, 2% Glucuronsäure und 1% Dimethylaminopyridin überschichtet wird und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen wird, 10 min bei 50°C inkubiert und anschließend nicht gebundenes Dextran durch 5 minütiges Behandeln mit 0,1 M HCl abgelöst wird, oder das Substrat mit einer Lösung aus 5% Polyethylenimin MW 600–1000 kDa in Wasser 15 min lang geschwenkt wird und nach Spülen mit dest. Wasser das aminofunktionalisierten getrocknete Substrat mit einer Lösung aus 15% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa in je...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem mit Gold bedampften Glassubstrat, nach diesem Verfahren hergestellte Beschichtung und deren Verwendung. Derartige Substratbeschichtungen werden häufig für Vorrichtungen verwendet, die in Kontakt mit biologischen Medien stehen, wie z. B. bioanalytische Vorrichtungen oder Implantate. Hierfür werden weitestgehend bioinerte – also möglichst wechselwirkungsarme – Oberflächen bevorzugt.
Nach dem Stand der Technik finden meist hydrophile Polymere als Substratbeschichtung Verwendung. Hierzu zählen Polyether, wie z. B. Polyethylenglycol; Polysaccharide, wie Heparin oder Dextran; Polyalkohole, wie z. B. Polyvinylalkohol; oder auch Polyamide, wie z. B. Polyacrylamid. Für biosensorische Zwecke haben sich dünne Hydrogelschichten aus carboxylierten Polysacchariden, wie beispielsweise Carboxymethyldextran bewährt ( US 5 436 161 A ), da diese die Sensoroberfläche nicht nur gegen unspezifische Wechselwirkungen abschirmen, sondern über die Carboxylfunktionalitäten auch eine effiziente Immobilisierung von verschiedenen Biomolekülen ermöglichen.
Die verwendete Methode zur Anbindung der Polymere an das Substrat ist in der Regel vom verwendeten Substratmaterial abhängig.
An Glas und andere oxidische Oberflächen wird üblicherweise zunächst ein kupplungsfähiges Silan gebunden (Silanisierung), an welches in einem zweiten Schritt ein hydrophiles Polymer gekoppelt wird. Die Herstellung qualitativ hochwertiger Silanschichten bedingt allerdings den Einsatz organischer Lösungsmittel und ist relativ arbeitsaufwendig.
Edelmetalle können über einen Monolayer aus bifunktionellen langkettigen Alkylmercaptanen funktionalisiert werden. An die aktivierten funktionellen Gruppen werden dann dünne Polysaccharidschichten kovalent gebunden, welche zwecks Einführung kupplungsfähiger Funktionalitäten später carboxymethyliert werden. Da die selbstorganisierten Monolagen den Nanorauhigkeiten der Metalloberfläche folgen, kommt es zu punktuellen Inhomogenitäten, den sog. Pinhole-defects. Weiterhin läßt sich die Dichte der später eingeführten Carboxylfunktionen nicht, bzw. nur schwer einstellen.
Kunststoffsubstrate lassen sich durch den Einsatz von Oxidationsmitteln, Plasma oder ionisierender Strahlung unselektiv funktionalisieren. Weiterhin wurden Polyamine in dünner Schicht adsorbiert, woran wiederum Polyethylenglycol (PEG) kovalent gebunden werden konnte (Bergström et al. (1992) J. Biomed. Mat. Res., 26, 779–790). Ein Nachteil bei dieser Methode besteht jedoch darin, daß zur nachfolgenden kovalenten Immobilisierung von Liganden lediglich die terminale funktionelle Gruppe der PEG-Kette zur Verfügung steht. Aus demselben Grund ist auch die Immobilisierungsdichte von Polyethylenglycol nicht besonders hoch.
Eine substratunabhängige Möglichkeit zur Oberflächenderivatisierung besteht in der Plasmaabscheidung von dünnen Polymerfilmen geeigneter Funktionalität auf dem Substrat mit anschließender kovalenter Anbindung des gewünschten hydrophilen Polymers ( WO 94/06485 A1 ). Auch diese Methode bedingt einen vergleichsweise hohen apparativen Aufwand und liefert dazu häufig nur geringe Dichten an kupplungsfähigen Gruppen. Darüber hinaus ist die Dicke der abgeschiedenen Polymerisatschichten schwer steuerbar.
Weiterhin werden beispielsweise in DE 40 26 978 A1 mehrlagige selbstorganisierte Polyelektrolytschichten beschrieben, die alternierend auf ein Substrat aufgebracht sind. Die Polymerketten liegen hierbei in Train-Konfiguration (parallel zur Oberfläche) bzw. Train-Loop-Konfiguration (teilweise flach auf der Oberfläche, teilweise schleifenartig abstehend) vor. Diese Techniken der alternierenden Polyelektrolytadsorption sowie deren Varianten bewirken nur ein geringes Schichtdickenwachstum pro Schritt (wenige nm). Die Anordnung der Polymerketten parallel zur Oberfläche führt zu zweidimensionalen Strukturen mit geringer Immobilisierungskapazität. Darüber hinaus können Biomoleküle, die größer als wenige kDa sind, nicht oder nur sehr schwer durch diese Schichten hindurchdiffundieren (Siebeffekt).
EP 0 751 823 B1 offenbart die Beschichtung von hydrophoben Substraten mit amphiphilen Polymeren, die anschließend mit Glycidol umgesetzt wird.
WO 99/49124 A2 beschreibt ebenso wie die WO 98/28026 A1 eine Beschichtung mit diversen Polymeren. Es wird jedoch keine hydrophile Polymerschicht aus mindestens zwei unterschiedlichen Polymeren, die sich in der chemischen Zusammensetzung, der Ladung und/oder ihrem Molekulargewicht unterscheiden, offenbart.
EP 0 853 947 A1 und US 4 521 564 A beschreiben Methoden zur Herstellung von Polycarboxylat-Polyethylenimin Systemen.
US 5 916 585 A befasst sich mit der Immobilisierung von bioaktiven Substanzen auf biologisch biologisch abbaubaren, hydrophilen Polymeren.
US 4 565 740 A offenbart die Verwendlung eines Polyamins, hier Polymin SN, und eines hydrophilen Polymers, Dextransulfat, zur Beschichtung eines Substrates und die anschließende Immobilisierung von Heparin.
Die WO 94/03530 A1 lehrt ein Verfahren zur Modifizierung der Bindungseigenschaften auf einer Oberfläche einer Festphase mit nukleophilen Gruppen, wobei die Oberfläche mit einer Lösung aktivierter Polysaccharide behandelt wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellte Beschichtung für goldbedampfte Glassubstrate zur Verfügung zu stellen, mit der unspezifische Adsorptionen vermieden und gleichzeitig eine einstellbare Immobilisierungskapazität erzielt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren zur Herstellung der Beschichtung nach Anspruch 1, der Beschichtung gemäß Anspruch 2 sowie der Verwendung nach Anspruch 3 gelöst.
Die erfindungsgemäße hergestellte Beschichtung mit den beschriebenen Eigenschaften läßt sich dadurch erzeugen, dass das gereinigte Glassubstrat zunächst mit einer dünnen polymeren Haftvermittlerschicht überzogen wird, an die eine weitere hydrophile Polymerschicht aus mindestens einem Polymer gekoppelt wird, deren Polymerketten zumindest teilweise senkrecht zur Substratoberfläche, also bürstenartig, ausgerichtet sind. Anhand des Anteils der bürstenartig ausgerichteten Polymerketten kann die Immobilisierungskapazität dieser Schicht gegenüber z. B. Biomolekülen eingestellt werden.
Dabei kann sich die hydrophile Polymerschicht aus unterschiedlichen Polymeren zusammensetzen. Dies hat den Vorteil, dass die Permeabilität der hydrophilen Polymerschicht für Biomoleküle mit unterschiedlichem Molekulargewicht gesteuert werden kann. Dies erfolgt, indem das Konzentrationsverhältnis zwischen nieder- und hochmolekularen Polymeren, welche die hydrophile Polymerschicht ausbilden, den zu untersuchenden Molekülen entsprechend eingestellt wird.
Als hydrophile Polymere werden Dextrane eingesetzt, die zusätzlich noch durch weitere Reaktionsschritte chemisch funktionalisiert werden können. Hierzu zählen z. B. mit Isothiocyanat-, Isocyanat-, Carbonsäureazid-, N-Hydroxysuccinimidester-, N-Acylimidazol-, Sulfonylchloridderivat-, Aldehyd-, Keto-, Glyoxal-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhalogenid-, Imidoester-, Anhydrid-, Halogenalkyl-, Halogenacyl-, Maleimid-, Aziridin-, Acryloyl-, Sulhydryl-, Disulfid-, Diazoalkan-, Diazoacetyl-, Imidazolylcarbamat-, Hydrazid-, Diazonium-, Arylazid-, Benzophenon-, Diazopyruvat oder Diaziringruppen. Darüber hinaus ist eine Funktionalisierung z. B. mit Nitrilotriessigsäurederivaten möglich, wodurch Liganden über ein Metallchelat immobilisiert werden können. Die Ankopplung von Molekülen, die anhand einer biospezifische Erkennungsreaktion Liganden immobilisieren können, ist gleichfalls möglich.
Die polymere Haftvermittlerschicht der erfindungsgemäß hergestellten Beschichtung ist parallel zur Substratoberfläche angeordnet, was eine gute Haftung der Polymerketten auf dem Glassubstrat sowie eine hohe Dichte kupplungsfähiger funktioneller Gruppen bewirkt.
Struktur und Immobilisierungskapazität der erfindungsgemäß hergestellten Hydrogelstrukturen lassen sich durch Veränderung der Adsorptions- und Kupplungsbedingungen steuern. Neben Verringerung der Konzentration des zweiten Polymers, welche zu Schleifen- und Trainstrukturen führt, läßt sich durch Veränderungen von pH und Salzgehalt bei der Adsorption des Haftvermittlerpolymers ein nanorauher Untergrund erzeugen, auf den, wie oben beschrieben, die zweite Polymerschicht in Brushkonformation aufgebracht werden kann. Durch ihre erhöhte Oberfläche besitzen sie eine höhere Immobilisierungskapazität als planare Strukturen, ohne dabei die für dickere Hydrogele charakteristische Diffusionslimitierung aufzuweisen.
Als polymere Haftvermittlerschicht werden Poly(ethylen-co-maleinsäuremono(carboxymethylethylsulfid)ester, Polyethylenimin oder Polyallyamin eingesetzt.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Beschichtung werden mit Gold bedampfte Glassubstrate verwendet, die als leitfähiges Substrat elektrochemisch eingesetzt werden können. Die Schichten sind zudem elektrochemisch und für Ionen begrenzt permeabel. Dies führt dazu, daß Biomoleküle durch Anlegen eines Potentials an ein darunterliegendes Metallsubstrat unter bestimmten Bedingungen selektiv und reversibel in der bürstenartigen Polymerschicht angereichert werden können. Immobilisiert man Enzyme in der Polymerschicht, erhält man bei Anlegen eines geeigneten Potentials einen extrem schnell ansprechenden Enzymsensor.
Ebenso kann als Substrat ein Glasmaterial eingesetzt werden, wobei dieses durch einen zusätzlichen Reaktionsschritt silanisiert werden kann.
Die Adsorption des Haftvermittlerpolymers sowie die kovalente Anbindung der bürstenartig angeordneten zweiten Polymerschicht können hierbei einfach aus wässerigen Lösungen erfolgen. Da der Aufbau dieses Schichtelements durch Selbstorganisation resp. unter vollständiger Umsetzung der funktionellen Gruppen erfolgt, besitzt das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren eine systemimmanent hohe Fehlertoleranz, die zu konstanten Schichtqualitäten führt.
Für die Verwendung der Beschichtung gemäß Anspruch 3 bieten sich vielfältige Möglichkeiten.
Hierzu zählt die Immobilisierung von Liganden in einem Affinitätssensor ebenso wie die Immobilisierung von Enzymen in amperometrischen Enzymsensoren. Aber auch eine Selektivitätssteigerung von Sensoren wird ermöglicht, indem Moleküle oberhalb eines bestimmten Molekulargewichts ausgeschlossen werden können, wobei die Grenze durch die Struktur der Beschichtung eingestellt werden kann.
Bei der Verwendung leitfähiger Substrate besteht die Möglichkeit, die Beschichtungen durch Anlegen eines Potentiales für die Immobilisierung von Biomolekülen, in einer weiterführenden Variante auch für die stationäre Chromatographie einzusetzen.
Weitergehende Verwendungsmöglichkeiten bestehen auch im Einsatz als schmutzabweisende Beschichtungen oder Antihaftbeschichtungen in wäßrigen Medien. Dazu zählt auch die Beschichtung von Füllkörpern von Bioreaktoren, ebenso wie die bioinerte Beschichtung von medizinischen Geräten, die in Kontakt mit biologischen Medien stehen.
Für optische Elemente kann die Beschichtung als Antibeschlagsbeschichtung ebenso wie für die Retention von Flüssigkeiten eingesetzt werden.
Im folgenden werden verschiedene Ausführungen und Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäß hergestellten Beschichtung anhand der folgenden schematischen Figuren und weiterer Anwendungsbeispiele näher dargestellt.
1 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäß hergestellten Beschichtung. Das hier bezeichnete Substrat (3) ist mit einer polymeren Haftvermittlerschicht (2) überzogen, wobei deren Polymerketten parallel zur Substratoberfläche angeordnet sind, so dass eine hohe Dichte funktioneller Gruppen vorliegt, die für die weitere Ankopplung des hydrophilen Polymers (1) geeignet ist. Das hydrophile Polymer (1) ist dabei senkrecht zur Substratoberfläche angeordnet, so dass eine Vielzahl funktioneller Gruppen (4) für die Immobilisierung von Biomolekülen zur Verfügung steht.
2 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäß hergestellten Beschichtung auf einer im Nanomaßstab und/oder Mikromaßstab aufgerauhten Oberfläche. Diese fraktalen Strukturen bilden sich, wenn die Konzentration des Haftvermittlers vergrößert wird, so dass sich die Haftvermittlerschicht nicht vollständig parallel zur Substratoberfläche ausrichtet, sondern auch teilweise schleifenartig vom Substrat absteht. Aufgrund der erhöhten Oberfläche kann so eine erhöhte Immobilisierungskapazität gegenüber der in 1 dargestellten planaren Struktur erreicht werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die bei Verwendung von hydrophilen Polymeren höheren Molekulargewichts charakteristische Diffusionslimitierung vermieden werden kann.
In 3 ist die gemischte Belegung des Substrats mit hydrophilen Polymeren unterschiedlichen Molekulargewichts und Ladungsdichten schematisch dargestellt. (1a) ist ein Polymer mit einem höheren Molekulargewicht und einer höheren Dichte negativ geladener funktioneller Gruppen (4), als Polymer (1b). Beide Polymere können in einem Arbeitsgang via einen Haftvermittler (2) auf ein Substrat (3) gebracht werden. Vorteile derartiger Strukturen liegen in einem über das Mischungsverhältnis (1a) zu (1b) einstellbarem räumlichen Abstand zwischen den den höhermolekularen Ketten, wodurch ein Hydrogel mit einstellbarer Porengröße entsteht. Diese läßt sich vorteilhaft zur Steigerung der Selektivität in Sensoren verwenden. Werden Polymere unterschiedlicher Ladungsdichte gemischt und Liganden in einem zweiten Arbeitsgang bevorzugt an die höhergeladenen Ketten gekoppelt, so kann die herabgesetzte Ladung der dazwischenliegenden Bereiche zu deutlich reduzierten unspezifischen Wechselwirkungen führen.
4 zeigt schematisch ein 1 ähnliches Schichtelement, in dem über der hydrophilen Polymerschicht in Bürstenkonformation (4) noch eine weitere vorzugsweise ungeladene in Train Konfiguration vorliegende indifferente Polymerschicht (5) gelegt wurde. Solche Architekturen stellen nach Immobilisierung eines Liganden innerhalb Schicht (4) eine diffusionslimitierte Beschichtung dar, die sich besonders vorteilhaft zur Konzentrationsbestimmung von Analyten in Affinitätssensoren eignet. Des weiteren schirmt Schicht (5) die eigentliche sensitive Schicht (4) gegen unspezifische Wechselwirkungen aus der Probenmatrix ab und kann ebenfalls als molekularer Filter genutzt werden.
Beispiel 1: Carboxymethyl (CM) Dextran mit reduziertem Carboxymethylierungsgrad.
Zu einer Lösung von 0,5 g Dextran MW 60 kDa (Sigma) in 10 ml 3 M NaOH werden unter ständigem Rühren 0,74 g Iodessigsäure gegeben. Nach 70 min bei Raumtemperatur neutralisiert man mit Phosphorsäure und dialysiert gegen dest. Wasser. Die Carboxymethyldextranlösung wird anschließend auf 1–2 ml eingeengt, mit 5 ml Methanol versetzt und anschließend mit 25 ml Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation, zweimaligem Waschen mit Ethanol und Trocknung im Vakuum erhält man 410 mg weißes Pulver. Der Carboxymethylierungsgrad, der sich beispielsweise durch Rücktitration eines mittels sauren Ionenaustauschern in die freie Säure überführten Aliquots ermitteln läßt, beträgt 1 COOH Gruppe pro sechs Anhydroglucoseeinheiten.
Beispiel 2: CM Dextran Monoschichten auf carboxylfunktionalisierten Oberflächen
1 mm dicke einseitig mit Gold bedampfte Glasplättchen werden gereinigt, mit einer Lösung aus 0,1% Poly(ethylen-co-maleinsäureco-maleinsäuremono(carboxymethylethylsulfid)ester) in Wasser überschichtet und 1 h lang geschwenkt. Die derart carboxylfunktionalisierten Glasplättchen werden durch einstündige Beaufschlagung mit 20 mM N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (Fluka) und 10 mM NHydroxysuccinimid (Merck) in 0,1 M Natrium 2-Morpholino-ethansulfonatpuffer, pH 6,0 (Fluka) in die aktiven NHS Ester überführt. Man überschichtet die getrockneten Substrate mit wenigen μl einer Lösung aus 20% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa (aus Beispiel 1), 2% Glucuronsäure und 1% Dimethylaminopyridin (Merck), zieht das Lösungsmittel im Vakuum ab und inkubiert 10 min bei 50°C. Abschließend wird nicht gebundenes Dextran durch 5 minütige Behandlung mit 0,1 M HCl abgelöst.
Beispiel 3: CM Dextran Monoschichten auf aminofunktionalisierten Oberflächen
1 mm dicke einseitig mit Gold bedampfte Glasplättchen werden gereinigt und mit einer Lösung aus 5% Polyethylenimin MW 600–1000 kDa (Fluka) in Wasser 15 min lang geschwenkt. Nach Spülen mit dest. Wasser werden die aminofunktionalisierten getrockneten Substrate mit einer Lösung aus 15% 1/6 CM Dextran MW 60.000 (aus Beispiel 1) in je 0,1 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (Fluka), N-Hydroxysuccinimid (Merck) und Natriumphosphat, pH 6,0 (Fluka) beaufschlagt und eine Stunde stehengelassen. Das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran behandelt man 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na-Carbonatpuffer pH 9,4, worauf sich nicht kovalent gebundenes CM Dextran ablöst. Die verbleibende Monoschicht weist einen Kontaktwinkel von unter 5° auf.
Beispiel 4: Stabilisierung gegen unspezifische Proteinadsorptionen durch CM Dextran Beschichtungen
Das goldbeschichtete, CM Dextran modifizierte Glassubstrat aus Beispiel 2 wird in einen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Biosensor (IBIS, XanTec) montiert und durch Beaufschlagung mit verschiedenen proteinhaltigen Lösungen auf unspezifische Wechselwirkungen geprüft (3). An eine unbeschichtete Vergleichsfläche werden bereits aus einer Lösung von 1 mg Rinderserumalbumin (BSA)/ml physiologischer Kochsalzpuffer (PBS), pH 7,4 innerhalb kurzer Zeit ca. 5 ng Protein/mm² irreversibel adsorbiert, was einer nahezu vollständigen Belegung entspricht. An die mit Carboxymethyldextran beschichtete Oberfläche findet dagegen selbst bei Beaufschlagung mit unverdünntem foetalen Kälberserum keine Adsorption statt.
Beispiel 5: Erhöhung der Immobilisierungskapazität durch dreidimensionale Hydrogelstrukturen
Ein analog zu Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran MW 500 kDa beschichtetes goldbedampftes Glassubstrat wird in einen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Biosensor (IBIS, XanTec) montiert und die Immobilisierungskapazität der Sensoroberfläche gemessen (4). Bei Beaufschlagung mit einer Lösung von 50 μg BSA/ml 10 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 findet eine ca. fünffach höhere elektrostatische Adsorption statt, als an eine vergleichbare carboxylierte Planare Oberfläche. Im vorliegenden Beispiel wird das angereicherte BSA durch Elutionspuffer (2 M NaCl, pH 13) wieder quantitativ desorbiert. Überführt man vor der Proteinanreicherung einen Teil der Carboxylgruppen mittels 20 mM N-(3-Dimethylaminoprapyl)-N'-ethylcarbodiimid (Fluka) und 10 mM N-Hydroxysuccinimid (Merck) in 0,1 M Natrium 2-Morpholino-ethansulfonatpuffer, pH 6,0 (Fluka) in die aktiven NHS Ester, werden die zunächst elektrostatisch angereicherten Proteine kovalent gebunden und lassen sich folglich nicht mehr eluieren.
Beispiel 6: Dreidimensional-fraktale Hydrogelstrukturen
Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet. Statt Polyethylenimin wird hierbei Polyallylamin (Aldrich Nr. 28,322-3) hohes Molekulargewicht und statt 1/6 Cm Dextran MW 60 kDa wird diesmal vollständig carboxyliertes CM Extran MW 5 kDa verwendet. Dieses spült man einmal mit 2 M NaCl, 10 mM NaOH und eine andere Charge mit 2 M NaCl, 10 mM HCl. Im Fall der sauren Spülung beträgt die Immobilisierungskapazität ca. 8,5 ng BSA/mm2, bei der alkalischen Elution hingegen nur 5,3 ng BSA/mm2. Zurückgeführt werden kann diese Beobachtung auf eine lockere, teilabgelöste Struktur der Polyallylaminketten nach der sauren Elution, die letztlich eine höhere Oberfläche und damit auch eine höhere Immobilisierungskapazität zur Folge hat.
Beispiel 7: Gemischte Hydrogelschichten
Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet, wobei man statt 1/6 CM Dextran MW 60.000 diesmal jedoch eine Mischung aus 7,5% 1/6 CM Dextran MW 5.000 und 7,5% vollständig carboxyliertes Dextran MW 60.000 verwendet. Die resultierenden Beschichtungen zeigen eine deutlich geringere Diffusionslimitierung bei der Anbindung von Biomolekülen an immobilisierte Liganden sowie verbesserte Stabilisierung gegen unspezifische Wechselwirkungen.
Beispiel 8: Diffusionslimitierte Hydrogelstrukturen
Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet. Anschließend aktiviert man die Carboxylgruppen erneut mit jeweils 0,2 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid und beaufschlagt die Chips mit einer Lösung von 10% Dextran MW 500.000 in 0,1 M PBS Puffer pH 7,5. Nach einer Reaktionszeit von 2 bis 4 Stunden wäscht man ungebundenes Dextran mit 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,4 über 4 Stunden ab. Die resultierenden Doppelschichten zeigen eine deutlich höhere Diffusionslimitierung bei der Anbindung von Biomolekülen an immobilisierte Liganden als die in Beispiel 3 beschriebenen Monoschichten. Sie eignen sich deshalb vorzugsweise zur Durchführung von Konzentrationsbestimmungen.
Beispiel 9: Reversible Antikörperanbindungen an immobilisierte Haptene
Um die Eignung der in den obigen Beispielen beschriebenen Hydrogelstrukturen als Immobilisierungsmatrix zur Durchführung von Immungssays zu testen, wurde 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure-3-Aminopropylamid kovalent an einen mit CM Dextran derivatisierten SPR Sensorchip gekoppelt. Die derart mit Haptenen versehene Oberfläche beaufschlagte man anschließend mit Anti 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure Antikörpern in den Konzentrationen 1 μg/ml (1), 16 μg/ml (2), 2 μg/ml (3), 1, 5 μg/ml (4) und 3 μg/ml (5) (7). Die Antikörper waren jeweils in PBS Puffer, pH 7,4 gelöst; nach der Antikörperbeaufschlagung wurde zunächst jeweils mit einer Lösung von 100 μg 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure-3-Aminopropylamid/ml PBS Puffer die Dissoziation gemessen und die Chipoberfläche anschließend mit 0,5 M NaOH vollständig regeneriert. Vor dem nächsten Assay stellte man mit PBS Puffer jeweils wieder das Grundsignal ein. Nach jedem Assay wurden die gebundenen Antikörper mit denaturierender Regenerationslösung nahezu quantitativ wieder abgelöst.
Beispiel 10: Elektrodeposition in Carboxymethyldextranhydrogelschichten
8 zeigt die irreversible Anbindung von Avidin an dextranbeschichtete Sensoroberflächen durch Anlegen eines ausreichend negativen Potentials unter Bedingungen, bei denen ohne Potential keine Adsorption erfolgen würde. Zunächst wird die Oberfläche durch Behandlung mit 1 M NaCl regeneriert (100 sec). Zur Kontrolle legt man anschließend in Abwesenheit von Avidin eine negatives Potential von –0.4 und –0.6 V an (bei ca. 300 sec), wobei sich keine Veränderung des SPR Signals zeigt. Nach 400 sec. werden zunächst 500 μg Avidin/ml 2 mM Natriumacetatpuffer pH 4,7 zugegeben, worauf ca. 8 ng/mm2 adsorbiert werden. Durch Anlegen verschiedener negativer Potentiale wird zusätzlich Avidin abgeschieden (bei 600 sec). Wie ein Elutionsversuch durch Behandlung mit 1 M NaCl zeigt (bei 800 sec), verbleibt das Protein irreversibel in der Matrix. Avidin ist biologisch voll aktiv, was durch Bindung von biotinylierter Glucoseoxidase belegt wird (bei 900 sec). Die Bindung widersteht einer Elution von 10 mM NaOH in 2 M NaCl.
Nicht erfindungsgemäßes Beispiel 11: Herstellung von ultradünnen Enzymschichten sowie Verwendung in einem Enzymsensor
in 9 wird beispielhaft die Bestimmung von Glukose mit GOD-Pt-Elektroden auf der Basis von Carboxymethyldextranmonolagen gezeigt. Die Pt-Elektroden, Maße 800 × 800 μm werden zunächst gemäß Beispiel 3 mit einer Monoschicht 1/6 CM-Dextran 60 kDa auf PEI Haftvermittler versehen.
Avidin wird aus einer Lösung von 500 μg/ml Avidin in 2 mM Natriumacetat, pH 4.7 gemäß Beispiel 8 bei einem Potential von –0.8 V (1 h) auf der Elektrodenoberfläche abgeschieden. Anschließend inkubiert man mit biotinylierter Glukoseoxidase (50 μg/ml) in PBS Puffer, pH 7,4 über 1 Stunde. Die so derivatisierten Elektroden werden mit verschieden konzentrierten Glucoselösungen (100, 250, 500, 1000 u. 2000 μmol/l Glc) in PBS Puffer, pH 7.4 kalibriert (s. 10). Gemessen wird dabei das enzymatisch gebildete H2O2 bei + 700 mV gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode (3 M KCl).

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem mit Gold bedampften Glassubstrat, wobei das Substrat mit einer Lösung aus 0,1% Poly(ethylen-co-maleinsäureco-maleinsäuremono(carboxymethylethylsulfid)ester) in Wasser überschichtet und 1 h lang geschwenkt wird und das Substrat durch einstündige Beaufschlagung mit 20 mM N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und 10 mM N-Hydroxysuccinimid in 0,1 M Natrium 2-Morpholino-ethansulfonatpuffer pH 6,0 in die aktiven NHS Ester überführt wird und das getrocknete Substrat mit wenigen μl einer Lösung aus 20% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa, 2% Glucuronsäure und 1% Dimethylaminopyridin überschichtet wird und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen wird, 10 min bei 50°C inkubiert und anschließend nicht gebundenes Dextran durch 5 minütiges Behandeln mit 0,1 M HCl abgelöst wird, oder das Substrat mit einer Lösung aus 5% Polyethylenimin MW 600–1000 kDa in Wasser 15 min lang geschwenkt wird und nach Spülen mit dest. Wasser das aminofunktionalisierten getrocknete Substrat mit einer Lösung aus 15% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa in je 0,1 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid, N-Hydroxysuccinimid und Natriumphosphat pH 6,0 beaufschlagt und eine Stunde stehen gelassen wird und das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na-Carbonatpuffer pH 9,4 behandelt wird, oder das Substrat mit einer Lösung aus 5% Polyallylamin mit hohem Molekulargewicht in Wasser 15 min lang geschwenkt wird und nach Spülen mit dest. Wasser das aminofunktionalisierten getrocknete Substrat mit einer Lösung aus 15% vollständig carboxyliertem CM Dextran MW 5 kDa in je 0,1 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid, N-Hydroxysuccinimid und Natriumphosphat pH 6,0 beaufschlagt und eine Stunde stehen gelassen wird und das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na-Carbonatpuffer pH 9,4 behandelt wird, oder das Substrat mit 5% Polyethylenimin MW 600–1000 kDa in Wasser 15 min lang geschwenkt wird und nach Spülen mit dest. Wasser das aminofunktionalisierten getrocknete Substrat mit einer Lösung aus 7,5% 1/6 CM Dextran MW 5.000 und 7,5% vollständig carboxyliertem Dextran MW 60.000 in je 0,1 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid, N-Hydroxysuccinimid und Natriumphosphat pH 6,0 beaufschlagt und eine Stunde stehen gelassen wird und das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na-Carbonatpuffer pH 9,4 behandelt wird, oder das Substrat mit einer Lösung aus 5% Polyethylenimin MW 600–1000 kDa in Wasser 15 min lang geschwenkt wird und nach Spülen mit dest. Wasser das aminofunktionalisierten getrocknete Substrat mit einer Lösung aus 15% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa in je 0,1 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid, N-Hydroxysuccinimid und Natriumphosphat pH 6,0 beaufschlagt und eine Stunde stehen gelassen wird und das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na-Carbonatpuffer pH 9,4 behandelt wird und anschließend die Carboxylgruppen erneut mit jeweils 0,2 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid aktiviert werden und das Substrat mit einer Lösung von 10% Dextran MW 500.000 in 0,1 M PBS Puffer pH 7,5 beaufschlagt wird und nach einer Reaktionszeit von 2 bis 4 Stunden das ungebundene Dextran mit 0,1M Natriumcarbonatpuffer pH 9,4 über 4 Stunden abgewaschen wird.
Beschichtung auf einem mit Gold bedampften Glassubstrat, enthaltend eine polymere Haftvermittlerschicht und eine weitere, mindestens einen Polymer enthaltende, hydrophile Polymerschicht, deren Polymerketten zumindest teilweise bürstenartig ausgerichtet sind, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.
Verwendung einer Beschichtung gemäß Anspruch 2 in einem Affinitätssensor durch die Immobilisierung von Liganden, oder in einem amperometrischer Enzymsensor durch die Immobilisierung von Enzymen, oder in Sensoren durch Ausschluss von Molekülen oberhalb eines bestimmten Molekulargewichts, oder für die Immobilisierung von Biomolekülen, wobei an das leitfähige Substrat ein Potential angelegt wird, oder als Beschichtungsmaterial für stationäre chromatographische Phasen, wobei an das leitfähige Substrat ein Potential angelegt wird, oder als schmutzabweisende Beschichtung, oder als Antihaftbeschichtung in wässrigen Medien, oder als Beschichtungsmaterial für Füllkörper von Bioreaktoren, oder als bioinerte Beschichtung für mit biologischen Medien in Kontakt stehende medizinische Geräte, oder für optische Elemente als Antibeschlagsbeschichtung, oder für die Retention von Flüssigkeiten auf optischen Geräten in der Ophthalmiatrie.