DE10121201A1 - Photoaktivierbare Polysaccharidderivate für die Immobilisierung von Biomolekülen - Google Patents
Photoaktivierbare Polysaccharidderivate für die Immobilisierung von BiomolekülenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate der Formel (I) DOLLAR F1 wobei DOLLAR A p eine Zahl von 5-100000 ist; A ein O- oder ein NH-Atom/Molekül darstellt; B eine photoaktivierbare Gruppe B¶a¶ und/oder eine Gruppe B¶b¶ darstellt, DOLLAR A wobei B¶b¶ ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt, wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen; DOLLAR A wobei der Substitutionsgrad DS¶a¶ von B¶a¶ pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DS¶b¶ von B¶b¶ pro Anhydroseeinheit 1-2,999 beträgt, wobei gilt DS¶a¶ + DS¶b¶ = 3; und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können. DOLLAR A Die Erfindung stellt zudem ein Beschichtungsverfahren mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid, ein entsprechend beschichtetes Substrat und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an dieses Substrat bereit.
Description
Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate, die
photoaktivierbar sind, Verfahren zur Beschichtung von
Substraten unter Verwendung dieser Verbindungen, die so
erhaltenen, beschichteten Substrate sowie deren Verwendung zur
Immobilisierung von Biomolekülen.
Die Immobilisierung von Biomolekülen an festen Trägern spielt
bei einer Vielzahl moderner Analyse- und Trenntechniken, wie
der Affinitätschromatographie, der Bioreaktortechnik und vor
allem der analytischen Bio- und Chemosensorik eine
entscheidende Rolle. Z. B. erfolgt ein Nachweis in Immuntests
und Hybridisierungstests dadurch, dass an eine feste
Substratoberfläche adsorbierte Rezeptormoleküle spezifisch
mit den zu bestimmenden Spezies reagieren. Insbesondere im
Bereich der hochempfindlichen Detektion einzelner DNA-, RNA-,
Antigen- bzw. Proteinmoleküle ist es von großer Bedeutung,
dass die entsprechenden Moleküle spezifisch und fest an
Oberflächen gebunden sind und eine unspezifische Adsorption
von Molekülen auf diesen Substratoberflächen unterbunden
wird.
DE 197 36 736 beschreibt Polysaccharidderivate, wie
Celluloseether, insbesondere Aminoalkyltrialkylsilyl-
Cellulosen, die nach Übertrag auf Substratoberflächen mit der
Langmuir-Blodgett- und/oder Langmuir-Blodgett-Schäfer-Technik
Beschichtungen bereitstellen, an denen eine unkontrollierte
Adsorption wie auch eine Oberflächen-induzierte Denaturierung
der Biomoleküle weitgehend verhindert wird und die auf
beliebige Substrate aufgebracht werden können.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen Biomoleküle an
feste Trägeroberflächen nach photochemischer Aktivierung der
Oberfläche immobilisiert werden. Die photochemische
Immobilisierung weist insbesondere dann Vorteile auf, wenn
unterschiedliche Biomoleküle auf der Oberfläche geordnet bzw.
in Mustern immobilisiert werden sollen. So beschreibt
US 5 847 019 ein Verfahren, bei dem eine Lösung einer
Acrylamidverbindung, einer Bisvinylverbindung und einer
photoaktivierbaren Verbindung über einem mit Vinylgruppen
beschichteten Substrat photoaktiviert wird, wobei eine
photoaktivierte und vernetzte Schicht erhalten wird, an die
Biomoleküle photochemisch immobilisiert werden können. Dieses
Verfahren weist insbesondere den Nachteil auf, dass nur
Vinyl-derivatisierte Oberflächen so beschichtet werden
können, wodurch die Anwendbarkeit des Verfahrens
eingeschränkt ist. Weiterhin kann gemäß US 5 847 019 keine
definierte Schichtdicke und keine definierte Anzahl von
photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit erhalten werden.
Vor diesem Hintergrund ist es die der Erfindung
zugrundeliegende Aufgabe, eine chemische Verbindung
bereitzustellen, die als Beschichtung die Vorteile der
Beschichtung gemäß DE 197 36 736 zeigt, insbesondere im
Hinblick auf die breite Anwendbarkeit und die Vermeidung
unkontrollierter Adsorption und Oberflächen-induzierter
Denaturierung von Biomolekülen, jedoch eine einfachere,
schnellere und damit schonendere Immobilisierung erlaubt und
gleichzeitig eine erhöhte Stabilität zeigt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines
Polysaccharidderivates der Formel (I):
wobei
p eine Zahl von 5-100000 ist; A O oder NH darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und eine Gruppe Bb darstellt,
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt, wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder als Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DSb = 3;
und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
p eine Zahl von 5-100000 ist; A O oder NH darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und eine Gruppe Bb darstellt,
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt, wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder als Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DSb = 3;
und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Beschichtung
eines planaren Substrates mit dem erfindungsgemäßen
Polysaccharidderivat, ein entsprechend beschichtetes Substrat
und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an
dieses beschichtete Substrat bereit.
Die durch die obige Formel (I) dargestellte Struktureinheit
des erfindungsgemäßen Polysaccharidderivats kann von jedem
beliebigen Polysaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 5
bis 100000 abgeleitet sein; bevorzugt werden jedoch
Cellulose-, Chitosan- und Dextran-Derivate, insbesondere
Cellulose- und Chitosan-Derivate. Der Polymerisationsgrad
beträgt vorzugsweise 10 bis 50000, besonders bevorzugt 100
bis 1000, am meisten bevorzugt 140 bis 160.
Beispiele für die geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl-
oder die geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe
schliessen die Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Propenyl-, Butyl-
Isobutyl-, Butenyl-, Isobutenyl-, Pentyl-, Pentenyl- usw.
ein, die über eine Ether-, Amid- oder Estergruppe in das
Polysaccaridderivat eingeführt werden. Diese Gruppen liegen
vorzugsweise zu einem Substitutionsgrad von 1 bis 2,9 vor.
Als besonders geeignet haben sich Polysaccharidderivate mit
einer Gruppe der Formel -SiXYZ erwiesen, wobei X, Y und Z die
gleiche Bedeutung wie oben haben, insbesondere Tri-(C1-C10)-
alkylsilylderivate erwiesen. Sie verleihen den
Polysaccharidderivaten besonders gute Eigenschaften bezüglich
Beschichtbarkeit und unspezifischer Proteinadsorption. Nach
erfolgreicher Beschichtung lassen sich die Silylgruppen durch
Säurebehandlung wieder abspalten, was die entsprechende
Beschichtung gegenüber Lösungsmittel stabilisiert und sie
besonders biokompatibel macht. Besonders bevorzugt sind
Trimethylsilylderivate. Der Substitutionsgrad der Gruppen -
SiXYZ beträgt vorzugsweise 1 bis 2,9 pro Anhydroseeinheit.
Die Gruppe Bb kann ganz oder teilweise aus Gruppen der Formel
-SiXYZ bestehen.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate sind nicht
löslich in Wasser und Ethanol.
Beispiele für die Gruppe Bb sind:
Die erfindungsgemäß verwendete, photoaktivierbare Gruppe Ba
ist nicht beschränkt, sofern sie kovalent an das
Polysaccharidderivat binden kann. Im Hinblick auf die spätere
Immobilisierung von Biomolekülen sind solche
photoaktivierbaren Gruppen bevorzugt, die im UV- oder
kurzwelligen, sichtbaren Wellenlängenbereich aktiviert werden
können. Die Verwendung der in US 4,269,933; G. Sundarababu
et al. "Photochemistry and Photobiology", 61, (1995), S. 540-
544; T. S. Godovikova, et al. "Bioconjugate Chemistry", 7,
(1997), S. 343-348; Claire L. Hypolite, "Bioconjugate
Chemistry"; 8, (1997), S. 658-663; L. F. Rozsnyai et al.,
"Angew. Chem.", 104, Nr. 6, 1992; Chen et al., "Bioconjugate
Chemistry", 8, (1997), S. 730-734; Van der Heiden et al.,
"Macromolecules", 1996, 29, 7012-7015; und US 3,959,078
offenbarten, photoaktivierbaren Gruppen ist erfindungsgemäß bevorzugt.
Besonders bevorzugte Beispiele für die erfindungsgemäß
verwendete, photoaktivierbare Gruppe Ba sind:
darstellt, wobei Ar einen beliebigen Aromaten darstellt, der
die (4n + 2) π-Elektronenregel befolgt, vorzugsweise Phenyl
oder Naphthyl,
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br, vorzugsweise H, NO2, CH3, OH, NH2, NO, SH, oder CHO darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH(CH2)n, wobei n = 0-20, vorzugsweise n = 1-10,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br, vorzugsweise H, NO2, CH3, OH, NH2, NO, SH, oder CHO darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH(CH2)n, wobei n = 0-20, vorzugsweise n = 1-10,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
Insbesondere bevorzugt sind die Arylazid-, wie z. B. die
Phenylazid-, die Diazirin-, die Anthrachinon- und die
Benzophenongruppen. Die Arylazidgruppe bildet bei UV-
Bestrahlung unter Abspaltung von Stickstoff eine
Arylnitrengruppe; Diazirine bilden unter Bestrahlung Carbene;
Benzophenone und Anthrachinone hingegen bilden Radikale.
Der Substitutionsgrad DSa von Ba beträgt 0,001 bis 2,
vorzugsweise 0,1 bis 1, besonders bevorzugt 0,5 pro
Anhydroseeinheit.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate können ausgehend
von einem Polysaccharid synthetisiert werden. Das
Polysaccharid wird vorzugsweise in einem ersten Schritt mit
den Gruppen Bb in einer dem Fachmann geläufigen Art und Weise
derivatisiert. Entsprechende Derivatisierungen sind in
B. Philip et al., "Das Papier", Heft 2, 1995, S.58; U. Schuldt
et al., "Das Papier", Heft 1, 1994, S.3; "Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry", Vol. A5, 2. Auflage, S. 461 ff; Löscher
et al. "Proc. SPIE", Vol. 2928, 1996, S. 209-219; und in DE 197 36 736
beschrieben.
Dann erfolgt die Derivatisierung mit der photoaktivierbaren
Gruppe. Diese Gruppen lassen sich am einfachsten über eine
Veresterung der Säurederivate der photoaktiven Gruppen mit
dem Polysaccharid nach der DDC (Dicyclocarbodiimid)-DMAP
(Dimethylaminopyridin)-Methode (Klemm et al., "Z. Chem.",
24. Jg., 1984, Heft 2, S.62) einführen
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Beschichtung
eines planaren Substrates bereit,
wobei ein erfindungsgemäßes Polysaccharidderivat auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
wobei ein erfindungsgemäßes Polysaccharidderivat auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
Einzige Anforderung an das Substrat ist die Planarität. An
das Substratmaterial werden keine besonderen Anforderungen
gestellt. Es können z. B. Glas- oder Kunststoffsubstrate
verwendet werden, wobei die Wahl des Substratmaterials in
erster Linie durch die spätere Verwendung des beschichteten
Substrates bedingt ist. Wird beispielsweise das beschichtete
Substrat für die Immobilisierung von Biomolekülen für
optische Assays verwendet, ist das Substrat vorzugsweise ein
Glassubstrat, insbesondere ein Quarzglassubstrat.
Glassubstrate können mit Aminoalkylderivaten der
erfindungsgemäßen Polysaccharide direkt ohne vorhergehende
Hydrophobisierung mit der Langmuir-Blodgett- oder Langmuir-
Blodgett-Schäfer-Technik beschichtet werden, ansonsten führt
eine vorhergehende Hydrophobisierung zu einem besseren
Übertrag der Schicht auf das Glassubstrat. Entsprechende,
erfindungsgemäße Aminoalkyl-Polysaccharidderivate können
insbesondere durch Derivatiserung der in DE 197 36 736
offenbarten Aminoalkyltrialkylsilylcellulosen mit einer
photoaktivierbaren Gruppe erhalten werden.
Alternativ kann zunächst eine oder mehrere Schichten eines
Aminoalkylderivates eines Polysaccharides, beispielsweise wie
in DE 197 36 736 offenbart, und anschließend eine oder
mehrere Schichten des erfindungsgemäßen, photoreaktiven
Polysaccharidderivates auf das Substrat übertragen werden.
Die Übertragung erfolgt nach dem klassischem Langmuir-
Blodgett- oder insbesondere für kleine Substrate auch nach
der Langmuir-Schäfer-Technik.
Die Polysaccharidderivate werden vorzugsweise in einem leicht
flüchtigen Lösungsmittel, wie Chloroform oder Hexan, gelöst und
auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet.
Der so erhaltene Polysaccharidfilm wird mit einem
vorbestimmten Beschichtungsdruck, der an dem Langmuir-Trog
einstellbar ist, komprimiert. Bei bekanntem Substitutionsgrad
der Seitenketten, bekannter Ausrichtung der Moleküle und bei
bekanntem Polymerisationsgrad ist durch den
Beschichtungsdruck ein exakter Wert für die Anzahl der
photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit einstellbar.
Dieser Umstand kann z. B. für eine erfolgreiche
Proteinimmobilisierung von großer Bedeutung sein. Werden
beispielsweise einem Antikörper zu viele Gruppen zur
kovalenten Bindung angeboten, ist die Bindung an die
Oberfläche zwar erfolgreich; aber es kann zu einem deutlichen
Aktivitätsverlust durch Entfaltung des Proteins kommen. Oder
räumlich zu dicht immobilisierte Oligonukleotide können zu
einer sterischen Behinderung während einer
Hybridisierungsreaktion führen, was den Erfolg oder die
Empfindlichkeit einer solchen Reaktion wesentlich
beeinträchtigen kann. Eine Vorschrift zur Berechnung der
Anzahl der photoreaktiven Gruppe pro Flächeneinheit ist in
Beispiel 4 unten angegeben.
Nach Kompression des Filmes kann dieser durch vertikales
Tauchen der Substrate oder durch horizontales Aufsetzen der
Substrate (Schäfer-Technik) übertragen werden.
Der übertragene Film wird dabei zunächst durch rein
adsorptive Wechselwirkungen an das Substrat gebunden; durch
die spätere Bestrahlung können die neuen, photochemisch
aktiven Substanzen aber anschliessend kovalent an
verschiedene Oberflächengruppen der Substrate, wie z. B. an
Hydroxylgruppen von Glas zu binden, was zu einer wesentlichen
Stabilitätserhöhung der Beschichtung führt.
Die so erhaltenen, erfindungsgemäßen, beschichteten Substrate
zeichnen sich durch eine hohe Stabilität, Transparenz (bei
transparentem Substrat) und Biokompatibilität bei einer
geringen, unspezifischen Proteinadsorption aus.
Nach Beschichtung der Substrate können die gewünschten
Biomoleküle immobilisert werden. Hierzu bedarf es nur weniger,
naßchemischer Schritte. Durch die schnelle und spezifische
Bindung der Biomoleküle an die LB-Filme nach photochemischer
Aktivierung kann so mit geringstem Zeit- und Materialaufwand
an teuren Proteinen gearbeitet werden. Es bestehen
verschiedene Möglichkeiten, um die Aktivierung der Schichten
durchzuführen. Sie kann z. B. flächendeckend durch eine Maske
oder durch Zeichnen mit fokussiertem Licht erfolgen.
Hierdurch können Proteine oder andere Biomoleküle sehr
schnell kovalent über Amino-, Sulfid-, Phosphat-, Hydroxy-
oder andere aktive Gruppen spezifisch an das erfindungsgemäße
Polysaccharidderivat gebunden und somit an dem Substrat
immobilisiert werden. In jedem Fall erfolgt die Aktivierung
in einem Wellenlängenbereich, in dem die photoaktivierbare
Gruppe aktiviert werden kann. Die Bestrahlung erfolgt dabei
vorzugsweise sehr kurz und mit einer geringen Energie, um die
zu immobilisierenden Moleküle nicht zu beeinflussen. Die
flächendeckende Bestrahlung kann beispielsweise nach
Einsetzen des planaren, mit der photoaktiven Substanz
belegten Substrates in eine UV-durchlässige Durchflußzelle
oder in eine nach oben offene Inkubationskammer, in welche
die zu immobilisierende Biomoleküllösung transferiert wird,
über 5 bis 30 Sekunden erfolgen, um eine homogene
Immobilisierung zu erreichen
Bei der Bestrahlung zur Immobilisierung der Biomoleküle
erfolgt die bereits oben erwähnte Stabilisierung der
Beschichtung, da der Polysaccharidfilm über die
photoaktivierbaren Gruppen auch an aktive Gruppen der
Oberfläche, wie z. B. OH-Gruppen bei Glas kovalent gebunden
wird. So stabilisierte Beschichtungen sind resistenter
gegenüber Chemikalien und können für
Hybridisierungsreaktionen bei 96°C genutzt werden.
Unter Verwendung von Masken können gleiche, aber auch
verschiedenste Biomoleküle in definierten Strukturen
immobilisiert werden.
Die strukturierte Immobilisierung von ein und derselben
Substanz erfolgt über eine Maske unter Vorhandensein dieser
Substanz. Während der Bestrahlung bindet die Substanz an die
exponierten Stellen. Nach einem kurzem Spülschritt erfolgt
die Deaktivierung nicht exponierter Stellen durch Bestrahlung
des ganzen Substrates in der Gegenwart von Wasser oder eines
beliebigen Blockierungsreagenz, z. B. Aminoethanol oder
Polyethylenglycol.
Die Immobilisierung von Arrays verschiedener Substanzen kann
auf verschiedene Weise erfolgen. Im allgemeinen wird hierbei
ein bestimmter Bereich der erfindungsgemäßen Beschichtung
selektiv, beispielsweise durch eine Maske oder durch
fokussiertes (Laser-)Licht in Anwesenheit der zu
immobilisierenden Substanz bestrahlt; dann wird die Substanz
durch die nächste zu immobilisierende Substanz ausgetauscht,
und die selektive Bestrahlung wird wiederholt. Durch ein
solches Vorgehen können beliebige Muster an verschiedenen
Substanzen an der erfindungsgemäßen Beschichtung gebildet
werden.
Ein anderer Weg ist die Aktivierung der Schicht durch einen
gebündelten Lichtstrahl. Durch vertikale Verschiebung des
Lichtfokus gegenüber dem Substrat kann jede beliebige
Struktur "gezeichnet" werden. Durch die Steuerung der
Konzentration an Biomolekülen und/oder der Anzahl der
photoaktivierbaren Gruppen in der Fläche des Lichtfokus
ist die Immobilisierungsdichte und die immobilisierungsfläche
frei variabel. Für die Immobilisierung weniger oder gar
einzelner Proteinmoleküle wird ein Laser im unteren,
sichtbaren oder UV-Bereich auf eine Größe zwischen der Größe
der Laserwellenlänge (< 1 µm) bis 100 µm zur Aktivierung auf
die beschichtete Substratoberfläche fokussiert. Bei einer
geringen Dichte von photoreaktiven Gruppen, beispielsweise 1
bis 10 photoreaktive Gruppen auf eine Oberfläche, die dem
Laserfokus entspricht, wird erfindungsgemäß somit erstmals
ein Verfahren bereitgestellt, das die gezielte
Immobilisierung einzelner bzw. weniger Moleküle ermöglicht.
Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die folgenden
Schritte:
- a) Einstellen der Dichte photoreaktiver Gruppen auf einer Substratoberfläche;
- b) Überschichten der Substratoberfläche mit Biomolekülen, und
- c) Fokussieren eines Laserstrahls auf die Substratoberfläche, wobei die photoreaktiven Gruppen für die Immobilisierung der Biomoleküle aktiviert werden.
Die Konzentration der Biomoleküle beträgt vorzugsweise
weniger als 10-12 mol/l bei diesem Verfahren. Ein
rechnergesteuerter X-Y-Tisch ermöglicht die Immobilisierung
von einzelnen Biomolekülen an bestimmten X-Y-Koordinaten
oder in gezielte Strukturen durch Bewegung des Substrates
über den Laserfokus. Die Dosierung der Biomoleküllösung kann
hierbei über einen Microdispensor oder über eine
Durchflusszelle erfolgen. Wird ein entsprechender Aufbau
mit einer Einzelmoleküldetektion kombiniert, so kann der
Erfolg der Immobilisierung online überprüft werden. Nicht
bestrahlte Bereiche werden anschließend mit geeigneten
Blocklösungen, wie z. B. inaktiven Proteinen, Aminoethanol,
PEG, Wasser usw., blockiert.
Die so erhaltenen, definierte Biomolekülschichten tragenden
Substrate sind in einer Vielzahl von biologischen, chemischen
oder medizinischen Nachweismethoden einsetzbar und sind mit
minimalstem Zeit- und Materialaufwand industriell fertigbar.
2,0 g Cellulose (12,2 mmol; Lehmann & Voss, Avicell 301)
werden in einem 500-ml-Zweihalsrundkolben mit
Rückflusskühler in 200 ml DMA und 20,0 g wasserfreiem LiCl
aufgelöst. Die klare Lösung wird auf 70°C erhitzt, und 20,0 ml
Hexamethyldisilazan (15,48 g, 95,91 mmol) werden aus einem 25-ml-
Tropftrichter in einen Zeitraum von 30 min zugetropft.
Nach weiteren 30 min läßt man die Reaktionslösung ohne Rühren
auf Raumtemperatur langsam abkühlen und über Nacht 12 h
stehen. Die immer noch klare Reaktionsmischung wird in einem
2000-ml-Erlenmeyerkolben überführt und in einem Eisbad mit 1 l
2%iger NaHCO3 Lsg. ausgefällt. Das milchig weiße, geklumpte
Rohprodukt wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und in
einem Exsikkator über P2O5 getrocknet.
1 g TMSC-Rohprodukt wird in einem 1000-ml-Erlenmeyerkolben in
100 ml THF in Lösung gebracht. Unter Kühlung in einem Eisbad
und Rühren gibt man 750 ml 2% NaHCO3 in kleinen Portionen zu.
Der sofort beginnende, weiße, in großen Flocken ausfallende
Niederschlag wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und 48 h
im Exsikkator getrocknet.
0,55 g TMSC und 0,413 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
werden in einem mit Alufolie verdunkelten 100 ml
Zweihalsrundkolben mit Rückflusskühler in 25 ml THF gelöst.
Die Lösung wird auf 40°C erhitzt, und 0,333 g 5-Azido-2-
nitrobenzoesäure wird zugegeben. Nach 15 min gibt man
katalytische Mengen an Dimethylaminopyridin zu. Die
Reaktionzeit beträgt 20 Std. Anschließend wird aus dem auf
Raumtemperatur abgekühlten Reaktionsgemisch der seiden
schimmernde Dicyclohexylharnstoffniederschlag über einen
Büchnertrichter abgesaugt und zweimal mit je 10 ml THF
gewaschen. Das orangegelbe Filtrat wird auf 20 ml eingeengt.
Aus diesem wird mit 2% NaHCO3 Lsg. in MeOH (1 : 30, v/v, 2%
NaHCO3/MeOH) das gelbbeige Rohprodukt ausgefällt.
0,15 g Rohprodukt werden in 20 ml THF gelöst, verbleibende
Feststoffanteile über einen Büchnertrichter filtriert und
zweimal mit je 5 ml THF gewaschen. Das Filtrat wird auf 20 ml
einrotiert und das Produkt durch Zugabe von 75 ml MeOH in
kleinen Portionen unter Schwenken ausgefällt, über einen
Büchnertrichter filtriert, mit zweimal 25 ml MeOH gewaschen
und im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
Das so erhaltene Produkt weist einen Substitutionsgrad der
photoreaktiven Gruppen von durchschnittlich 0,2 pro
Anhydreseeinheit auf. Über diese Kochvorschrift können alle
organischen Gruppen, die einen Säurerest enthalten, an
Alkylsilylethercellulosen gekoppelt werden.
- - Eine Monolage der Photocellulosederivate wird mit einer Langmuir-Filmwaage (Nima Typ 622; GB) im Dunklen bei einem Beschichtungsdruck von 10 mN/m und einer Tauchgeschwindigkeit von 5 mm/min übertragen (der Übertrag erfolgt ausschließlich beim Austauchschritt).
- - Die beschichteten Substrate werden im Dunkeln in ein nach oben offenen Gefäß mit der Schichtseite nach oben überführt und mit der zu immobiliserenden Proteinlösung (optimal in einer Konzentration von 2 × 10-7 mol/l) 5 mm überschichtet.
- - Das Substrat wird 10 s bei den Azidderivaten und 20 s bei den Benzophenonderivaten mit einer 500-W-UV-Handlampe (Delo)(240-380 nm) in Gegenwart der zu immobilisierenden Proteinlösung im Abstand von 10 cm bestrahlt und anschließend für weitere 15 min ohne Bestrahlung in der Lösung belassen.
- - Nach einem kurzen Waschschritt ist das Substrat einsatzbereit.
- - Nach diesem Protokoll wurde Streptavidin immobilisiert. Das so hergestellte Substrat wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Biotin-Cy5 und purem Cy5 als Negativtest inkubiert und mit zwei verschiedenen Fluoreszenzsystemen vermessen (Axon Genpix 2500, und MMI LB8-Reader). Während das Biotin-Cy5 deutlich bis zur Nachweisgrenze der Systeme gemessen werden konnte, war bei Cy5 pur eine Unspezifität von weniger als 1% nachweisbar.
- - Um sicher zu stellen, daß die Immobiliserung photochemisch erfolgt ist, wurde das Substrat in Gegenwart von BSA- Blocklösung bestrahlt und anschließend eine halbe Stunde mit Streptavidinlösung inkubiert. Hier waren bei Biotin- Cy5 auf beiden Systemen weniger als 3% der Positivsignale des vorherigen Experimentes auszumachen.
Die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit kann
durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden:
wobei
Naktiv: Anzahl der photoreaktiven Gruppen
A: Flächeneinheit
NAHE: Anzahl der Anhydroseeinheiten pro Länge l360
DS: Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppe pro Anhydroseeinheit
bp: Breite eines Moleküls in der Schicht bei einem definierten Druck p
l360: Länge einer kompletten Umdrehung von 360° des spiralförmigen Cellulosemoleküls
Naktiv: Anzahl der photoreaktiven Gruppen
A: Flächeneinheit
NAHE: Anzahl der Anhydroseeinheiten pro Länge l360
DS: Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppe pro Anhydroseeinheit
bp: Breite eines Moleküls in der Schicht bei einem definierten Druck p
l360: Länge einer kompletten Umdrehung von 360° des spiralförmigen Cellulosemoleküls
Durch Bestimmung der Parameter NAHE, bp, DS und l360 kann
somit die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro
Flächeneinheit bestimmt werden:
- a) Der Substitutionsgrad DS kann durch Variation der Eduktkonzentration und der Reaktionsverhältnisse eingestellt und mittels 1H-NMR-Spektren und C,H- Analysen überprüft werden.
- b) Die Parameter NAHE und l360 können durch Berechnung der Konformation des Cellulosederivates ermittelt werden, beispielsweise mit Hilfe von "Molecular-Modelling"- Programmen, wie Hyperchem (Hypercube, Canada) oder Chem3D-Ultra (CambridgeSoft, USA). Haar-Stab-Polymere, wie die erfindungsgemäßen Cellulosederivate, liegen in einer Spiralstruktur vor, wobei die Spirale von den Anhydroseeinheiten gebildet wird. Die Länge der Spiralstruktur, die einer kompletten Drehung um 360° entspricht, wird als l360 definiert. Eine komplette Drehung um 360° liegt dann vor, wenn - in Längsrichtung des Polymers betrachtet - der durch die Anhydroseeinheiten gebildete Kreis sich schließt. Die Anzahl der Anhydroseeinheiten, die für eine solche Umdrehung um 360° notwendig ist, gibt den Parameter NAHE an. Beide Parameter NAHE und l360 hängen von den Arten der Substituenten wie auch deren Substitutionsgrad ab und können entsprechend variieren.
- c) Über das Messmenü eines Langmuir-Blodgett-Troges (Nima Typ 622; GB) kann bei bekannter Molmasse der durchschnittliche Flächenbedarf eines einzelnen Moleküls bestimmt werden. Sowohl die Anzahl der Moleküle wie auch die Fläche auf dem Trog, die die Monolage-Moleküle einnimmt, sind bekannt. Die Fläche wird durch den Komprimierungsdruck bestimmt. Somit kann der durchschnittliche Flächenbedarf bei einem bestimmten Komprimierungsdruck in [Å2/mN] und damit die Breite bp des Moleküls bei diesem Komprimierungsdruck gemessen werden.
- d) Es stehen jedoch nicht alle photoreaktiven Gruppen für eine Ankopplung zur Verfügung, sondern nur diejenigen, die - nach Auftragung auf eine Substratoberfläche - für die anzukoppelnden Moleküle zugänglich sind. Der Prozentsatz liegt somit in jedem Fall unter 50% und ist druckabhängig: je enger die Moleküle in Kontakt kommen, desto stärker wechselwirken benachbarte Polymerketten und desto weniger photoreaktive Gruppen stehen für die Ankopplung zur Verfügung. Bei gängigen Komprimierungsdrücken wird der Prozentsatz der photoreaktiven Gruppen, an die immobilisiert werden kann, auf 25% abgeschätzt. Hieraus ergibt sich in obiger Formel der Faktor ¼.
Claims (14)
1. Polysaccharidderivate der Formel (I):
wobei
p eine Zahl von 5-100000 ist; A ein O oder NH-Atom/Molekül darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und/oder eine Gruppe Bb darstellt;
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt;
wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder über eine Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist, und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2, 999 beträgt;
wobei gilt DSa + DSb = 3, und
wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
wobei
p eine Zahl von 5-100000 ist; A ein O oder NH-Atom/Molekül darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und/oder eine Gruppe Bb darstellt;
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt;
wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder über eine Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist, und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2, 999 beträgt;
wobei gilt DSa + DSb = 3, und
wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
2. Polysaccharidderivat gemäß Anspruch 1, wobei die
photoaktivierbare Gruppe ausgewählt wird aus einer der
folgenden Gruppen,
wobei Ba:
darstellt,
wobei K:
darstellt, Ar einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n + 2) π-Elektronenregel befolgt,
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH (CH2)n,
wobei n = 0-20,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
wobei Ba:
darstellt,
wobei K:
darstellt, Ar einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n + 2) π-Elektronenregel befolgt,
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH (CH2)n,
wobei n = 0-20,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
3. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche, wobei p eine Zahl von 10-50000
ist.
4. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche, wobei der Substitutionsgrad DSa von
Ba pro Anhydroseeinheit 0,1-1 beträgt.
5. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Gruppe Bb ganz oder teilweise SiXYZ darstellt,
wobei X, Y und Z jeweils wie in Anspruch 1 definiert sind.
wobei die Gruppe Bb ganz oder teilweise SiXYZ darstellt,
wobei X, Y und Z jeweils wie in Anspruch 1 definiert sind.
6. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polysaccharidderivat als
Gruppe Bb eine mit einer Aminogruppe substituierte C1-12-
Alkyl- oder C2-12-Alkylengruppe trägt.
7. Verfahren zur Beschichtung eines planaren
Substrates, wobei:
ein Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 auf die Oberfläche eines Langmuir- Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, wobei ein komprimierter Polysaccharidfilm erhalten wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
ein Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 auf die Oberfläche eines Langmuir- Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, wobei ein komprimierter Polysaccharidfilm erhalten wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Substrat ein
Glassubstrat ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei
das Substrat vor dem Beschichten mit dem Polysaccharidderivat
gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 mit einer
oder mehreren Schichten eines mit Aminoalkylgruppen
derivatisierten Polysaccharidderivates beschichtet wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei
das Polysaccharidderivat ein Polysaccharidderivat gemäß
Anspruch 6 ist.
11. Beschichtetes Substrat, erhältlich gemäß einem der
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10.
12. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen,
wobei ein beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 11 mit einer
Lösung von Biomolekülen überschichtet und dann bei einer
Wellenlänge bestrahlt wird, bei der die photoaktivierbaren
Gruppen Ba aktiviert werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung
durch eine Maske erfolgt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung
mit einem auf einen Durchmesser von 1 bis 100 µm
fokussierten Laserstrahl erfolgt.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publication number | Publication date |
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