WO2002088189A2 - Photoaktivierbare polysaccharidderivate für die immobilisierung von biomolekülen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to new polysaccharide derivatives which can be photoactivated, processes for coating substrates using these compounds, the coated substrates thus obtained and their use for immobilizing biomolecules.
  • the immobilization of biomolecules on solid supports plays a crucial role in a variety of modern analysis and separation techniques, such as affinity chromatography, bioreactor technology and, above all, analytical bio and chemical sensor technology.
  • detection in immunoassays and hybridization tests is carried out by the fact that receptor molecules adsorbed on a solid substrate surface react specifically with the species to be determined.
  • receptor molecules adsorbed on a solid substrate surface react specifically with the species to be determined.
  • it is of great importance that the corresponding molecules are specifically and firmly bound to surfaces and that non-specific adsorption of molecules on these substrate surfaces is prevented.
  • DE 197 36 736 describes polysaccharide derivatives such as cellulose ethers, in particular aminoalkyltrialkylsilyl celluloses, which, after transfer to substrate surfaces using the Langmuir-Blodgett and / or Langmuir-Blodgett-Schäfer technology, provide coatings on which uncontrolled adsorption and also surface-induced denaturation occur the biomolecules are largely prevented and which can be applied to any substrates.
  • Methods are also known in which biomolecules are immobilized on solid support surfaces after photochemical activation of the surface. Photochemical immobilization has particular advantages when different biomolecules are to be ordered on the surface or to be immobilized in patterns. No.
  • 5,847,019 describes a method in which a solution of an acrylamide compound, a bisvinyl compound and a photoactivatable compound is photoactivated over a substrate coated with vinyl groups, a photoactivated and crosslinked layer being obtained to which biomolecules can be photochemically immobilized.
  • This method has the particular disadvantage that only vinyl-derivatized surfaces can be coated in this way, which limits the applicability of the method.
  • no defined layer thickness and no defined number of photoreactive groups per unit area can be obtained.
  • the object on which the invention is based is to provide a chemical compound which, as a coating, shows the advantages of the coating according to DE 197 36 736, in particular with regard to the broad applicability and the avoidance of uncontrolled adsorption and surface-induced denaturation of biomolecules, however, it allows simpler, faster and therefore gentler immobilization and at the same time shows increased stability.
  • AR represents any aromatic that follows the (4n + 2) ⁇ electron rule
  • L represents La or -M-COO-La, where La represents one or more representatives selected from -MH; -M-NO; -M-NO2; -M-CF 3 ; -M-OH; -M-NH 2 ; -M-SH, -M-SO 3 H; -M-CHO; -M-CONH 2 ; -MF; -M-Cl; -M-Br; and -MI represents;
  • L and M are freely variable in their position on the aromatic
  • the invention also provides a method for coating a preferably planar substrate with the polysaccharide derivative according to the invention, a correspondingly coated substrate and a method for immobilizing biomolecules on this coated substrate.
  • the structural unit of the polysaccharide derivative according to the invention represented by the above formula (I) can be used by anyone Any polysaccharide with a degree of polymerization of 5 to 100,000 can be derived, but preference is given to cellulose, chitosan and dextran derivatives, in particular cellulose and chitosan derivatives.
  • the degree of polymerization is preferably 10 to 50,000, particularly preferably 50 to 1,000, most preferably 60 to 160. Cellulose derivatives with a degree of polymerization of 60 to 120 are particularly preferred.
  • AR is preferably phenyl or naphthyl; and L preferably represents H, N0 2 , NO or CHO.
  • aryl azide e.g. the phenylazide, the diazirine, the anthraquinone and the benzoate and benzophenone groups.
  • the arylazide group forms an aryl nitrene group on UV radiation with the elimination of nitrogen, while diazirines form carbenes under irradiation, benzophenones and anthraquinones form radicals.
  • the degree of substitution DS a of D a is 0.001 to 2, preferably 0.1 to 1, particularly preferably 0.1 to 0.4 per anhydrous unit.
  • the polysaccharide derivative according to the invention has a group Db.
  • Db is chosen so that the required solubility properties, i.e. the solubility in chloroform, dichloromethane, dimethyl ether, THF or hexane can be obtained. So e.g. it is excluded that Db only represents H. Rather, in order to achieve the solubility properties, Db should always be selected such that Db at least partially represents one or more of the above substituents listed for Db, which are different from H.
  • the substituent Db is preferably a straight-chain or branched Cl-12-alkyl or a straight-chain or branched C2-12-alkylene group, which may optionally be substituted by a group OR or NHR.
  • groups include the ethyl, propyl, isopropyl, propenyl, butyl, isobutyl, butenyl, isobutenyl, pentyl, pentenyl, etc. or appropriately substituted groups.
  • the group R is preferably a hydrogen atom, a straight-chain or branched Cl-15 alkyl or a straight-chain or branched C2-15 alkylene group, or an oxyalkylene group.
  • the following groups are particularly preferred as group Db:
  • These groups are preferably present with a degree of substitution of 1 to 2.9, particularly preferably 1.8 to 2.2.
  • Polysaccharide derivatives with a group of the formula -SiR3 have proven to be particularly suitable, where R has the meanings given above, in particular -SiY3, where Y has one of the meanings listed above.
  • the groups R and Y can be the same or different.
  • Tri- (C1-C10) -alkylsilyl derivatives have proven particularly preferred, in particular trimethylsilyl derivatives. These groups give the polysaccharide derivatives particularly good properties with regard to coatability and non-specific protein adsorption. After successful coating, the silyl groups can be split off again by acid treatment, which stabilizes the corresponding coating against solvents and makes it particularly biocompatible.
  • the degree of substitution of the groups -SiR3 is preferably 1 to 2.9, particularly preferably 1.8 to 2.5 per
  • the group Db can consist entirely or partially of groups of the formula --SiR 3 .
  • Polysaccharide derivatives with silyl groups with a degree of substitution from 1.8 to 2.5, with a photoactivatable group with a degree of substitution from 0.1 to 0.4, and a degree of substitution with H from 0.4 to 1.1 are particularly preferred.
  • Particularly preferred polysaccharide derivatives include azido nitrobenzyl trimethylsilyl cellulose of the following formula:
  • the polysaccharide derivatives according to the invention are not soluble in water and ethanol (solubility less than 0.05 mg / ml).
  • the polysaccharide derivatives according to the invention are soluble in apolar solvents such as chloroform, dichloromethane, dimethyl ether, THF or hexane, preferably preferably at least 0.1 mg / 1 ml chloroform, particularly preferably at least 0.5 mg / 1 ml chloroform, most preferably 1 to 5 mg / 1 ml chloroform.
  • the solubility relates to 25 ° C and atmospheric pressure.
  • the polysaccharide derivatives according to the invention can be synthesized starting from a polysaccharide.
  • the polysaccharide is preferably derivatized with the groups Db in a first step in a manner familiar to the person skilled in the art.
  • Corresponding derivatizations are described in B.Philip et al. , Das Toilet, Heft 2, 1995, p.58; U. Schuldt et al. , Das Textil, Heft 1, 1994, p.3; Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol.A5, 2nd edition, p.461ff; Löscher et al. Proc.SPIE Vol. 2928, 1996, pp.209-219; and described in DE 19736736.
  • the invention also provides a method for coating a substrate, a polysaccharide derivative according to the invention being spread on the surface of a Langmuir trough; the polysaccharide film thus obtained is compressed at a predetermined coating pressure; and the thus compressed polysaccharide film is transferred onto this substrate by vertical dipping or by placing a substrate horizontally.
  • the substrate is preferably planar. No special requirements are placed on the substrate material. For example, Glass or plastic substrates are used, the choice of substrate material being primarily dependent on the later use of the coated substrate. If, for example, the coated substrate is used for the immobilization of biomolecules for optical assays, the substrate is preferably a glass substrate, in particular a quartz glass substrate.
  • Glass substrates can be coated with aminoalkyl derivatives of the polysaccharides according to the invention directly without prior hydrophobization using the Lang uir-Blodgett or Langmuir-Blodgett-Schäfer technique, otherwise prior hydrophobization leads to better transfer of the layer to the glass substrate.
  • Corresponding aminoalkyl polysaccharide derivatives according to the invention can be coated with aminoalkyl derivatives of the polysaccharides according to the invention directly without prior hydrophobization using the Lang uir-Blodgett or Langmuir-Blodgett-Schäfer technique, otherwise prior hydrophobization leads to better transfer of the layer to the glass substrate.
  • Corresponding aminoalkyl polysaccharide derivatives according to the invention can be coated with aminoalkyl derivatives of the polysaccharides according to the invention directly without prior hydrophobization using the Lang uir-Blodgett or Langmuir-Blod
  • Sensitivity of such a reaction can significantly affect.
  • a rule for calculating the number of photoreactive groups per unit area is given in Example 4 below.
  • the film After compression of the film, it can be transferred by vertically immersing the substrates or by placing the substrates horizontally (Schäfer technology).
  • the transferred film is first bound to the substrate by purely adsorptive interactions, but later irradiation allows the new photochemically active substances to subsequently covalently attach to various surface groups of the substrates, e.g. bind to hydroxyl groups of glass, which leads to a substantial increase in the stability of the coating.
  • coated substrates according to the invention obtained in this way are distinguished by high stability, transparency (with a transparent substrate) and biocompatibility with a low non-specific protein adsorption.
  • the desired biomolecules can be immobilized. This requires only a few wet chemical steps. Thanks to the fast and specific binding of the biomolecules to the LB films after photochemical activation, expensive proteins can be worked with in the least amount of time and material. There are various ways to activate the layers. It can be done, for example, across the board, through a mask or by drawing with focused light. As a result, proteins or other biomolecules can be very quickly covalently bound specifically to the polysaccharide derivative according to the invention via amino, sulfide, phosphate, hydroxyl or other active groups and thus immobilized on the substrate. When immobilizing oligonucleotides, spacers with at least 10 carbon atoms (preferably CIO to C20) with an SH-
  • a certain area of the coating according to the invention is selectively irradiated, for example through a mask or by focused (laser) light in the presence of the substance to be immobilized, then the substance is replaced by the next substance to be immobilized and the selective irradiation is repeated.
  • any pattern of different substances can be formed on the coating according to the invention.
  • Another way is to activate the layer by a bundled light beam. Any structure can be "drawn” by vertically shifting the light focus relative to the substrate. By controlling the concentration of biomolecules and / or the number of photoactivatable groups in the area of the light focus, the immobilization density and the immobilization area are freely variable. For the immobilization of a few or even individual protein molecules, a laser in the lower visible or UN range is focused on a size between the size of the laser wavelength ( ⁇ 1 ⁇ m) and 100 ⁇ m for activation on the coated substrate surface.
  • the concentration of the biomolecules is preferably less than 10 "12 mol / 1 in this method.
  • a computer-controlled XY table enables the immobilization of individual biomolecules at specific XY coordinates or in targeted structures by moving the substrate via the laser focus. The dosage of the biomolecule solution If an appropriate setup is combined with a single-molecule detection, the success of the immobilization can be checked online. Non-irradiated areas are then covered with suitable block solutions such as inactive proteins, aminoethanol, PEG, water, etc. blocked.
  • the substrates obtained in this way bearing defined biomolecule layers, can be used in a large number of biological, chemical or medical detection methods and can be manufactured industrially with minimal expenditure of time and material.
  • the spin coating method can also be used to coat the polysaccharide derivatives according to the invention.
  • the polysaccharide derivative is in a volatile organic solvent such as e.g. Chloroform dissolved.
  • the solution is then dripped onto a rapidly rotating carrier and thus distributed into a thin film, analogous to modern CD-R production.
  • the still clear reaction mixture is transferred to a 2000 ml Erlenmeyer flask and precipitated in an ice bath with 1 1 2% NaHCOs solution.
  • the milky white, clumped raw product is sucked off over a Büchner funnel and dried in a desiccator over P2O5.
  • TMSC crude product 1 g is dissolved in 100 ml of THF in a 1000 ml Erlenmeyer flask. While cooling in an ice bath and stirring, 750 ml of 2% NaHCOs are added in small portions. The white precipitate that begins immediately and precipitates in large flakes is suctioned off over a Büchner funnel and dried in a desiccator for 48 hours.
  • Azidonitrobenzoic acid ester trimethylsilyl ether celluloses (ANBTMSC)
  • TMSC and 0.413 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) are dissolved in 25 ml of dichloromethane in a 100 ml two-necked round bottom flask darkened with aluminum foil with a reflux condenser. The solution is heated to 40 ° C and 0.333 g 5- Azido-2-nitrobenzoic acid is added. After 15 minutes, catalytic amounts of dimethylaminopyridine are added. The reaction time is 20 hours.
  • the silk shimmering dicyclohexylurea precipitate is then suctioned off from the reaction mixture, which has cooled to room temperature, through a Buchner funnel and washed twice with 10 ml of dichloromethane each.
  • the orange-yellow filtrate is concentrated to 20 ml.
  • the yellow-beige crude product is precipitated from this with 2% NaHCOa solution in MeOH (1:30, v / v, 2% NaHC03 / MeOH).
  • the product obtained in this way has an average degree of substitution of the photoreactive groups of 0.2 per anhydrose unit. All organic groups containing an acid residue can be coupled to alkylsilyl ether celluloses via this cooking instruction.
  • a monolayer of the photocellulose derivatives is transferred with a Langmuir film scale (Nima Type 622; GB) in the dark at a coating pressure of 14 mN / m (the transfer takes place only during the dipping step; dipping speed of 20 mm / min; dipping speed 12mm / min; thickness the monolayer 1.2 +/- 0.2 nm). In this way, the number of transferred monolayers can be precisely controlled (even odd!). A monolayer is usually sufficient for the subsequent immobilization.
  • the coated substrates are at least one month in
  • coated substrates are transferred in the dark into an upwardly open vessel with the layer side up and with the protein solution to be immobilized
  • the substrate is flashed with 10 flashes (alternatively 10 s for the azide derivatives and 20 s for the benzophenone derivatives with a 500W UV hand lamp
  • the substrate is ready for use
  • the substrate was irradiated in the presence of BSA block solution and then incubated for half an hour with streptavidin solution.
  • biotin Cy5 was less than 3% of the positive signals from the previous experiment on both systems.
  • the number of photoreactive groups per unit area can be expressed by the following equation:
  • NEAR Number of anhydrose units per length I360
  • Anhydrosis unit b P width of a molecule in the layer at a defined pressure p I360: length of a complete revolution of 360 ° of the spiral cellulose molecule
  • the number of photoreactive groups per unit area can thus be determined by determining the parameters NEAR, b P , DS and la ⁇ o:
  • the degree of substitution DS can be set by varying the starting material concentration and the reaction ratios and can be checked by means of 1H-NMR spectra and C, H analyzes.
  • the parameters NAHE and lsso can be determined by calculating the conformation of the cellulose derivative, for example with the aid of "molecular modeling" programs such as Hyperchem (Hypercube, Canada) or Chem3D-Ultra (CambridgeSoft, USA). Hair-rod polymers such as the cellulose derivatives according to the invention are present in a spiral structure, the spiral being formed by the anhydrous units. The length of the spiral structure, which corresponds to a complete rotation through 360 °, is defined as laso.
  • a complete rotation of 360 ° occurs when - viewed in the longitudinal direction of the polymer - the circle formed by the anhydrose units closes.
  • the number of anhydrous units required for such a rotation through 360 ° indicates the parameter NEAR.
  • Both parameters NEAR and laso depend on the types of substituents as well as their degree of substitution and can vary accordingly.
  • c) Using the measurement menu of a Langmuir-Blodgett trough (Nima type 622; GB), the average area required for a single molecule can be determined if the molar mass is known. Both the number of molecules and the area on the trough that the monolayer molecules occupy are known. The area is determined by the compression pressure.
  • the average area requirement at a given compression pressure in [ ⁇ 2 / mN] and thus the width b P of the molecule can be measured at this compression pressure.
  • the percentage is therefore below 50% in any case and is pressure-dependent: the closer the molecules come into contact, the more closely neighboring polymer chains interact and the fewer photoreactive groups are available for coupling.
  • the percentage of photoreactive groups that can be immobilized is estimated to be 25%. In the above formula, this gives the factor A-

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate der Formel (I), wobei p eine Zahl von 5 - 100000 ist; A1, A2 bzw. A3 u.a. ein Sauerstoffatom oder eine NH-Gruppe darstellt, D eine photoaktivierbare Gruppe Da oder eine Gruppe Db darstellt, wobei die Gruppe Db ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- und/oder Alkylengruppe oder eine Silylgruppe darstellt, die jeweils substituiert sein können, der Substitutionsgrad DSa von Da pro Anhydroseeinheit 0,001 - 2 und der Substitutionsgrad DSb von Db pro Anhydroseeinheit 1 - 2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DSb = 3; und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können, und das Polysaccharidderivat in Chloroform oder Hexan löslich ist. Die Erfindung stellt zudem ein Beschichtungsverfahren mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid, ein entsprechend beschichtetes Substrat und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an dieses Substrat bereit.

Description

PHOTOAKTIVIERBARE POLYSACCHARIDDERIVATE FÜR DIE IMMOBILISIERUNG VON BIOMOLEKÜLEN
Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate, die photoaktivierbar sind, Verfahren zur Beschichtung von Substraten unter Verwendung dieser Verbindungen, die so erhaltenen beschichteten Substrate sowie deren Verwendung zur Immobilisierung von Biomolekülen.
Die Immobilisierung von Biomolekülen an festen Trägern spielt bei einer Vielzahl moderner Analyse- und Trenntechniken, wie der Affinitätschromatographie, der Bioreaktortechnik und vor allem der analytischen Bio- und Chemosensorik eine entscheidende Rolle. Z.B. erfolgt ein Nachweis in Immuntests und Hybridisierungstests dadurch, dass an eine feste Substratoberfläche adsorbierte Rezeptormoleküle spezifisch mit den zu bestimmenden Spezies reagieren. Insbesondere im Bereich der hochempfindlichen Detektion einzelner DNA-, RNA- , Antigen- bzw. Proteinmoleküle ist es von großer Bedeutung, dass die entsprechenden Moleküle spezifisch und fest an Oberflächen gebunden sind und eine unspezifische Adsorption von Molekülen auf diesen Substratoberflächen unterbunden wird.
DE 197 36 736 beschreibt Polysaccharidderivate wie Celluloseether, insbesondere Aminoalkyltrialkylsilyl- Cellulosen, die nach Übertrag auf Substratoberflächen mit der Langmuir-Blodgett- und/oder Langmuir-Blodgett-Schäfer-Technik Beschichtungen bereitstellen, an denen eine unkontrollierte Adsorption wie auch eine Oberflächen-induzierte Denaturierung der Biomoleküle weitgehend verhindert wird und die auf beliebige Substrate aufgebracht werden können. Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen Biomoleküle an feste Trägeroberflächen nach photochemischer Aktivierung der Oberfläche immobilisiert werden. Die photochemische Immobilisierung weist insbesondere dann Vorteile auf, wenn unterschiedliche Biomoleküle auf der Oberfläche geordnet bzw. in Mustern immobilisiert werden sollen. So beschreibt US 5 847 019 ein Verfahren, bei dem eine Lösung einer Acrylamidverbindung, einer Bisvinylverbindung und einer photoaktivierbaren Verbindung über einem mit Vinylgruppen beschichteten Substrat photoaktiviert wird, wobei eine photoaktivierte und vernetzte Schicht erhalten wird, an die Biomoleküle photochemisch immobilisiert werden können. Dieses Verfahren weist insbesondere den Nachteil auf, dass nur Vinyl-derivatisierte Oberflächen so beschichtet werden können, wodurch die Anwendbarkeit des Verfahrens eingeschränkt ist. Weiterhin kann gemäß US 5 847 019 keine definierte Schichtdicke und keine definierte Anzahl von photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit erhalten werden.
Vor diesem Hintergrund ist es die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, eine chemische Verbindung bereitzustellen, die als Beschichtung die Vorteile der Beschichtung gemäß DE 197 36 736 zeigt, insbesondere im Hinblick auf die breite Anwendbarkeit und die Vermeidung unkontrollierter Adsorption und Oberflächen-induzierter Denaturierung von Biomolekülen, jedoch eine einfachere, schnellere und damit schonendere Immobilisierung erlaubt und gleichzeitig eine erhöhte Stabilität zeigt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines Polysaccharidderivates der Formel (I)
Figure imgf000005_0001
wobei p eine Zahl von 5 - 100000 ist; ein Vertreter von A]_, A2 und A3 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom (-0-), -O-(CO)-, -0-(CO)-NH-, -NH-, -NH-(CO)-, -NH-(CO)-0-, -NH- (CO) -NH-, -NH-NH- oder -N=N- , die beiden übrigen Vertreter von A]_, A2 und A3 ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom (-0-), -O-(CO)-, oder -0- (CO) -NH- (jeweils von dem Polysaccharidgerüst ausgehend, d.h. bei der Gruppe -0- (CO) - handelt es sich um eine Estergruppe, bei der das Sauerstoffatom am Polysaccharidgerüst bindet usw.); D eine photoaktivierbare Gruppe Da oder eine Gruppe Dj-, darstellt, die photoaktivierbare Gruppe Da ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
wobei K eine der folgenden Gruppen darstellt
Figure imgf000006_0003
AR einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n+2) π- Elektronenregel befolgt;
L La oder -M-COO-La darstellt, wobei La einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -M-H; -M-NO; -M-NO2; -M-CF3; -M-OH; -M-NH2; -M-SH, -M-SO3H; -M-CHO; -M-CONH2; -M-F; -M-Cl; -M-Br; und -M-I darstellt;
M, M^ und M2 unabhängig voneinander einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -(CH2)n- (mit n=o eine Einfachbindung); - (CH2-0-) n- (CH2)m; - (CH2-NH- ) n- (CH2)m- ; - [ (CH) 2- (CH2) ]m- (CH2)n-; mit m=0-20, vorzugsweise m=l-10; und n=0-20, vorzugsweise n=l-10, darstellen;
L und M (bzw. M]_ und M2) in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind;
die Gruppe Dj-, ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Cl-15-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-15-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer oder mehreren Gruppen OR oder NHR substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiR3 darstellt, wobei R unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Cl-15-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-15-Alkylengruppe, oder eine Oxyalkylen-Gruppe darstellt; der Substitutionsgrad DSa von Da pro Anhydroseeinheit 0,001 - 2 und der Substitutionsgrad DSj-, von D^ pro Anhydroseeinheit 1 - 2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DS^ = 3; und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können, und das Polysaccharidderivat in Chloroform, Dichlormethan, Dimethylether, THF oder Hexan löslich ist.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Beschichtung eines vorzugsweise planaren Substrates mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharidderivat, ein entsprechend beschichtetes Substrat und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an dieses beschichtete Substrat bereit.
Die durch die obige Formel (I) dargestellte Struktureinheit des erfindungsgemäßen Polysaccharidderivates kann von jedem beliebigen Polysaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 5 bis 100000 abgeleitet sein, bevorzugt werden jedoch Cellulose-, Chitosan- und Dextran-Derivate, insbesondere Cellulose- und Chitosan-Derivate. Der Polymerisationsgrad beträgt vorzugsweise 10 bis 50000, besonders bevorzugt 50 bis 1000, am meisten bevorzugt 60 bis 160. Cellulosederivate mit einem Polymerisationsgrad von 60 bis 120 werden besonders bevorzugt .
Bevorzugt sind Polysaccharidderivate der folgenden Formel (la)
Figure imgf000008_0001
besonders bevorzugt Derivate der Formel (la), bei denen A ein Sauerstoff tom oder eine NH-Gruppe darstellt, Db über eine Etherbindung (-0-) an das Polysaccharid gebunden ist, und Da über eine der Gruppen -0- (Etherbindung) , -0- (CO) - (Estergruppe) , -0- (CO) -NH- (Carbamatgruppe) , oder -NH- (CO) - (Säureamidgruppe) an das Polysaccharid gebunden ist, und D, Da, Db und p die gleiche Bedeutung wie in Formel I aufweisen.
In der photoaktivierbaren Gruppe Da stellt AR vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl dar; und stellt L vorzugsweise H, N02, NO oder CHO dar.
M, M]_ und M2 stellen unabhängig voneinander einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -(CH2)n- (bzw. -C0-(CH2)n- wenn die Gruppe über eine Carbonylgruppe an das Polysaccharidgerüst gebunden ist); - (CH2-O-) n- (CH2)m (bzw. - CO- (CH2-0-)n- (CH2)m-) ; - (CH2-NH-) n- (CH2)m- (bzw. -CO-(CH2-NH- )n-(CH2)m-); - [(CH)2- (CH2) ]m- (CH2)n- (bzw. -CO-[(CH)2- (CH2) ]m- (CH2) n-) ; mit m=0-20, vorzugsweise m=l-10; und n=0- 20, vorzugsweise n=l-10, dar. Besonders bevorzugt stellt M (bzw. M]_ oder M2) -(CH2)n-, -NH(CH2)n-, -(CH2)nNH-, NH(CH2)nNH-, oder - (CH2) nNH (CH2) n- , mit n=0-20, vorzugsweise n=l-10, dar.
Insbesondere bevorzugt als Da sind die Arylazid-, wie z.B. die Phenylazid-, die Diazirin-, die Anthrachinon- und die Benzoat- und Benzophenongruppen. Die Arylazidgruppe bildet bei UV-Bestrahlung unter Abspaltung von Stickstoff eine Arylnitrengruppe, Diazirine bilden unter Bestrahlung Carbene, Benzophenone und Anthrachinone hingegen bilden Radikale.
Der Substitutionsgrad DSa von Da beträgt 0,001 bis 2, vorzugsweise 0,1 bis 1, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,4 pro Anhydroseeinheit .
Neben der photoaktivierbaren Gruppe Da weist das erfindungsgemäße Polysaccharidderivat eine Gruppe Db auf. Db wird so gewählt, dass die erforderlichen Löslichkeitseigenschaften, d.h. die Löslichkeit in Chloroform, Dichlormethan, Dimethylether, THF oder Hexan, erhalten werden. So z.B. ist es ausgeschlossen, dass Db ausschließlich H darstellt. Vielmehr ist Db zum Erreichen der Löslichkeitseigenschaften stets so auszuwählen, dass Db zumindest teilweise einen oder mehrere der obigen, für Db aufgelisteten Substituenten, die von H verschieden sind, darstellt .
Der Substituent Db ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Cl-12-Alkyl- oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Gruppe OR oder NHR substituiert sein kann. Beispiele schliessen die Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Propenyl-, Butyl- Isobutyl-, Butenyl-, Isobutenyl-, Pentyl-, Pentenyl- usw. bzw. entsprechend substituierte Gruppen ein. Die Gruppe R ist vorzugsweise ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Cl-15-Alkyl- oder eine geradkettige oder verzweigte C2-15-Alkylengruppe, oder eine Oxyalkylengruppe . Besonders bevorzugt als Gruppe Db sind die folgenden Gruppen:
—(CH2)n-Y
-[(CH2)m-(CH)2]n-Y
-[(CH2)-O]n-Y
-[(CH2)m-O]n-Y
-[(CH2)—NH]n-Y
-[(CH2)m—NH]n—Y
wobei m und n eine Zahl von 0 bis 15, vorzugsweise 1 bis 12 ist, besonders bevorzugt m=2 und n= 1-8, und Y eine der folgenden Gruppen darstellt:
Figure imgf000010_0001
\
Figure imgf000010_0002
-[(CH2)m—O]n—H -[(CH2)m—O]n—CH3
wobei m und n die gleiche Bedeutung wie oben aufweisen.
Diese Gruppen liegen vorzugsweise zu einem Substitutionsgrad von 1 bis 2,9, besonders bevorzugt 1,8 bis 2,2, vor.
Als besonders geeignet haben sich Polysaccharidderivate mit einer Gruppe der Formel -SiR3 erwiesen, wobei R die oben aufgeführten Bedeutungen aufweist, insbesondere -SiY3, wobei Y eine der oben aufgeführten Bedeutungen aufweist . Die Gruppen R bzw. Y können gleich oder verschieden sein. Besonders bevorzugt sind Tri- (C1-C10) -alkylsilylderivate erwiesen, insbesondere Trimethylsilylderivate. Diese Gruppen verleihen den Polysaccharidderivaten besonders gute Eigenschaften bezüglich Beschichtbarkeit und unspezifischer Proteinadsorption. Nach erfolgreicher Beschichtung lassen sich die Silylgruppen durch Säurebehandlung wieder abspalten, was die entsprechende Beschichtung gegenüber Lösungsmittel stabilisiert und sie besonders biokompatibel macht. Der Substitutionsgrad der Gruppen -SiR3 beträgt vorzugsweise 1 bis 2,9, besonders bevorzugt 1,8 bis 2,5 pro
Anhydroseeinheit. Die Gruppe Db kann ganz oder teilweise aus Gruppen der Formel --SiR3 bestehen. Besonders bevorzugt sind Polysaccharidderivate mit Silylgruppen zu einem Substitutionsgrad von 1,8 bis 2,5, mit einer photoaktivierbaren Gruppe in einem Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,4, und einem Substitutionsgrad mit H von 0,4 bis 1,1.
Besonders bevorzugte Polysaccharidderivate schliessen Azido- nitrobenzyl-trimethylsilylcellulose der folgenden Formel ein:
Figure imgf000012_0001
wobei der Substitutionsgrad an Silylgruppen 1,8 bis 2,2 beträgt, und der Substitutionsgrad der photoaktivierbaren Gruppe 0,1 bis 0,4 beträgt. Weiterhin bevorzugt sind Derivate, bei denen die Azidonitrobenzylgruppe durch eine Benzoat- oder Benzophenon-Gruppe ausgetauscht ist.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate sind nicht löslich in Wasser und Ethanol (Löslichkeit von unter 0,05 mg/ml) . Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate sind jedoch in apolaren Lösungsmitteln wie Chloroform, Dichlormethan, Dimethylether, THF oder Hexan löslich, und zwar vorzugsweise zu mindestens 0,1 mg/ 1 ml Chloroform, besonders bevorzugt zu mindestens 0,5 mg/ 1 ml Chloroform, am bevorzugtesten zu 1 bis 5 mg/ 1 ml Chloroform. Die Löslichkeit bezieht sich jeweils auf 25°C und Atmospärendruck .
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate können ausgehend von einem Polysaccharid synthetisiert werden. Das Polysaccharid wird vorzugsweise in einem ersten Schritt mit den Gruppen Db in einer dem Fachmann geläufigen Art und Weise derivatisiert . Entsprechende Derivatisierungen sind in B.Philip et al . , Das Papier, Heft 2, 1995, S.58; U. Schuldt et al . , Das Papier, Heft 1, 1994, S.3; Ullmann"s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol.A5, 2.Aufläge, S.461ff; Löscher et al. Proc.SPIE Vol. 2928, 1996, S.209-219; und in DE 19736736 beschrieben.
Dann erfolgt die Derivatisierung mit der photoaktivierbaren Gruppe. Diese Gruppen lassen sich am einfachsten über eine Veresterung der Säurederivate der photoaktiven Gruppen mit dem Polysaccharid nach der DDC (Dicyclocarbodiimid) -DMAP (Dimethylaminopyridin) -Methode (Klemm et al . , Z.Chem., 24.Jg., 1984, Heft 2, S.62) einführen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Beschichtung eines Substrates bereit, wobei ein erfindungsgemäßes Polysaccharidderivat auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet wird; der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird; und der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
Das Substrat ist vorzugsweise planar. An das Substratmaterial werden keine besonderen Anforderungen gestellt . Es können z.B. Glas- oder KunststoffSubstrate verwendet werden, wobei die Wahl des Substratmaterials in erster Linie durch die spätere Verwendung des beschichteten Substrates bedingt ist. Wird beispielsweise das beschichtete Substrat für die Immobilisierung von Biomolekülen für optische Assays verwendet, ist das Substrat vorzugsweise ein Glassubstrat, insbesondere ein Quarzglassubstrat.
Glassubstrate können mit Aminoalkylderivaten der erfindungsgemäßen Polysaccharide direkt ohne vorhergehende Hydrophobisierung mit der Lang uir-Blodgett- oder Langmuir- Blodgett-Schäfer-Technik beschichtet werden, ansonsten führt eine vorhergehende Hydrophobisierung zu einem besseren Übertrag der Schicht auf das Glassubstrat. Entsprechende erfindungsgemäße Aminoalkyl-Polysaccharidderivate können
Figure imgf000014_0001
Empfindlichkeit einer solchen Reaktion wesentlich beeinträchtigen kann. Eine Vorschrift zur Berechnung der Anzahl der photoreaktiven Gruppe pro Flächeneinheit ist in Beispiel 4 unten angegeben.
Nach Kompression des Filmes kann dieser durch vertikales Tauchen der Substrate oder durch horizontales Aufsetzen der Substrate (Schäfer-Technik) übertragen werden. Der übertragene Film wird dabei zunächst durch rein adsorptive Wechselwirkungen an das Substrat gebunden, durch die spätere Bestrahlung können die neuen photochemisch aktiven Substanzen aber anschliessend kovalent an verschiedene Oberflächengruppen der Substrate wie z.B. an Hydroxylgruppen von Glas zu binden, was zu einer wesentlichen Stabilitätserhöhung der Beschichtung führt.
Die so erhaltenen erfindungsgemäßen beschichteten Substrate zeichnen sich durch eine hohe Stabilität, Transparenz (bei transparentem Substrat) und Biokompatibilität bei einer geringen unspezifischen Proteinadsorption aus.
Nach Beschichtung der Substrate können die gewünschten Biomoleküle immobilisert werden. Hierzu bedarf es nur weniger naßchemischer Schritte. Durch die schnelle und spezifische Bindung der Biomoleküle an die LB-Filme nach photochemischer Aktivierung kann so mit geringstem Zeit- und Materialaufwand an teuren Proteinen gearbeitet werden. Es bestehen verschiedene Möglichkeiten, um die Aktivierung der Schichten durchzuführen. Sie kann z.B. flächendeckend, durch eine Maske oder durch Zeichnen mit fokussiertem Licht erfolgen. Hierdurch können Proteine oder andere Biomoleküle sehr schnell kovalent über Amino-, Sulfid, Phosphat-, Hydroxy- oder andere aktive Gruppen spezifisch an das erfindungsgemäße Polysaccharidderivat gebunden und somit an dem Substrat immobilisiert werden. Bei der Immobilisierung von Oligonukleotiden sind Spacer mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen (vorzugsweise CIO bis C20) mit einer SH-
Figure imgf000016_0001
ein bestimmter Bereich der erfindungsgemäßen Beschichtung selektiv, beispielsweise durch eine Maske oder durch fokussiertes (Laser-) Licht in Anwesenheit der zu immobilisierenden Substanz bestrahlt, dann wird die Substanz durch die nächste zu immobilisierende Substanz ausgetauscht und die selektive Bestrahlung wird wiederholt . Durch ein solches Vorgehen können beliebige Muster an verschiedenen Substanzen an der erfindungsgemäßen Beschichtung gebildet werden .
Ein anderer Weg ist die Aktivierung der Schicht durch einen gebündelten Lichtstrahl. Durch vertikale Verschiebung des Lichtfokusses gegenüber dem Substrat kann jede beliebige Struktur "gezeichnet" werden. Durch die Steuerung der Konzentration an Biomolekülen und/oder der Anzahl der photoaktivierbaren Gruppen in der Fläche des Lichtfokusses ist die Immobilisierungsdichte und die Immobilisierungsfläche frei variabel. Für die Immobilisierung weniger oder gar einzelner Proteinmoleküle wird ein Laser im unterem sichtbaren oder UN-Bereich auf eine Größe zwischen der Größe der Laserwellenlänge (<1 μm) bis 100 μm zur Aktivierung auf die beschichtete Substratoberfläche fokussiert. Bei einer geringen Dichte von photoreaktiven Gruppen, beispielsweise 1 bis 10 photoreaktive Gruppen auf eine Oberfläche, die dem Laserfokus entspricht, wird erfindungsgemäß somit erstmals ein Verfahren bereitgestellt, das die gezielte Immobilisierung einzelner bzw. weniger Moleküle ermöglicht. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die folgenden Schritte :
a) Einstellen der Dichte photoreaktiver Gruppen auf einer Substratoberfläche; b) Überschichten der Substratoberfläche mit Biomolekülen; und c) Fokussieren eines Laserstrahls auf die Substratoberfläche, wobei die photoreaktiven Gruppen für die Immobilisierung der Biomoleküle aktiviert werden.
Die Konzentration der Biomoleküle beträgt vorzugsweise weniger als 10"12 mol/1 bei diesem Verfahren. Ein rechnergesteuerter X-Y-Tisch ermöglicht die Immobilisierung von einzelnen Biomolekülen an bestimmten X-Y-Koordinaten oder in gezielte Strukturen durch Bewegung des Substrates über den Laserfokus . Die Dosierung der Biomoleküllösung kann hierbei über einen Microdispensor oder über eine Durchflusszelle erfolgen. Wird ein entsprechender Aufbau mit einer Einzelmoleküldetektion kombiniert, so kann der Erfolg der Immobilisierung online überprüft werden. Nicht bestrahlte Bereiche werden anschließend mit geeigneten Blocklösungen wie z.B. inaktiven Proteinen, Aminoethanol, PEG, Wasser usw. blockiert.
Die so erhaltenen, definierte Biomolekülschichten tragenden Substrate sind in einer Vielzahl von biologischen, chemischen oder medizinischen Nachweismethoden einsetzbar und sind mit minimalstem Zeit- und Materialaufwand industriell fertigbar.
Für Anwendungen, bei denen eine hohe Planarität und geringe Schichtdicke des Filmes eine geringere Bedeutung haben, wie z.B. bei der Zellkultur, kann zur Beschichtung der erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate auch das Spin Coating-Verfahren zur Anwendung kommen. Hierfür wird das Polysaccharidderivat in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel wie z.B. Chloroform gelöst. Die Lösung wird dann auf einen schnell rotierenden Träger aufgetropft und somit zu einem dünnen Film verteilt, analog der modernen CD- R-Herstellung.
Beispiele Beispiel 1: Darstellung von Trimethylsilylethercellulosen (TMSC)
2,0 g Cellulose (12,2 mmol; Lehmann & Voss, Avicell 301) werden in einem 500 ml Zweihalsrundkolben mit Rückflusskühler in 200 ml DMA und 20,0 g wasserfreiem LiCl aufgelöst. Die klare Lösung wird auf 70°C erhitzt und 20,0 ml Hexamethyldisilazan (15,48 g, 95,91 mmol) werden aus einem 25 ml Tropftrichter in einen Zeitraum von 30 min zugetropft. Nach weiteren 30 min läßt man die Reaktionslösung ohne Rühren auf Raumtemperatur langsam abkühlen und über Nacht 12 h stehen. Die immer noch klare Reaktionsmischung wird in einem 2000 ml Erlenmeyerkolben überführt und in einem Eisbad mit 1 1 2%iger NaHCOs Lsg. ausgefällt. Das milchig weiße, geklumpte Rohprodukt wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und in einem Exsikkator über P2O5 getrocknet.
1 g TMSC Rohprodukt wird in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben in 100 ml THF in Lösung gebracht. Unter Kühlung in einem Eisbad und Rühren gibt man 750 ml 2% NaHCOs in kleinen Portionen zu. Der sofort beginnende weiße, in großen Flocken, ausfallende Niederschlag wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und 48 h im Exsikkator getrocknet.
Beispiel 2 : Darstellung von
Azidonitrobenzoesäureestertrimethylsilylethercellulosen (ANBTMSC)
0,55 g TMSC und 0,413 g N, N' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) werden in einem mit Alufolie verdunkeltem 100 ml Zweihalsrundkolben mit Rückflusskühler in 25 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird auf 40°C erhitzt, und 0,333 g 5- Azido-2-nitrobenzoesäure wird zugegeben. Nach 15 min gibt man katalytische Mengen an Dimethylaminopyridin zu. Die Reaktionzeit beträgt 20 Std . Anschließend wird aus dem auf Raumtemperatur abgekühltem Reaktionsgemisch der seiden schimmernde Dicyclohexylharnstoffniederschlag über einen Büchnertrichter abgesaugt und zweimal mit je 10 ml Dichlormethan gewaschen. Das orangegelbe Filtrat wird auf 20 ml eingeengt. Aus diesem wird mit 2% NaHCOa Lsg in MeOH (1:30, v/v, 2% NaHC03/MeOH) das gelbbeige Rohprodukt ausgefällt.
0,15 g Rohprodukt werden in 20 ml Dichlormethan gelöst, verbleibende Feststoffanteile über einen Büchnertrichter filtriert und zweimal mit je 5 ml Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat wird auf 20 ml einrotiert und das Produkt durch Zugabe von 75 ml MeOH in kleinen Portionen unter Schwenken ausgefällt, über einen Büchnertrichter filtriert, mit zweimal 25 ml MeOH gewaschen und im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
Das so erhaltene Produkt weist einen Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppen von durchschnittlich 0,2 pro Anhydroseeinheit auf. Über diese Kochvorschrift können alle organischen Gruppen, die einen Säurerest enthalten, an Alkylsilylethercellulosen gekoppelt werden.
Beispiel 3: Beschichtung und Proteinimmobilisierung
- Eine Monolage der Photocellulosederivate wird mit einer Langmuir-Filmwaage (Nima Typ 622; GB) im Dunklen bei einem Beschichtungsdruck von 14 mN/m übertragen (Der Übertrag erfolgt ausschließlich beim Austauchschritt; Eintauchgeschwindigkeit von 20 mm/min; Austauchgeschwindigkeit 12mm/min; Dicke der Monolage 1,2 +/-0,2 nm) . So lässt sich die Anzahl der übertragenen Monolagen exakt kontrollieren (auch ungeradzahlig!). Eine Monolage ist in der Regel für die anschließende Immobilisierung ausreichend.
- Die beschichteten Substrate sind mindestens einen Monat im
Dunkeln (4°C) stabil.
- Die beschichteten Substrate werden im Dunkeln in ein nach oben offenes Gefäß mit der Schichtseite nach oben überführt und mit der zu immobiliserenden Proteinlösung
(optimal in einer Konzentration von 10"7 bis 10"8 mol/1) 5 min lang vorinkubiert .
- Das Substrat wird mit 10 Blitzen einer Blitzlichtlampe (alternativ 10 s bei den Azidderivaten und 20 s bei den Benzophenonderivaten mit einer 500W UV-Handlampe
(Delo) (240-380 nm) ) in Gegenwart der zu immobilisierenden Proteinlösung im Abstand von 10 cm bestrahlt und anschließend für weitere 10 min ohne Bestrahlung in der Lösung belassen
- Nach einem kurzen Waschschritt und möglicherweise Trocknen ist das Substrat einsatzbereit
- Nach diesem Protokoll wurde Streptavidin immobilisiert . Das so hergestellte Substrat wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Biotin-Cy5 und purem Cy5 als Negativtest inkubiert und mit zwei verschiedenen Fluoreszenzsystemen vermessen (Axon Genpix 2500, und MMI LBs-Reader) . Während das Biotin-Cy5 deutlich bis zur Nachweisgrenze der Systeme gemessen werden konnte war bei Cy5 pur eine Unspezifität von weniger als 1% nachweisbar.
- Um sicher zu stellen, daß die Immobiliserung photochemisch erfolgt ist, wurde das Substrat in Gegenwart von BSA- Blocklösung bestrahlt und anschließend eine halbe Stunde mit Streptavidinlösung inkubiert. Hier waren bei Biotin- Cy5 auf beiden Systemen weniger als 3% der Positivsignale des vorherigen Experimentes auszumachen.
Beispiel 4: Bestimmung der Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit
Die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit kann durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden:
Figure imgf000022_0001
wobei
Naktiv : Anzahl der photoreaktiven Gruppen
A: Flächeneinheit
NAHE: Anzahl der Anhydroseeinheiten pro Länge I360
DS: Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppe pro
Anhydroseeinheit bP: Breite eines Moleküls in der Schicht bei einem definierten Druck p I360 : Länge einer kompletten Umdrehung von 360° des spiralförmigen Cellulosemoleküls
Durch Bestimmung der Parameter NAHE , bP , DS und laβo kann somit die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit bestimmt werden:
a) Der Substitutionsgrad DS kann durch Variation der Eduktkonzentration und der Reaktionsverhältnisse eingestellt und mittels 1H-NMR-Spektren und C,H- Analysen überprüft werden. b) Die Parameter NAHE und lsso können durch Berechnung der Konformation des Cellulosederivates ermittelt werden, beispielsweise mit Hilfe von "Molecular-Modelling" Programmen wie Hyperchem (Hypercube, Canada) oder Chem3D-Ultra (CambridgeSoft , USA) . Haar-Stab-Polymere wie die erfindungsgemäßen Cellulσsederivate liegen in einer Spiralstruktur vor, wobei die Spirale von den Anhydroseeinheiten gebildet wird. Die Länge der Spiralstruktur, die einer kompletten Drehung um 360° entspricht, wird als laso definiert . Eine komplette Drehung um 360° liegt dann vor, wenn- in Längsrichtung des Polymers betrachtet - der durch die Anhydroseeinheiten gebildete Kreis sich schließt. Die Anzahl der Anhydroseeinheiten, die für eine solche Umdrehung um 360° notwendig ist, gibt den Parameter NAHE an. Beide Parameter NAHE und laso hängen von den Arten der Substituenten wie auch deren Substitutionsgrad ab und können entsprechend variieren. c) Über das Messmenü eines Langmuir-Blodgett-Troges (Nima Typ 622; GB) kann bei bekannter Molmasse der durchschnittliche Flächenbedarf eines einzelnen Moleküls bestimmt werden. Sowohl die Anzahl der Moleküle wie auch die Fläche auf dem Trog, die die Monolage Moleküle einnimmt, sind bekannt. Die Fläche wird durch den Komprimierungsdruck bestimmt . Somit kann der durchschnittliche Flächenbedarf bei einem bestimmten Komprimierungsdruck in [Ä2/mN] und damit die Breite bP des Moleküls bei diesem Komprimierungsdruck gemessen werden. d) Es stehen jedoch nicht alle photoreaktiven Gruppen für eine Ankopplung zur Verfügung, sondern nur diejenigen, die - nach Auftragung auf eine Substratoberfläche - für die anzukoppelnden Moleküle zugänglich sind. Der Prozentsatz liegt somit in jedem Fall unter 50 % und ist druckabhängig: je enger die Moleküle in Kontakt kommen, desto stärker wechselwirken benachbarte Polymerketten und desto weniger photoreaktive Gruppen stehen für die Ankopplung zur Verfügung. Bei gängigen Komprimierungsdrücken wird der Prozentsatz der photoreaktiven Gruppen, an die immobilisiert werden kann, auf 25 % abgeschätzt. Hieraus ergibt sich in obiger Formel der Faktor A-

Claims

Patentansprüche
Polysaccharidderivat der Formel (I)
Figure imgf000025_0001
wobei p eine Zahl von 5 - 100000 ist; ein Vertreter von A^, A2 und A3 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom (-0-) , -O-(CO)-, -0-(CO)-NH-, -NH-, -NH-(CO)-, -NH-(CO)-0-, -NH- (CO) -NH-, -NH-NH- oder -N=N- , die beiden übrigen Vertreter von A]_, A2 und A3 ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom (-0-), -O-(CO)-, oder -0-(CO)-NH-; D eine photoaktivierbare Gruppe Da oder eine Gruppe D^ darstellt, die photoaktivierbare Gruppe Da ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen:
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
wobei K eine der folgenden Gruppen darstellt :
Figure imgf000026_0003
darstellt;
AR einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n+2) π- Elektronenregel befolgt; L La oder -M-COO-La darstellt, wobei La einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -M-H; -M-NO; -M-N02; -M-CF3; -M-OH; -M-NH2; -M-SH, -M-SO3H; -M-CHO; -M-CONH2; -M-F; -M-Cl; -M-Br; und -M-I darstellt;
M, M]_ und M2 unabhängig voneinander einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -(CH2)n- (mit n=o eine Einfachbindung); - (CH2-0-) n- (CH2)m; - (CH2-NH- ) n- (CH2) m- ; - [ (CH)2- (CH2) ]m- (CH2)n-; mit m=0-20 und n=0-20, darstellen;
L und M (bzw. Mι_ und M2) in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind;
die Gruppe Dj-, ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Cl-15-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-15-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer oder mehreren Gruppen OR oder NHR substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiR3 darstellt, wobei R unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte Cl-15-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-15-Alkylengruppe, oder eine Oxyalkylen-Gruppe darstellt; der Substitutionsgrad DSa von Da pro Anhydroseeinheit 0,001 - 2 und der Substitutionsgrad DS]-, von Dj-*, pro Anhydroseeinheit 1 - 2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DSj-, = 3; und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können, und das Polysaccharidderivat in Chloroform, Dichlormethan, Dirnethylether, THF oder Hexan löslich ist.
2. Polysaccharidderivat gemäß Anspruch 1, wobei AR Phenyl oder Naphthyl darstellt; L H, N02, CH3 , OH, NH2, NO, SH, oder CHO darstellt; und M, M]_ und M2 unabhängig voneinander einen oder mehrere Vertreter ausgewählt aus -(CH2)n-, -NH(CH2)n-, - (CH2)nNH-, NH(CH2)nNH-, oder - (CH2) nNH (CH2) n- , mit n=0-20, darstellt .
3. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei p eine Zahl von 10 - 50000 ist .
4. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Substitutionsgrad DSa von Da pro Anhydroseeinheit 0,1 - 1 beträgt.
5. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gruppe Dj**, ganz oder teilweise SiR3 darstellt, wobei R wie in Anspruch 1 definiert ist .
6. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polysaccharidderivat als Gruppe Db eine mit einer Aminogruppe substituierte Cl-12- Alkyl- oder C2-12 Alkylengruppe trägt.
7. Verfahren zur Beschichtung eines Substrates, wobei ein Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 auf die Oberfläche eines Langmuir- Troges aufgespreitet wird; der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, wobei ein komprimierter Polysaccharidfilm erhalten wird; und der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Substrat ein planares Glassubstrat ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Substrat vor dem Beschichten mit dem Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 mit einer oder mehreren Schichten eines mit Aminoalkylgruppen derivatisierten Polysaccharidderivates beschichtet wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Polysaccharidderivat ein Polysaccharidderivat gemäß Anspruch 6 ist.
11. Beschichtetes Substrat, erhältlich gemäß einem der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10.
12. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, wobei ein beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 11 mit einer Lösung von Biomolekülen überschichtet und dann bei einer Wellenlänge bestrahlt wird, bei der die photoaktivierbaren Gruppen Ba aktiviert werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung durch eine Maske erfolgt .
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung mit einem auf einen Durchmesser von 1 bis 100 μm fokusssierten Laserstrahl erfolgt.
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