DE602004004753T2

DE602004004753T2 - Photolinker-makromoleküle, mit den linkern modifizierte metallische substrate und liganden sowie verfahren zur herstellung davon

Info

Publication number: DE602004004753T2
Application number: DE602004004753T
Authority: DE
Inventors: Hans Sigrist; Hui Chai Gao; Isabelle Soury-Lavergne
Original assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Current assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-23
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: WO2005052580A1; EP1563306A1; EP1563306B1; DE602004004753D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues, Schwefelgruppen enthaltendes Photolinker-Makromolekül, das durch Chemisorption oder Schwefel–Metall-Komplexbildung an ein metallisches Substrat angefügt wird, wahlweise kovalent an einen Liganden, allgemein ein Biomolekül, gebunden ist und insbesondere zur Verwendung in Oberflächenplasmonenresonanz-Biosensoren bestimmt ist, sowie auf ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die US-Patentschriften No. 5 242 828 und 5 436 161 sowie Lofas und Johnsson, 1990, J. Chem. Soc. Chem. Commun., Seiten 1526–1528, offenbaren die chemische Modifizierung von Metalloberflächen wie zum Beispiel Goldoberflächen im Hinblick auf die Herstellung von zu selektiven molekularen Wechselwirkungen befähigten Sensoroberflächen für die Verwendung in Oberflächenplasmonenresonanz-(SPR-)Biosensorsystemen. Diese Dokumente beschreiben Matrixbeschichtungen auf Metalloberflächen und insbesondere auf Goldoberflächen, die für eine Verwendung in Biosensoren geeignet sind. Die Oberflächenbeschichtung von Metallen mit freien Elektronen wird durch Aufbringen einer dicht gepackten Monoschicht von organischen Molekülen erreicht, die Kohlenwasserstoffketten besitzen, die wahlweise von Heteroatomen unterbrochen werden und eine Länge von mehr als zehn Atomen sowie auf der einen Seite Funktionen, die die Wechselwirkung mit der Oberfläche des Metalls mit freien Elektronen ermöglichen, zum Beispiel asymmetrische oder symmetrische Disulfide, und auf der anderen Seite eine aktive Gruppe für die kovalente Bindung einer biokompatiblen porösen Matrix haben, über die ein erwünschter Ligand gebunden werden kann. Die Matrix ist ein schwellbares organisches Polymer oder ein Polysaccharid, zum Beispiel ein Carboxymethyldextran.
Die so hergestellten Sensoroberflächen haben sich in Biosensoren als nützlich erwiesen, die SPR auf Goldoberflächen benutzen, um ohne jede Markierung die molekulare Wechselwirkung zwischen einem ersten Bindungspartner, der als Ligand oder Sonde bezeichnet wird, und einem zweiten Bindungspartner, der als Analyt bezeichnet wird, zu verfolgen. Sie haben jedoch die folgenden Nachteile:

– zwischen dem Liganden und dem Metall ist eine hydrophobe Zwischenschicht (die Monoschicht der organischen Moleküle) vorhanden, die zu einer unspezifischen Bindung des Analyten an den Liganden führen kann,
– wegen der Überlagerung von zwei Schichten, nämlich einer kovalent an eine Polymermatrix angefügten hydrophoben Monoschicht, besteht ein grosser Abstand des Liganden von der Metalloberfläche und daher auch des Bereichs der molekularen Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem Analyten von der Metalloberfläche. Dadurch wird die Empfindlichkeit verringert (das evaneszierende Feld nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Metalloberfläche ab).

Das durch die Erfindung angesprochene Problem besteht darin, Mittel und Wege zu finden, um Biosensoroberflächen insbesondere zur Verwendung in SPR-Biosensoren herzustellen, die die oben aufgeführten Nachteile nicht besitzen.
In EP 0 484 472 wird eine chemische Modifizierung von nichtmetallischen Oberflächen beschrieben, mit der erwünschte chemische und physikalische Oberflächeneigenschaften sowie eine kovalente Bindung von Biomolekülen an die Oberfläche erreicht werden sollen. Latente reaktive Gruppen werden verwendet, um eine kovalente Kopplung von Reagentien wie z.B. Biomolekülen mit derivatisierten Biopolymeren oder synthetischen Polymeren an verschiedene nichtmetallische Substrate zu erreichen. Die bevorzugte latente reaktive Gruppe wird typischerweise als eine photochemisch reaktive funktionelle Gruppe, d.h. eine photoaktivierbare Gruppe beschrieben. Wenn eine photoaktivierbare Gruppe einer geeigneten Energiequelle ausgesetzt wird, geht sie von einem passiven Zustand zu einem reaktiven Zwischenzustand über, der zur Bildung kovalenter Bindungen mit geeigneten Materialien oder Molekülen befähigt ist (siehe z.B. Sigrist und Mitautoren, 1995, Optical Engineering, Band 34, Nr. 8, Seiten 2339–2347). Solche Linkermittel, zum Beispiel Photolinker-Polymere auf Polysaccharidbasis, die mit photoreaktiven Gruppen substituiert sind (siehe Caelen und Mitautoren, 2002, Langmuir, Band 18, Seiten 2463–2467), können verwendet werden, um Proteine an Siliciumnitrid und Polystyrol anzufügen.
Das oben genannte Problem wird durch die Erfindung gelöst, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert wird.
Die Erfindung liefert tatsächlich ein Photolinker-Makromolekül sowie ein Verfahren, um damit Sensoroberflächen herzustellen, worin keine hydrophobe Barriere zwischen dem Liganden und der Metalloberfläche vorhanden und der Abstand des Liganden von der Metalloberfläche kleiner als im Stande der Technik ist, wodurch in SPR-Biosensoren eine höhere Empfindlichkeit ermöglicht wird.
Dieses Photolinker-Makromolekül kann auch verwendet werden, um Mikroarrays oder durch Licht aktivierbare Nanoteilchen, Nanogruppierungen und Mikroteilchen auf Metallbasis herzustellen, die in der Bioanalytik oder in der Pharma- oder Textilindustrie nützlich sind.
Die Erfindung betrifft ein neues Photolinker-Makromolekül, das ein Polymer auf Saccharidbasis ist und photoaktivierbare Gruppen, die bei einer Wellenlänge von wenigstens 320 nm aktiviert werden können, sowie schwefelhaltige Gruppen enthält, die aus der Gruppe von Thiol (-SH), Thiosäure (-COSH), Dithiosäure (-CSSH), Sulfid (-S-) und Disulfid (-SS-) ausgewählt und an ein Metallsubstrat angefügt werden.
Der Begriff „Photolinker" bedeutet hier, wie fachüblich (siehe z.B. Sigrist und Mitautoren, 1995, und Caelen und Mitautoren, 2002, oben zitiert), dass das Makromolekül befähigt ist, unter Ausnutzung einer Photoreaktion ein Substrat an einen Liganden zu knüpfen.
Das Polymer auf Polysaccharidbasis, das photoaktivierbare Gruppen und schwefelhaltige Gruppen enthält, wird allgemein durch mehrfache Substitutionen mit photoaktivierbaren Gruppen und schwefelhaltigen Gruppen aus einem Polysaccharid abgeleitet.
Als das Polysaccharid ist ein lineares oder verzweigtes Polysaccharid oder ein synthetisches Polymer mit Polysaccharidsubstitutionen geeignet, das ein Molekulargewicht von 1000 bis 5000000 Dalton, bevorzugt von 5000 bis 200000 Dalton und insbesondere von 10000 bis 70000 Dalton besitzt.
Das Polysaccharid kann zum Beispiel ein Polysaccharid wie Agarose, Dextran, Carrageenan, Alginsäure, Stärke und Cellulose oder Derivate wie z.B. Carboxymethyl- oder Aminoderivate dieser Stoffe sein.
Polysaccharide des Dextrantyps, die anders als z.B. Cellulose oder Agarose von nichtkristalliner Natur sind, sind in diesem Zusammenhang sehr geeignet. So ist Dextran, insbesondere Aminodextran oder Carboxymethyldextran ein bevorzugtes Polysaccharid.
Nach oxidierender Ringöffnung von Polymer bildenden Monosacchariden an vicinalen Hydroxylfunktionen und Einführung von Aminogruppen an erzeugten Aldehyden werden letztere chemische Funktionen für eine Funktionalisierung verfügbar. Der Grad der Substitution mit schwefelhaltigen funktionellen Gruppen und photoaktiven Gruppen hängt vom Ausmass der primären oxidierenden Spaltung der Polysaccharide bildenden Monosaccharide ab.
Somit bestehen mehrere Möglichkeiten für die Anpassung des schlussendlichen Gesamtgehalts an funktionellen Gruppen (schwefelhaltigen Gruppen und photoaktivierbaren Gruppen) in dem auf Polysaccharid beruhenden Polymer.
In einem bevorzugten Vorgehen wird der schlussendliche Gesamtgrad der Substitution durch die primäre oxidierende Ringöffnung festgelegt, und die Substitution mit schwefelhaltigen Gruppen und photoaktivierbaren Gruppen wird in einem bewusst gewählten Verhältnis realisiert.
Wechselweise kann ein variabler Substitutionsgrad durch Vermischen eines Polymers auf Polysaccharidbasis von hohem Substitutionsgrad mit einem Polymer auf Polysaccharidbasis von niedrigem Substitutionsgrad festgelegt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Grad der Substitution mit schwefelhaltigen Gruppen und photoaktiven Gruppen durch eine Variation der Reaktionsbedingungen (z.B. Konzentration der Reaktanten, Inkubationszeit oder Temperatur) der Polymerfunktionalisierungsreaktion variiert. Die Gesamtzahl der verfügbaren Aminofunktionen in Aminodextran oder der Carboxyfunktionen in Carboxymethyldextran kann zwischen 0,005 und 1 Mol pro Mol des Glucosemonomers variieren, wobei ein bevorzugter Bereich für nachfolgende Funktionalisierung mit den photoaktivierbaren Gruppen wie auch den schwefelhaltigen Gruppen 0,01 bis 0,5 Mol pro Mol des Glucosemonomers ist.
Die schwefelhaltigen Gruppen sind Gruppen, die zur Chemisorption an einem Metal befähigt sind. Solche Gruppen sind zum Beispiel von R. G. Nuzzo und Mitautoren, 1993, M. D. Porter und Mitautoren, 1987, sowie E. B. Troughton und Mitautoren, 1988, für eine Modifizierung von Goldoberflächen beschrieben worden. Geeignete schwefelhaltige Gruppen sind Thiol (-SH), Thiosäure (-COSH), Dithiosäure (-CSSH), Sulfid (-S-) und Disulfid (-SS-).
Reaktanten für die Einführung schwefelhaltiger Gruppen in das Polymer auf Polysaccharidbasis sind N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Sulfosuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoat, Sulfosuccinimidyl-6-(α-methyl-α-(2- pyridyldithio)toluamido)hexanoat, N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat, 3-((2-Aminoethyl)dithio)propionsäure, Dithiobis(succinimidylpropionat), Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat und andere, wie sie von Fluka Chemicals, Molecular Probes, Pierce und anderen Lieferanten von Spezialchemikalien zur Verfügung gestellt werden.
Die photoaktivierbaren Gruppen, die bei einer Wellenlänge von mindestens 320 nm aktiviert werden können, sind Gruppen, die nach Photoaktivierung bei einer Wellenlänge von mindestens 320 nm Zwischenstufen liefern, die in Insertionsreaktionen mit kovalenten Bindungen von Biomolekülen eintreten können. Geeignete photoaktivierbare Gruppen sind von photoaktivierbaren Reaktanten wie z.B. Aryldiazirinen, die photochemisch Carbene liefern, Benzophenonen, die photochemisch die Ketylradikale der Benzophenongruppe liefern, und Arylaziden, die photochemisch Nitrene liefern, abgeleitet.
Bevorzugte photoaktivierbare Gruppen sind Aryldiazirine und Benzophenone. Photoaktive Gruppen auf der Basis von Aryldiazirinen und Benzophenon werden photochemisch aktiviert, und die photochemischen Zwischenstufen werden durch Einstrahlung von aktinischem Licht bei 350 nm erzeugt. Unter der Voraussetzung einer genügenden Einstrahlung bei der erforderlichen Wellenlänge kann jede Lichtquelle eingesetzt werden. Ein spezielles Erfordernis für die Photoaktivierung von an metallische Substrate gebundenen Linkerpolymeren ist die Ausschaltung von Strahlung hoher Energie durch Herausfiltern sämtlichen einfallenden Lichtes von weniger als 320 nm mit einem Cutoff-Filter, um nicht die chemisorptive Verknüpfung zwischen dem Metall und der schwefelhaltigen Gruppe aufzubrechen. Die bevorzugte Aktivierung von schwefelhaltigen Photolinker-Polymeren auf Metalloberflächen erfolgt zum Beispiel durch eine vierminütige Bestrahlung, z.B. mit einer Oriel-Lampe (350 nm, 11 mW/cm²). Alternative Lichtquellen, die die gleiche Bestrahlung liefern, können stattdessen verwendet werden (z.B. Stratalinker mit 365-nm-Röhren, 1 mW/cm², 45 min Bestrahlung).
Beispiele bevorzugter Reaktanten für die Einführung photoaktivierbarer Gruppen sind 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin, N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsäure, p-Azidophenyl-isothiocyanat, Benzophenon-4-isothiocyanat, Benzophenon-4-maleimid, 4-Benzylbenzoesäure-Succinimidylester, 3-(Trifluormethyl)-3-(m-isothiocyanophenyl)diazirin und weitere Aryldiazirine enthaltende Reaktanten.
Als das Metallsubstrat geeignete Metalle sind Metalle mit freien Elektronen, die Affinität für Schwefel zeigen, wie z.B. Kupfer, Aluminium, Cadmium, Eisen, Mangan, Silber, Gold und Platin. Bevorzugte Metalle sind Kupfer, Aluminium, Silber, Gold, Palladium und Platin.
Das Metallsubstrat kann in seiner Gestalt breit variieren, z.B. plattenförmig, sphäroidisch, zylindrisch, pyramidenförmig oder stabförmig, ebenso in seiner Grösse (von wenigen Nanometern bis zu beliebiger Grösse). Für die Verwendung als eine Sensoroberfläche in einem SPR-Biosensor ist das Metallsubstrat allgemein plattenförmig.
Die Kopplung ans Metall erfolgt spontan bei Raumtemperatur durch Chemisorption, wie im Fach für selbst-organisierte Monoschichten aus Thioalkanen beschrieben (siehe z.B. G. M. Whitesides, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., Band 25, Seiten 55–78), oder durch Schwefel-Metall-Komplexbildungsprozesse. Eine Inkubation bei erhöhten Temperaturen von 30 bis 60°C schliesst die Reaktion in kurzer Zeit ab und stabilisiert die Wechselwirkung.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das obige, an ein Metallsubstrat angekoppelte Photolinker-Makromolekül, das kovalent an einen Liganden gebunden ist.
Der Ligand (auch als „Sonde" bezeichnet) kann je nach der Anwendung ein jegliches interessierendes Molekül sein. Allgemein ist er ein Biomolekül, z.B. ein Protein oder eine Nucleinsäure in einer aktive Form.
Die kovalente Bindung des Liganden mit dem an das Metallsubstrat gekoppelten Photolinker-Makromolekül erfolgt bevorzugt, indem ein Gemisch dieser beiden Komponenten einer Photoreaktion unterworfen wird. Die photoaktivierbaren Gruppen erzeugen hoch reaktive Spezies wie Carbene oder Nitrene mit sehr kurzen Halbwertszeiten, die unter Bildung kovalenter Bindungen mit benachbarten Ligandenmolekülen reagieren. Wenn der Ligand ein biologisch aktives Biomolekül ist, dann ermöglicht die obige Photoreaktion einen Erhalt seiner Aktivität.
Die kovalente Bindung des Liganden an das an ein Metallsubstrat angekoppelte Photolinker-Makromolekül kann auch thermisch bei erhöhter Temperatur bewirkt werden.
Das obige, an ein Metallsubstrat angekoppelte und kovalent mit einem Liganden verbundene Photolinker-Makromolekül kann als Teil der Biosensor-Oberfläche eines Biosensorsystems und insbesondere eines SPR-Biosensors verwendet werden. Ein solcher Biosensor hat dank des kurzen Abstandes zwischen dem Liganden und der Metalloberfläche eine erhöhte Empfindlichkeit. Er kann dank der Abwesenheit einer hydrophoben Barriere zwischen dem Liganden und der Metalloberfläche für alle Arten von Analyten verwendet werden, selbst für teilweise hydrophobe von niedrigem Molekulargewicht.
Das an ein Metallsubstrat angekoppelte und kovalent an einen Liganden gebundene Makromolekül ist auch als Teil eines Mikroarrays nützlich, wo eine grosse Anzahl verschiedener, immobilisierter Biomoleküle wie Proteine und Nucleinsäuren dargeboten wird.
Das an ein Metallsubstrat angekoppelte und kovalent an einen Liganden gebundene Makromolekül kann auch verwendet werden, um Nanoteilchen, Nanogruppierungen oder Mikroteilchen herzustellen, d.h. zu funktionalisieren. Diese können als Liganden eine biologisch aktive Substanz tragen, z.B. einen antibakteriellen oder einen kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Stoff. Solche Teilchen oder Gruppierungen können in der Gesundheitsindustrie z.B. als Mittel für die Verabreichung von Wirkstoffen oder in der Textilindustrie z.B. für die Immobilisierung von antibakteriellen Stoffen auf Textilfasern verwendet werden.
So hergestellte Nano- oder Mikroteilchen sind auch auf dem Gebiet der Bioanalytik von Interesse.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die einen veranschaulichenden, aber keinen einschränkenden Charakter besitzen, weiter beschrieben werden.
Die Beschreibung wird unter Bezugnahme auf 1, 2A, 2B, 2C, 2D, 3 und 4 besser zu verstehen sein.
1 ist ein Reaktionsschema, das die Derivatisierung von Optodex A zu Optodex S und Optodex SH zeigt.
2A ist die Photographie einer zur Photostrukturierung verwendeten Maske mit einem gitterförmigen Muster durchsichtiger (weisser) und Licht absorbierender (dunkler) Bereiche.
2B ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der mit Cy-5 markiertes, Riboflavin bindendes Protein (RBP) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A.
2C ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der mit Cy-3 markiertes Rinderserum-Albumin (BSA: bovine serum alabumin) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A.
2D ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der Maus-Immunglobulin (m-IgG) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A und Immunkomplexbildung mit Cy-5-markiertem Ziege-Antimaus-IgG-Antikörper.
3 ist ein Fluoreszenz-Scanogramm von vier gedruckten Mikroarrays (Arrays 1, 2, 3 und 4, je 20 × 20 Punkte, mit vier Nadeln parallel gedruckt) von mit Fluorophor markierten Proteinen nach Photoimmobilierung auf einer Goldplattform.
4 ist ein Oberflächenplasmonenresonanz-Sensogramm von Vitamin B₂-Bindung an Riboflavin bindendes Protein (RBP) nach seiner Photoimmobilisierung auf einer mit OptoDex S modifizierten Goldplattform.
Optodex ist ein Handelsname für mit Aryldiazirinen funktionalisierte, von Dextran abgeleitete Photolinker-Polymere, die von Gao und Mitautoren, 2003, Band 57, Nr. 10, beschrieben worden sind.
BEISPIEL 1: Synthese und Charakterisierung von OptoDex S und Optodex SH
a) Synthese von Optodex S und Optodex S-H (siehe 1)
Sowohl OptoDex S als auch OptoDex SH (reduziertes OptoDex S) ist ein Photolinker-Polymer, das ein mehrfach substituiertes, sowohl mit photoaktiven als auch mit Schwefel (Thiol und/oder Disulfid) enthaltenden Substituenten funktionalisiertes Aminodextran ist. Die Synthese dieser Photolinker-Polymere ist in 1 veranschaulicht.
Das Ausgangsmaterial ist Photolinker-Polymer Optodex A, das durch partielle Thiocarbamoylierung von Aminodextran mit dem Photolinkerreaktanten 3-(Trifluormethyl)-3-(m-isothiocyanophenyl)diazirin gewonnen wird (siehe I. Caelen, H. Gao und H. Sigrist, Langmuir, Band 18, Seiten 2463–2467). Dieses Photolinker-Polymer wird mit dem Reaktanten Sulfosuccinimidyl-6-[3'-(2-pyrimidyldithio)propionamido)hexanoat (Sulfo-LC-SPDP) an den restlichen Aminofunktionen derivatisiert. Das Reaktionsprodukt ist Photolinker-Polymer OptoDex S, das eine aktivierte Disulfidgruppe trägt. Die Behandlung von OptoDex S mit Dithiothreit als Reduktionsmittel liefert seine reduzierte Form mit freien Thiolfunktionen, das Photolinker-Polymer OptoDex SH.
OptoDex S wird nach dem folgenden detaillierten Verfahren hergestellt. Aminodextran mit einem Molekulargewicht von 40000 Dalton, erhältlich von Molecular Probes, wird durch eine Reaktion von Aminodextran (2,0 mg/ml) mit dem Diazirin-Arylisothiocanat (0,3 mg/ml) in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,0, während fünf Stunden bei 37°C mit dem photoaktiven Reaktanten 3-(Trifluormethyl)-3-(m-isothiocyanophenyl)diazirin derivatisiert. Nach beendeter Reaktion wird überschüssiger Photoreaktant durch Ausschluss-Chromatographie auf Sephadex G 25 in verdünntem wässrigem Puffer (1 : 100 verdünnte, phosphat-gepufferte Salzlösung) entfernt. Ins Leervolumen eluierende Fraktionen enthalten das substituierte Aminodextranprodukt, OptoDex A, funktionalisiert mit dem oben genannten photoreaktiven Reaktanten. Gesammelte Fraktionen werden gefriergetrocknet und by –18°C aufbewahrt, wie erforderlich. Zur weiteren Funktionalisierung wird OptoDex A, das ungefähr 14 Mole Aminogruppen pro Mol OptoDex A enthält, in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: phosphate buffered saline) von pH 7,4 zu einer Konzentration von 2,0 mg/ml aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 100 μl einer frisch zubereiteten Lösung von Sulfo-LC-SPDP (5,2 mg/ml phosphatgepufferte Salzlösung) zugegeben. Das Gemisch der beiden Lösungen wird bei Umgebungstemperatur unter fortgesetztem Rühren inkubiert. Nach beendeter Reaktion (nach etwa einer Stunde) wird das Reaktionsgemisch unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung von pH 7,4 als Elutionspuffer, die 1 mM EDTA enthält, durch Chromatographie auf einer PD 10-Säule (Pharmacia) gereinigt. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt, und die Absorption bei 350 nm wird aufgezeichnet, um das Produkt zu identifizieren. Wenn nicht sofort verwendet, wird das Produkt, OptoDex S, bei –18°C aufbewahrt.
OptoDex S enthält aktivierte Disulfidgruppen, die erleichterte Disulfid-Austauschreaktionen ermöglichen. Die reduzierte Form von OptoDex S wird durch Behandlung von OptoDex S mit 5 mM Dithiothreit in 10 mM Natriumacetatpuffer von pH 5,0 und Inkubation des Reaktionsgemischs während 60 Minuten bei 37°C gewonnen. Das Reaktionsprodukt ist OptoDex SH (freie Thiolgruppen enthaltend). Es wird durch Chromatographie auf Sephadex G10 gereinigt. Sofortige Verwendung des Produkts wird empfohlen, da eine inter- und intramolekulare Disulfidbrückenbildung spontan eintreten kann.
b) Charakterisierung von OptoDex S
Das Produkt OptoDex S sollte sowohl photoaktive Aryldiazirin-Funktionen als auch aktivierte Disulfid-Funktionen enthalten. Das Vorliegen jeder dieser chemischen Funktionen wird durch die beiden unten umrissenen analytischen Prozeduren bewiesen. In beiden Prozeduren dient ein Muster von OptoDex A (photoaktiv, aber keine Disulfide oder Thiole enthaltend) als Kontrolle. Eine zusätzliche analytische Kontrolle umfasst Muster, die keinem aktivierenden Licht ausgesetzt worden sind.
Bestimmung des Sulfidgehalts von OptoDex S
Der Sulfidgehalt von Optodex S wird bestimmt, indem Optodex S wie oben beschrieben zu OptoDex SH reduziert und dessen Gehalt an freien Thiolen mit dem von Pierce Chemicals erhältlichen Thiol- und Sulfid-Quantitationskit T-6060 bestimmt wird. OptoDex S wird zu einer Konzentration von 0,2 mg/ml in entionisiertem Wasser aufgelöst, und 100 μl der Lösung werden in eine Mikroplatte (Nunc-Immuno-Modul Polysorp F8) pipettiert. Das Mikroplattenmaterial ist Polystyrol, und acht Replikate jedes Musters werden mit OptoDex S wie auch mit als Kontrolle dienendem OptoDex A hergestellt. Nach adsorptiver Bindung während 90 Minuten bei Umgebungstemperatur werden die Mikroplattenlöcher mit Wasser gespült und während 90 Minuten in einem Vakuum von 5 × 10^–2 mbar getrocknet. Beschichtete Löcher werden dann während vier Minuten mit der Oriel-Lichtquelle (Wellenlänge 350 nm, Bestrahlungsstärke 11 mW/cm²) bestrahlt und danach dreimal mit einer 0,05 % Tween enthaltenden, phosphatgepufferten Salzlösung, dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung und dreimal mit deionisiertem Wasser gespült. Kontrollmuster (–Licht) werden identisch behandelt, aber nicht bestrahlt. Zur quantitativen Sulfidbestimmung wird photoimmobilisiertes OptoDex S (oder OptoDex A als eine Kontrolle) mit 100 μl 5 mM Dithiothreit in 10 mM Natriumacetatpuffer von pH 5,0 behandelt, was Optodex SH liefert. Alle Muster werden während 60 Minuten bei 37°C inkubiert und dann dreimal mit entionisiertem Wasser gespült. Das Vorhandensein von aus OptoDex SH erzeugten Thiolen wird mit dem Thiol- und Sulfid-Quantitationskit analysiert (kolorimetrische Prüfung). Die Ergebnisse sind in der Tabelle hierunter zusammengefasst.

Muster Thiolgruppen (pmol/Loch)

+ mit Licht aktiviert – Licht

OptoDex S 29,8 ± 4,9 4,2 ± 2,3

OptoDex A 5,5 ± 0,40 2,3 ± 2,2
Die obige Tabelle zeigt, dass photoimmobilisiertes OptoDex SH ungefähr 20 pmol reaktive Thiolgruppen SH (entsprechend 10 pmol Disulfidgruppen für OptoDex S) pro Loch enthalten, was etwa 500 fmol pro mm² Polystyrol entspricht.
Photoaktivität von OptoDex S
Die Photoaktivität von OptoDex S wird durch die lichtabhängige Immobilisierung des Enzyms alkalische Phosphatase auf Polystyrol geprüft, indem Photolinker-Polymer OptoDex S (bzw. OptoDex A als Kontrolle) verwendet wird.
OptoDex S wird mit alkalischer Phosphatase (2000–3000 DEA-Einheiten je mg Protein, bezogen von Sigma) in einem Gewichtsverhältnis von 8 : 1 (Gew./Gew.) vermischt und auf Mikroplattenlöcher aufgetragen (Nunc-Immun-Modul Polysorp F8 von Nunc, Dänemark). Die endgültige Menge der zu jedem Loch hinzugefügten alkalischen Phosphatase beträgt 200 ng. Das pro Loch hinzugegebene Volumen beträgt 40 μl, eingestellt mit verdünnter (1 : 100) phosphatgepufferter Salzlösung, die 10% Ethanol (Vol./Vol.) enthält. Nach dreistündigem Trocknen in Vakuum (1 h bei 20 mbar, 2 h bei 5 × 10^–2 mbar) werden die beschichteten Oberflächen während vier Minuten mit der Oriel-Lampe (Wellenlänge 350 nm, 11 mW/mm²) bestrahlt. Die Oberflächen werden dann mit PBS/Tween^TM (dreimal), PBS (dreimal) und entionisiertem Wasser (dreimal) gespült. Jeder Spülschritt besteht aus fünfminütigem Schütteln. Acht Replikate pro Muster wurden geprüft.

Die enzymatische Aktivität der photoimmobilisierten alkalischen Phosphatase wird unter Benutzung des Substratkits für alkalische Phosphatase von Pierce nachgewiesen. Die Substratlösung wird nach der Produktbeschreibung frisch hergestellt und in die Löcher gegeben (100 μl pro Loch). Die Mikroplatten werden während 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe von 2,0 N NaOH (50 μl/Loch) angehalten. Die entwickelte Farbe wird durch Messung der Absorption bei 405 nm mit einem handelsüblichen Mikroplattenleser bestimmt. Die mit acht Replikatmustern gewonnenen Ergebnisse sind in der Tabelle hierunter zusammengefasst (+Licht: Muster wurde aktivierendem Licht ausgesetzt; –Licht: keinem aktivierendem Licht ausgesetzt).

	Oberflächengehalt	Prüfbedingung	Aktivität der alkalischen Phosphatase (E, 450 nm)
Muster	OptoDex S und alkalische Phosphatase	+Licht	2,333
		–Licht	0,058
Kontrolle 1	OptoDex A und alkalische Phosphatase	+Licht	2,256
		–Licht	0,064
Kontrolle 2	OptoDex S	+Licht	0,055

Die obige Tabelle zeigt, dass OptoDex S nach Aktivierung durch Licht ebenso wie Optodex A alkalische Phosphatase unter Beibehaltung ihrer Aktivität auf Polystyrol immobilisiert.
BEISPIEL 2: Beschichtung von Goldoberflächen mit OptoDex S und maskengestützte Untersuchung der Photoimmobilisierung von Biomolekülen darauf
Die für Beschichtung mit OptoDex S verwendeten Goldplattformen sind Siliciumchips von 12 × 12 mm mit einer 150-nm-Goldschicht zuoberst auf einem Si₃N₄-beschichteten Siliciumwafer. Diese Chips werden zuerst dreimal mit Isopropanol gespült und während drei Minuten bei Raumtemperatur mit einem Sauerstoffplasma gereinigt.
a) Chemisorption von Optodex S auf Goldoberflächen
Die OptoDex S-Beschichtung von Gold wird erreicht, indem zu jeder vergoldeten Plattform 50 μl einer Lösung von 1,0 mg OptoDex S pro ml verdünnter (1 : 100), phosphatgepufferter Salzlösung zum vergoldeten Chip zugegeben werden. Um eine gleichförmige Chemisorption von OptoDex S zu erreichen, werden die Plattformen während fünf Stunden bei 37°C in einer Feuchtekammer gehalten. Nach diesem Schritt werden die Plattformen mit entionisiertem Wasser gespült und während einer Stunde bei 5 × 10^–2 mbar getrocknet. Sofern sie nicht sofort verarbeitet werden, werden die mit OptoDex S behandelten Goldoberflächen vakuum-verpackt bei –18°C aufbewahrt.
b) Photoimmobilisierung von Biomolekülen auf mit OptoDex S behandelten Goldoberflächen
Die Photoimmobilisierung eines Biomoleküls an mit OptoDex S behandelten Goldoberflächen wird erreicht, indem das Biomolekül mit phosphatgepufferter Salzlösung (1 : 100) zu einer Schlusskonzentration von 0,2 mg/ml verdünnt wird. Die in dieser Gruppe von Experimenten verwendeten Biomoleküle sind mit Fluorophor (Cy-5) markiertes, Riboflavin bindendes Protein, mit Cy-3 markiertes Rinderserum-Albumin und unmarkiertes Mäuse-Immunglobulin. Zu jeder mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform werden 25 μl der oben beschriebenen Proteinlösung zugegeben. Die beschichteten Plattformen werden dann während 1,5 Stunden im Vakuum getrocknet (30 Minuten bei 20 mbar, gefolgt von einer Stunde bei 5 × 10^–2 mbar). Eine kovalente Bindung der Biomoleküle an mit OptoDex S beschichtete Goldoberflächen wird erreicht, indem die Oberflächen während fünf Minuten mit der Oriel-Lichtquelle (350 nm, Bestrahlungsstärke 11 mW/cm², in Gegenwart eines UV-Cutoff-Filters) bestrahlt werden, und zwar unter Benutzung einer strukturierten Photomaske (siehe 1A), um die Lichtabhängigkeit der Immobilisierungsreaktion leicht zeigen zu können.
Nach der Photoimmobilisierung werden die oberflächenbehandelten Goldplattformen unter fortgesetztem Rühren durch aufeinanderfolgende Behandlung (von je fünf Minuten) mit den folgenden Lösungen gründlich gespült: 1% Serum-Albumin in phosphatgepufferter Salzlösung (einmal); phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,02% Tween^TM 20 (dreimal); phosphatgepufferte Salzlösung (dreimal); entionisiertes Wasser (dreimal).
Mäuse-Immunglobulin m-IgG ohne Fluorophor wurde mit Cy-5-markiertem Ziege-Antimaus-IgG-Antikörper immun-komplexiert. Immunfärbung mit Cy-5-markiertem Ziege-Antimaus-Immunglobulin-Antikörper wird durch Inkubieren der Plattform während 30 Minuten bei 37°C in einer Lösung erreicht, die eine verdünnte Antikörper-Zubereitung enthält (1 : 200 verdünnt mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserum-Albumin enthält). Vor der Aufnahme werden die immungefärbten Oberflächen (je dreimal) mit 0,05% Tween 20 enthaltender phosphatgepufferter Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung und entionisiertem Wasser gespült.
Die photostrukturierten, mit Fluorophor markierten Proteine werden durch Scannen mit einem konfokalen Arrayscanner photographiert. Die Scannereinstellungen am Affymetrix-ArrayScanner 428 waren: Verstärkung 50, Fokus 0,1, sowohl für Cy-5 als auch für Cy-3.
Die Ergebnisse des Fluoreszenzscannens werden in den Scanogrammen der 2B, 2C und 2D gezeigt.
2B ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der mit Cy-5 markiertes, Riboflavin bindendes Protein (RBP) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A.
2C ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der mit Cy-3 markiertes Rinderserum-Albumin (BSA) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A.
2D ist ein Fluoreszenz-Scanogramm einer mit Optodex S behandelten, vergoldeten Plattform, zu der Maus-Immunglobulin (m-IgG) hinzugegeben worden war, nach UV-Bestrahlung unter Verwendung der Photomaske von 2A und Immunkomplexbildung mit Cy-5 markiertem Ziege-Antimaus-IgG-Antikörper.
Diese Scanogramme zeigen, dass jedes der drei Biomoleküle auf der mit OptoDex behandelten Goldoberfläche nur in den Bestrahlungsbereichen (leuchtend erscheinend), aber nicht in den Bereichen immobilisiert wird, wo die Bestrahlung durch die Maske aufgehalten wurde.
BEISPIEL 3: Beschichtung von Goldoberflächen mit OptoDex S und Untersuchung der Photoimmobilisierung von Biomolekülen unter Verwendung der normalen Mikroarray-Drucktechnologie
Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung von mit OptoDex modifizierten Goldplattformen für die Fertigung von Mikroarrays mit einem herkömmlichen MikroArrayer (Affymetrix ArrayPrinter 417). Die in dieser Gruppe von Experimenten verwendeten Goldplattformen sind handelsübliche, vergoldete Glasträger (75 mm × 25 mm × 1 mm), wie sie zum Beispiel von der Erie SA (Biogold) verfügbar sind. Die vergoldeten Träger werden während drei Minuten mit Sauerstoffplasma behandelt, um eine Reinigung der Goldoberfläche zu bewirken. OptoDex S wird auf der Goldoberfläche chemisorbiert, indem die Trägerplattformen während fünf Stunden bei 37°C in einer OptoDex S-Lösung (0,5 mg OptoDex S pro ml verdünnter (1 : 100) phosphatgepufferter Salzlösung) inkubiert werden. Nach dieser Behandlung werden die Trägeroberflächen mit entionisiertem Wasser gespült und während einer Stunde in einer Vakuumkammer bei 5 × 10^–2 mbar getrocknet. So behandelte Oberflächen können bis zur weiteren Verwendung bei –18°C aufbewahrt werden.
Zur Demonstration werden zwei Arten von Biomolekülen für das Array-Drucken verwendet: mit Cy-5 markiertes Mäuse-Immunglobulin und mit Cy-3 markiertes Rinderserum-Albumin. 400-Punkt-Wiederholungs-Arrays jeder Biomolekülzubereitung werden mit dem Affymetrx-ArrayPrinter 427 (Nadel-und-Ring-Drucker, gleichzeitiges Drucken mit vier Nadeln) gedruckt. Die kovalente Bindung der Biomoleküle in den Punkten an die mit OptoDex S beschichteten Goldoberflächen wird durch fünfminütige Bestrahlung der Oberflächen mit der Oriel-Lichtquelle (350 nm, Bestrahlungsstärke 11 mW/cm², mit UV-Cutoff-Filter) erreicht. Nach der Belichtung werden die Plattformen unter fortgesetztem Rühren durch aufeinanderfolgende Behandlung (von je fünf Minuten) mit den folgenden Lösungen gründlich gespült: 1% Serum-Albumin in phosphatgepufferter Salzlösung (einmal); phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,02% Tween^TM 20 (dreimal); phosphatgepufferte Salzlösung (dreimal); entionisiertes Wasser (dreimal). Die gedruckten Arrays werden durch Ablesung mit dem Affymetrix-ArrayReader aufgenommen.
Das Ergebnis eines solchen Experiments wird in 3 gezeigt. Die 400-Punkt-Mikroarrays werden parallel mit vier Nadeln des Affymetrix-ArrayPrinters gedruckt. Array 1 ist ein Wiederholungsarray einer Lösung, die mit Cy-5 markiertes Mäuse-Immunglobulin enthält. Array 2 stellt ein Wiederholungsarray einer Lösung dar, die eine 1 : 1-Mischung von mit Cy-5 markiertem Maus-Immunglobulin und OptoDex A enthält. Entsprechend ist Array 3 ein Wiederholungsarray einer Lösung von mit Cy-3 markiertem Rinderserum-Albumin. Array 4 zeigt den Druck einer Lösung, die eine 1 : 4-Mischung von mit Cy-3 markiertem Rinderserum-Albumin und OptoDex A enthält.
Dieses Beispiel zeigt, dass die normale Drucktechnologie zur Herstellung von Mikroarrays mit einer grossen Anzahl von verschiedenen, darauf immobilisierten Proteinen eingesetzt werden kann.
BEISPIEL 4: Direkte Messung der Bindung von Vitamin B₂ an photoimmobilisiertes, Riboflavin bindendes Protein durch Oberflächenplasmonenresonanz auf Goldplattformen
Diese Folge von Experimenten liefert Beweise, dass das Riboflavin (d.h. Vitamin B₂) bindende Protein RBP auf Goldplattformen photoimmobilisiert werden kann. Weiter werden die Bedingungen für die RBP-Bindung und für die Prüfung mit auf Mikroplatten photoimmobilisiertem RBP ausgearbeitet. Schliesslich werden Beweise erbracht, dass die Kombination von photoimmobilisiertem RBP auf Gold für die direkte quantitative Messung von Vitamin B₂ verwendet werden kann.
Die Bewahrung der biologischen Aktivität von photoimmobilisiertem RBP wurde vor Ausarbeitung der Prüfung der Bindung von Vitamin B₂ an Goldplattformen in einem Mikroplatten-Prüfsystem bestätigt. Zwei Verfahren für die Immobilisierung von Biomolekülen wurden geprüft: a) Beschichtung von RBP, b) Co-immobilisierung von RBP. Beide Systeme verwenden OptoDex A als das Linker-Polymer, und die Bindung von Vitamin B₂ wird durch Fluoreszenzlöschung nachgewiesen; Riboflavin (Vitamin B₂) fluoresziert in Lösung. Die intrinsische Fluoreszenz wird gelöscht, wenn das Vitamin an RBP bindet. Je mehr Vitamin B₂ an RBP bindet, desto stärker ist die Löschung der intrinsischen Fluoreszenz von Vitamin B₂. Die Fluoreszenzlöschung ist somit ein Anzeiger für die Bioaktivität des immobilisierten RBP. Beide Prüfungstypen werden auf Polystyrol-Mikroplatten ausgeführt. Von den beiden erwähnten Prozeduren lieferte die Coimmobilisierung eine hohe Bindungsaktivität von Vitamin B₂ und eine geringe unspezifische Bindung. Auf der Basis der gewonnenen Ergebnisse wird die Coimmobilisierung bevorzugt für die Immobilisierung von Sondenmolekülen auf Goldoberflächen verwendet, wie mit RBP demonstriert wurde.
Photoimmobilisierung von Riboflavin bindendem Protein (RBP) auf Gold
Das experimentelle Verfahren für die Immobilisierung von Riboflavin bindendem Protein (RBP) auf Goldoberflächen ist ausführlich in Beispiel 2 beschrieben. Identische Prozeduren werden befolgt, jedoch mit dem Unterschied, dass statt des mit Fluorophor markierten RBP natives (nicht markiertes) RBP verwendet wurde.
a) Vorbehandlung der Goldplattformen und Funktionalisierung mit OptoDex S
Goldplattformen (Biacore Au-Sensor-Chips), die zur Verwendung im analytischen Nachweissystem Biacore QC ausgelegt sind, wurden von Biacore AB, Schweden, bezogen. Die Goldoberflächen werden während drei Minuten bei Umgebungstemperatur mit einem Sauerstoffplasma vorbehandelt. OptoDex S wird in phosphatgepufferter Salzlösung (1 : 100 verdünnt) zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml aufgelöst, und 50 μl dieser Lösung werden mit einer Pipette auf die Goldplattform aufgebracht. Die Bindung von OptoDex S an Gold wird durch fünfstündige Inkubation bei 37°C und 80-%iger Luftfeuchte erreicht. Die behandelten Oberflächen werden dann mit entionisiertem Wasser gespült und während einer Stunde in einer Vakuumkammer bei 5 × 10^–2 mbar getrocknet. Die anfallenden, mit OptoDex S modifizierten Goldplattformen werden bis zur weiteren Verwendung vakuum-verpackt und bei –18°C aufbewahrt.
b) Kovalente Anknüpfung von RBP an mit OptoDex S modifizierte Goldplattformen
RBP wird in phosphatgepufferter Salzlösung (1 : 100 verdünnt) zu einer Konzentration von 0,2 mg/ml aufgelöst und auf mit OptoDex S modifizierte Goldplattformen aufgetragen (25 μl pro Chip). Den Beschichtungsprozeduren folgend wird RBP mit OptoDex A (Verhältnis 1 : 2, Gew./Gew.) in verdünnter (1 : 100), phosphatgepufferter Salzlösung gemischt, und die Mischung wird auf mit OptoDex S modifizierte Goldplattformen aufgetragen. Die Plattformen werden dann während 30 Minuten bei 20 mbar und während einer Stunde bei 5 × 10^–2 mbar vakuum-getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Plattformen während fünf Minuten mit einer Oriel-Lampe (350 nm, 11 mW/cm²) bestrahlt, und zwar in Gegenwart eines UV-Cutoff-Filters, um Licht mit Wellenlängen kürzer als 300 nm zu eliminieren. Nach der Anknüpfung von RBP werden die Plattformen durch Anwendung der folgenden Behandlung in dieser Reihenfolge gespült: a) phosphatgepufferte Salzlösung, 0,02% Tween 20 enthaltend; b) phosphatgepufferte Salzlösung; c) entionisiertes Wasser, wobei jeder Spülschritt während fünf Minuten unter Bewegung erfolgte. Die Plattformen mit dem kovalent angeknüpften RBP werden bis zur weiteren Verwendung vakuum-verpackt und bei –18°C aufbewahrt.
c) Durch Oberflächenplasmonenresonanz nachgewiesene Bindung von Vitamin B₂ an RBP
Der Nachweis der Bindung von Vitamin B₂ an photoimmobilisiertes RBP erfolgt mit dem Biacore QC-Gerät. Biacore Au-Sensor-Chips werden wie oben beschrieben modifiziert und in das Biacore QC-Gerät eingesetzt. Eine Lösung von Vitamin B₂ (5 bis 50 μg Vitamin B₂ in Wasser, das 0,12% (Vol./Vol.) Essigsäure enthält) wird eingespritzt, und die Bindung von Vitamin B₂ wird registriert, indem die Änderung der auf der Oberfläche abgeschiedenen Masse aufgezeichnet wird (RU = relative units: relative Einheiten). In dem in 4 gezeigten Experiment wird die Sättigung der Bindung von Vitamin B₂ in vier Minuten erreicht. Nach vier Minuten wird die Oberfläche mit entionisiertem Wasser gespült, das 0,12% Essigsäure enthält (Spülpuffer). Die Wechselwirkung von Vitamin B₂ mit dem immobilisierten RBP kann rückgängig gemacht werden, indem die Oberfläche einem Regenerationspuffer ausgesetzt wird, der aus einer Lösung von 0,033% Natriumdodecylsulfat in 0,1 M Phosphatpuffer von pH 4,5 besteht.
Das oben Dargelegte zeigt, dass auf einer Beschichtung von OptoDex S auf einer Goldoberfläche immobilisierte Biomoleküle ihre biologische Aktivität bewahren und daher als Liganden in einem Biosensor wirken können.

Claims

An ein Metallsubstrat angeheftetes Photolinker-Makromolekül, das ein auf Saccharid beruhendes Polymer ist, das photoaktivierbare Gruppen, die bei einer Wellenlänge von mindestens 320 nm aktiviert werden können, sowie schwefelhaltige Gruppen enthält, wobei die schwefelhaltigen Gruppen aus der Gruppe von Thiol (-SH), Thiosäure (-COSH), Dithiosäure (-CSSH), Sulfid (-S-) und Disulfid (-S-S-) ausgewählt werden.
Makromolekül nach Anspruch 1, kovalent an ein Biomolekül in einer aktiven Form gebunden.
Makromolekül nach Anspruch 1 oder 2, worin das Polysaccharid aus der Gruppe von Agarose, Dextran, Carrageenan, Alginsäure, Stärke und Cellulose sowie einem Abkömmling davon ausgewählt ist.
Makromolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin das Polysaccharid Dextran und insbesondere Aminodextran oder Carboxymethyldextran ist.
Makromolekül nach Anspruch 4, worin das Saccharid Aminodextran oder Carboxymethyldextran ist, wobei die Gesamtmenge der Aminofunktionen oder Carboxyfunktionen, die für eine nachfolgende Funktionalisierung sowohl mit den photoaktivierbaren Gruppen als auch mit den schwefelhaltigen Gruppen zur Verfügung stehen, 0,01 bis 0,5 Mol je Mol des Glucosemonomers darstellen.
Makromolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die photoaktivierbaren Gruppen aus der Gruppe von Aryldiazirinen und Benzophenonen ausgewählt sind.
Makromolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die photoaktivierbaren Gruppen aus der Gruppe von 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin, N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsäure, p-Azidophenyl-isothiocyanat, Benzophenon-4-isothiocyanat, Benzophenon-4-maleimid, 4-Benzylbenzoesäure-Succimidylester oder 3-(Trifluormethyl)-3-(m-isothiocyanophenyl)diazirin ausgewählt werden.
Makromolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Metall aus der Gruppe von Aluminium, Kupfer, Gold, Palladium, Platin und Silber ausgewählt ist.
Sensoroberfläche eines Biosensors, die ein Makromolekül nach Anspruch 2 umfasst.
Mikroarray, der ein Makromolekül nach Anspruch 2 umfasst.
Nanopartikel, Nanogruppierung oder Mikropartikel, ein Makromolekül nach Anspruch 2 umfassend.
Verfahren zur Herstellung eines Photolinker-Makromoleküls nach Anspruch 1, das umfasst, ein Polysaccharid durch mehrfache Substitution mit photoaktivierbaren Gruppen und schwefelhaltigen Gruppen zu derivatisieren und das derivatisierte Saccharid durch Chemisorption oder Schwefel-Metall-Komplexbildungsprozesse an ein Metall anzufügen.
Verfahren zur Herstellung eines Makromoleküls nach Anspruch 2, das umfasst, ein Gemisch eines Photolinker-Makromoleküls nach Anspruch 1 und eines Biomoleküls in einer aktiven Form in Abwesenheit von jeglichem Lichteinfall unterhalb von 320 nm einer Photoreaktion bei einer Wellenlänge von mindestens 320 nm zu unterwerfen.