DE60024432T2

DE60024432T2 - Bindungspolymer für amin- ligand-verbindungen und seine verwendung

Info

Publication number: DE60024432T2
Application number: DE60024432T
Authority: DE
Inventors: David Weston; Peter Anthony North Crawley TURNER; Charles David CULLEN; A. Sergiy PILETSKY; Volodimirivna Olena Cranfield PILETSKA; Uwe Schedler
Original assignee: Cranfield University
Current assignee: Cranfield University
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-04-26
Also published as: AU4584900A; EP1173761B1; DE60024432D1; WO2001006256A1; ATE311598T1; US6680204B1; GB9909245D0; EP1173761A1; ES2253224T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polymer, das in der Lage ist, Aminliganden zu binden, dessen Herstellung und Verwendungen einschließlich Tests und Chromatographie.
Es gibt einen steigenden Bedarf an der Messung und Quantifizierung von Aktivitäten des Menschen. Sensoren erfüllen teilweise diesen Bedarf, wobei jedoch Sensoren für zahlreiche Anwendungen nicht leicht in einer geeigneten Form zur Vermarktung erhältlich sind.
Eine bestimmte Klasse an Sensoren, die sogenannten Bio- und Chemo-Erkennungssensoren, erfordert die Integration von Liganden (Erkennungselementen) in einen Transduktor. Die Integration sollte normalerweise Änderungen des Erkennungselements ermöglichen, die durch Wechselwirkung mit einem entsprechenden Analyt entstehen, den es durch den Transduktor in ein messbares Signal umzuwandeln gilt.
Die Immobilisierung der Liganden an der Oberfläche eines geeigneten Transduktors ist ein erforderlicher Schritt bei der Herstellung von Sensoren. Wünschenswerte Eigenschaften dieses Prozesses umfassen: Platzieren von geeigneten Mengen an Liganden auf die Detektoroberfläche mittels einfacher Verfahren, Aufrechterhalten von Bioerkennungsaktivität der Liganden nach Immobilisierung und Minimierung nicht-spezifischer Wechselwirkungen zwischen der Probe und dem Erkennungselement oder anderen Teilen des Sensors.
Stand der Technik
Erst jüngst wurden zahlreiche verschiedene Verfahren zum Anbinden verschiedener Liganden an Transduktoren entwickelt, um wirksame und empfindliche Bio- und Chemosensoren zu schaffen.
Beispiele sind in der US-A-4177038, US-A-4250267, US-A-4784962, US-A-5242828, US-A-5436161 und in S. Löfås, B. Johnsson, K. Tegendal, I. Rönnberg, "Dextran modified gold surfaces for surface plasmon resonance sensors: immunoreactivity of immobilised antibodies and antibody-surface interaction studies", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 1, 83–89 (1993), offenbart.
Auch von Interesse ist S. Simons Jr. et al., "Reaction of O-Phthalaldehyde and Thiols With Primary Amines; Formation of 1-Alkyl (and Aryl) Thio-α-Alkylisoindoles", J. Org. Chem. 43(14), 2886–2896 (1978).
Ein üblicher Ansatz ist die Verwendung von Transduktoroberflächen, die mit Hydrogel-Schichten (US-Patent 5.436.161), wie z.B. Carboxymethyl-Dextran, modifiziert sind. Typischerweise sind Hydrogel-Polymere kovalent an eine Transduktoroberfläche immobilisiert, um eine dünne Hydrogel-Schicht zu bilden. Liganden können unter Verwendung einer chemischen Aktivierung kovalent an das Hydrogel-Polymer immobilisiert werden. Ein solches Verfahren mit zahlreichen Schritten führt zu erheblichen Unkosten bei jeglicher Massenfertigung einer Sensorvorrichtung. Ein alternativer Ansatz, der diesem Nachteil beikommt, wäre von enormem Nutzen.
Offenbarung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung einer Aminogruppe, die Liganden L-NH₂ enthält, mithilfe einer Dialdehyd-Komponente OHC-X-CHO und einer polymerisierbaren Komponente R-Z, worin R eine polymerisierbare Gruppierung ist und Z aus -SH, -S-Alkyl-, -CN und -SO₂ ausgewählt ist, durch Durchführung der folgenden Reaktionen gleichzeitig und/oder nacheinander in beliebiger chemisch möglicher Reihenfolge bereit:

i) Polymerisierung der polymerisierbaren Gruppierungen R, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Comonomeren;
ii) Umsetzung einer Komponente, die -Z enthält, mit der Dialdehydkomponente;
iii) Umsetzung von L-NH₂ mit der Dialdehydkomponente oder mit dem Produkt der Reaktion (ii).

Die Dialdehydkomponente ist vorzugsweise ein 1,4-Dialdehyd, im Allgemeinen konjugiert
das im Allgemeinen einen Teil eines aromatischen Ringsystems darstellt und z.B. o-Phthaldialdehyd (I) sein kann:
Konjugation kann wünschenswert sein, um ein Produkt zu ergeben, das mittels optischer Verfahren, z.B. unter Einbindung von Fluoreszenz, nachweisbar ist.
Die polymerisierbare Gruppierung R enthält im Allgemeinen eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Mehrfachbindungen. Beispielsweise kann R-Z Allylmercaptan sein.
Polymerisation kann Comonomere sowie die R-Gruppierungen einbinden. Sie können verwendet werden, um die Z-Gruppen im Polymer zu "verdünnen". Insbesondere wenn Z -SH ist, kann solch eine Verdünnung wünschenswert sein, um das Auftreten von Vernetzung durch Z-Z- (z.B. Disulfid-) Brücken zu reduzieren. Comonomere können auch verwendet werden, um Polymerlöslichkeit zu regulieren, um diese an bestimmte Anwendungen anzupassen.
Insbesondere wenn Z für -SH oder -S-Alkyl steht, kann die Umsetzung zur Erreichung von Selbstassemblierung eines Polymers auf einer geeigneten Oberfläche (insbesondere einer Metalloberfläche (insbesondere aus Edelmetall) oder einer Oberfläche mit -SH-Gruppen) geeignet sein. Somit basiert eine bevorzugte Klasse an Ausführungsformen auf der Fähigkeit eines synthetischen Polymers, das Thioacetal-Gruppen, gebildet aus einer Mercapto-Gruppe und Phthaldialdehyd, enthält, auf einer Metalloberfläche Selbstassemblierung zu erfahren und aminohältige Liganden zu binden, um einen fluoreszierenden Komplex zu bilden. Das Polymer kann unter Verwendung von ionischer oder radikalischer Polymerisation oder Polykondensation synthetisiert werden. Vorzugsweise enthält zumindest eines der für Polymerisation verwendeten Monomere freie SH-Gruppen. In einer anderen Variante kann das Polymer zuerst unter Verwendung eines SH-Gruppen-hältigen Monomers hergestellt und daraufhin mit Dialdehyd behandelt werden, um ein Thioacetal zu bilden. Auch ist es möglich, CN- und SO₂-hältige Monomere anstelle oder gleichzeitig mit SH-hältigem Monomer zur Polymerherstellung zu verwenden.
Oberflächen, die mit einem Polymer der Erfindung beschichtet sind, können Mikrotiterplatten, Wells, Transduktoren (z.B. für Oberflächen-Plasmonresonanz oder elektrochemische Vorrichtungen) oder Bindungsmaterialien, z.B. für Chromatographie, sein.
Ein Polymer der Erfindung kann Einheiten der Formel II enthalten:
worin R' von Polymerisation einer R-Gruppe abstammt.
Die Einheit
wird vorzugsweise durch ein aromatisches Ringsystem bereitgestellt, das z.B.
ist, gegebenenfalls substituiert und/oder kondensiert, um einen Polyzyklus zu bilden.
Ein Polymer der Erfindung, das L-NH₂ einbindet, kann Einheiten der Formel III umfassen:
dem folgenden in Formel II entspricht, die z.B.
ist (gegebenenfalls substituiert und/oder kondensiert).
Die oben beschriebenen Polymere können bei Affinitätschromatographie oder in Sensoren verwendet werden. Solch ein Polymer, das SH-Gruppen enthält, kann an einer Metall- oder SH-hältigen Oberfläche (z.B. während der Synthese) adsorbieren, wodurch eine homogene, stabile Beschichtung entsteht. Es ist möglich, zuerst eine Oberflächenbeschichtung mit einem Polymer von RSH zu bilden, worauf Behandlung dieses Polymers unter Verwendung von Dialdehyd, vorzugsweise Phthaldialdehyd, folgt und daraufhin mit aminohältigem Liganden. Wiederum kann der Ligand durch gleichzeitigen Zusatz der erwünschten Verbindung mit Dialdehyd zum SH-hältigen Polymer immobilisiert werden. Spezies, wie z.B. Zellen, Enzyme, Viren, Pilze, Antikörper, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Nucleinsäuren und Derivate oder Gemische können leicht am Polymer, das wie zuvor beschrieben synthetisiert wurde, immobilisiert werden. Die immobilisierte Spezies kann selbst zum Binden eines zweiten Typs von Liganden dienen. Das Binden des zweiten Ligandentyps kann messbare Eigen schaften, z.B. Fluoreszenz, beeinflussen, sodass die Bindung nachgewiesen werden kann. Die Liganden vom ersten und zweiten Typ können spezifische Bindungspaare, z.B. Antikörper-Antigen, bilden.
Liganden-Immobilsierung an der Polymeroberfläche umfasst eine Einschritt-Wechselwirkung zwischen Thioacetal- und Aminogruppe ohne chemische Aktivierung der funktionellen Gruppen des Polymers oder des Liganden. Bildung von fluoreszierenden Komplexen kann verwendet werden, um Bindung zu überwachen. Der durch Thioacetal mit Liganden-Aminogruppen gebildete Isoindolkomplex wurde als sehr stabil erkannt, was die Verwendung stark saurer Bedingungen für Oberflächenregeneration ermöglicht.
Das homologe aromatische Dialdehyd, o-Phthaldialdehyd, oder Thioacetal ist im Wesentlichen nicht fluoreszierend, bis es mit primärem Amin in Gegenwart von überschüssigem Cyanid oder Mercaptan umgesetzt wird, um ein fluoreszierendes Isoindol zu ergeben. Überwachung der Polymer-Fluoreszenz bietet eine Gelegenheit, die Menge der an die Polymeroberfläche gebundenen Substanzen direkt zu kontrollieren, was weiter in Sensoren und Tests verwendet werden kann.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 zeigt mögliche Reaktionsschemata, die in der Erfindung einsetzbar sind.
2 zeigt eine Abhängigkeit der OPA-AM-Polymer-Emissionsspektren von verschiedenen Ammoniumhydroxidkonzentrationen (1–100 mM). Gepunktete Linie – Kontrolle ohne Ammoniumhydroxid. Reaktionsgemisch ist 3 mg/ml Polymer in einem 1:1-Gemisch von Acetonitril und 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8. Inkubationsdauer beträgt 30 min.
3 zeigt eine Abhängigkeit von OPA-AM-Polymerreaktion auf 100 mM Ammoniak vom pH.
4 zeigt eine Änderung der Emissionsspektrenintensität des OPA-AM-Polymers (I(lamda)_exc 355 nm) als Reaktion auf den Zusatz von Meerrettichperoxidase.
5 zeigt eine Polymerabscheidung auf Goldoberfläche unter Verwendung von Durchflusssystem.
6 zeigt eine kovalente Bindung von menschlichem Immunglobulin an die mit OPA-AM-Polymer beschichtete Oberfläche, gefolgt von Anti-Human-Immunglobulin-Bindung.
7 zeigt eine Regeneration von Oberfläche, die mit Polymer mit 0,1% SDS/10 mM HCl beschichtet ist.
8 zeigt eine Verdrängung von Anti-Human-Immunglobulin (HIGg) durch das menschliche Immunglobulin von der Prismenoberfläche, die mit OPA-AM-Polymer beschichtet ist, mit darauf folgender Regeneration. Konzentrationen von HIGg und Anti-HIGg – 10 mg/ml.
9 ist ein Säulendiagramm, das die Bindungskapazität des OPA-AM-Polymers für verschiedene Proteine zeigt.
Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt einige Beispiele für Reaktionstypen, die in der Erfindung verwendet werden können.
Reaktion (i) zeigt die Wechselwirkung von o-Phthaldialdehyd ("OPA")(I) mit einem polymerisierbaren Thiol R-SH und einem Aminliganden L-NH₂, um ein fluoreszierendes Isoindol (IV) zu bilden. Die Reaktionen (ii) und (iii) zeigen diesen Prozess, durchgeführt in aufeinander folgenden Phasen: Umsetzung von OPA (I) mit Thiol, um ein Thioacetal (V) zu bilden, das daraufhin mit dem Aminliganden umgesetzt wird.
Die Herstellung eines Polymers, das die Erfindung verkörpert, und einige damit durchgeführte Versuche werden nun beschrieben.
1. Herstellung des Polymers
134 mg OPA und 82 mg Allylmercaptan (AM) wurden in 2 ml (2-Hydroxyethyl)methacrylat und 2 ml Acetonitril aufgelöst. 50 mg AIBIN wurden als Katalysator für diese Umsetzung verwendet. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 80°C inkubiert. Polymer (OPA-AM) wurde in Ethanol aufgelöst, und 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, wurden zugesetzt. Das resultierende Pellet wurde gesammelt und mit Wasser unter Verwendung von Glasfilter gewaschen.
2. Fluorimetrie mit reaktivem Polymer
30 mg OPA-AM-Polymer wurden in 10 ml Acetonitril/H₂O (1:1) aufgelöst. Um das Gemisch auf einen basischen pH einzustellen, wurden 30 ml von 4%igem NaOH zugesetzt. Fluoreszenzmessungen wurden mit Spektralfluoriphotometer RF-5301 PC (Shimadzu, Japan) durchgeführt.
Das Polymer wurde bei einer Wellenlänge von 355 nm angeregt, und das Emissionsspektrum wurde gemessen. Es wurde erkannt, dass die Intensität der Fluoreszenz von der Gegenwart von Aminogruppen in der Probe (siehe 2), der Inkubationsdauer (nicht gezeigt) und dem pH (siehe 3) abhängt.
Dieselben Versuche wurden unter Verwendung von Meerrettichperoxidase durchgeführt, woraus ähnliche Resultate erhalten wurden (4).
3. Anwendung von OPA-AM-Polymer für Liganden-Immobilisierung in Oberflächen-Plasmonresonanz
Glasprismen, beschichtet mit >> 50 nm Goldschicht, wurden 5 min lang in die Polymerlösung in Methanol (1 mg/ml) getaucht und zweimal mit Methanol und Wasser gewaschen.
In einer anderen Variante des Verfahrens wurde die Polymerlösung in Methanol durch die Durchflusszelle (20 ml Volumen) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min 10 min lang durchlaufen gelassen. Methanol wurde dann 10 min lang laufen gelassen, um überschüssiges Polymer zu entfernen. Die Positionsverschiebung des Reflexionskurvenminimums (A_SPR) ist ein Resultat von Polymer-Immobilisierung (5).
100 ml Lösung von menschlichem IgG (0,1 mg/ml, 100 mM Natriumboratpuffer, pH 9,0) wurden injiziert, und die Immobilisierungsrate wurde unter Verwendung von Winkel-Scanning gemessen. Die Verschiebung der Position des Reflexionskurvenminimums wurde gemessen.
Die Adsorption der zweiten Antikörper, die für kovalent immobilisiertes HIGg spezifisch waren (Anti-HIGg), wurde beobachtet (6). Die Oberfläche wurde mit einem Gemisch aus 0,1% SDS/10 mM HCl regeneriert (7).
Das Zeit-Scanning wurde angewandt, um Bindungs/Ersetzungs-Ereignisse zu messen (8). Es wurde erkannt, dass die OPA-AM-Matrix eine reaktive Oberfläche schafft, die für optische Transduktoren geeignet ist. Sie ist bei Lagerung stabil, einfach herzustellen und ist zur Massenfertigung von Biosensorvorrichtungen geeignet.
Protein-Immobilisierung. Die Bindungskapazität des Polymers wurde mit mehreren Proteinen nachgewiesen:
Mikroperoxidase (FG = 1 kD), Cytochrom C (FG = 12,4 kD), Meerrettichperoxidase (HRP)(FG = 44 kD), Rinderserumalbumin (BSA)(FG = 66 kD) und Hämoglobin (FG = 67 kD). 10 mg Polymer wurden mit 400 ml Proteinlösung (5 mg/ml) in 10 mM HEPES-Puffer, pH 8,6, 18 h lang inkubiert. Die Proteinkonzentration vor und nach Sorption wurde spektralphotometrisch unter Verwendung eines BCA-Verfahrens (siehe T. Osnes, O. Sandstad, V. Skar, M. Osnes, P. Kierulf, Scandinavian journal of clinical & laboratory investigation 53(7), 757–763 (1993)) gemessen und mittels Kalibrationskurven, die individuell für jedes Protein erhalten wurden, berechnet. Es wurde berechnet, dass 1 g des Polymers 0,6 mg BSA, 0,55 mg Cytochrom C, 0,2 mg Mikroperoxidase, 0,5 mg Meerrettichperoxidase und 1 mg Hämoglobin binden kann (siehe 9). Die Bindungskapazität des Polymers und die Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion hängen daher von der Anzahl an Aminen ab, die verfügbar sind – eine Funktion sowohl von der Struktur des Proteins als auch von seiner Aminosäurezusammensetzung. Die Immobilisierungsgeschwindigkeit wurde als vergleichbar mit jener handelsüblicher Sorptionsmittel erkannt, die für Protein-Immobilisierung verwendet werden, wie z.B. aktivierte CN-Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden). Es wird erwartet, dass das Polymer als wirksame alternative Immobilisierungsmatrix bei Affinitätschromatographie zur Immobilisierung von organischen Aminen, Proteinen und Nucleinsäuren geringen Gewichts sowie als Sensor/Test-Komponenten zur Detektion primärer Amine verwendet werden kann.

Claims

Verfahren zur Immobilisierung eines aminogruppenhältigen Liganden L-NH₂ mithilfe einer Dialdehydkomponente OHC-X-CHO und einer polymerisierbaren Komponente R-Z, worin R eine polymerisierbare Gruppierung ist und Z aus -SH, -S-, Alkyl, -CN und -SO₂ ausgewählt ist, durch die Durchführung der folgenden Umsetzungen gleichzeitig und/oder nacheinander in beliebiger, chemisch machbarer Reihenfolge: i) Polymerisation der polymerisierbaren Gruppierungen R, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Comonomeren; ii) Umsetzung einer Komponente, die -Z enthält, mit der Dialdehydkomponente; iii) Umsetzung von L-NH₂ mit der Dialdehydkomponente oder mit dem Produkt der Umsetzung (ii).
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Dialdehydkomponente ein 1,4-Dialdehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Dialdehydkomponente die folgende Form aufweist:
Verfahren nach Anspruch 3, worin A-C=C-B ein aromatisches Ringsystem darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Dialdehydkomponente o-Phthaldialdehyd ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppel- oder -Dreifachbindungen enthält.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die polymerisierbare Komponente ein Thiol R-SH ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Komponente R-Z oder das Produkt, das aus ihrer Polymerisation und/oder Umsetzung mit der Dialdehydkomponente resultiert, auf einer Metalloberfläche oder Oberfläche mit SH-Gruppen adsorbiert wird; und die Durchführung des Verfahrens dazu führt, dass der Ligand auf der Oberfläche immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das einen fluoreszierenden Komplex ergibt, worin die Immobilisierung des Liganden durch die Überwachung der Fluoreszenz detektiert wird.
Polymer, Einheiten der folgenden Formel umfassend:
worin R' von einer polymerisierbaren Gruppierung stammt, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Mehrfachbindungen enthält.
Polymer, Einheiten der folgenden Formel umfassend:
worin R' von einer polymerisierbaren Gruppierung stammt, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Mehrfachbindungen umfasst, und
von einem Liganden L-NH₂ stammt, der eine Aminosäure, ein Peptid, ein Protein, eine Nucleinsäure oder ein Derivat von einem davon umfasst.
Polymer nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin
ein aromatisches Ringsystem ist.
Bindemedium, umfassend ein Trägermaterial mit einer Oberfläche, die ein Polymer nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 trägt.
Bindemedium nach Anspruch 13, das eine stationäre Phase für die Chromatographie ist.
Chromatographiesäule oder -platte mit einer stationären Phase nach Anspruch 14.
Biosensorvorrichtung, umfassend ein Bindemedium nach Anspruch 13.
Testverfahren zur Detektion von Liganden mithilfe einer Vorrichtung nach Anspruch 16, bei dem das Bindemedium einer Probe ausgesetzt wird, die vermutlich diese Liganden enthält, und die optischen Eigenschaften des Bindemediums überwacht werden.
Verfahren, Medium oder Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13–17, worin das Trägermaterial ein Polymer nach Anspruch 10 trägt und zur Bindung von aminogruppenhältigen Liganden dient.