DE10308894A1

DE10308894A1 - Qualitätskontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays

Info

Publication number: DE10308894A1
Application number: DE2003108894
Authority: DE
Inventors: Robert Schnepf; Harald Rau
Original assignee: Graffinity Pharmaceuticals AG
Current assignee: Graffinity Pharmaceuticals AG
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-09
Also published as: WO2004077054A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Qualitätskontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays, Mikroarrays mit Kontrollliganden sowie Kontrollliganden selbst zur Durchführung von Verfahren zur Qualitätskontrolle sowie Verfahren zum Auffinden solcher Kontrollliganden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Qualitätskontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays, Mikroarrays mit Kontrollliganden sowie Kontrollliganden selbst zur Durchführung von Verfahren zur Qualitätskontrolle sowie Verfahren zum Auffinden solcher Kontrollliganden.
Mikroarrays haben in der letzten Zeit immer mehr an Bedeutung gewonnen. Sie ermöglichen die Präsentation einer enormen Vielzahl von chemischen oder biologischen Materialien für die vielfältigsten Anwendungsgebiete. Hierbei sind Polynukleotid- (z.B. DNA- oder RNA-) oder Oligonukleotidarrays die am weitesten verbreiteten. Diese basieren häufig auf einem Glasträger, der, chemisch modifiziert, den synthetischen Aufbau oder die Anbindung der gewünschten Probe ermöglicht. Zuweilen werden derart modifizierte Träger auch Chip oder Biochip genannt. Diese können dann u.a. für Hybridisierungszwecke eingesetzt werden. Eine vergleichbare Entwicklung haben Mikroarrays mit immobilisierten Proteinen vollzogen. Jedoch zeigt sich hier eine gewisse Unverträglichkeit zumindest einiger Proteine mit dem festen Träger, so daß beispielsweise Denaturierungserscheinungen zu beobachten sind. Seltener werden in der Literatur chemische Mikroarrays beschrieben, d.h. Mikroarrays, auf denen organische Moleküle meist mit geringem Molekulargewicht (sogenannte "kleine organische Moleküle"; im Englischen auch "small molecules" oder "small organic molecules") immobilisiert sind. Dies liegt an den stark unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindungen dieser heterogenen Stoffklasse, die bei der Synthese der Proben und der Herstellung der Mikroarrays berücksichtigt werden müssen.
Die Vorteile solcher Mikroarrays liegen in deren leichten Handhabbarkeit sowie ihrem Potenzial zur Miniaturisierung und der möglichen Automatisierung bei der Herstellung und dem Einsatz in Instrumenten, wie Messgeräten. Dies liegt zum einen in der Mikrosystemtechnik begründet, die beispielsweise Strukturierungen bis in den Nanometerbereich ermöglicht. Zum anderen erlauben die fortschreitenden Entwicklungen in der Handhabung von Flüssigkeiten mit Hilfe von Mikropipetten oder Stiften (Pins) das Absetzen immer kleinerer Mengen von Flüssigkeitstropfen auf den Mikroarrays, wobei versucht wird, die Varianz der Volumina von Tropfen zu Tropfen zu verringern.
Ein bedeutender Anwendungsbereich insbesondere für chemische Mikroarrays ist die Wirkstoffforschung, wobei die oben genannten Vorteile deutlich zu Tage treten. Hierbei wird eine Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen nahezu gleichzeitig mit einem Zielmolekül, beispielsweise einem Protein das in Zusammenhang mit einer Krankheit oder einem therapeutischen Anwendungsgebiet steht, in Kontakt gebracht und die Wechselwirkung zwischen immobilisierter Verbindung und Zielmolekül, z.B. als Bindungsassay, detektiert (Screening). Die hieraus gewonnenen Informationen dienen dann zur Weiterentwicklung interessanter Strukturen bis hin zum Wirkstoff. Dabei erweist sich das Arrayscreening als schneller und kostengünstiger gegenüber dem klassischen, häufig mit Mikrotiterplatten (im Löslichen) arbeitenden Hochdurchsatzscreening (HTS).
Für alle Anwendungsbereiche ist die Qualitätskontrolle der Mikroarrays von großer Bedeutung. Zahlreiche Kontrollen, die die Qualität und den Erfolg bestimmter Vorgänge betreffen, sind allgemein bekannt und werden auch in der Chip- bzw. Mikroarraytechnologie eingesetzt. Hierzu gehören beispielsweise das Anfertigen mehrerer Kopien, beispielsweise von Duplikaten, sowohl von Proben auf einem Array als auch des Arrays selbst. Darüber hinaus werden sogenannte Positiv- und Negativkontrollen eingesetzt.

So beschreibt WO 01/6236 A1 einen Oberflächenplasmonen Resonanz (SPR) Chip, auf dem einzelne Kontrollspots als positive oder negative Kontrolle dienen sollen. Mit Hilfe solcher QC-Kontrollen soll sichergestellt werden, daß die Chipproduktion (insbesondere das Spotting) als Ganzes und der Assay, für den der Chip beispielsweise eingesetzt werden kann, als solcher funktioniert haben. Dem liegt die Annahme zugrunde, dass eine gewisse Anzahl an Kontrollproben, die gleichmässig über den Chip plaziert werden, bei Eintreten des erwarteten Ergebnisses (Signalerkennung der Positivkontrolle bzw. fehlendes oder ein dem Untergrundrauschen vergleichbares Signal bei einer Negativkontrolle) prognostiziert werden können und nach statistischer Bewertung eine Aussage hinsichtlich des Gelingens des Versuchs für alle Sensorfelder erlauben. In WO 01/6236 A1 wird jedoch nichts über Eigenschaft und chemische Struktur solcher Positiv- oder Negativkontrollen offenbart.

DE 102 45 651.8 offenbart die Verwendung von Kontrollliganden auf Sensorfeldern eines Mikroarrays, die dazu dienen zu überprüfen, wie vollständig ein Sensorfeld mit einem Liganden belegt ist. Hierbei wird die spezifische Bindung zwischen diesem Kontrollliganden und einem für diesen an sich bekannten mobilen Interaktionspartner ausgenutzt. Eine Wechselwirkung des Kontrollliganden mit dem eigentlich für die Liganden zu untersuchenden mobilen Interaktionspartner wird zu (Qualitäts-) Kontrollzwecken nicht herangezogen.

MacBeath et al. beschreiben in J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7967–7968 die Herstellung von Mikroarrays und die Detektion der Protein-Ligand Interaktion. Hierbei werden als Referenzpunkte mehrere Sensorfelder mit einem Derivat von Tetramethylrhodamin belegt und diese fluoreszenzaktive Verbindung mit Hilfe eines Fluoreszenzscanners nachgewiesen. Hierdurch kann nachgewiesen werden, daß der Immobilisierungsschritt der Liganden erfolgreich war. Es ist jedoch nicht möglich, Aussagen über den generellen Erfolg (in Form einer Qualitätskontrolle) der eigentlichen Protein-Ligand Interaktion zu treffen.

Es besteht jedoch in der Fachwelt ein Bedürfnis, Kontrollliganden auf Mikroarrays einzusetzen, die eine Kontrolle von Bindungsmessungen zwischen Liganden und deren mobilen Interaktionspartnern (auch Targets genannt) ermöglichen.

Es wurde nun gefunden, daß eine solche Kontrolle möglich ist, wenn als Kontrolliganden unspezifisch bindende Universalbinder eingesetzt werden, die mit ausreichender Reproduzierbarkeit die Bindung mit zahlreichen Targets zeigen.. Diese Eigenschaften erlauben es, solche Universalbinder für eine Vielzahl unterschiedlicher Targets einzusetzen. Damit muss nicht für jedes Target ein spezieller Kontrollligand eingesetzt werden, der spezifisch an das Target bindet. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass trotz der unspezifischen Wechselwirkung der Universalbinder Aussagen zur Qualitätskontrolle möglich sind.

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß bei Einsatz mindestens zweier entgegengesetzt geladener Kontrollliganden auf Mikroarrays die Zahl der verwendbaren Targets für die Bindungsmessung mit Liganden nochmals stark anwächst. So konnten bislang von den Erfindern keine Targets gefunden werden, bei denen solche entgegengesetzt geladenen Kontrollliganden nicht anwendbar waren.

Ebenso wurde überraschenderweise gefunden, daß es möglich ist, die Bindungsfähigkeit eines Universalbinders mit einer Vielzahl von Targets zu steigern, indem ein oder mehrere besonders geeignete Strukturmotive (zum Beispiel ladungstragende oder ladungsstabilisierende) mehrfach in einen Universalbinder eingebaut werden, der als Kontroilligand eingesetzt wird.

Die Aufgabe wird dem zufolge gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Kontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays, die Schritte umfassend

(a) Bereitstellen eines Mikroarrays für zu testende Liganden auf Sensorfeldern;
(b) Aufbringen mindestens eines Kontrollliganden auf mindestens einem Sensorfeld;
(c) Messung der Bindung zumindest zwischen Kontrollligand und einem mobilen Bindungspartner für die zu testenden Liganden,

wobei mindestens ein Kontrollligand ein unspezifischer Universalbinder ist.

Vorteilhafte Merkmale des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Unter dem Begriff "Universalbinder" ist im Rahmen der Erfindung eine chemische Verbindung zu verstehen, die aufgrund ihrer chemischen Struktur in der Lage ist, an zahlreiche Targets in messbarer Weise zu binden. Hierbei muß die Bindung reproduzierbar im Rahmen üblicher Fehlertoleranzen nachweisbar sein. Vorzugsweise bindet ein solcher Universalbinder an mindestens 10 verschiedene Targets, die sich in ihrer Größe, Hydrophobizität und isoelektrischem Punkt möglichst stark unterscheiden.

Unter dem Begriff "unspezifisch" oder "unspezifische Bindung" ist im Rahmen der vorliegender Erfindung eine nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen Ligand und Target zu verstehen. Diese sollte nicht auf den bekannten Prinzipien molekularer Erkennung beruhen, wie z.B. der Bindung des Kontrollliganden als Substrat in einer Bindungstasche eines Proteins als Target, einer Hybridisierung, etc.

Unter dem Begriff "Target" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein mobiler Bindungspartner oder ein potentieller mobiler Bindunngspartner für Liganden zu verstehen. Targets können beispielsweise RNA, DNA, und natürliche oder synthetische Proteine darstellen. Hierbei bedeutet "mobil", daß der Bindungspartner nicht in irgend einer Weise auf dem Mikroarray fixiert ist.

Der Begriff „Probe" wird in der vorliegenden Erfindung auf Moleküle angewandt, die der Fachmann aufgrund ihrer räumlichen und/oder elektronischen Struktur als potentielle Bindungspartner für ein solches Target in Betracht ziehen würde.

Der Begriff "Ligand" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Probe, die auf einem Sensorfeld beispielsweise adsorptiv, ionisch, komplexchemisch oder bevorzugt kovalent immobilisiert werden kann oder jedes Probenfragment biologischer, chemischer oder anderer Natur. Im Zusammenhang mit der molekularen Wechselwirkung von Bindungspartnern bestimmt der Begriff "Ligand" den Partner, der auf dem Array vorliegen soll. Der/die andere/n Partner wird/werden als "mobile/r Bindungspartner" bezeichnet.

Ein Mikroarray zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren trägt bevorzugt mindestens zwei unterschiedliche Typen von Liganden. Zum einen sind dies ein oder mehrere Kontrollliganden, deren Struktur im Hinblick auf eine unspezifische Bindung mit dem Liganden optimiert wurde. Zum anderen handelt es sich um zu testende Liganden, deren Fähigkeit zu einer, bevorzugt spezifischen, Wechselwirkung mit dem Target überprüft werden soll.

Soweit nicht gesondert angegeben, ist eine Bezugnahme auf mehrere oder auf unterschiedliche Kontrollliganden oder zu testende Liganden im Rahmen der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass nicht nur einzelne Liganden der jeweiligen Struktur auf dem Array aufgebracht sind, sondern dass unterschiedliche Typen von Liganden jeweils in mehrfacher Ausfertigung auf dem Array vorliegen.

Der Begriff "Mikroarray" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede gegenständliche Ausgestaltung, die mindestens eine Oberfläche aufweist, auf der Sensorfelder vorhanden sind. Es bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf die Form oder Dimensionen eines Mikroarrays oder der Form, Anzahl oder Dimensionen der Sensorfelder oder der Dichte der Sensorfelder auf einem Mikroarray. Das Suffix "Mikro" dient lediglich der Verdeutlichung, daß eine Miniaturisierung -soweit möglichbevorzugt ist.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Kontrollverfahrens können verschiedene Messungen miteinander verglichen werden. Der Vergleich des Meßwertes eines Kontrollliganden kann u.a. mit einem früheren Meßwert dieses Kontrollliganden erfolgen und/oder mit dem Meswert des Kontrollliganden an anderer Stelle des Mikroarrays und/oder mit dem Meßwert des Kontrollliganden auf einem anderen Mikroarray und/oder mit einem anderen Kontrollliganden auf demselben und/oder einem anderen Array und/oder mit Liganden auf demselben und/oder einem anderen Array.

Der Charakter des erfindungsgemäßen Verfahrens als Kontrollmessung ergibt sich daher in der Regel aus einem Vergleich der erhaltenen Bindungswerte für den Kontrollliganden mit Werten, die bei einem weiteren, d.h. früheren und/oder parallelen Einsatz des gleichen Kontrollliganden erhalten wurden. Diese Messungen können räumlich und/oder zeitlich getrennt auf einem oder mehreren Arrays erfolgen. Aufgrund der „universalbindenden" Eigenschaft des Kontrollliganden können sowohl Werte verglichen werden, die mit identischen Targets erhalten wurden (z.B. bei mehrfachem Einsatz eines Kontrollliganden in Kombination mit wechselnden zu testenden Liganden bei gleichem Target), aber auch Werte, die mit unterschiedlichen Targets erhalten wurden (z.B. bei mehrfachem Einsatz eines Kontrolliganden in Kombination mit gleichbleibenden zu testenden Liganden bei unterschiedlichen Targets). Natürlich kann der zur Kontrolle herangezogene Vergleich auch mit Angaben zur Bindungsfähigkeit erfolgen, die dem Fachmann z.B. aus Patent- und Fachliteratur für solche Liganden geläufig sind, die als Universalbinder Verwendung finden können.

Anhand dieses Vergleiches sind Aussagen in qualitativer, semi-quantitativer oder quantitativer Hinsicht z. B. zu Kalibrierungszwecken möglich. Bei einer qualitativen Aussage ergibt sich als Qualitätsnachweis eine "Ja-Nein-Aussage". Hierbei wird beispielsweise die Tatsache, daß der Kontrollligand ein Signal zeigt und somit ein Messwert ermittelt werden kann, herangezogen, um das Gelingen der Bindungsmessung als solcher festzustellen. Hier erfolgt der (qualitative) Vergleich mit früheren Meßwerten für den Kontrollliganden, die das Auftreten einer Bindung anzeigten. In einer anderen Ausführungsform ist eine qualitative Kontrollaussage beispielsweise möglich, in dem überprüft wird, ob ein bestimmter Kontrollligand auf einem Mikroarray ein Signal (und damit ein Meßwert, der nicht als Rauschen anzusehen ist) zeigt und ob dieses Signal ebenso auf einem Duplikat des Arrays nachzuweisen ist.

Es können also verschiedene Mikroarrays miteinander verglichen werden (Array zu Array Kontrolle), auf denen die gleichen Liganden vorhanden sind (Überprüfung oder Skalierung von Duplikaten). Es können auch verschiedene Mikroarrays mit jeweils unterschiedlichen Liganden miteinander verglichen werden. Generell kann das Verfahren auch zur Skalierung oder einem semi-quantitativen Vergleich von Signalen (Meßwerten} von Liganden mit Hilfe des Kontrollliganden herangezogen werden. Es können aber auch Meßgeräte zur Bindungsmessung über die Kontrollliganden miteinander verglichen werden. Bei Mehrfachbelegung eines oder mehrerer Kontrollliganden auf einem Mikroarray können Homogenitätskontrollen des Arrays (Feld zu Feld Kontrolle) durchgeführt werden.

Für den Fachmann ergeben sich offensichtlich eine Reihe weiterer Möglichkeiten, anhand deren die gewonnenen Einzeldaten (Messwerte) zu Qualitätskontrollzwecken verarbeitet werden können.

Generell kann mit Hilfe des Kontrollverfahrens der Erfolg der Bindungsmessungen) auf einem Mikroarray überprüft werden. Ursachen für ein Nichtgelingen des Versuches können beispielsweise bei der Mikroarrayproduktion, dem Verfahren zum Aufbringen der Liganden/Kontrollliganden, dem Zustand des Targets oder beim Meßgerät zu finden sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Kontrollverfahrens werden auf einem Mikroarray mindestens zwei unterschiedliche Kontrollliganden auf einem oder mehreren Sensorfeldern eingesetzt. Besonders bevorzugt handelt es sich um genau zwei Kontrollliganden. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn diese Kontrollliganden jeweils positiv und negativ geladen sind. Vorzugsweise besitzen solche Kontrollliganden jeweils zusätzlich hydrophobe Bereiche, beispielsweise Aromaten.

Unter dem Begriff "geladen" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung derjenige elektronische Zustand einer Verbindung zu verstehen, der die Ausbildung einer positiven oder negativen, lokalisierten oder delokalisierten Ladung unter den Bedingungen der Bindungsmessung erlaubt. Dies schließt beispielsweise auch Verbindungen ein, die nicht über den gesamten pH-Bereich in geladenem Zustand vorliegen, sondern die durch Aufnahme oder Abgabe von Protonen eine Ladung annehmen.

Es hat sich nämlich gezeigt, daß trotz unspezifischer Wechselwirkung mit zahlreichen Targets die Bindung gleichgesinnt geladener Kontrollliganden und Target zu einem vergleichsweise geringeren Signal führen kann. Die Kombination komplementär geladener Kontrollliganden führt daher dazu, daß nahezu alle Targets mit Hilfe dieser Kontrollligandkombination adressiert werden können.

Aufgrund des Einflusses der Ladung auf die Eigenschaft der Kontrollliganden als unspezifische Universalbinder eignen sich Farbstoffe oder deren Derivate besonders als Kontrollliganden, da diese häufig zur Ladungsausbildung fähig sind Unter "Derivate" sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verbindungen zu verstehen, die durch formale Substitution, Addition oder Eliminierung aus der ursprünglichen Verbindung hervorgehen.

Besonders bevorzugt als Kontrollligand ist Eosin und seine Derivate. Die Anbindung an das Sensorfeld des Mikroarrays kann beispielsweise über die Carboxylfunktion erfolgen. Die unspezifische Bindung des Eosins an Proteine ist bekannt und wird ausgenutzt, um Proteinkonzentrationen photometrisch zu bestimmen (A. Waheed et al., Anal. Biochem. 287, 2000, 73–79).

Bevorzugte Eosinderivate sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

wobei A¹ bis A⁴ jeweils unabhängig voneinander H oder Halogen, vorzugsweise Br oder I, und Ar eine durch eine Carboxylgruppe substituierte Phenylgruppe, die gegebenenfalls durch 1 bis 4 Halogenatome substituiert sein kann, ist.

In diesem Zusammenhang als besonders geeignete Kontrollliganden sind zu nennen Erythrosin, Rose bengale, Phloxin, Cyanosin, Daphinin, Eosin B, Eosin Y, Eosin G oder Acid Red 51.

Als weitere geeignete Kontrollliganden wären zum Beispiel Naphtol Blau, Schwarz und Coomassie zu nennen, die bekanntermaßen zur Färbung von Proteingelen eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von – Eosin oder Eosinderivaten als Kontrollliganden zur Kontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stellt der Kontrollligand eine Verbindung dar, die mehrere d.h. mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, stärker bevorzugt mindestens vier Strukturmotive, enthält, die für die unspezifische Bindung an zahlreiche Targets verantwortlich ist. Bevorzugt handelt es sich dabei um Strukturmotive, die die Ausbildung einer positiven oder negativen, lokalisierten oder delokalisierten Ladung am Liganden erlauben. Dadurch ist es möglich, die Stärke der unspezifischen Bindung zu steigern und somit den Kontrollliganden universeller einzusetzen. Dies ist insofern überraschend, als man annehmen mußte, daß aufgrund der räumlichen Nähe der Strukturmotive diese sich gegenseitig bei der Ausbildung von Bindungen zum Liganden behindern und der Effekt der Signalverstärkung somit ausbleibt. Innerhalb eines Liganden können diese Strukturmotive gleich oder unterschiedlich sein. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, ein einziges Strukturmotiv mindestens zweifach, bevorzugt mindestens dreifach, stärker bevorzugt mindestens vierfach in den Kontrolliganden einzubauen.

Ein bevorzugtes Strukturmotiv ist in diesem Zusammenhang die Guanidiniumgruppe. Um ihre Fähigkeit zur Ausbildung einer unspezifschen Bindung weiter zu steigern, wird sie bevorzugt kovalent mit einer hydrophoben Gruppierung, z.B. einen Arylenrest, insbesondere einem Phenylenrest, verbunden. Bevorzugt kommt hier Guanidiniumphenylalanin (GuaPhe) bzw. ein Guanidiniumphenylalaninrest zum Einsatz, besonders bevorzugt sollte die Guanidino-Gruppe in para Stellung stehen. Der Guanidiniumphenylalaninrest kann über die Carboxylfunktion des Phenylalanins mit einer Gerüststruktur gekoppelt sein. Dieses Gerüst trägt die weiteren Strukturmotive, und bildet gemeinsam mit ihnen den Kontrollliganden. Weitere Strukturmotive, die erfahrungsgemäß zur unspezifischen Bindung von Proteinen neigen, sind Derivate des 2,6-Diiodophenols und 2,6-Dibromophenols.

Vorzugsweise sind solche Strukturmotive durch ein Gerüst, beispielsweise eine natürliche Aminosäure, wie Lysin oder ein Peptid, bestehend aus natürlichen Aminosäuren wie Lysin, verknüpft. So ist es beispielsweise möglich, eine oder beide Aminofunktionen des Lysins jeweils mit einem GuaPhe-Rest mit Hilfe einer Peptidbindung zu verknüpfen. Daneben können zwei, drei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäureeinheiten -verwendet werden. Im Falle des Lysins können die zur Carbonsäuregruppe alpha- und/oder omegaständigen Aminoreste zur Anknüpfung des GuaPhe verwendet werden. Drei Lysineinheiten, die untereinander jeweils über Amidbindungen verknüpft sind, können somit mit einem, zwei, drei oder vier Strukturmotiven verknüpft werden. Als weitere Beispiele für geeignete Gerüststrukturen sind allgemein Verbindungen mit drei oder mehr funktionellen Gruppen zu nennen, wie Diaminocarbonsäuren, Dicarboxyamine oder Glycole.

Insbesondere bevorzugt kommen als Kontrollliganden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verbindungen der folgenden Struktur zum Einsatz

wobei X = -OH, -NH₂, -NHA, wobei A Alkyl oder Acyl ist, oder eine Bindung zur direkten oder indirekten Anbindung an eine feste Phase ist, sowie deren Tautomere, Isomere, Enatiomere, Gemische oder Salze.

Der Term „Alkyl" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein lineares oder verzweigtes Alkylketten-Radikal der jeweils angegebenen Länge, das gesättigt oder ungesättigt sein kann und worin bis zu fünf CH₂-Gruppen durch Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome ersetzt sein können. Dabei sind die Heteroatome mindestens durch zwei Kohlenstoffatome voneinander getrennt. So bedeutet C_1-4-Alkyl z. B. Methyl, Hydoxymethyl, Ethyl, Hydroxyethyl, Vinyl, 1-Propyl, 2-Propyl, Allyl, 2-Methyl-2-propyl, 2-Methyl-l-propyl, 1-Butyl, l-But-2-enyl, 2-Butyl, C_1-6-Alkyl z. B. C_1-4-Alkyl, Pentyl, 1-Pentyl, 2-Pentyl, 3-Pentyl, 1-Hexyl, 2-Hexyl, 3-Hexyl, 4-Methyl-1-pentyl oder 3,3-Dimethyl-butyl. C_1-8-Alkyl bedeutet zusätzlich zu den für C_1-4-Alkyl angegebenen Resten z. B. C_1-6-Alkyl, Heptyl, 2-(2-Methoxyethoxy)-ethyl oder Octyl.

Der Term "Acyl" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Verbindung ein Radikal -C(O)-Alkyl.

Sensorfelder und Mikroarrays können verschiedenartig erzeugt werden. So kann der Mikroarray ein- oder mehrstückig sein und beispielsweise mehrere Schichten umfassen. Dabei können sich eine Vielzahl von Sensorfeldern auf einer Oberfläche des Mikroarrays befinden. Die Sensorfelder können voneinander durch Sensorfeldzwischenbereiche getrennt sein, die sich chemisch, physikalisch oder andersartig von den Sensorfeldern unterscheiden.

Die Fixierung, Anbindung oder Immobilisierung der Liganden bzw. Kontrollliganden kann auf vielfältige Weise direkt oder indirekt auf dem Sensorfeld erreicht werden. (Kontroll-) Liganden können direkt adsorptiv, ionisch, komplexchemisch, kovalent oder andersartig mit der Oberfläche des Sensorfeldes angebracht werden. Bei der indirekten Anbindung kann eine Bindematrix meist organischer Natur eingesetzt werden. Dabei kann jedes Sensorfeld eine organische Schicht als Bindematrix enthalten. Die Bindematrix dient zur adsorptiven, ionischen, komplexchemischen, kovalenten oder andersartigen Anbindung des Liganden bzw. des Kontrollliganden an das Sensorfeld.

Die Materialien, die ein Mikroarray beinhaltet, können vielfältiger Natur sein und hängen u.a. von der Natur der Liganden und der für das erfindungsgemäße Verfahren notwendige Messmethode ab. Geeignete Materialien z.B. sind permeable Stoffe, wie Cellulose oder undurchlässige Stoffe, wie Kunststoffe, Gläser, Metalle, Metalloxide oder Legierungen.

Der Mikroarray kann auf der sensorfeldseitigen Oberfläche strukturiert oder unstrukturiert sein Beispielsweise kann ein Träger als Teil des Mikroarrays eine planare Oberfläche besitzen, auf der sich eine einheitliche Bindematrix beispielsweise zur kovalenten Anknüpfung des Liganden befindet. Die Sensorfelder entstehen dann erst beim Aufbringen der Liganden, beispielsweise durch Spotting. Die Position sowie die Form der Sensorfelder werden dann durch die Spotting-Vorrichtung bestimmt. Für die Messfelderkennung existieren im Stand der Technik zahlreiche, meist soffwarebasierte Methoden, die dem betreffenden Fachmann geläufig sind. Die Sensorteldzwischenbereiche unterscheiden sich in diesem Fall chemisch von den Sensorfeldern durch das Fehlen von Liganden. Diese Bereiche weisen jedoch ebenfalls eine Bindematrix auf.

Bevorzugt sind jedoch strukturierte Mikroarrays. Die Strukturierung kann beispielsweise chemisch durch photostrukturierende Behandlung einer auf einem Planaren Träger aufgebrachten Bindematrix erfolgen. Die Sensorfelder werden somit durch die Beschaffenheit bzw. die Modifizierung der Bindematrix definiert. Hierbei unterscheiden sich, wie im Fall eines unstrukturierten Mikroarrays, die Sensorfelder von den Sensorfeldzwischenbereichen nur chemisch. Jedoch ist diese Unterscheidung bereits vor Immobilisierung der Liganden erkennbar und die Sensorfeldposition somit vor deren Aufbringen festgelegt. Ein Beispiel eines solchen Arrays ist in WO 00/67028 A1 gegeben.

Weiterhin kann die Strukturierung durch Erhebungen oder Vertiefungen erzielt werden. Als Beispiel eines einstückigen Mikroarrays kann eine Mikrotiterplatte dienen. Hierbei können die Kavitätenböden (Vertiefungen) und -wandungen die Sensorfelder darstellen und der Plattenkörper die Sensorteldzwischenbereiche. In einem solchen Fall kann eine Bindematrix sich nur über die Sensorfelder oder über die gesamte Oberfläche erstrecken. Die US-A-6,063,338 offenbart beispielsweise eine Mikrotiterplatte, die ein Cycloolefin für spektroskopische Zwecke enthält und für die Festphasensynthese geeignet sein soll. Hierbei wird unter anderem vorgeschlagen, daß die Kavitäteninnenwände und -böden funktionalisiert werden, um Komponenten für die Festphasensynthese zu immobilisieren.

Ebenso kann ein Mikroarray aus mehreren Schichten aufgebaut sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, daß der Mikroarray auf seiner den Sensorflächen zugewandten Oberfläche eine strukturierende Schicht auf einem Planaren Träger umfaßt. Die strukturierende Schicht kann beispielsweise mit Hilfe einer Maske auf den Träger aufgebracht werden. Die Stellen, an denen keine Schicht aufgebracht wurde, stellen dann die Sensorfelder dar. Ebenso kann der Träger oder eine weitere Zwischenschicht zusätzlich Vertiefungen an diesen Stellen aufweisen, wodurch die gebildeten Kavitäten tiefer ausgestaltet sind. Weiterhin bevorzugt kann der Mikroarray eine Metallschicht, insbesondere eine Goldschicht, auf der strukturierenden Schicht und/oder auf dem Träger enthalten. Vorteilhaft wäre die Goldschicht sowohl auf den Sensorfeldern, die durch die freigelassene Trägeroberfläche gebildet werden, als auch der strukturierenden Schicht, die den Träger bedeckt. Dabei kann sich die Bindematrix ebenfalls nur im Bereich der Sensorfelder oder über den gesamten Array auf der Metallschicht nach außen hin befinden. Solche mehrschichtigen Mikroarrays sind in WO 01192883 A2 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt diesbezüglich vollständig Bezug genommen wird.

Besonders bevorzugt besteht der Träger eines solchen mehrschichtigen Mikroarrays aus einem lichtdurchlässigen Material (wie z.B. Glas) und die strukturierende Schicht besitzt zusätzlich geeignete optische Eigenschaften, die einen Mikroarray als Oberflächen Plasmonenresonanz (SPR) Sensor bilden, wie er in der WO 01/92883 A1 beschrieben ist. Auf den diesbezüglichen Offenbarungsgehalt der WO 01/92883 A1 wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.

Für die Abmessungen des Mikroarrays bestehen keine Beschränkungen. Ein häufig verwendetes Maß entspricht dem eines handelsüblichen – Objektträgers für die Mikroskopie mit den Maßen 76 × 26 mm. Aber auch andere Abmessungen, wie 125 × 83 mm sind denkbar. Die Sensorfelddichte beträgt vorteilhafterweise mehr als 50, bevorzugt mehr als 100 Sensorfelder pro cm². Bevorzugt enthält der Mikroarray mindestens 96, stärker bevorzugt mindestens 4608 und am meisten bevorzugt mindestens 9216 Sensorfelder. Die Sensorfelder liegen hierbei bevorzugt in einer an handelsübliche Mikrotiterplattenformate angepaßten Anzahl (gleiche Anzahl oder ein ganzzahliges Vielfaches davon) vor. Die Sensorfelder können rund, elliptisch, rechteckig oder quadratisch sein oder eine andere Form besitzen. Bevorzugte Sensorfelder sind rund und haben einen Durchmesser von höchstens 700 um, bevorzugt 400μm.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Kontrolle von Bindungsmessungen verwendeten Sensorfelder beinhalten bevorzugt eine Bindematrix. Diese Bindematrix dient dazu, einen Liganden vorzugsweise (chemisch) kovalent zu binden. Die Bindematrix kann beispielsweise als Ergebnis der Modifizierung vorhandener Teile des Mikroarrays oder durch Hinzufügen zusätzlicher Teile entstehen. So kann ein fester Träger auf einer seiner Oberflächen Chemikalien ausgesetzt werden, die reaktive chemische Gruppen freisetzen, die dann die Anbindung des Liganden ermöglichen. Beispielsweise setzt die alkalische Behandlung von Giasoberflächen Si-OH Gruppen frei, die eine kovalente Bindung ermöglichen können. Die so behandelte Oberfläche wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bindematrix verstanden.

Bevorzugt wird jedoch der Ligand/Kontrollligand nicht direkt an einen festen Träger immobilisiert, sondern es wird eine zusätzliche organische Schicht aufgebracht, die beispielsweise über die oben genannte chemische Modifikation an den Träger gebunden wird. Die als Bindematrix fungierende organische Schicht muß jedoch nicht kovalent an einen festen Träger gebunden sein. Vielmehr ist auch eine ionische, adsorptive, oder komplexchemische oder andersartige Anbindung möglich. Auch bioorganische Systeme, die hydrophobe Wechselwirkungen mit Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen kombinieren, können die Anbindung des Liganden gewährleisten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Bindematrix eine selbstassemblierende Monolage (SAM) als organische Schicht. Die Selbstorganisation eines SAM zu einem dichten Film erfolgt normalerweise durch hydrophobe Wechselwirkung langkettiger Kohlenwasserstoffe an deren einem Ende eine funktionelle Gruppe vorhanden ist, die die Anbindung an den Träger ermöglicht und an deren anderen Ende eine funktionelle Gruppe die Immobilisierung des Liganden ermöglicht. Verbindungen, die diese funktionellen Bausteine umfassen (Kopf-, Fußgruppe, hydrophober Teil), werden auch Anker oder Ankermoleküle genannt. Weiterhin kann der Anker einen Spaceranteil besitzen, der bevorzugt Ethylenglykoleinheiten enthält.

Vorteihafterweise werden zusammen mit den erwähnten Ankermolekülen sogenannte Verdünnermoleküle auf die Trägeroberfläche aufgebracht, um die selbstassemblierende Monolage geeignet zu strukturieren und die Konzentration der Bindungsstellen auf der Oberfläche zu steuern. Eine zu dichte Oberflächenkonzentration kann durch sterische Hinderung nachteilig sein. Verdünnermoleküle sind strukturell den Ankermolekülen angepaßt, jedoch besitzen Sie keine Kopfgruppe für die Anbindung des Liganden. Ebenso muß gewährleistet werden, daß der Kontrolligand nicht an die Verdünnermoleküle bindet.

Beispielsweise können SAMs durch Chemisorption van Alkylthiolen auf einer Metalloberfläche (z.B. Gold) erzeugt werden. Die langkettigen Moleküle packen sich als SAM auf die Festphase, wobei die Goldatome von den Schwefelfunktionen komplexiert werden. Ein weiteres Beispiel ist die Silanisierung von Glas oder Silizium mit reaktiven Epoxid- oder Aminogruppen-haltigen Silanen und die anschließende Acylierung der Aminogruppen, beispielsweise mit Nukleosidderivaten (Maskos und Southern, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1679–84).

Zur Synthese und zu bevorzugten chemischen Strukturen von Anker und Verdünnermolekülen sei auf WO 00/73796 A2 und WO 01/92883 A2 verwiesen, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Bevorzugt ist ein Ankermolekül der allgemeinen Formel Z-R-Y.

Dabei ist Z ein Atom oder eine Atomgruppierung, die die Anbindung an einen festen Träger gewährleistet. Die Wahl der Gruppe Z hängt von der chemischen Natur des festen Trägers ab. Geeignete funktionelle Gruppen oder reaktive Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und können leicht bei Kenntnis des Trägers ermittelt werden. Besonders bevorzugt ist Z ein Element der V. oder VI. Hauptgruppe, wobei auch Kombinationen von identischen oder verschiedenen Elementen verwendet werden können. Vorteilhaft sind hier Kombinationen wie -S-Se- oder -Se-Se-. Ebenfalls vorteilhaft ist, je nach Oberflächenbeschaffenheit die Verwendung von bei neutralem pH ionisiert vorliegenden Gruppen, wie z.B. Sulfonat. Bevorzugt eingesetzt wird als Z Schwefel, z.B. in Form der Disulfidfunktion (-S-S-), der Thiolfunktion (-SH) oder der Sulfidfunktion (-S-). Die verwendeten Elemente zeichnen sich dadurch aus, daß sie entweder eine hohe Affinität zu Metallen, insbesondere Edelmetallen (Gold, Silber etc.), aufweisen und somit eine Immobilisierung der Ankermoleküle z.B. auf einer Gold, Silber oder Platinoberfläche ermöglichen, oder aber, wenn es sich um eine ionische Gruppe handelt, an eine Metalloxidoberfläche wie z.B. Al₂O₃ binden können. Weist Z zwei freie Valenzen auf, so können beide mit gleichen oder unterschiedlichen Resten – R-Y verbunden sein.

Der Rest R stellt eine verzweigte oder unverzweigte, gegebenenfalls durch Heteroatome wie beispielsweise S, N oder O, Amid- oder Esterbindungen unterbrochene Kohlenwasserstoffkette von mehr als 10 Atomen Länge dar.

Y ermöglicht die kovalente Anbindung der Liganden direkt oder indirekt mit oder ohne vorheriger Modifizierung der Liganden. Geeignete funktionelle Gruppen oder reaktive Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und können leicht bei Kenntnis der Liganden ermittelt werden. Besonders bevorzugt für Y sind Acetate, Ketale, Acylale, Acylhalogenide, Alkohole, Aldehyde, Alkene, Halogenide, Alkine, Allene, Amide, Amidine, Aminale, Amine, Anhydride, Azide, Azine, Aziridine, Azoverbindungen, Borane, Carbamate, Carbodiimide, Carbonsäuren, Carbonsäureester, Cyanamide, Cyanate, Diazoverbindungen, Diazoniumsalze, Epoxide, Ether, Hydrazide, Hydrazine, Hydrazone, Hydroxamsäuren, Hydroxamsäureester, Hydroxylamine, Imide, Imine, Anorganische Ester, Isocyanate, Isocyanide, Isothiocyanate, Ketene, Ketone, Nitrile, Nitroverbindungen, Nitrosoverbindungen, Oxime, Phenole, Phosphine, Phosphonate, Ammoniumsalze, Phosphoniumsalze, Sulfonamide, Sulfone, Sulfonsäuren, Sulfonester, Sulfoniumsalze, Sulfonylazide, Sulfonyihalogenide, Sulfoxide, Thioamide, Thiocarbamate, Thiocyanate, Triazene, Harnstoffe oder Isoharnstoffe.

Am meisten bevorzugt sind reaktive Kopfgruppen, die prinzipiell eine nahezu quantitative (> 99%) Umsetzung der Gruppe Y mit dem Liganden ermöglicht. Als Beispiel sei die Addition von Thiolen an eine Maleimidylgruppe genannt. Weitere Beispiele sind in WO 01/92883 A2 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Weiterhin kann die organische Schicht polymere Moleküle wie Biomoleküle oder synthetische Makromoleküle umfassen. Beispielhaft seien Hydrogele, wie sie in WO 90/5303 A1 offenbart sind, genannt. Diese bilden ein dreidimensionales Gerüst, das eine Immobilisierung der Liganden gegebenenfalls auch in drei Dimensionen erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Qualitätskontrolle ist auch für Arrays mit derartig modifizierten Oberflächen einsetzbar.

Die Verwendung der Begriffe Schicht, Oberfläche oder Oberflächenkonzentration u.a. sind nicht dahin gehend einschränkend zu interpretieren, daß eine Zweidimensionalität der Präsentation der zur Anbindung der Liganden bzw. Kontrollliganden vorhandenen Stellen eines Mikroarrays Voraussetzung wären.

In einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die Bindematrix über die gesamte sensorfeldseitige Mikroarrayoberfläche.

Bevorzugt können als Liganden Proteine, Peptide, Oligonucleotide, Kohlenhydrate (Glycoside), Isoprenoide, Enzyme, Lipidstrukturen und organische Moleküle (Chemische Mikroarrays) eingesetzt werden.

Bevorzugt können als Kontrollliganden organische Moleküle eingesetzt werden.

Insbesondere sind kleine organische Moleküle (small molecules oder small molecular weight molecules oder small organic molecule) für die Liganden und die Kontrollliganden oder deren Strukturmotive, die einfach oder mehrfach in Kontrollliganden vorkommen, bevorzugt In der Literatur stellt zumeist das Molekulargewicht die Definitionsgrundlage für solche kleinen Moleküle dar. In WO 89/03041 und WO 89/03042 werden Moleküle mit Molekülmassen von bis 7000 g/mol als kleine Moleküle beschrieben. Üblicherweise werden jedoch Molekülmassen zwischen 50 und 3000 g/mol, häufiger aber zwischen 75 und 2000 g/mol und meistens im Bereich zwischen 100–1000 g/mol angegeben. Als Beispiele sei auf die Schriften WO 86/02736, WO 97/31269, US-A-5928868 , US-A-5242902 , US-A-5468651 , US-A-5547853 , US-A-5616562 , US-A-5641690 , US-A-4956303 und US-A-5928643 verwiesen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelten organische Moleküle mit einem Molekulargewicht unter 3000, bevorzugt unter 1000 am meisten bevorzugt unter 750 g/mol als kleine organische Moleküle.

Falls eine Bindematrix eingesetzt wird, können zur Immobilisierung der Liganden und Kontrollliganden an die Bindematrix vorhandene chemische funktionelle Gruppen im Liganden eingesetzt werden (z.B. N-terminale Aminogruppen von Peptiden). Es können auch vorhandene funktionelle Gruppen chemisch modifiziert werden (z.B. Spaltung von Disulfidbrücken zu Thiolen in Proteinen). Bevorzugt ist bei der Herstellung chemischer Mikroarrays die Verwendung von zusätzlichen Linkermolekülen (Zusatzmoleküle oder „Tag"), die zum einen die Anbindung an den Liganden/Kontrollliganden und zum anderen die Immobilisierung an die Bindematrix ermöglichen und dabei eine zusätzliche Spacerfunktion erfüllen. Bevorzugt wird für alle Liganden und Kontrollliganden das gleiche Linkermolekül verwendet, wodurch die Liganden chemisch "ähnlicher werden". Einsetzbare Linkermoleküle ("Ligand Tag") sind in PCT/EP 02/01184 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich bezug genommen wird.

Bevorzugt erfolgt das in Kontakt bringen des Kontrollliganden mit der Bindematrix -falls vorhanden- unter Bedingungen, unter denen eine bevorzugt kovalente Anbindung des Kontrolliganden an die Bindematrix möglich ist. Im allgemeinen, also auch wenn keine Bindematrix vorhanden ist, wird eine Flüssigkeit, die den Kontrollliganden enthält, auf die Bindematrix oder das Sensorfeld direkt aufgebracht.

Der Kontrollligand kann als solcher oder in Flüssigkeit durch Tüpfeln oder durch Inkubation der gesamten sensorfeldseitigen Mikroarrayfläche oder durch Inkubation des gesamten Mikroarrays auf die Sensorfelder gebracht werden.

Bevorzugt wird der mobile Interaktionspartner ganzflächig auf die sensorfeldseitigen Fläche des Mikroarrays in geeigneter Lösung (z.B. Pufferlösung) aufgebracht. Die Konzentration des mobilen Bindungspartners sollte so gewählt werden, daß eine ausreichende Interaktion zumindest mit dem Kontrollliganden möglich ist.

Die Bindungsmessung kann sequentiell von Sensorfeld zu Sensorfeld bzw. Sensorfeldreihe zu Sensorfeldreihe erfolgen oder aber bevorzugt parallel, indem alle Felder gleichzeitig gemessen werden. Vorteilhaft beruht das Meßverfahren auf einem radioaktiven, optischen oder elektrischen Verfahren. So sind beispielsweise radioaktivfluoreszenz- oder lumineszenzbasierte Detektion (z.B. RIA, ELISA, etc.) möglich. Bevorzugt erfolgt die Messung jedoch markierungsfrei, da hierdurch die Durchführung erleichtert wird. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines reflexionsoptischen Verfahrens, wie der SPR-Spektroskopie.

Erfindungsgemäß ist weiterhin ein Mikroarray für Bindungsmessungen von Liganden auf Sensorfeldern mit mindestens einem Kontrollligand auf mindestens einem Sensorfeld, wobei der Kontrollligand eine Verbindung darstellt, die mehrfach ein Strukturmotiv enthält. Hinsichtlich des Kontrolliganden gelten die gleichen Ausführungen wie für das erfindungsgemäße Kontrollverfahren.

Erfindungsgemäß ist weiterhin ein Mikroarray für Bindungsmessungen von Liganden auf Sensorfeldern mit mindestens einem positiv geladenen und mindestens einem negativ geladenen Kontrollligand auf jeweils mindestens einem Sensorfeld. Vorzugsweise besitzen solche Kontrollliganden jeweils zusätzlich hydrophobe Bereiche, beispielsweise Aromaten.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Auffinden von Kontrollliganden als unspezifische Unversalbinder, die Schritte umfassend

(a) Bereitstellen von potenziellen Kontrollliganden auf Sensorfeldern;
(b) Messung der Bindung zwischen den potenziellen Kontrollliganden und mehreren mobilen Bindungspartnern;
(c) Auswahl von Kontrollliganden anhand ihrer Bindungswerte (Meßwerte).

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Auffinden von Kontrollliganden einen weiteren Schritt (d) die chemische Verknüpfung mehrerer Kontrollliganden zu einem Kontrollliganden mit mehreren Strukturmotiven umfassen.

Vorzugsweise werden hierfür mindestens 10 Targets (mobile Interaktionspartner) getestet. Die Targets sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA und natürliche oder synthetische Proteine, die sich möglichst in ihrer Größe sowie ihren Ladungs- und Hydrophobizitätseigenschaften unterscheiden.

I Herstellung eines chemischen Mikroarrays
Beispiel 1 Synthese eines Verdünners ("Verdünnermolekül")
a) Immobilisierung von N-(N⁵-Fmoc-5-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid an Chlortrityl-Harz
600 mg (1,15 mmol) N-(N⁵-Fmoc-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid, erhältlich aus S-geschütztem 11-Mercaptoundecanamid und Fmoc-1,5-diaminopentanhydrochlorid, wurden in 15 ml DMF gelöst und mit 2 g Methoxytritylchlorid-Harz (1,6 mmol) (Novabiochem) versetzt. Die Suspension wurde 1 h vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurden 500 μl Pyridin zugegeben und die Suspension weitere 3 h geschüttelt. Das Harz wurde anschließend 1 × mal mit N,N-Dimethylformamid (DMF), 1 × mit 5% Wasser in DMF, 4 × mit DMF, 3 × mit Dichlormethan und 2 × mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Beladung des Harzes mit N-(N⁵-Fmoc-5-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid wurde über Fmoc-Analytik (G.B. Fields, R.L. Noble, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 35, 161–214) zu 0,35 mmol/g bestimmt (Ausbeute 60 % d.Th.). b) Allgemeine Vorschrift für die Kupplung von Fmoc-8-Amino-3,6-dioxa-octansäure (Fmoc-Ado)
Für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde 1 g des beladenen Harzes (0,35 mmol) 20 min in 15 ml 1/3 (v/v) Piperidin/DMF vorsichtig gerührt und anschließend 6 mal mit DMF gewaschen. Die Kupplung von Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure erfolgte durch 4 h Inkubation des Harzes mit einer Lösung von 270 mg (0,70 mmol) Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure, 270 mg (0,71 mmol) O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU) und 250 μl (1,44 mmol) Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in 7 ml DMF. Anschließend wurde das Harz 5 mal mit DMF, 3 mal mit Dichlormethan und 2 mal mit Hexan gewaschen und getrocknet.
c) Weitere Kupplung von Fmoc-Ado und Acetylierung
An 500 mg Harz aus b) (0,175 mmol) wurde wie unter b) beschrieben Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure nochmals gekuppelt und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe wie unter b) beschrieben abgespalten. Anschließend wurden die freien Aminogruppen durch 30 min Inkubation des Harzes mit 10 ml 1/1/2 (v/v/v) Essigsäureanhydrid/Pyridin/DMF acetyliert. Dann wurde das Harz 5 mal mit DMF und 3 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgte mit 2/18/1 (v/v/v) Trifluoressigsäure/Dichlormethan/Triethylsilan. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert. LC-MS (ber.): [M+H]⁺ 635,5 (635,4), [M+Na]⁺ 657,5 (657,4) Beispiel 2 Synthese eines Ankers ("Ankermolekül")
An 100 mg Harz des in Beispiel 1 b) dargestellten Harzes wurde wie unter 1 b) beschrieben zweimal Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure gekuppelt und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten. Anschließend wurde 3-Maleinimidopropansäure durch 1 h Inkubation des Harzes mit 4 eq. 3-Maleinimidopropansäure und 4 eq. Diisopropylcarbodiimid in DMF (c = 0,15 M) gekuppelt.
Dann wurde das Harz 5 mal mit DMF und 3 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgte mit 2/18/1 (v/v/v) Trifluoressigsäure / Dichlormethan/Triethyisilan. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert. LC-MS (ber.): [M+H]⁺ 889,2 (889,5) [M+Na]⁺ 911,1 (911,5)
Beispiel 3 Herstellung eines Mikroarrays (Goldchip) mit Bindematrix
a) Mikroarray
Als Mikroarray diente eine Sensorplatte (40 nm Gold, 2 nm Titan als Haftvermittlung, 50 um strukturierende Schicht auf einer planaren Glasplatte mit den Außenmaßen im Mikrotiterformat (ca.12,5 × 8,3 cm) wie sie als Teil einer SPR Sensoranordnung in WO 01/63256 A1 beschrieben ist. Die Strukturierung der Sensorplatte wurde mit Ormocer^® durchgeführt, dem Graphit beigemischt wurde, so daß sich 4608 annähernd kreisrunde Sensorfelder mit einem Sensorfelddurchmesser von ca. 700 um ergaben.
b) Beschichtung mit der Bindematrix Die Bindematrix setzt sich aus dem Anker aus Beispiel 2 und dem Verdünnen aus Beispiel 1 zusammen.
Zunächst werden Stammlösungen der Einzelkomponenten durch Auflösen der Feststoffe in Ethylenglycol/1 % TFA mit der gewünschten Molarität hergestellt, die im Ellman-Test (G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959), 70–77) oder über den Extinktionskoeffizienten bei 295 nm überprüft wird. Anschließend werden die Stammlösungen von Anker und Verdünner im gewünschten Verhältnis (z.B. 1/24, v/v) gemischt und die Goldoberfläche ganzflächig mit dieser 100μM bis 1 mM Lösung 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit Methanol/0,1 % TFA sowie mehrfach mit Wasser/Essigsäure (2ppm) gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
II Synthese und immobilisierung von Kontrollliganden Als Kontrollliganden dienen Eosin und Verbindung 1 ("GuaPhe-4", siehe unten), die eine Carboxylgruppe besitzen. Vor der Immobilisierung werden die Kontrollliganden mit einem "Tag" umgesetzt, um eine Thiolgruppe einzuführen, die dann in einer Additionsreaktion mit der Maleimideinheit der Kopfgruppe des Ankers abreagieren kann. Die Anbindung des Tags an die Carboxylfunktion des Liganden erfolgt über eine Amidbindung. Das daraus resultierende Kontrollligand-Tag-Konjugat besitzt die Formel HS-(CH₂)₂-NH-C(O)-CH₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-NH-CO-Kontrollligand (zur Synthese vergleiche WO-A-02/063299).
Beispiel 4 Synthese des Eosin-Tag-Konjugates 20mg (8.6 μmol) Tentagel-Trityl-immobilisierter "Tag" werden mit einer Lösung von 16.7 mg (25.8 μmol) Eosin, 3.5 mg (25.8 μmol) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 4 μl (51.6 μmol) Diisopropylcarbodiimid (DIC) in 100 μl DMF für 2h geschüttelt und anschliessend 6x mit DMF gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt mit 48/48/4 (v/v/v) Trifluoressigsäure/Dichlormethan/Triethyisilan, welches im Anschluß durch RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert wird. LC-MS (ber.): [M+H]⁺ 996 (998)
Beispiel 5 Synthese des Konjugates aus Tag und Verbindung 1
20mg (8.6 μmol) Tentagel-Trityl-immobilisierter "Tag" werden mit einer Lösung von 15.2 mg (25.8 μmol) Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH, 9.8 mg (25.8 umol) O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphat (HATU) und 9 μl (51.6 μmol) Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in 100 μl DMF für 2h geschüttelt und anschliessend 6x mit DMF gewaschen. Für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wird der Harz 10 min in 1ml 1/3 (v/v) Piperidin/DMF vorsichtig gerührt und anschliessend 6 mal mit DMF gewaschen.
Das Produkt wird mit 20.3 mg (34.4 μmol) Fmoc-Lys(Fmoc), 13 mg (34.4 μmol) O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphat (HATU) und 12 μl (68.8 μmol) Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in 100 μl DMF für 2h geschüttelt und anschliessend 6 mal mit DMF gewaschen. Für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wird der Harz 10 min in 1 ml 1/3 (v/v) Piperidin/DMF vorsichtig gerührt und anschliessend 6 mal mit DMF gewaschen. Im Anschluss erfolgt die Kupplung von 33.3 mg (51.6 μmol) Fmoc-L-Phenylalanin(4-Guanidino-Boc₂)-OH, 19.6 mg (51.6 μmol) O(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphat (HATU) ) und 18 μl (103.2 μmol) Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in 200 μl DMF für 2h. Für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wird der Harz 10 min in 1ml 1/3 (v/v) Piperidin/DMF vorsichtig gerührt und anschliessend 6 mal mit DMF gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt mit 48/48/4 (v/v/v) Trifluoressigsäure/Dichlormethan/Triethylsilan, welches im Anschluß durch RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert wird. LC-MS (ber:): [M+3H]³⁺ 1570 (1572)
Beispiel 6 Belegung der Sensorfelder mit dem Kontrollligand-Tag-Konjugat
Zur Belegung der Sensorfelder des Mikroarrays mit dem Kontrollligand-Tag-Konjugat wird dieses in einem Gemisch aus Ethylenglycol/Wasser/Acetonitril in gewünschter Konzentration gelöst und mittels Phosphatpuffer auf pH 7 eingestellt. Aus dieser Lösung werden Flüssigkeitstropfen mit Hilfe eines Tüpfelroboters unter Verwendung von Stahlpins auf die Sensorfelder transferiert. Anschließend wird der gesamte Array mit Methanol gewaschen und getrocknet.
III Bindungsmessungen
Beispiel 7 Allgemeine Bindungsmessung
Die Bindung zwischen Kontrollligand und mobilem Bindungspartner wurde mit Hilfe einer SPR Sensoranordnung, wie sie in WO 01/63256 A1 beschrieben ist (vgl. Beispiel 3a), durchgeführt. Durch Imaging des Mikroarrays können die Intensitäten aller Sensorfelder gleichzeitig erfaßt und ausgewertet werden. Die dabei ermittelten SPR-Verschiebungen (SPR shift) ergeben sich durch Subtraktion der ermittelten Minima aus den wellenlängenabhängigen Intensitätskurven vor und nach Inkontaktbringen der mit den Kontroilliganden belegten Sensorfelder mit dem entsprechenden Target.
Beispiel 8 Überprüfung von Eosin und GuaPhe-4 als Universalbinder Die Kontrollliganden wurden mit einer Auswahl an Proteinen untersucht weiche durch unterschiedliche Eigenschaften hinsichtlich Grösse (Molekulargewicht, MW), Ladung (isoelektrischer Punkt, pl) und Hydrophobizität (GRAVY, Kyte, J.; J. Mol. Biol. 157, 1982, 105–132) charakterisiert sind.
1 zeigt die erhaltenen SPR-Verschiebungen.
Die SPR-Ergebnisse zeigen, dass die untersuchten Kontrollliganden sehr häufig binden und sich durch ein komplementäres Bindungsverhalten auszeichnen.- Solche Proteine, die unter den Messbedingungen stark positiv geladen sind, wie beispielsweise Lysozym und Avidin binden eher an den negativ geladenen Eosin-Kontrollligand. Proteine mit negativer Ladung (Fibrinogen, Thrombin) binden verstärkt an das Guanidiniumphenylalaninderivat.
Beispiel 9 Array zu Array- und Feid zu Feid- Kontrolle
Zur Reproduzierbarkeit der unspezifischen Signale der beiden Kontrollliganden sind im folgenden die Daten eines Targets (t-RNA) zusammengefasst, welches auf zwei verschiedenen Arrays gemessen wurde.
Die Array zu Array Kontrolle erfolgt durch Vergleich der gemittelten Messsignale der untersuchten Kontrollliganden. Die Daten zeigen, dass die Mittelwerte lediglich um maximal 02 nm voneinander abweichen, was im Rahmen der Messgenauigkeit liegt. Somit sind die in den verschiedenen Messungen auf den verschiedenen Arrays erzielten Ergebnisse ohne Einschränkung zu vergleichen.
Der Vergleich der Messsignale der Kontrollliganden innerhalb einer Zeile liefert ein Maß für die Homogenität der Messbedingungen über ein einzelnes Array hinweg. Der Kontrollligand Eosin ist in dieser Messung nicht informativ, da er keine ausreichende Wechselwirkung mit dem Target eingeht. Bei GuaPhe sind Schwankungen um 15% um den Mittelwert zu beobachten. Berücksichtigt man, dass es sich um Einzelmessungen handelt und lediglich sechs Messpunkte über den Array zur Verfügung stehen, kann von den dargestellten Daten auf homogene Messbedingungen geschlossen werden. Eine höhere Empfindlichkeit kann beispielsweise erzielt werden, wenn die Kontrollliganden in höhere Kopienzahl auf dem Array vorhanden sind.

Claims

Verfahren zur Kontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays die Schritte umfassend (a) Bereitstellen eines Mikroarrays für zu testende Liganden auf Sensorfeldern; (b) Aufbringen mindestens eines Kontrollliganden auf mindestens einem Sensorfeld; (c) Messung der Bindung zumindest zwischen Kontrollligand und einem mobilen Bindungspartner für die zu testenden Liganden, wobei mindestens ein Kontrollligand ein unspezifischer Universalbinder ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei unterschiedliche Kontrollliganden eingesetzt werden. –
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein positiv geladener in Kombination mit mindestens einem negativ geladenen Kontrollligand eingesetzt wird, wobei diese vorzugsweise jeweils zusätzlich hydrophobe Bereiche besitzen.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Kontrollligand ein Farbstoff oder ein Farbstoffderivat ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrollligand Eosin oder ein Eosinderivat ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Kontrollligand eine Verbindung darstellt, die mehrere Strukturmotive zur Bindung an das Target enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um mehrere identische Strukturmotive handelt..
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Strukturmotiven um Guanidiniumgruppen handelt.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Strukturmotiven um Guanidiniumphenylalaninreste handelt
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturmotive durch ein Gerüst miteinander verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gerüst eine Aminosäure oder ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Lysin ist oder das Peptid aus Lysin- aufgebaut ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorfelder eine organische Schicht als Bindematrix . beinhalten.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Schicht eine selbstassemblierende Monolage (SAM) ausbilden kann.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der SAM Ankermoleküle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der SAM weiterhin Verdünnermoleküle umfaßt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindematrix sich über die gesamte sensorfeldseitige Mikroarrayoberfläche erstreckt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroarray auf seiner den Sensorflächen zugewandten Oberfläche strukturiert ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroarray eine strukturierende Schicht auf einem planaren Träger umfaßt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroarray eine Metallschicht auf der strukturierenden Schicht und/oder dem Träger enthält, auf der sich nach außen hin die Bindematrix befindet.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht Gold enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroarray mindestens 96, bevorzugt mindestens 4608, am meisten bevorzugt mindestens 9216 Sensorfelder enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Liganden und gegebenenfalls um das wiederkehrende Strukturmotiv um kleine organische Moleküle handelt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden und/oder die Kontrollliganden alle ein gleiches Linkermolekül (Tag) besitzen.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsmessung auf mehreren oder allen Sensorfeldern parallel verläuft.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsmessung auf einem radioaktiven, optischen oder elektrischen Verfahren beruht.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das die Bindungsmessung markierungsfrei erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß ein reflexionsoptisches Verfahren verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bindungsmessung die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) verwendet wird.
Mikroarray für Bindungsmessungen von Liganden auf Sensorfeldern mit mindestens einem Kontrollligand auf mindestens einem Sensorfeld, wobei der Kontrollligand eine Verbindung darstellt, die mehrfach ein Strukturmotiv enthält.
Mikroarray nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Strukturmotive durch ein Gerüst miteinander verbunden sind.
Mikroarray nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturmotiv Guanidiniumphenylalanin ist.
Mikroarray nach einem oder mehreren der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Gerüst eine Aminosäure oder ein Peptid ist.
Mikroarray nach einem oder mehreren der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Lysin ist oder das Peptid aus Lysin aufgebaut ist.
Mikroarray für Bindungsmessungen von Liganden auf Sensorfeldern mit mindestens einem positiv geladenen und mindestens einem negativ geladenen Kontrollliganden, wobei diese vorzugsweise jeweils zusätzlich hydrophobe Bereiche besitzen, auf jeweils mindestens einem Sensorfeld.
Verfahren zum Auffinden von Kontrollliganden als unspezifische Unversalbinder, die Schritte umfassend (a) Bereitstellen von potenziellen Kontrollliganden auf Sensorfeldern; (b) Messung der Bindung zwischen den potenziellen Kontrollliganden und mehreren mobilen Bindungspartnern; (c) Auswahl von Kontrollliganden anhand ihrer Bindungswerte.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß dem Schritt (c) folgt (d) Chemische Verknüpfung mehrerer Kontrollliganden zu einem Kontrollliganden mit mehreren Strukturmotiven.
Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 10 mobile Bindungspartner getestet werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 36 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die mobilen Bindungspartner ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA und Proteine, die sich möglichst in ihrer Größe sowie ihren Ladungs- und Hydrophobizitätseigenschaften unterscheiden.
Verwendung von Eosin oder Eosinderivaten als Kontrollliganden zur Kontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays.
Verbindungen der Formel
wobei X = -OH, -NH₂, -NHA, wobei A Alkyl oder Acyl ist, oder eine Bindung zur direkten oder indirekten Anbindung an eine feste Phase ist, sowie deren Tautomere, Isomere, Enatiomere, Gemische oder Salze.
Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 41 als Kontrollliganden zur Kontrolle von Bindungsmessungen auf Mikroarrays.