DE10307390A1

DE10307390A1 - Testvorrichtung und Methoden zur Testung einer Vielzahl von Substanzen in zellulären Tests

Info

Publication number: DE10307390A1
Application number: DE2003107390
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Brock; Karl-Heinz Dr. Wiesmüller; Rainer Fischer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2004-09-02

Abstract

Eine Testvorrichtung und Methoden zur Testung einer Vielzahl von Substanzen in zellulären Tests, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Testsubstanzen auf planaren Oberflächen (1) in Form von Flecken (2) durch eine kovalente Verknüpfung mit der Oberfläche aufgebracht werden, wobei der Durchmesser der Substanzflecken vorzugsweise zwischen 100 und 500 μm liegt und der Abstand von Substanzflecken voneinander vorzugsweise zwischen 100 und 500 μm liegt und die Flecken nicht physikalisch, d. h. durch Stege, die eine Mischung von Flüssigkeit zwischen Testfeldern verhindern, voneinander getrennt sind. Die Testsubstanzen sind derart beschaffen, dass sie in der genannten Reihenfolge über eine Funktionalität zu einer gerichteten (regioselektiven) Anbindung an die Oberfläche verfügen (3), über eine chemolabile Gruppierung (4) sowie über einen Teil des Moleküls, der auf seine biologische Aktivität untersucht werden soll (6). Durch Spaltung der chemolabilen Bindung unter Bedingungen, die mit dem Wachstum von Zellkulturzellen (9) kompatibel sind, wird die Substanz freigesetzt wobei der Teil...

Description

Zur parallelen und sensitiven Messung von molekularen Wechselwirkungen bei minimalem Verbrauch an Probensubstanz und Lösungsmitteln finden sogenannte Microarrays zunehmend Verwendung. In den meisten Anwendung von Microarrays sind Fängermoleküle in der Form von Microspots in einem regulären Muster auf einer Oberfläche ausgebracht. Die Bindung von Probenmolekülen aus der Probenlösung wird z. B. über eine fluoreszente Reportergruppe, die in das Probenmolekül integriert ist oder einen indirekten Fluoreszenznachweis, z. B. durch fluoreszent markierte Antikörper, die gegen das Probenmolekül gerichtet sind, detektiert. Aus den Ortskoordinaten des Signals kann auf die Natur des immobilisierten Fängermoleküls und die Art der Wechselwirkung mit dem Analyten geschlossen werden (Bier FF, Kleinjung F (2001) Fresenius J Anal Chem 371, 151–156).
Merkmal der meisten Microarrays ist das Fehlen einer physikalischen Trennung einzelner Testfelder (Unter einer physikalischen Trennung wird hier und im Folgenden eine Trennung verstanden, die eine Mischung von Flüssigkeit zwischen verschiedenen Testfeldern verhindert. Dies wird üblicherweise dadurch erreicht, dass die Testsubstanzen sich am Boden von Mikrokavitäten befinden. Ein Flüssigkeitsübertritt zwischen diesen Mikrokavitäten wird vermieden). Das Testfeld wird in einem Arbeitsschritt mit der Probenlösung benetzt. Über Diffusion oder aktiven Flüssigkeitstransport wird sichergestellt, dass die Probenlösung und die darin gelösten Probenmoleküle an jedes Testfeld gelangen. Ein wesentliches Merkmal von Microarrays in der Rationalisierung von parallelen Testungen liegt in der Reduktion der erforderlichen Arbeitsschritte bei der Zugabe von Probenlösung begründet. Testungen der üblichen An, wie sie z. B. in Microtiterplatten durchgeführt werden, erfordern die Zugabe von Testlösung zu jedem der Testfelder in einem separaten Arbeitsschritt.
Je nach Art der gewählten Technologie für die Herstellung von Microarrays ist es erforderlich, sehr kleine Volumina von Lösungen mit Fängermolekülen zu pipettieren und dabei den Pipettierkopf exakt zu positionieren. Diese Leistungsmerkmale ermöglichen eine hohe Dichte an Microspots. Dabei helfen Nanopipettierroboter, die einzelne eng aneinander liegende Punkte auf der Oberfläche ansteuern und wenige Nano- bis Picoliter Lösung abgeben. Einige Nanopipettierroboter arbeiten nach der Inkjettechnologie, bei der die Lösung auf die Oberfläche gespritzt wird. Sogenannte Kontaktspotter setzen zur Probenabgabe, anders als die Inkjetroboter, einen kleinen, mit Lösung der Fängermoleküle benetzten Stempel auf der Oberfläche in direktem Kontakt auf (Zubritsky E (2000) Anal Chem 72, 761A–767A). Eine andere Methode, Moleküle über Oberflächenkontakt aufzutragen, ist die Stempelmethode (Lin SC, Tseng FG, Huang HM, Huang CY, Chieng CC (2001) Fresenius J Anal Chem 371, 202–208). Alternativ zum Ausbringen der Fängermoleküle mit Spottern, Pipettierern und Stempeln, sind auch Synthesen auf dem Substrat meist mit lichtoptischen Methoden beschrieben worden (Holmes CP, Adams CL, Kochersperger LM, Mortensen RB, Aldwin LA (1995) Biopolymers 37, 199–211; Komolpis K, Srivannavit O, Gulari E (2002) Biotechnol Prog 18, 641–6). Dabei werden photoaktivierbare Schutzgruppen eingesetzt. Insbesondere für Peptide ist die Synthese auf dem Chip nach den Prinzipien der Festphasensynthese ebenfalls möglich (Frank R (2002) J Immunol Methods 267, 13–26).
Das Microarray-Format und ebenso miniaturisierte Mikrotiterplatten sind auf sehr viele Systeme und analytische Fragestellungen anwendbar. Diese haben sich bedingt durch noch zu nennende Limitationen im Stand der Technik, deren Überwindung Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, auf die Detektion der Bindung von Molekülen an DNA-Fängermoleküle und zunehmend an Proteine, Peptide und potenziellen Wirkstoffmoleküle konzentriert. Probenmoleküle und Fängermoleküle liegen jeweils isoliert in Lösung vor. Der Einsatz von Microarrays in zellbiologischen Anwendungen wurde bislang nur in beschränktem Umfang beschrieben. Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellungen neuer Vorrichtungen und Methoden für die Nutzung der Microarraytechnologie auf planaren Substraten in der Testung der biologischen Aktivität von Molekülen in Zellen, wobei die Fängermoleküle zunächst wie oben beschrieben durch kovalente Anbindung auf den Oberflächen immobilisiert werden.
Anknüpfung von Fängermolekülen auf Oberflächen für die Herstellung von Microarrays. Für die Immobilisierung von Molekülen auf planaren Trägern zur Produktion von funktionellen Oberflächen und Microarrays steht eine Anzahl an Methoden zur Verfügung. Die meisten Methoden gehen von planaren Metall- oder Nichtmetalloxidoberflächen, insbesondere Glas, aus. Für oberflächenbehandelte Kunststoffe wurden ebenfalls Methoden beschrieben. Diese planaren Träger werden meist mit heterobifunktionellen Molekülen behandelt, die einerseits eine Reaktivität für die Anknüpfung an die Oberfläche aufweisen, andererseits die Anbindung weiterer Moleküle erlauben. Je nach Beschaffenheit dieser Moleküle werden der Oberfläche neue chemische Eigenschaften verliehen. Sofern eine Knüpfung von Bindungen der Moleküle untereinander nicht möglich ist, erfolgt die Funktionalisierung der Oberfläche in Form einer Monolage. Ein besonderer Fall der Monolagen sind die sogenannten Self-Assembled Monolayers (Schaeferling M, Schiller S, Paul H, Kruschina M, Pavlickova P, Meerkamp M, Giammasi C, Kambhampati D (2002 Electrophoresis 23, 3097–3105). Diese werden bevorzugt von Alkylreste mit einer Kettenlänge ab ca. 8 Methylengruppen gebildet. Alkylsilane, die an beiden Enden einer Alkylkette unterschiedliche funktionelle Gruppen tragen, werden z. B. als heterobifunktionelle Modifikatoren für Glasoberflächen verwendet. Die Bindung an Glas findet z. B. über ein Trialkoxysilan statt.
Durch Inkorporierung protonierbarer oder deprotonierbarer Gruppen wie Amino- oder Carboxygruppen in diese Moleküle, können Ladungen auf der Oberfläche erzeugt werden. Auf diese Weise können andere Moleküle über elektrostatische Wechselwirkungen an die Oberfläche binden. Diese Methode bietet aber nur geringe Spezifität der Immobilisierung. Trägt das zu immobilisierende Molekül Carboxy- bzw. Aminogruppen, so entstehen bei entsprechender Aktivierung meist der Carboxygruppe kovalente Amidbindungen auf der Oberfläche. Für die Gewährleistung einer regioselektiven Anbindung der zu immobilisierenden Moleküle ist Sorge zu tragen, dass nicht mehrere gleichartige reaktive Gruppen im Molekül vorkommen. So ist bei der Immobilisierung von Peptiden zu beachten, dass neben den terminalen Amino- und Carboxygruppen, diese Funktionalitäten ebenfalls in Aminosäureresten vorkommen.
Die Modifikation der Oberflächen mit weiteren heterobifunktionellen Linkem erweitert die Möglichkeiten für eine Anbindung von Fängermolekülen an Oberflächen. Ziel derartiger weiterer Modifikationen ist es häufig, eine chemoselektive Anbindung über eine bestimmte funktionelle Gruppe im Fängermolekül zu erreichen. Eine Aminooberfläche kann z. B. mit N-Succinimidyl-3-maleimidopropionat, ein mit N-Hydroxysuccinimid aktiviertes Maleinimidderivat, in eine maleinimidaktivierte Oberfläche umgewandelt werden (Oh SJ, Cho SJ, Kim CO, Park, JW (2002) Langmuir 18, 1764–1769). An diese Oberfläche können bevorzugt Thiolgruppen in einer Michael-Addition addieren und ein Molekül als Thioether immobilisieren.
Epoxygruppen sind reaktiv gegenüber einer Vielzahl nukleophilen funktionellen Gruppen wie Amino-, Thiol- oder Hydroxygruppen. Ihre Spezifität gegenüber diesen unterschiedlichen Nucleophilen, lässt sich über den pH-Wert der Lösung, aus dem das Fängermolekül auf dieser Oberfläche ausgebracht wird, steuern. Des weiteren lässt sich mit durch die Behandlung mit einem Dithiolbehandlung wie z. B. Ethandithiol aus einer Epoxyoberfläche leicht eine Thioloberfläche erzeugen. Die Anbindung von Molekülen an diese Thioloberfläche funktioniert z. B. durch Thiolgruppenaustausch mit einer Disulfidgruppe des Fängermoleküls unter Ausbildung einer neuen Disulfidbindung mit der Oberflaeche (Rogers Y, Jiang-Baucom P, Huang Z, Bogdanov V, Anderson S, Boyce-Jacino MT (1999) Anal Biochem 266, 23-30).
Im Gegensatz zu diesen kovalenten Anbindungsmethoden eignen sich auch Molekülkomplexe mit sehr kleinen Dissoziationskonstanten für Immobilisierungen. Ausführlich wurde die Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin beschrieben und zur Funktionalisierung von Oberflächen eingesetzt. Wenn Biotin z.B. über eine Amidbindung auf eine Oberfläche gebunden wird, dann ist die Möglichkeit offen, Streptavidin nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden. An dieses Streptavidin können wiederum biotinylierte Moleküle binden.
Anders als bei den zweidimensionalen Monolagen funktioniert die Immobilisierung in Gelen, die dreidimensionale Gestalt haben. Dabei können die Moleküle über funktionelle Gruppen direkt während der Polymerisation eingebunden (Vasiliskov AV, Timofeev EN, Surzhikov SA, Drobyshev AL, Shick VV, Mirzabekov AD (1999) Biotechniques 27, 592–605) oder einfach in den engen Maschen dreidimensionaler Netze, z.B. eines Polyacrylamidgels, eingeschlossen werden (Delgado M, Spanka C, Kerwin LD, Wentworth P, Janda KD (2002) Biomacromolecules 3, 262–271).
DNA Microarrays. Sind auf einem planaren Substrat DNA-Moleküle immobilisiert, so wird von einem DNA-Microarray oder DNA-Chip gesprochen. DNA-Moleküle sind dabei als Microspots in hoher oder sehr hoher Dichte (Microspots/Fläche) aufgetragen. Die immobilisierten DNA-Moleküle dienen als Fänger für DNA-Moleküle in einer Probelösung. Komplementäre markierte DNA aus der Probenlösung hybridisiert mit DNA auf der Oberfläche und erzeugt dadurch ein Signal auf der Oberfläche. Die Markierung gestattet entweder die direkte Auslesung über Fluoreszenz oder Radioaktivität oder aber erlaubt die Bindung von Molekülen, die wiederum eine Detektion erlauben. DNA-Chips werden z.B. für Mutationsanalysen und zur Erstellung von Genexpressionsprofilen genutzt.
Bei Mutationsanalysen werden Oligonucleotide auf einem Chip aufgetragen, die komplementär zu Genmutationen sind (Goto S, Takahashi A, Kamisango K, Matsubara K (2002) Anal Biochem 307, 25–32). Dabei werden auch einzelne Basenaustausche berücksichtigt. Unter stringenten Bedingungen wird das Microarray mit markierter Proben-DNA inkubiert. Ein Signal auf dem Chip deutet direkt auf Hybridisierung und das Vorliegen einer Genmutation im untersuchten DNA-Pool hin.
Zur Erstellung von Genexpressionsprofilen werden DNA-Chips verwendet, auf denen eine Auswahl von Oligonucleotiden immobilisiert sind (Lockhart DJ, Winzeler EA (2000) Nature 405, 827–836). Mit einer markierten cDNA-Probe wird der Chip inkubiert. Findet Hybridisierung statt, so enthält das Signalmuster auf der Oberfläche Information darüber, welche Gensequenzen in der Probe, aus der die cDNA erzeugt wurde, exprimiert waren. Zwei verschiedene Proben können vergleichend auf einem Chip untersucht werden, wenn beide Proben unterschiedlich markiert sind, z. B. mit zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Diese Technik wird häufig in der Tumorforschung angewandt, um Genexpressionsprofile von Tumorzellen mit denjenigen gesunder Zellen zu vergleichen.
Komplementarität der Sequenzen von Oligonucleotiden ist eine hinreichende Bedingung für Hybridisierung. Dreidimensionale Konformationen wie bei den Interaktionen von Proteinen spielen eine geringe Rolle. Deshalb kann in der DNA-Chip-Technologie auf synthetische Oligonucleotide für die Immobilisierung zurückgegriffen werden. Diese können durch Festphasensynthese mit der Phosphoramidit-Methode hergestellt werden (Beaucage SL (2001) Curr Med Chem, 8, 1213–1244). Auch PCR (Polymerase Chain Reaction) ist eine Möglichkeit, Oligonucleotide zu gewinnen. Oligonucleotide können aber auch direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden. Entweder werden klassische Schutzgruppen eingesetzt und an gezielten Stellen auf dem Chip gespalten oder es werden temporäre Schutzgruppen eingesetzt, die durch Bestrahlung mit Licht abgespalten werden und reaktive Zentren für einen folgenden Kupplungszyklus freisetzen (Barone AD, Beecher JE, Bury PA, Chen C, Doede T, Fidanza JA, McGall GH (2001) 20, 525–531).
Proteinmicroarrays. Protein-Microarrays oder Protein-Chips sind den DNA-Microarrays ähnlich (Stoll D, Templin MF, Schrenk M, Traub PC, Vöhringer CF, Joos TO (2002) Front Biosci 7, 13–32). Auf kleinen Flächen eines Substrates werden Proteine immobilisiert (MacBeath G, Schreiber SL (2000) Nature 289, 1760–1763). Die Immobilisierung von Proteinen zur Detektion molekularer Interaktionen mit Probenmolekülen ist jedoch anspruchsvoller als die von Oligonucleotiden, da bei Proteinen die Bindungseigenschaften nicht nur aus der Aminosäuresequenz, sondern aus der dreidimensionalen Anordnung der Aminosäuren im nativen, gefalteten Zustand des Proteins bestimmt werden. Sofern die Anwendung die native räumliche Faltung der Proteine erfordert, ist sicherzustellen, dass diese räumliche Faltung während der Immobilisierung und Handhabung des Chips erhalten bleibt. Protein-Chips werden z.B. zur Erstellung von Proteomprofilen, zur Charakterisierung von Antikörpern oder zum Auffinden von Tumormarkern oder Enzymsubstraten eingesetzt. In letzterem Fall beruht der Nachweis der Aktivität auf der Umsetzung der auf dem Microarray immobilisierten Proteine oder Peptide, die als Substrate für die Reaktion dienen (Houseman BT, Huh JH, Kron SJ, Mrksich M (2002) Nature Biotech 20, 270–274).
Ein Beispiel für die Erstellung von Proteomprofilen ist die Analyse des Proteoms von Krebszellen. Antikörper gegen einzelne Proteine werden auf einem festen Substrat immobilisert und mit Probelösung inkubiert. Die Proteine der Probelösung binden an entsprechenden Antikörper und erzeugen, sofern sie markiert wurden oder mit einem markierten Sekundärantikörper detektiert werden, ein entsprechendes Signal auf der Oberfläche. Das resultierende Signalmuster lässt direkt auf das Proteinexpressionsprofil in der Probe schließen (Knezevic V, Leethanakul C, Bichsel VE, Worth JM, Prabhu VV, Gutkind JS, Liotta LA, Munson PJ, Petricoin EF, Krizman DB (2001) Proteomics 1, 1271–1278).
Um Antikörper zu charakterisieren, werden Proteine oder Peptide, die mögliche Epitope darstellen, auf einer Oberfläche immobilisiert und der Microarray wird mit Antikörperlösung inkubiert. Auch hier muss der Antikörper markiert sein oder mit einem markierten Sekundärantikörper detektiert werden (Cahill DJ (2001) J Immunol Methods 250, 81–91).
Microarrays mit kleinen Molekülen (Small-Molecule Microarrays). Statt Proteinen oder Oligonucleotiden lassen sich auch kleine organische Moleküle oder synthetische Peptide auf einem Chip immobilisieren (Heiduschka P, Göpel W, Beck W, Kraas W, Kienle S, Jung G (1996) Chem Eur J 2, 667–672) bzw. synthetisieren (Frank R (2002) J Immunol Methods 267, 13–26). Peptidmicroarrays können sowohl den Protein- als auch den Microarrays mit kleinen Molekülen zugerechnet werden. Oft stammen diese niedermolekularen Verbindungen aus kombinatorischen Substanzbibliotheken (Jung G (ed.) (1996) Wiley-VCH, Weinheim; Birkert O, Tünnemann R, Jung G, Gauglitz G (2002) Anal Chem 74, 834–840).
Mit diesen Substanzbibliotheken auf Chips ließen sich bereits einige Protein-Ligand-Wechselwirkungen (MacBeath G, Koehler AN, Schreiber SL (1999) J Am Chem Soc 121, 7967–7968) oder gar Regulatoren für Proteinaktivität (Kuruvilla FG, Shamji AF, Sternson SM, Hergenrother PJ, Schreiber SL (2002) Nature 416, 653657) identifizieren.
Immobilisierte Peptide wurden verwendet, um Enzymsubstrate, zum Beispiel Kinasesubstrate (Houseman BT, Huh JH, Kron SJ, Mrksich M (2002) Nature Biotech 20, 270–274), zu identifizieren.
Zell-Chips. Es wird zunehmend versucht, die Vorteile der Microarray-Technologie, d. h. Gewinnung einer Vielzahl von Parametern bei einem Minimum an Fängermolekülen und Testsubstanz, auch bei Zellanalysen zu nutzen. Dabei wachsen Zellen als Zellkultur oder Kokultur verschiedener Zelllinien auf funktionalisierten Substraten bzw. werden Zellen mit diesen Substraten in Kontakt gebracht (Blau A, Weinl C, Mack J, Kienle S, Jung G, Ziegler C (2001) J Neurosc Methods 112, 65–73). Durch eine geeignete Funktionalisierung der Oberfläche kann das Zellwachstum auf solche Bereiche beschränkt werden, in denen eine Substanztestung durchgeführt werden soll. Eine derartige Vorgehensweise und der Einsatz zur Testung von Substanzen in zellulären Nachweisverfahren wurden z. B. in WO0017624 und DE10032730A1 dargelegt. In WO0017624 wurden Mikrokavitäten durch Auflegen einer Mikrotiterplatte auf den Zellchip erzeugt wurden. Im folgenden wird der Begriff der Testsubstanz synomym mit dem Begriff des Fängermoleküls, wie er oben für auf dem Microarray immobilisierte Substanzen gebraucht wurde, verwendet.
Mit geeigneten Mikromessmethoden kann eine Vielzahl funktioneller Parameter in den Zellen gemessen werden. So kann durch den Einsatz von automatisierter Fluoreszenzmikroskopie mit digitaler Bildaufnahme der Einfluss von potenziellen Wirkstoffmolekülen auf die Translokation von Proteinen und Vesikeln in Zellen automatisiert bestimmt werden. Messvorrichtungen und Methoden wurden von der Firma Cellomics z. B. in WO003246, WO0079241 und WO0070342 dargelegt. Die Kleinheit der Zellen ist per se kompatibel mit einer hohen Probendichte, sofern für eine hinreichend kleine Zellzahl ein statistisch aussagekräftiges Ergebnis gewonnen werden kann. Des Weiteren wurden Träger vorgestellt, mit dem elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Zellen durchgeführt werden können (Fertig N, Blick RH, Behrends JC (2002) Biophys J 82, 3056–3062) und DE10032568A1 . In einer weiteren Anwendung wurden HeLa-Zellen mittels einer Stempeltechnik auf eine funktionalisierte Oberfläche aufgebracht und deren Sauerstoffverbrauch mit Mikroelektroden gemessen (Nishizawa M, Takoh K, Matsue T (2002) Langmuir 18, 3645–3649).
Der Stand der Technik der bisherigen Anwendung von Microarrays für zellbiologische Untersuchungen ist in der Applikation einer Testsubstanzen pro physikalisch abgegrenztem Testfeld limitiert. Werden Substanzmischungen getestet, wie es in der kombinatorischen Chemie häufig erfolgt, so kann eine biologische Aktivität nicht einer einzelnen Substanz innerhalb der Mischung zugewiesen werden. Die Testung unterschiedlicher Substanzen erfordert eine physikalische Trennung der Testfelder. Vorrichtungen, in der über Mikrofluidik Testsubstanzen zu unterschiedlichen Mikrokavitäten geleitet werden kann, wurden z. B. in WO0017624 und CN1330154 dargelegt.
Sampson et al. (Sampson NS, Mrksich M, Bertozzi CR (2001) PNAS 98, 12870–12871) ist das Problem der Trennung von unterschiedlichen Testfeldern in zellulären Microarrays durch die kovalente Immobilisierung von Testsubstanzen umgangen, deren Einfluss auf das Zellwachstum untersucht wurde. Mit einem solchen Microarray lassen sich beispielsweise Liganden gegen Zelloberflächenmoleküle identifizieren, die das Zellwachstum beeinflussen. Eine derartige Vorrichtung ist jedoch auf Testsubstanzen limitiert, die ihre Wirkung auf extrazelluläre Proteine ausüben.
Schwenk hat den Nachweis von zellulären Oberflächenantigenen demonstriert, indem je Testfeld ein unterschiedlicher Zelltyp mit einem Kontaktprinter mikrostrukturiert auf die Oberfläche aufgebracht wurde und die Bindung eines Typs von Antikörpern gegen Zelloberflächenproteine getestet wurde (Schwenk J, Stoll D, Templin MF, Joos TO (2002) Biotechniques). In diesem Fall entsprachen die Zellen den Fängermolekülen und der Antikörper den Probenmolekülen. Um die Aktivität unterschiedlicher Probenmoleküle zu untersuchen, sind diese mit unterschiedlichen Markierungen zu versehen, die z. B. aufgrund ihrer spektralen Eigenschaften unterschieden werden können.
Biologisch aktive Substanzen entfalten ihre Wirkung häufig im Innern von Zellen durch molekulare Wechselwirkung mit intrazellulären Molekülen. Zu diesem Zweck müssen zellbiologische Testsysteme derart gestaltet sein, dass eine Aufnahme von Substanzen in Zellen möglich ist. Der derzeitige Stand der Technik für die Erzeugung und den Einsatz von Microarrays wird diesem Anspruch nicht gerecht. Wie dargestellt, wird eine dauerhafte lokale Anbindung von Fängermolekülen auf der Oberfläche angestrebt. Eine Ablösung der Fängermoleküle von der Oberfläche und Übertritt in den Inkubationspuffer würde die Trennung der einzelnen Testfelder ausheben. Aus diesem Grund war der Einsatz zellulärer Microarrays auf Ausführungsbeispiele der oben dargestellten Art beschränkt. Eine Testung synthetischer Moleküle, die ihre Wirkung innerhalb von Zellen entfalten auf einem planaren Träger ohne physikalische Trennung von Testfeldern durch Stege voneinander, wurde bislang nicht beschrieben.
Allein von Ziauddin et al. (Ziauddin J, Sabatini DM (2001) Nature 411, 107–110) wurde die Inkorporation von Transfektions- und Plasmidlösung in Gelkissen beschrieben. Diese Technologie ist ebenfalls von David M. Sabatini in WO02077264 dargelegt. Diese Gelkissen waren voneinander räumlich getrennt. Nach Aufwachsen von Zellen auf die Gelkissen, wurde von diesen lokal Plasmid aufgenommen. Der Nachweis der Aufnahme erfolgte über die Expression des Grünen Fluoreszenten Proteins GFP. Diese Anwendung ist jedoch auf Moleküle beschränkt, die sich nicht-kovalent in einer polymeren Matrix inkorporieren lassen und aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften langsam aus dieser Matrix austreten. Für die Induktion und den Nachweis einer Proteinexpression sind nur sehr geringe Mengen aufgenommener DNA erforderlich. Bereits die Freisetzung kleinster Substanzmengen führt bei dieser Art des Nachweises bereits zu einem detektierbaren Signal. Darüberhinaus sind sich DNA Moleküle, die unterschiedliche Gene tragen in ihren physikochemischen Eigenschaften nahezu identisch. Es kann daher eine sehr ähnliche Kinetik der Freisetzung unterschiedlicher DNA Moleküle an unterschiedlichen Testfeldern des Microarrays angenommen werden.
Kleine Moleküle sowie Peptide, die auf ihre biologische Aktivität in Zellen getestet werden sollen, unterscheiden sich im Gegensatz dazu meist erheblich in ihren physikochemischen Eigenschaften. Darüber hinaus besitzen sie ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht als die von Ziauddin et al. beschriebenen DNA Moleküle. Der Austritt solcher kleinen Moleküle aus einer polymeren Matrix erfolgt deutlich schneller als der Austritt der DNA. Zudem ist zu erwarten, dass die Effizienz und die Kinetik des Austritts stark von den physikochemischen Eigenschaften des Probenmoleküls abhängen. In Abhängigkeit von diesen physikochemischen Eigenschaften interagieren diese Probenmoleküle unterschiedlich stark über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit der Polymermatrix.
Chemolabile, kovalente Anbindung der kleinen Moleküle an das Substrat. Für eine langsame und hinsichtlich ihrer Kinetik einheitliche Freisetzung von Molekülen aus einem Polymer ist daher eine kovalente Verknüpfung mit dem Polymer erforderlich. Die Freisetzung der Verbindung erfolgt entweder durch die langsame Auflösung des Polymers unter den Bedingungen der Anwendung oder durch die Inkorporierung einer unter den Bedingungen der Anwendung spaltbaren chemischen Bindung zwischen der funktionellen Gruppe über die die Anbindung der Substanzen an das Polymer erfolgt und dem Teil des kleinen Moleküls, der auf seine biologische Wirksamkeit untersucht werden soll.
Unter einer langsamen Freisetzung wird in diesem Zusammenhang eine Freisetzung mit einer Halbwertzeit der Bindungsspaltung von typischerweise 12 h bis wenigen Tagen verstanden.
Diese langsame Kinetik bei zellulären Microarrays ergibt sich aus der Notwendigkeit, den Zellen zunächst Gelegenheit für die Ausbildung eines Kontaktes mit der Oberfläche zu geben.
Die Anwendung von hydrolyselabilen Bindungen zur langsamen Freisetzung von Wirkstoffen aus Polymeren ist im pharmakologischen Bereich beschrieben. Darüber hinaus werden Wirkstoffe selber so modifiziert, dass sie erst nach Abspaltung der Modifkikation ihre Wirksamkeit entfalten. Wenn ein Wirkstoff so derivatisiert wird, dass durch Hydrolyse der Wirkstoff freigesetzt wird, so lässt sich über die Hydrolysegeschwindigkeit die Wirkstofffreisetzung steuern. Diese Wirkstoffderivate sind ein Beispiel für Prodrugs. Hydrolyselabile Bindungen sind z.B. Ester mit Thiol- oder aromatischen Hydroxygruppen Bonina FP, Arenare L, Palagiano F, Saika A, Nava F, Trombetta D, Caprariis P (1999) J Pharm Sci 88, 561–567, US2001012893 ). Werden Wirkstoffderivate enzymatisch gespalten, so lässt sich dadurch ihre Aktivität an den Ort der Enzymaktivität lenken. Diese Vorgehensweise ist z. B. in US6350780 und WO0059546 dargelegt.
Disulfidbindungen sind ein weiteres Beispiel chemolabiler Bindungen. Sie lassen sich durch Oxidation oder Thiolgruppenaustausch bilden, sind unter vielen Bedingungen stabil und lassen sich reduktiv, z.B. mit Dithiothreitol, spalten. Anwendung findet dies unter anderem bei wiederverwendbaren Sensoroberflächen (Schlecht U, Nomura Y, Bachmann T, Karube I (2002) Bioconjug Chem 13, 188–193).
Bindungspaltung lässt sich bei geeigneten sensitiven Gruppen ebenfalls durch Licht oder elektrische Potentiale induzieren. Eine 1-(2-Nitrophenyl)-ethyl-Gruppe ist z.B. eine durch Licht aus dem nahen Ultraviolettbereich spaltbare Gruppe. Dies wurde z. B. für einen Biotin-Anker genutzt, um Biotin vom eigentlichen Zielmolekül wieder zu entfernen (Olejnik J, Sonar S, Krzymanska-Olejnik E, Rothschild KJ (1995) PNAS 92, 7590–7594).
Leipert et al. haben die mikrostrukturierte Belegung von Oberflächen mit Peptid über elektrochemische Polymerisation beschrieben (Leipert D (1998) Dissertation, Fakultät für Chemie und Pharmazie, Universität Tübingen). Die Verwendung eines Chinonesters als Brückenmolekül zwischen einem Anker und einem funktionellen Molekülteil erlaubte bei Reduktion des Chinons zum Hydrochinon durch ein elektrisches Potential die Spaltung einer Bindung in diesem Brückenmolekül und die Freisetzung des funktionellen Molekülteils (Yeo W, Hodneland CD, Mrksich M (2001) Chembiochem 7, 590–593). Bei der beschriebenen Anwendung wurde der Einfluss von Änderungen des Wachstumssubstrates durch Freisetzung des funktionellen Molekülteils auf Zellwachstum untersucht.
Die Freisetzung von Molekülen aus Polymeren lässt sich durch Polymere erreichen, die in Abhängigkeit von Umgebungsbedingungen wie pH-Wert oder Temperatur z. B. eine lockere oder eine kollabierte Form annehmen. In der lockeren Form ist die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung fast unbeeinflusst, in der kollabierten Form ist sie aber fast überhaupt nicht mehr möglich (Stayton PS, Shimoboji T, Long C, Chilkoti A, Chen G, Harris JM, Hoffman AS (1995) Nature 378, 472–474).
Polymere lassen sich auch so synthetisieren, dass sie Moleküle nicht nur binden und in ihren Maschen fixieren, sondern auch durch Diffusion entweichen lassen. Durch die Maschengröße kann diese Freisetzung gesteuert werden (Delgado M, Spanka C, Kerwin LD, Wentworth P, Janda KD (2002) Biomacromolecules 3, 262–271). Alternativ ist ein langsamer Abbau des einschließenden Polymers im Körper möglich (z. B. US5548035 ).
Die mikrostrukturierte Ausbringung von Proteinen auf einem planaren Träger, der ein polymeres Substrat geringer Dicke trägt, wurde von Perkin Elmer LifeSciences beschrieben (Hydrogel^TM Microarray Substrate). Derartige Träger eignen sich bei geeigneter chemischer Voraktivierung ebenfalls für die Immobilisierung von kleinen Molekülen. Die Möglichkeit und die Anwendungsmöglichkeiten einer mikrostrukturierten chemolabilen, kovalenten Anbindung von kleinen Molekülen auf derartigen Trägern, wie sie durch Inkorporation einer chemolabilen chemischen Bindung zwischen der Funktionalität des kleinen Moleküls zur Anbindung an die voraktivierte Gruppe des polymeren Trägers und dem Teil des Moleküls, das die relevante biologische Aktivität trägt, ermöglicht wird, und die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist für zellbiologische Assays, wurden bislang jedoch nicht erkannt.
Inhalt der Erfindung
Wie zu dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung dargelegt, zielte die mikrostrukturierte Immobilisierung von Verbindungen in Form von Microarrays bislang fast ausschließlich auf eine stabile Anknüpfung der Verbindung an das Substrat ab. Das genannte Beispiel, in dem eine langsame Freisetzung der immobilisierten Verbindung mit dem Ziel einer Aufnahme in Zellkulturzellen angestrebt wurde, ist wie dargelegt, nur mit großen Einschränkungen auf kleine Moleküle übertragbar.
Die chemolabile Anbindung an eine polymere Matrix für eine langsame Freisetzung eines Wirkstoffes hat nach dem Stand der Technik bislang ausschließlich die Bereitstellung einer therapeutischen Darreichungsform des Wirkstoffes bezweckt. Im Gegensatz zu diesem Stand der Technik zielt die vorliegende Erfindung auf eine chemolabile Anbindung einer Vielzahl von verschiedenen Molekülen auf planaren Trägern zum Zweck der Testung dieser Moleküle auf eine biologische Aktivität ab.
Der Inhalt der Erfindung zielt daher insbesondere auf solche Methoden der chemolabilen Anbindung ab, die sich in Form einer Mikrostruktur, insbesondere in Form eines Microarrays auf Substraten ausbringen lassen. Die chemolabile Anbindung und langsame Freisetzung der Moleküle ist daher unabhängig von der Einbettung der Moleküle in eine polymere Matrix. Der Inhalt der Erfindung zielt daher insbesondere auf die chemolabile, kovalente Anknüpfung von Molekülen auf einem planaren Substrat in Form einer Monolage ab. Durch Abspaltung der Substanzen von den Oberflächen, die bevorzugt in dem Format eines Microarrays aufgebracht werden, wird angestrebt, solche Substanzen aus der Gesamtheit aller auf dem Microarray ausgebrachten Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität von Zellen beeinflussen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche Methoden zur chemolabilen Anbindung von kleinen Molekülen an Oberflächen, die eine Halbwertzeit der Bindungsspaltung von 12 bis 48 Stunden unter den jeweiligen physiologischen Bedingungen der verwendeten Zellen besitzen. Für Zellkulturzellen aus Säugetieren, die insbesondere Gegenstand dieser Erfindung sind, sind dies 37 °C und eine wässrige Umgebung mit pH 7 – 7,4, deren ionische Zusammensetzung derjenigen entspricht, die für gewöhnlich in den Zellmedien und Puffern vorherrscht, wie sie für die Kultivierung dieser Zellen verwendet wird. Die wesentlichen Merkmale der Erfindung sind in den 1 und 2 zusammengefasst.
Auf einem geeigneten Substrat (1) sind lokal Testsubstanzen aufgebracht (2), wobei der Durchmesser der Flecken mit Testsubstanz Idealerweise zwischen 100 und 500 μm liegt. Die Testsubstanzen (6) weisen eine chemische Funktionalität zur Anbindung an eine reaktive Gruppe auf der Oberfläche auf (3), eine chemische Bindung, die unter den jeweiligen Bedingungen der Zellkultur im Sinne der Erfindung spaltbar (chemolabil) ist (4) sowie eine Gruppierung auf, die auf ihre biologische Aktivität im jeweiligen biologischen Assay getestet wird (6). Als Optionen kann die Testsubstanz mit einer Funktionalität versehen sein, die eine Aufnahme in Zellen steuert (5a) sowie zusätzlich einer Gruppierung, die die Detektion der Aufnahme der Testsubstanz in Zellen zulässt (5b), z. B. eine Fluoreszenzmarkierung. Die Steuerung des Wachstums von Zellen (9) ist zusätzlich über Substanzen möglich, die Zellwachstum unterbinden (7) oder fördern (6). Es sind aber auch Realisierungen der Erfindung möglich, bei denen keine Steuerung des Zellwachstums stattfindet, sondern die Zellen gleichmäßig auf dem ganzen Substrat wachsen. Die Aktivität der Zellen wird dann in den Bereichen ausgelesen, in denen sich Testsubstanz (2) befindet. In den Zellen sind molekulare Targets (10), die potenziell in ihrer biologischen Aktivität durch die Testsubstanz beeinflusst werden können.
Die typische Durchführung eines solchen zellulären Nachweises ist in 2 dargestellt. (A) Nach der Herstellung eines mit Testsubstanzen mikrostrukturiert funktionalisierten Substrates (1), wird dieses mit Zellen (9) inkubiert. Sofern die Oberfläche zusätzlich mit Substanzen funktionalisiert ist, die das Zellwachstum steuern (7, 8) wachsen die Zellen nur auf den Bereichen an, in denen sich Testsubstanzen (6) befinden oder gleichmäßig auf der ganzen Oberfläche. (B) Im Laufe der Inkubation lösen sich die chemolabilen Bindungen (4), so dass Testsubstanzen unterhalb der Zellen in Lösung treten. (C) Diese Testsubstanzen werden von den Zellen in Abhängigkeit von ihren physikochemischen und strukturellen Eigenschaften aufgenommen und binden innerhalb der Zellen potenziell an molekulare Targets (10). (D) Die Beeinflussung der zellulären Aktivität wird mit Hilfe einer geeigneten Detektionsvorrichtung (11), z. B. einem Fluoreszenzmikroskop, ausgelesen.
Ein besonderer Vorteil einer chemolabilen, kovalenten Anbindung der Fängermoleküle auf einem planaren Substrat in Form einer Monolage liegt in der Möglichkeit, mit dem gleichen Substrat sowohl zellbiologische Testungen durchführen zu können, als auch, sofern die Kinetik der Spaltung der chemolabilen Bindung hinreichend langsam ist, Bindungstests mit isolierten Probenmolekülen, wie für Small-molecule microarrays beschrieben, durchführen zu können.
Wie durch eine Abschätzung der auf einer Oberfläche in Form einer Monolage immobilisierbaren Moleküle leicht zu erkennen ist, ist die Anzahl der Moleküle durchaus ausreichend, um in einer darüber hinaus befindlichen Zellschicht eine ausreichend hohe lokale Konzentration für eine Substanztestung zu erreichen. Bei einer Belegung mit einem Molekül Testsubstanz/nm² sind auf einem Substanzspot von 100 μm Durchmesser 7,85 × 10⁹ Moleküle vorhanden, entsprechend einer Stoffmenge von 1,3 × 10¹⁴ mol. Treten alle diese Moleküle in das Volumen ein, das sich in einer 5 μm hohen Schicht über dem Substanzspot befindet, so ergibt sich eine Konzentration von 0,33 mM. Eine Schichtdicke von 5 μm entspricht der Schichtdicke, die von einer Monolage von Zellen eingenommen würde. Aus dieser Abschätzung ist leicht zu sehen, dass bereits bei einer Ablösung von nur einem Teil der Substanzmoleküle Konzentrationen erreicht werden, wie sie für die Substanztestung in zellulären Assays üblicherweise erforderlich sind. Bei einem gesamten Volumen von 1 ml Inkubationspuffer für den gesamten Zellarray, verdünnt sich diese Substanzmenge, sofern sie in das Gesamtvolumen eintritt, auf eine Konzentration von 1,3 × 10^-11 M. Diese Konzentration liegt deutlich unterhalb der Konzentration, bei der in der Regel eine biologische Aktivität beobachtet wird. Aus dieser Abschätzung ist zu erkennen, dass trotz des Fehlens einer physikalischen Trennung zwischen den Testfeldern, tatsächlich nur in dem jeweiligen Testfeld für eine Testung relevante Konzentrationen erreicht werden. Sobald die Testsubstanzen das Testfeld durch Diffusion verlassen, werden sie auf nicht aktive Konzentrationen verdünnt.
Eine Anbindung auf einer Oberfläche in Form einer Monolage besitzt, im Gegensatz zu einer polymeren Matrix, bei Anwendungen, bei denen auch eine Bindung von isolierten Probenmolekülen beabsichtigt ist, den Vorteil einer uneingeschränkten Zugänglichkeit der Probenmoleküle an die Fängermoleküle. Bei Einbettung in eine polymere Matrix, kann die Maschenweite der Matrix die Zugänglichkeit der Probenmoleküle in das Innere der Matrix erschweren. Diese Limitation polymerer Trägermaterialien bei der Nachweisung molekularer Wechselwirkungen ist z. B. beim sogenannten On-bead Screening bekannt (Meldal M (2002) Tetrahedron Lett. 43, 6409–6411)
Als eine Strategie für eine chemolabile Anbindung mit besonderer Relevanz für die vorliegende Erfindung sind Verbindungen mit einer Estergruppierung als Linkergruppe zu nennen. Esterbindungen in wässrigen Lösungsmitteln durch Wasser gespalten. Wasser ist grundlegender Bestandteil jeder zellulären Umgebung und dadurch in biologischer Sicht ein sehr geeignetes Spaltreagenz. Nach allgemeinem Kenntnisstand ist die Hydrolysestabilität von Estergruppen sowohl abhängig von Substitution des Carbonyl-Kohlenstoffs als auch von der des alkoholischen Sauerstoffs. So sind aromatische Ester, wie sie z. B. durch die Veresterung der Hydroxygruppe der Aminosäure Tyrosin mit Carbonsäuren erzeugt werden können, weniger stabil gegenüber Wasser als z. B. ein aliphatischer Ester, wie er durch Veresterung der Hydroxygruppe der Aminosäure Serin mit einer Carboxygruppe erzeugt werden kann. Die Stabilität aromatischer Ester kann darüber hinaus durch geeignete Substitution des Aromaten beeinflusst werden, die die Elektronendichte im Aromaten ändern. Substituenten, die die Elektronendichte verringern, bewirken eine einfachere Spaltbarkeit der Estergruppe, während Substituenten, die die Elektronendichte erhöhen, die Spaltbarkeit erschweren. Thiolester sind in ihrer Stabilität den jeweiligen alkoholischen Estern vergleichbar. Seitenketten von Aminosäuren wie z. B. Polylysin in der Nachbarschaft der Esterbindung beschleunigen die Hydrolyse des Esters.
Wie sich bei der Etablierung von Estergruppierungen als hydrolyselabile chemolabile Gruppierung für die langsame Freisetzung von Molekülen von Oberflächen jedoch überraschenderweise gezeigt hat, ist die Hydrolyselabilität von Verbindungen, die eine Estergruppierung tragen in Lösung, nicht mit derjenigen auf Oberflächen vergleichbar.
Ausführungsbeispiel: Verwendung von Estergruppierungen als chemolabile Gruppierung.
Die Verwendung einer Estergruppierung zur chemolabilen Immobilisierung von kleinen Molekülen wurde anhand von Verbindungen getestet, bei denen jeweils Serin, Cystein oder Tyrosin mit der Carboxygruppe von Cystein verestert wurden. Die Sulfhydrylgruppe des Cystein, das als Carboxykomponente eingesetzt wurde, diente der regioselektiven Anbindung der Esterverbindungen auf Maleinimid-voraktivierten Oberflächen.
Zur Verfolgung des Hydrolyseverlaufs von Oberflächen, wurde der N-terminus der Aminosäuren, die als Abgangsgruppen dienten, zusätzlich mit dem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluoreszein als Reportergruppe markiert.
Die Synthese dieser Verbindungen erfolgte nach allgemein bekannten Methoden der Festphasenpeptidsynthese durch Kopplung von Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Mmt)-OH oder Fmoc-Tyr(ClTrt)-OH auf Rinkamid-Harz. Nach Fmoc-Abspaltung erfolgte die Kupplung von Carboxyfluoreszein an die Aminogruppe und die Umsetzung der Hydroxygruppen des Carboxyfluoreszeins mit di-tertiär-butyl-dicarbonat. Danach wurden die Trt-Schutzgruppe des Serin, bzw. die Mmt-Schutzgruppe des Cysteins oder die ClTrt-Schutzgruppe des Tyrosins selektiv entfernt und die freiwerdende Gruppe mit Boc-Cys(Trt)-OH verestert. Dazu wurden 5 eq Boc-Cys(Trt)-OH und DMAP (N,N-Dimethyl-4-aminopyridin) (2 eq) in 1 ml DMF gelöst und DIC (5 eq) zupipettiert. Die gemischte Lösung wurde auf das jeweilige trockene Harz mit den entschützten Aminosäuren gegeben und 3 Stunden geschüttelt. Das Harz wurde nach Reaktionsende mit DMF, Methanol, DCM und Diethylether gewaschen. Nach diesem letzten Schritt am Harz wurden die Peptide abgespalten. Der Serinester ist im folgenden PS benannt, der Cystein-Thiolester PC und der Tyrosinester PY.
In 3 ist die Struktur der Oberflächenbeschichtung, auf der die Immobilisierung der Ester erfolgte, dargestellt. In der linken Bildhälfte ist die Molekülstruktur der Maleinimidoberfläche, in der rechten Bildhälfte die der PEG-Maleinimidoberfläche (rechts) auf einem Glasträger aufgezeichnet. Der Glasträger ist als horizontale Linie dargestellt.
4 zeigt das HPLC-Chromatogramm (UV-Detektion bei 214 nm) und die Strukturformel von Fluo-Tyr(Cys)-NH₂ Die Immobilisierung auf einer in 3 gezeigten, maleinimidaktivierten Oberfläche findet über die freie Thiolgruppe statt.
In 5 ist Molekülstruktur des Peptids PY, dessen Thiolgruppe an die Doppelbindung des Maleinimids addiert ist (links) und damit als Thioether immobilisiert ist und von Mercaptoethanol, als Thioether an die Oberfläche gebunden (rechts) gezeigt. Zunächst wurde das Zeitfenster der Hydrolyse bestimmt, welches eine Halbwertszeit von etwa 48 h nicht überschreiten sollte. Des Weiteren wurde auf diese Weise sichergestellt, dass die Spaltung des Peptids tatsächlich an der Esterbindung stattfindet. Beides konnte durch HPLC- und MALDI-MS-Analysen der Peptidlösungen ermittelt werden.
Für die Peptidlösungen wurden je 1 mg der Peptide PS, PC und PY in 10 μl DMF in einem Plastikreaktionsgefäß gelöst und mit HBS auf 1 ml aufgefüllt (HEPES gepufferte Kochsalzlösung, HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin)-1-ethansulfonsäure)): HEPES (2,38 g, 10 mmol), Natriumchlorid (7,89 g, 135 mmol), Kaliumchlorid (372,5 mg, 5 mmol), Magnesiumchlorid (95,3 mg, 1 mmol) und Calciumchlorid (111,1 mg, 1,8 mmol) wurden in 1 1 bidestilliertem Wasser gelöst und auf pH 7,3 eingestellt). Die Reaktionsgefäße wurden fest verschlossen und in einem Heizblock bei 37 °C stehen gelassen. Aliquots wurden zu Beginn, nach 24 h und nach 48 h entnommen. Nach Entnahme eines Aliquots wurde dieses entsalzt. Dazu wurde eine Entsalzungssäule (Hewlett-Packard) mit je 1 ml destilliertem Wasser, ACN, 0,1 %TFA und nochmals destilliertem Wasser äquilibriert. 100 μl Peptidlösung wurde aufgetragen und dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen. Mit 100 μl ACN, 0,1 % TFA wurde das Peptid von der Säule eluiert und in einem Plastikreaktionsgefäß aufgefangen. Bis zur Analyse wurde die entsalzte Peptidlösung bei –20° C aufbewahrt. Von jeder entsalzten Aliquotlösung wurden eine analytische HPLC-Analyse und ein MALDI-Massenspektrum aufgenommen. In den HPLC-Chromatogrammen waren bereits nach 24 h die Signale des Ausgangsstoffes nicht mehr vorhanden. Im MALDI-Spektrum konnte die Masse des Fragmentes nach Esterspaltung nachgewiesen werden (Peptidfragmentmassen [m/z] berechnet/gemessen: PS: 461,4/463,1; PC: 476,5/479,0; PY: 537,5/539,2).
Zur Bestimmung der Hydrolyse auf Oberflächen wurden die Peptide PS, PC und PY auf Maleinimidoberflächen und auf PEG-Maleinimidoberflächen (4, 5) aufgebracht. Beide Oberflächenvarianten besitzen Maleinimidgruppen, die über Amidbindungen auf die Oberfläche aufgebracht wurden, unterscheiden sich aber in ihrer Struktur zwischen Maleinimid und Glas. Bei den PEG-Oberflächen wurde statt einer direkten Aminofunktionalisierung eine Epoxyfunktionalisierung durchgeführt und die Epoxygruppen anschließend mit Diamino-PEG in eine hydrophilere Aminooberfläche umgewandelt. Es ist im Gebiet der Oberflächenfunktionalisierung bekannt, dass durch derartige weitere Funktionalisierungen unspezifische Wechselwirkungen von Molekülen an Oberflächen beeinflusst werden können. Insbesondere wurde in diesem Durchführungsbeispiel untersucht, ob eine zusätzliche Funktionalisierung der Oberfläche mit Diamino-PEG die Kinetik der Freisetzung der Peptide von der Oberfläche beeinflusst.
Als Oberfläche wurde Glas verwendet, das chemisch modifiziert und damit funktionalisiert wurde. Als Substrate zur Oberflächenfunktionalisierung dienten handelsübliche Mikroskopiedeckgläser mit 12 mm Durchmesser. Weil immer nur eine Glasseite chemisch behandelt wurde, wurden die Deckgläser mit einem Glaskratzer so markiert, dass beide Seiten unterscheidbar waren. Funktionalisierte Deckgläser wurden bis zu ihrem Gebrauch unter Argongas in der Dunkelheit aufbewahrt.
Die Deckgläser wurden in einem Acetonbad unter Ultraschall 15 min gereinigt, getrocknet und 30 min in Piranha-Lösung (25 ml 30 % wässriges H₂O₂ und 30 ml H₂SO₄) behandelt, anschließend gründlich mit bidestilliertem Wasser gespült und trockengeblasen. Eine Lösung aus 3 % Aminopropyltriethoxysilan in Ethanol/Wasser 95:5 (v/v) wurde 5 min geschüttelt und anschließend wurde davon 60 μl auf die Glasoberseite pipettiert. In einer geschlossenen Reaktionskammer standen die Gläser genau 60 min. Durch Eingießen von Ethanol in die Kammer wurde die Reaktion abgestoppt. Die Gläser wurden mit Ethanol gespült, trocken geblasen, 60 min bei 99° C stehen gelassen, nach dem Abkühlen nochmals mit Ethanol gespült und getrocknet. Dann wurde auf die Glasoberseite 80 μl Succinimidylmaleimidopropionat in DMF (1 mg/ml) pipettiert und in einer geschlossenen Reaktionskammer 3 h stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit DMF und Ethanol abgespült und die Gläser getrocknet. Für die Peptidimmobilisierung thiolhaltiger Peptide wurde 200 μg Peptid (ca. 400 nMol) in 10 μl DMF gelöst. Aus dieser Lösung wurde jeweils frisch ein Aliquot entnommen und mit dem zehnfachen Volumen Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 6,8) aufgefüllt (ca. 4 mM Peptidlösung). Daraus wurden Tropfen zu 0,3 μl auf die Glasoberfläche aufgetropft und 20 min in einer mit Wasserdampf gesättigten Reaktionskammer stehen gelassen. Durch Öffnen der Kammer trockneten die Tropfen und das Glas wurde 30 min lang in ein Mercaptoethanolbad gelegt. Mercaptoethanol und ungebundenes Peptid wurde durch Spülen mit Ethanol, DMF und Aceton entfernt und die Gläser durch einen Luftstrom gerocknet.
PEG (Polyethylenglycol)-Maleinimidoberflächen wurden nach folgender Vorschrift hergestellt: Zuerst wurden Oberflächen mit Epoxygruppen hergestellt. Auf die mit Epoxygruppen funktionalisierten Gläser wurde 50 μl Bis(3-Aminopropyl)-PEG 800 pipettiert und über Nacht bei 70° C in einer geschlossenen Kammer stehen gelassen. Nach Abkühlen wurden die Gläser mit Aceton gespült und getrocknet. Die Einführung der Maleinimidgruppe und die Peptidimmobilisierung erfolgten oben beschrieben.
Die Peptide wurden in Ammoniumacetat-Puffer auf die Oberfläche manuell aufgetropft. Die Inkubationsbedingungen wurden so gewählt, dass eine Ausbringung mit einem automatisierten Pipettierroboter bis zu nanoliter und subnanoliter Volumina ebenfalls möglich ist. Die kovalente Anbindung an die Oberfläche erfolgte durch eine Michael-Addition der Thiolgruppe an die Doppelbindung des Maleinimids (5). Für eine lokal begrenzte Immobilisierung des Peptids auf der Oberfläche wurde der Tropfen erst eingetrocknet, dann wurden restliche Maleinimidgruppen durch Reaktion mit Mercaptoethanol abreagiert. Zuletzt wurde nicht-gebundenes Peptid durch Waschen im Ultraschallbad mit DMF von der Oberfläche entfernt. 5 stellt schematisch die Oberflächenfunktionalisierung dar. Der linke Bildabschnitt zeigt über ein Thioether immobilisiertes Peptid PY. Nicht mit Peptid behandelte Oberfläche wurde mit Mercaptoethanol abgesättigt. Die Thiolgruppe des Mercaptoethanols addiert an die Doppelbindung des Maleinimids und die Hydroxyethylgruppen bilden wie im rechten Bildabschnitt gezeigt die Endgruppen der Oberfläche.
Die Betrachtung der mit Carboxyfluoreszein (Fluoreszein) markierten Peptide auf den Oberflächen geschah mit einem Epifluoreszenzmikroskop (6). In der unteren Reihe wurde ein mit Fluoreszein markiertes modifiziertes Myc-Tag-Peptid (Fluoreszein-EQKLISEEDLC) immobilisiert, das über ein C-terminales Cystein auf der Oberfläche immobilisiert wurde. Es wurde als Referenzpeptid ausgewählt, weil es in dieser Form bereits mit guter Reinheit hergestellt und gut wasserlöslich war. Wegen der Abwesenheit von hydrolyselabilen Bindungen wurde eine stabile Anbindung auf der Oberfläche erwartet. Die hellen Stellen der 6 entsprechen den peptidfunktionalisierten Bereichen auf der Oberfläche. Jedes Peptid wurde in den oberen beiden Reihen zweimal, jeweils untereinander aufgetragen. Die hellen Gebiete sind sehr homogen und haben eine scharfe Begrenzung. Der Hintergrund ist schwarz, da dort Fluoreszein fehlt.
Zur Bestimmung der Hydrolyse der oberflächengebundenen Peptidester von der Oberfläche, wurden Deckgläser, auf denen die Peptidester PS, PC und PY immobilisiert worden war, in HBS bei 37°C inkubiert. Kurz vor der Inkubation sowie nach 5 h, nach 24 h und nach 48 h wurden nach kurzem Spülen mit Wasser mikroskopische Aufnahmen gemacht (6). In der linken Spalte sind die Peptidester zu den Zeitpunkten 0 h, 5 h, 24 h und 48 h (von oben nach unten) zu sehen, die auf einer Maleinimidoberfläche ausgebracht waren; in der rechten Spalte immobilisierte Peptidester auf PEG-Maleinimidoberfläche zu den Zeitpunkten 0 h, 5 h, 24 h und 72 h. Bei den jeweils unteren drei Punkten in jeder Teilabbildung handelt es sich um ein nicht hydrolysierbares Kontrollpeptid, die oberen beiden Punkte links sind PS, die oberen beiden Punkte in der Mitte sind PC und die oberen beiden Punkte rechts PY. In der linken Spalte sind Aufnahmen eines Deckglases mit Maleinimidoberfläche, in der rechten Spalte mit PEG-Maleinimid dargestellt. Von oben nach unten nimmt jeweils die Inkubationsdauer zu. Deutlich erkennbar ist eine Abnahme der Helligkeit der beiden oberen, rechten Gebiete. Auf diesen Gebieten war PY immobilisiert. Die anderen Gebiete behalten ihre Helligkeit bei. Das bedeutet, dass zum einen sowohl PS als auch PC auf der Oberfläche nicht feststellbar hydrolysieren bzw. von dieser freigesetzt werden. Von der Konstanz der Helligkeit des Kontrollpeptides konnte die Stabilität der Oberflächenbeschichtung in HBS abgeleitet werden.
Mit digitaler Bildverarbeitung konnten die mikroskopischen Aufnahmen bezüglich ihrer Helligkeit quantitativ ausgewertet werden. Es wurde von jedem hellen Gebiet mit oberflächengebundenem Peptid bzw. Ester die mittlere Helligkeit bestimmt. Zur Korrektur von Defokussierung und Photobleichung wurden die Helligkeiten der Ester durch die Helligkeit des Kontrollpeptides der jeweiligen Aufnahme geteilt und diese korrigierten Werte gegen die Inkubationsdauer aufgetragen. Die Resultate dieser Auswertung sind für Maleinimidoberflächen in 7 und für PEG-Maleinimidoberflächen in 8 wiedergegeben. Für Serinester sind Rauten abgebildet, für Cysteinester Quadrate und für Tyrosinester Dreiecke.
Die Hydrolyse auf der Oberfläche war bei allen drei Peptidestervarianten gegenüber der Hydrolyse in Lösung verlangsamt. Dennoch lag die Hydrolysegeschwindigkeit von (PY) im Rahmen des vorgegeben Zeitfensters für einen Einsatz in zellulären Microarrays. Die Helligkeit des Peptidesters PY fällt innerhalb des Inkubationszeitraumes auf etwa 30 % seiner Ausgangshelligkeit ab.
In 6–8 ist zu erkennen, dass sich die Helligkeiten der drei Peptidester PS, PC und PY auf der PEG-Maleimiooberfläche ebenso wie auf der Maleinimidoberfläche unterschiedlich verhalten. Auch hier nimmt die Helligkeit des Peptidesters PY ab, während die anderen beiden Peptidester konstante Helligkeit zeigen. Die Helligkeit des Gebietes mit PY nimmt jedoch nur auf etwa 55 % seiner Ausgangshelligkeit während des Inkubationszeitraums von 70 h ab. Offensichtlich unterscheiden sich die Hydrolysegeschwindigkeit auf verschiedenen Oberflächen und ist auf der PEG-Maleinimidoberfläche langsamer ist als auf der Maleinimidoberfläche. Einschränkend ist zu sagen, dass mit dem gewählten Messprotokoll nicht zwischen Hydrolyse und Freisetzung von Oberfläche unterschieden werden kann. Letztere ist jedoch für die Aufnahme der Verbindungen in Zellen entscheidend.
Die Eignung des Tyrosinesters für die Freisetzung kleiner Moleküle unter Zellkulturbedingungen wurde durch Inkubation eines Deckglases, das über eine Maleinimidoberflächen, die mit PY und Myc-Tag-Peptid als Referenz beschichtet war, mit Zellen getestet. Zellen wurden in RPMI Zellkulturmedium auf das Deckglas angesät und im Brutschrank 24 Stunden inkubiert. Vor und nach der Inkubation wurden Aufnahmen gemacht (9). Die schematische Darstellung unten links zeigt die Belegung: 1: PY, 2: Fluo-Myc-Tag-C. Die Teilabbildung oben links vor der Inkubation, die Teilabbildung oben rechts nach 24 Stunden Inkubation. Die Teilabbildung unten rechts zeigt Zellen, die sowohl auf der PY-Fläche (heller Bereich – rechts) als auch daneben (dunklerer Bereich -links) wachsen.
9 zeigt deutlich eine Abnahme der Helligkeit der PY-Flächen bereits nach 24 Stunden Inkubation. Allerdings verliert auch Fläche, die mit Referenzpeptid funktionalisiert wurde, deutlich an Helligkeit. Die Helligkeitsabnahme des Referenzpeptids ist möglicherweise auf einen Einfluss der Zellen zurückzuführen. Vermutlich spalten Peptidasen das Referenzpeptid und setzen auf diese Weise Fluoreszein von der Oberfläche frei. Allerdings ist die Helligkeitsabnahme des Tyrosinester gebundenen Peptides größer. Die Verträglichkeit der PY-Funktionalisierung ist anhand der Zellmorphologie im funktionalisierten Bereich und daneben deutlich zu erkennen.
Ausführungsbeispiel: Chemolabile Anbindung von Disulfiden Als eine zweite Strategie für eine reversibe Immobilisierung mit kontrollierter Freisetzung der Verbindungen von der Oberfläche bietet sich die Anbindung über Disulfide an. Eine Spaltung der Disulfidbrücken ist mit thiolhaltigen Reagenzien über eine Thiolaustauschreaktionen möglich.
Wie bei der chemolabilen Anbindung über Ester, wird die Strategie mit einer fluoreszenzmarkierten niedermolekularen Verbindung demonstriert. An Rinkamid-Harz wurde Fmoc-Cys(Trt)-OH gebunden. Nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde an die freigesetzte Aminogruppe des Cysteins Fluoreszein gekuppelt und danach die Trityl-Schutzgruppe des Cysteins selektiv entfernt. Für die effiziente Ausbildung von Disulfidbrücken, wurden die Thiolgruppen der Testverbindung mit 2,2'-Dithiopyridin aktiviert. Dabei bildet sich durch Disulfidaustausch ein Disulfid zwischen der Thiolgruppe des Peptides und 2-Thiopyridin. Das Thiopyridin kann durch andere Thiolgruppen substituiert werden. Zur Aktivierung wurde 2,2'-Dithiopyridin (5 eq) in 2,5 % Essigsäure in DCM gelöst, zum trockenen Harz gegeben, 1 h geschüttelt, abgesaugt und mit DMF, Methanol, DCM und Diethylether gewaschen. Um eine quantitative Aktivierung zu erreichen, wurden die Reaktionsschritte einmal wiederholt.
Das MALDI-Spektrum und das HPLC-Chromatogramm zeigten neben dieser Zielverbindung (PTP) (Masse errechnet: 585,5 m/z; Masse gemessen: 587,9 m/z) noch die Bildung disulfidverbrückter homodimere Peptide (PHD) (Masse errechnet: 950,9 m/z; Masse gemessen: 955,3 m/z). Diese Homodimerisierung fand vermutlich bereits auf dem Harz statt, indem noch freie Thiolgruppen mit bereits gebildeten Disulfiden austauschten. Die Struktur der voraktivierten Verbindung sowie des symmetrischen Disulfids sind in 10 unten bzw. oben dargestellt.
Diese Verbindungen wurden ohne weitere Reinigung auf Thioloberflächen aufgetropft. Die Herstellung von Thioloberflächen ging von epoxyfunktionalisierten Oberflächen aus. Zur Herstellung dieser Oberflächen wurden handelsübliche Mikroskopiedeckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm 5 min in 20 % (v/v) wässriger Extranlösung (alkalische Detergenzlösung) im Ultraschallbad gesäubert und mit Milliporewasser gespült. Danach wurden die Deckgläser in Piranha-Lösung (25 ml 30 % wässriges H₂O₂ und 30 ml H₂SO₄) im Ultraschallbad 20 min lang behandelt, um organische Substanzen von der Oberfläche zu entfernen und die Silanolgruppen des Glases zu aktivieren. Nach intensivem Spülen mit bidestilliertem Wasser und Trocknen der Gläser mit Druckluft wurde auf die Oberseite der Gläser 50 μl GOPTS (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan) pipettieri und 5 h in einer geschlossenen Reaktionskammer stehen gelassen. Das GOPTS wurde durch Spülen mit Aceton von der Oberfläche entfernt und die Gläser durch Druckluft getrocknet. Auf die Epoxyoberfläche wurde 60 μl Ethandithiol pipettiert und 45 min stehen gelassen. Das Ethandithiol wurde mit Ethanol heruntergespült und die Gläser getrocknet. Für die Peptidimmobilisierung wurde 200 μg thiolaktiviertes Peptid in 10 μl DMF gelöst, ein Aliquot mit dem zehnfachen Volumen Ammoniumacetatpuffer (10 mM, pH 6,8) aufgefüllt und in Tropfen zu 0,3 μl auf die Oberfläche getropft. Nach 20 min Inkubation in einer mit Wasserdampf gesättigten Reaktionskammer wurden die Gläser mit PBS übergossen und für eine Stunde in ein PBS-Bad gelegt. Nach dem Herausnehmen wurden die Gläser mit bidestilliertem Wasser gespült und getrocknet.
Durch Thiolgruppenaustausch war eine Bindung des Peptids an die Oberfläche über eine Disufidbindung möglich. Der direkte Nachweis einer Disulfidbrücke konnte nicht erbracht werden. Eine Disulfidbrücke scheint aber am plausibelsten. 11 links zeigt die Struktur des immobilisierten Peptids auf der Oberfläche über eine Disulfidverbrückung. Der Rest der Oberfläche trägt freie Thiolgruppen. In der rechten Teilabbildung ist eine epifluoreszenzmikroskopische Aufnahme der immobilisierten Testverbindung dargestellt. Helle Gebiete zeigen mit Fluoreszein markiertes Peptid auf einer Thioloberfläche.
Zur Freisetzung dieser disulfidverbrückten Verbindungen von der Oberfläche wurde Dithioerythritol (DTE) als thiolhaltiges Reagenz eingesetzt. Bei Inkubation des Deckglases in HBS-Puffer, der mit 5 mM DTE versetzt war, nahm die Helligkeit der Flecken deutlich ab. Bei Inkubation in HBS-Puffer blieb die Helligkeit erhalten (12). Dies sprach für eine Spaltung der Disulfidbrücken durch DTE, Ablösung des mit Fluoreszein markierten Peptids von der Oberfläche und einer daraus resultierenden Helligkeitsabnahme. Helle Flecken sind jeweils Peptide, immobilisiert auf einer Thioloberfläche. In der Teilabbildung oben rechts ist eine Aufnahme des gleichen Deckglases wie oben links nach 20 Stunden Inkubation in DTE-haltigem HBS-Puffer zu sehen. Zwischen den Aufnahmen der unteren Deckgläsern liegt eine Inkubationszeit von 20 Stunden in HBS-Puffer. Das rechte Bild ist das spätere.
Aus den dargestellten Ausführungsbeispielen ergeben sich folgende Möglichkeiten für die Anwendung der Testvorrichtung zur Testung einer Vielzahl von Substanzen in zellulären Tests.

1) Bei einer Verwirklichung der Erfindung wird eine Kollektion von Substanzen, die zum einen über eine Funktionalität für eine gerichtete Anbindung dieser Moleküle an Oberflächen verfügen, sowie über eine chemolabile Verknüpfung dieser Funktionalität mit dem Teil des Moleküls verbunden sind, das auf seine biologische Aktivität in zellbiologischen Tests untersucht werden soll, mit Methoden der Synthesechemie hergestellt. Die mikrostrukturierte Immobilisierung auf Oberflächen findet z. B. nach einer der Methoden statt, wie sie in den Ausführungsbeispielen beschrieben sind, wobei typischerweise ein Nanopipettierer zum automatisierten Auspipettieren der Verbindungen eingesetzt wird. Durch die langsame Lösung der Testsubstanzen von der Oberfläche wird ermöglicht, dass Zellen zunächst unter Beibehaltung der chemischen Mikrostrukturierung in einem wässrigen Puffer bzw. in einem geeigneten Zellkulturmedium auf die Oberflächen ausgebracht werden können. Eine Lösung des überwiegenden Teils der Testsubstanzen findet erst nach Herstellung des Kontaktes der Zellen mit den Oberflächen statt. Durch die Miniaturisierung der Testfelder und Einstellung der Dichte der Belegung der Testsubstanzen auf den Oberflächen kann erreicht werden, dass allein im Kontaktbereich mit den Zellen eine biologisch wirksame Konzentration erreicht wird. Die Aufnahme in die Zellen erfolgt je nach physikochemischen und strukturellen Merkmalen der Substanzmoleküle entweder durch Durchtritt der Substanz durch die Plasmamembran oder endozytotisch in Vesikeln. Dies kann entweder ein pinocytotischer Mechanismus sein, bei dem keine molekulare Interaktion der Subtanzen mit Molekülen der Zelloberfläche erfolgt oder aber ein rezeptorvermittelter endozytotischer Vorgang. Substanzmoleküle, die sich von der Oberfläche lösen und nicht von den Zellen aufgenommen werden, sondern statt dessen in das umgebene Medium/Puffer diffundieren, werden auf eine Konzentration verdünnt, in der sie keine biologische Wirkung mehr entfalten können. Eine mögliche biologische Aktivität der Moleküle auf die Zellen wird mit einer geeigneten Methode (z. B. Fluoreszenzmikroskopie) untersucht.
2) Bei einer weiteren Verwirklichung der Erfindung werden Moleküle und insbesondere Biomoleküle wie Antikörper, Peptide oder rekombinante Proteine mit einem Linkermolekül chemisch derivatisiert. Im Gegensatz zu den in Anwendungsbeispiel 1 beschriebenen Substanzen, wird das Linkermolekül also erst nachträglich am zu testenden Molekül angebracht. Dieses Linkermolekül verfügt über eine chemische Funktionalität, die eine chemisch gerichtete Immobilisierung dieses Moleküls auf einer Oberfläche erlaubt, sowie über eine chemolabile Bindung, die eine Freisetzung des Biomoleküls von der Oberfläche ermöglicht. Der Teil des Linkermoleküls, über den die Derivatisierung des Biomoleküls erfolgt, verbleibt am Biomolekül, während der andere Teil auf der Oberfläche verbleibt. Die Spaltung des Linkers erfolgt ausreichend langsam, dass ein Aussähen von Zellen auf diese Oberflächen in wässrigen Puffern unter Erhalt der Mikrostrukturierung möglich ist. Infolge der Spaltung des Linkers stehen die Moleküle für die Aufnahme in darüber befindlichen Zellen bereit. Die Biomoleküle werden über einen ihrer Beschaffenheit entsprechenden Prozess (s. o.) in die Zellen aufgenommen. Eine mögliche biologische Aktivität dieser Biomoleküle auf die Zellen wird mit geeigneten Methoden, z. B. Fluoreszenzmikroskopie, untersucht.
3) Bei einer Modifikation der in 1 und 2 beschriebenen Anwendungsbeispiele, wird mit den auf den Trägern immobilisierten Testsubstanzen zunächst ein Nachweis mit löslichen Probenmolekülen geführt, bevor in einem zweiten Schritt Zellen auf die Probenträger gegeben werden. Auf diese Weise kann mit einem Microarray sowohl ein Bindungsassay mit isolierten Molekülen als auch ein zellulärer Assay durchgeführt werden.
4) Bei einer dritten Verwirklichung der Erfindung werden die Testsubstanzen typischerweise entsprechend der in den Ausführungsbeispielen gegebenen Methoden chemolabil auf der Oberfläche von Testkavitäten immobilisiert. Diese Testkavitäten sind physikalisch voneinander getrennt, d. h. bei Befüllung mit einem Volumen, das kleiner ist als das Volumen der Kavitäten, ist ein Austausch von Flüssigkeit zwischen einzelnen Kavitäten nicht möglich. Nach Befüllung der Kavitäten mit einer wässrigen Testlösung werden die Testsubstanzen langsam in diese Testlösung abgegeben. In bevorzugten Verwirklichungen werden sich in dieser Testlösung ebenfalls Zellen befinden. Durch Realisierungen dieser Art kann durch die chemolabile Oberflächenanbindung eine verzögerte Freisetzung von Substanzen erreicht werden, die sonst zu Beginn des Testes, durch die jeweilige Art der Durchführung bedingt, zwischen benachbarten Testkavitäten ausgetauscht werden könnten. Auf diese Weise können Probenträger, z. B. Nanotiterplatten, ohne Rücksichtnahme auf einen Übertritt von Substanzen zwischen einzelnen Testkavitäten zunächst in einem Schritt mit einer Zellsuspension befällt werden und erst in einem zweiten Schritt das Flüssigkeitsvolumen so weit reduziert werden, dass die Trennung zwischen den Kavitäten wirksam wird. Die Arbeitsschritte, die zur Befüllung aller Kavitäten mit Zellen erforderlich sind, werden dadurch von der Zahl der Kavitäten auf zwei reduziert (gemeinsames Befüllen aller Kavitäten und Absaugen des überschüssigen Zellvolumens).
5) Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Testung von Peptiden bzw. Proteinen auf ihre antigenen Eigenschaften. Diese Peptide bzw. Proteine werden typischerweise gemäß den in den Ausführungsbeispielen genannten Methoden auf der Oberfläche von geeigneten Trägern mikrostrukturiert immobilisiert. Anschliessend werden antigenpräsentierende Zellen auf die Oberflächen gegeben. Die sich lösenden Peptide bzw. Proteine werden von diesen aufgenommen und bei geeigneten strukturellen Voraussetzungen intrazellulär prozessiert und auf der Zelloberfläche der antigenpräsentierenden Zellen im Komplex mit sogenannten MHC-Molekülen präsentiert. Anschließend werden T-Lymphozyten (T-Zellen) auf diese Träger gegeben. Bei Kontakt der T-Lymphozyten mit den peptidbeladenen antigenpräsentierenden Zellen findet eine Aktivierung der T-Lymphozyten statt, sofern die T-Lymphozyten einen zu den jeweiligen MHC-Peptidkomplexen passenden T-Zellrezeptor tragen bzw. die Peptide/Proteine so in den antigenpräsentierenden Zellen prozessiert wurden, dass eine ausreichende Präsentation erfolgte. Die Aktivierung der T-Zellen kann z. B. nach Fixierung und Immunofluoreszenzfärbung gegen Transkriptionsfaktoren bestimmt werden, die infolge der Aktivierung vom Zytoplasma in den Zellkern übertreten.

Claims

Eine Testvorrichtung und Methoden zur Testung einer Vielzahl von Substanzen in zellulären Tests, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Testsubstanzen auf planaren Oberflächen (1) in Form von Flecken (2) durch eine kovalente Verknüpfung mit der Oberfläche aufgebracht werden, wobei der Durchmesser der Substanzflecken vorzugsweise zwischen 100 und 500 μm liegt und der Abstand von Substanzflecken voneinander vorzugsweise zwischen 100 und 500 μm liegt und die Flecken nicht physikalisch, d. h. durch Stege, die eine Mischung von Flüssigkeit zwischen Testfeldern verhindern, voneinander getrennt sind. Die Testsubstanzen sind derart beschaffen, dass sie in der genannten Reihenfolge über eine Funktionalität zu einer gerichteten (regioselektiven) Anbindung an die Oberfläche verfügen (3), über eine chemolabile Gruppierung (4) sowie über einen Teil des Moleküls, der auf seine biologische Aktivität untersucht werden soll (6). Durch Spaltung der chemolabilen Bindung unter Bedingungen, die mit dem Wachstum von Zellkulturzellen (9) kompatibel sind, wird die Substanz freigesetzt wobei der Teil des Moleküls, über den die Anbindung auf die Oberfläche erfolgt ist, auf der Oberfläche verbleibt. Durch die Kofunktionalisierung mit Substanzen, die das Zellwachstum fördern (8) bzw. unterbinden (7) kann das Wachstum von Zellen auf die Bereiche eingeschränkt werden, in denen sich Testsubstanzen befinden.
Eine Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen, die auf ihre biologische Aktivität untersucht werden sollen, mit einem Trägermolekül (5a) versehen werden, das die Aufnahme dieser Substanz weitgehend unabhängig von den physikochemischen Eigenschaften der Substanzen in Zellen ermöglicht. Die relative Anordnung des Trägermoleküls und des Teils, der auf seine biologische Aktivität untersucht werden soll, kann unterschiedlich gewählt werden.
Eine Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen, die auf ihre biologische Aktivität untersucht werden sollen, zusätzlich mit einer Gruppierung (5b), vorzugsweise einem Fluoreszenzfarbstoff, versehen sind, der es ermöglicht, die Ablösung der Substanzen von der Oberfläche und die Aufnahme in Zellen mit einem geeigneten Detektionssystem, vorzugsweise ein konfokales Fluoreszenzmikroskop (11), zu bestimmen.
Eine Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen, die auf ihre biologische Aktivität untersucht werden sollen, zusätzlich mit einer Gruppierung (5b), vorzugsweise einem Fluoreszenzfarbstoff versehen sind, der es ermöglicht, die Ablösung der Substanzen von der Oberfläche und die Aufnahme in Zellen mit einem geeigneten Detektionssystem, vorzugsweise ein konfokales Fluoreszenzmikroskop (11), zu bestimmen. Die Reportergruppe ist vorzugsweise an dem Teil des Moleküls angebracht, der die Aufnahme der Moleküle in die Zellen vermittelt.
Eine Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chemolabilen Gruppierung um eine Esterbindung, vorzugsweise eine aromatische Esterbindung handelt.
Eine Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolysegeschwindigkeit des Esters durch Substituenten am Aromaten beeinflusst wird.
Eine Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chemolabilen Gruppierung um einen Ester zwischen der Hydroxygruppe der Aminosäure Tyrosin und der Carboxygruppe der Aminosäure Cystein handelt, wobei die Thiolgruppe des Cysteins zur Anbindung der Verbindung an eine Oberfläche dient, die vorzugsweise über reaktive Maleinimidgruppen verfügt. Der Teil der Testsubstanz, der auf seine biologische Aktivität untersucht werden soll, ist vorzugsweise an die alpha-Aminogruppe des Tyrosins geknüpft.
Eine Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chemolabilen Gruppierung um eine Disulfidbrücke handelt und die Ablösung der Substanz von der Oberfläche dadurch erfolgt, dass durch Zugabe einer Substanz, die über Thiolgruppen verfügt, ein Disulfidaustausch erfolgt, über den die Testsubstanz von der Oberfläche freigesetzt wird.
Eine Methode zur Testung einer Vielzahl von Substanzen auf ihre biologische Aktivität, die mit einer Testvorrichtung nach Ansprüchen 1–5 und 6 oder 7, oder 8 durchgeführt wird, die aus folgenden Schritten besteht: (1) Herstellung einer Testvorrichtung entsprechend der genannten Ansprüche, (2) in Kontaktbringen der Testvorrichtung mit Zellkulturzellen in einem geeigneten Medium, (3) Kultivierung der Zellen auf der Testvorrichtung, (4) Behandlung der Zellen auf der Testvorrichtung in einer Weise, die es erlaubt, eine mögliche Aktivität der Testsubstanzen zu erfassen, (5) Auslesung des Aktivierungszustandes der Zellen.
Eine Methode zur Testung einer Vielzahl von Substanzen auf eine biologische Aktivität nach Ansprüchen 1–5 und 6 oder 7, oder 8, wobei die Art der chemolabilen Anbindung derart gewählt ist, dass die Freisetzung von dem Substrat hinreichend langsam erfolgt, dass mit dem gleichen Substrat bzw. mit einer gleichen Substratpräparation sowohl ein Bindungsnachweis mit löslichen Probenmolekülen in vitro als auch eine Übertragung in aufgebrachte Zellen nach der in Anspruch 9 beschriebenen Weise möglich ist. Bei Verwendung des gleichen Substrates wird zunächst der Bindungsnachweis mit gelösten Probenmolekülen durchgeführt, dann die Probenmoleküle durch eine geeignete Methode von dem Substrat entfernt und im Anschluss werden die Zellen für die zellbiologische Testung auf das Substrat aufgebracht. Der Nachweis der Bindung der gelösten Probenmoleküle erfolgt vorzugsweise durch Verwendung fluoreszent markierter Probenmoleküle oder mit Immunfluoreszenz.
Eine Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1–5 und 6 oder 7, oder 8, jedoch dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche des Substrates, in denen unterschiedlichen Substanzen ausgebracht werden, physikalisch durch Stege voneinander getrennt sind, d. h. die Substanzen sich in Mikrokavitäten befinden.
Eine Methode zur Durchführung einer Testung von Substanzen auf ihre biologische Aktivität mit einer Testvorrichtung nach Anspruch 11, wobei (1) in einem Arbeitsschritt alle Testfelder der Testvorrichtung mit einer Zellsuspension gefüllt werden, (2) das Niveau der Flüssigkeit so weit gesenkt wird, dass die physikalischen Trennung zwischen den einzelnen Testfeldern wirksam werden, (3) die Testsubstanzen durch Spaltung der chemolabilen Bindungen in die Testkavitäten freigesetzt werden und (4) die Aktivität der Substanzen auf die Zellen in geeigneter Weise ausgelesen wird.