KR20070052972A - 아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 제조된자기조립단분자층 및 상기 자기조립단분자층을 이용하여제조되는 단백질 칩 - Google Patents

아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 제조된자기조립단분자층 및 상기 자기조립단분자층을 이용하여제조되는 단백질 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 이용하여 유리나 금 기질 등의 고체기질에 단분자 층으로 제조되는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 및 그를 이용하여 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층 표면에 단백질이 단백질 외부에 있는 이온성 혹은 수소결합성 작용기의 비가역적인 이온/분자인식에 의해 고정화되어, 모든 종류의 단백질을 단백질의 변성 없이 용액상에서 직접적으로 단분자층의 표면에 고정화되어 제조되는 단백질 칩 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112005066532371-PAT00001
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 및 C6H5 은 페닐기로 정의됨)).
[화학식 2]
Figure 112005066532371-PAT00002
(식 중, R1, R'1, R2, R'2, R3, R'3, R4, R'4, R5, R'5, R6, R'6, R7, R'7, R8 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 및 C6H5 은 페닐기로 정의됨)).
아미노캘릭스아렌 유도체, 단백질 칩

Description

아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 제조된 자기조립단분자층 및 상기 자기조립단분자층을 이용하여 제조되는 단백질 칩{SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS PREPARED BY USING A AMINOCALIXARENE DERIVATIVES, AND PROTEIN CHIP USING THE SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS}
도 1 은 논문(Langmuir,1996년, Vol 12, pp 5338-5342)에 발표된 방법에 따라 아민 슬라이드 글래스를 제조하는 모식도이다.
도 2 는 제조된 아민 슬라이드 글래스와 아미노캘릭스아렌 유도체와의 화학결합에 의해 제조되는 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층의 모식도이다.
도 3 은 아미노캘릭스아렌 유도체로서 화학식 1 과 화학식 2 의 유도체 중 티올기가 부착된 유도체가 금 기질 위에서 형성하는 자기조립 단분자층의 제조과정을 보여주는 모식도이다.
도 4 는 본 발명에서 제안한 단백질 칩을 보여주는 모식도로서, 아미노캘릭스아렌 유도체가 단분자층으로 자기조립되어있는 금 혹은 유리슬라이드 등의 고체기질 표면에 아무런 화학적 변화를 가하지 않은 무변성 단백질 용액을 도포하면, 단백질이 암모늄 이온인식 및 구아니딘기 등의 수소결합 가능한 작용기의 분자인식에 의해 고체기질의 표면에 자발적으로 고정화되어 이론적 최고밀도로 빈자리 없이 단백질이 고정화되어 형성되는 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩을 제조하는 신기술 을 보여주고 있으며 실제 실험결과는 도 6 에 나타낸 바와 같다.
도 5 는 본 발명에서 제안한 단백질 고정화에 의한 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩 제조 중 단백질의 고정화시에 아미노캘릭스아렌 유도체의 내부에 단백질의 암모늄기 또는 알기닌 등의 수소결합이 가능한 말단기가 인식될 때, 나머지 빈자리를 암모늄이온 등의 양이온이 채워서 단백질의 고정화가 진행되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 6 은 실시예 3에 따라 항체 단백질 고정화시, NH4 +의 이온농도에 따라 단백질의 고정화 속도가 영향을 받는다는 것을 보여주는 실제 실험결과이며, 본 발명이 NH4 + 이온 200 ~ 400 mM 에서 최고밀도로, 그리고 10-30 분 정도의 단시간 안에 초고속으로 단백질이 고정화되어 단백질칩을 제조할 수 있는 신기술임을 보여주는 결과이다. 고정화된 단백질의 밀도는 형광부착된 항원을 결합시켜 확인하였으며, 도 7 에서 보이는 이론적 최고밀도의 형광감도와 비교하여 이론적 최고밀도에 가깝게 단백질 고정화가 진행된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 7 은 본 발명에서 실시예 3 에 따라 자발적인 단백질 고정화를 수행한 결과인 도 6 에 기재된 결과를 고정화된 단백질 이론적 최고밀도의 결과와 비교 분석하기 위하여, 최고밀도의 단백질과 결합되는 양의 2 배, 1 배 및 0.5 배의 형광부착된 항원을 동일한 공간에 도포한 뒤 말려서 측정한 형광감도이다. 도 6 에서 암모늄이온 400 mM 을 이용하여 1 시간에 측정된 결과가 1 배의 형광 부착된 항원 을 사용한 경우의 형광감도와 거의 동일한 수준으로 나타나서, 초고속 그리고 고밀도로 단백질 고정화가 진행되었다는 것을 보여 주는 실제실험 결과이다.
도 8 은 본 발명의 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층에서의 단백질 고정화가 단백질의 외부에 노출된 라이신 등의 말단기에 존재하는 아민, 즉 암모늄이온과 단백질의 N-말단, 즉 아민말단기 등에 부착된 암모늄이온이 비가역적으로 이온인식되어 궁극적으로 단백질을 고정화시킨다는 것을 보여주기 위해, 아민작용기가 부착된 아민화합물과 단백질 간의 경쟁반응을 진행하여 아민화합물의 농도에 따라 단백질의 고정화가 방해받는다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 9 는 실시예 5 에 따라 진행된 실험결과이며, 본 발명의 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층에서 단백질을 고정화시킬 때, 라이신, 벤질아민 등의 암모늄기가 부착된 화합물은 고정화되는 단백질과 이온인식을 경쟁적으로 수행하여 실제 단백질의 고정화 속도를 감소시키는 반면, 완충용액에서 암모늄이온이 아닌 아민상태로 존재하는 아닐린과 같은 방향족아민은 아미노캘릭스아렌 내부에 인식되지 않아 경쟁반응을 진행하지 않는다는 것을 보여주는 경쟁반응 결과이다. 수소결합을 잘하는 알기닌 말단에 부착된 구아니딘 작용기를 이용하여 이러한 경쟁반응을 수행하는 경우에도 단백질 고정화 속도가 감소되는 결과를 얻을 수 있어서, 본 발명에서 제안된 단백질 단분자층 제조기술은 암모늄이온, 수소결합 등의 이온인식/분자인식 등이 함께 작용하여 무변성 단백질을 아미노캘릭스아렌 단분자층(단백질칩 기판)에 고정화한 단백질 단분자층을 형성하는 것임을 보여준다.
도 10 은 형광판독을 위하여, 항체 단백질과 결합되는 항원 단백질에 Cy-5( 텔레켐,미국) 형광물질을 부착시키는 모식도이다.
본 발명은 아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하여 제조된 자기조립단분자층, 이에 이온인식 혹은 분자인식을 이용하여 단백질을 단분자층으로 고정화하는 방법 및 그를 이용하여 제조된 단백질 칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 이용하여 유리나 금 기질 등의 고체기질에 단분자 층으로 제조하는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 그의 표면에 항원, 항체 등의 단백질, 특히 10 kD 이상의 분자량을 가진 단백질을 분자인식에 의해 단분자층의 표면에 고밀도로 고정화하는 방법 및 상기 단백질의 고정화에 의해 제조되는 단백질 칩(protein chip)에 관한 것이다.
생명현상의 발생 및 분화는 단백질-단백질, 단백질-리간드(혹은 약물), 항원-항체, 효소-기질 등의 기능적인 상호작용에 의해서 조절되어진다. 따라서 특정 단백질이나 리간드와 특이적으로 상호 작용하는 생체분자의 기능이나 역할을 밝히는 연구는 생명과학, 보건 및 의료분야 등에서 주된 과제가 되고 있다. 이러한 다양한 단백질들을 하나의 고체기질, 즉 칩 상에 고정화하고, 단백질-단백질 혹은 단백질-리간드 간의 상호작용을 측정하기 위해, 다수의 단백질을 동일 칩 상에 고정화한 단백질 칩이 많이 연구되고 있다.　
특히, 효소, 항원, 항체 등을 고체기질에 고정화하는 방법은 단백질을 이용 하여 질병을 판단하는 진단 키트 등, 다양한 단백질을 사용하여 제품화하는 분야에서 가장 기초적인 기반기술이 된다. 예를 들어 진단에서 많이 사용되고 있는 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunoassay, EIA)은 특정한 단백질 혹은 병원(病原)이 되는 특이 단백질을 분석하기 위하여 항체를 플라스틱으로 제조된 96-마이크로타이터 웰(96 microtiter well)의 바닥에 물리흡착시키거나 혹은 항체 외부에 존재하는 다양한 작용기를 플라스틱의 표면에 존재하는 작용기와 화학결합시키는 방식에 의해 항체를 고정화시켜 제품을 제조하고, 여기에 혈청 내에 존재하는 특정 항원을 반응시킨 후, 이차항체-효소 결합체를 이용하여 발색 및 형광분석 등으로 항원의 농도를 측정하여 진단하는 방식으로서, 상기 방식을 이용한 다양한 질병 진단용 키트가 시중에서 판매되고 있다.　
이러한 물리흡착이나 화학결합 방식 외에도 스트렙토에버딘이라는 단백질을 바이오틴이 화학결합된 고체기질 상에 바이오틴과 스트렙토에버딘간의 결합에 의해 고정화시킨 후, 스트렙토에버딘에 존재하는 바이오틴 부착위치에 바이오틴이 결합된 항체 등의 단백질을 바이오틴-스트렙토에버딘간의 결합력에 의해 고정화시키는 방식 등이 알려져 있다.
기존에 사용하던 물리흡착 방식이나 화학결합 방식, 및 최근에 사용되기 시작한 바이오틴-스트렙토에버딘 결합력을 이용한 방식 등의 단백질 고정화 기술에서 나타나고 있는 문제점은 다음과 같다.　
1. 고정화 밀도 : 단백질 고정화 기술에서 가장 많은 노력이 기울여지고 있는 분야이나 현재까지도 고정화를 위해 사용되는 다양한 종류의 단백질들이 용액상 에서 도포된 전체공간을 빈 공간 없이 완전히 단백질로 덮을 정도의 고밀도로 고정화된, 즉 단백질 단분자층 수준의 고정화가 가능한 단백질 칩 제조기술이 거의 발표되지 않고 있다. 표면의 고정화된 단백질의 밀도가 완전한 수준의 단분자층을 이루는 밀도(항체인 경우 1.1-1.4 ㎍/cm2)가 되지 않으면, 여러 가지의 단백질이 고정화되어 있는 고체기질의 표면 중 단백질로 덮이지 않아 노출된 고체기질의 표면, 즉 빈 공간에는 정해진 항원이 항체에 고정화되지 않고 고체기질이 그대로 노출된 표면에 비특이적인 고정화가 진행되는 현상 또는 고정화된 항체의 양이 적어서 결합된 항원의 양이 적게 나타나고 결과적으로 미량 단백질 분석 혹은 정량적인 판독이 어려워지는 문제점 등이 나타나고 있다.
2. 재현성 : 단백질을 고정화하여 진단 및 연구 등에 사용되는 제품화를 하는데 가장 중요한 기술로서, 수종-수십종의 단백질을 고정화했을 때 고정화된 단백질이 동일한 수준의 고정화 밀도 및 활성을 나타내어야 정확한 진단결과를 획득할 수 있다. 하지만, 현재 사용되고 있는 단백질 고정화 기술은　고체 기질 상에서 물리흡착이나 화학결합, 혹은 바이오틴-스트렙토에버딘 결합방식 등을 사용하는 것으로서, 대부분이 단백질과 특정 작용기와의 반응을 필요로 하고, 여러 번의 불완전한 반응을 진행하면 고정화되는 단백질이 동일한 밀도로 동일한 활성을 유지할 수가 없게 되어, 동일한 농도의 항원 단백질과 반응하여도 동일한 결과를 보이지 못하는 문제점을 가지고 있다. 즉, 기존 기술로 단백질을 고정화하여 제조된 단백질 칩은 제품화가 가능한 수준의 재현성을 확보하는데 많은 문제점을 가지고 있다.
3. 초고속 고정화 : 고정화시에는 용액상에서 고체기질의 표면으로 고정화가 진행되는데 용액상에 단백질이 녹아 있는 경우 시간이 흐름에 따라 용액상에서 단백질의 활성이 점진적으로 감소하는 경향을 나타낸다. 하지만 고정화된 후에는 활성감소가 거의 없기 때문에 고정화시의 활성 감소를 최소화하기 위하여 1 시간 이내에 고정화를 완전하게 수행하는 초고속 고정화가 가능한 고체기질의 개발이 필요하나 아직까지 개발된 예가 거의 없다.
4. 극미량 단백질 분석기술 : 현재까지 알려진 단백질 고정화 기술을 이용하여 분석가능한 항원 단백질 등의 농도가 수 ng/㎖ 수준에 머물고 있어서, 그 이하 농도로 존재하는 단백질에 대한 정량적인 분석이 가능한 진단용 제품이 개발되지 못하고 있다. 수 ng/㎖ 이하 농도의 단백질도 정량적으로 분석이 가능한 기술이 개발되면, 기존기술로는 분석이 불가능하던 새로운 암표지 단백질 등의 발굴이 가능하며, 동시에 암표지 단백질의 농도가 미량일 때에도 측정이 정량적으로 진행되어 조기진단 및 질병예방을 가능하게 하는 신개념의 진단용 단백질 칩 개발이 가능할 것으로 예측되고 있으나, 현재까지는 개발되지 못하고 있다.
5. 변성 없는 단백질 고정화 : 단백질 고정화 밀도, 즉 고정화되는 단백질의 개수가 일정한 수치 내에서 동일하게 유지되는 재현성을 확보하고, 동일한 단백질의 개수가 고정화된 경우에도 단백질의 활성이 일정오차 내인 동일한 수준에서 고정화를 진행하려면 제어가 가능한 용액상에서 고정화가 진행되어야 하고, 이를 위해서는 단백질의 활성에 문제를 일으킬 가능성이 있는 화학결합 단계가 불필요한 단백질이 용액상에서 아무런 화학적 조작 없이 직접 고정화되는 기술의 개발이 필수적이다. 그러나, 본 연구진이 수년 전에 발표한 크라운화합물을 이용한 기술 외에는 아직 무변성 단백질 고정화 기술이 개발되지 못하고 있어서, 작용기 부착을 필요로 하지 않는 단백질 고정화 기술의 개발이 필요하다.
6. 장기보존 기술 : 단백질은 3 내지 6 개월 정도의 장기간 보존시에는 활성이 상당폭 감소되는데, 그 감소폭이 일정하지 않아서 제품화에 많은 문제점을 가지고 있다. 이러한 장기보존시에도 동일한 진단결과를 얻기 위해서, 최근 단백질칩 연구회 등에서 제안되는 기술은 주로 단백질을 빈 공간 없이 고밀도로 고정화하여, 단백질이 저밀도로 고정화될 때 혹은 물리흡착으로 고정화될 때 나타나는 고체기질에 비특이적 인력에 의해 고정화된 단백질이 표면으로 끌리게 되는 현상, 즉 단백질의 형태를 유지하기가 어려워져서 나타나는 단백질 활성위치의 변성에 의한 활성감소를 최소화하는 기술개발, 즉 빈 공간 없는 고밀도 고정화가 가능한 단백질 칩 제조기술의 개발이 필요하다는데 연구방향이 일치되고 있다.
본 발명의 목적은 기존의 다양한 단백질 고정화 방법에서 발생하는 문제점 중 제품화를 어렵게 하는 제품의 재현성 문제를 해결하기 위하여, 단백질 고정화 밀도의 균일성 확보 및 동일 활성유지를 위한 빈 공간 없는 고밀도 고정화기술을 제공하는 것이다. 추가로 용액상에서 고정화가 진행될 때 용액상에서 시간이 지남에 따라 단백질의 활성이 감소되어 고정화 후에도 단백질의 활성이 동일하지 않아서 나타나는 판독결과 불균일성 문제를 해결하는 기술을 제공하는 것이다. 추가로 단백질의 활성을 나타내는 활성위치는 주로 수소결합에 의해 유지되는데 화학결합시 수소결합력보다 강력한 고체기질과의 화학결합력에 의해 활성위치 변성이 일어나 나타나는 활성감소에 의한 활성 불균일성 문제를 해결하고, 동시에 극미량의 단백질도 정량적으로 분석이 가능하게 하는 신개념의 무변성 단백질 고정화기술을 제공하는 것이며, 상기 기술들이 접목되어 제품화를 가능하게 하는 재현성 있는 단백질칩을 개발하는데 필수적인 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 그를 이용하여 제조되는 단백질 칩 및 관련기술을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 목적은 상기화합물을 아민 작용기가 부착된 유리기질(아민 슬라이드 글래스), 실리콘웨이퍼, 용융실리카(fused silica) 혹은 금 기질 등에 부착함으로서 모든 종류의 단백질이 아무런 가공과정 없이 10 ~ 800 mM 농도의 양이온이 포함된 용액상에서 30 분 내지 1 시간 정도의 짧은 시간 내에 초고속으로, 그리고 고밀도로 고체기질에 고정화하여 단백질 단분자층을 제조할 수 있는 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층을 제공하는 것이다.
추가로 본 발명의 목적은 모든 종류의 단백질이 아무런 변성과정 없이 빽빽하게 고밀도 및 초고속으로 고정화되는 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩과 그의 제조기술을 제공하는 것이다.
단백질이 아무런 가공과정 없이 30 분 내지 1 시간 이내에 초고속으로 고정화되는 자기조립단분자층 제조에 필수적인 아미노캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1 혹은 2 의 구조를 가지는 화합물이다.
Figure 112005066532371-PAT00003
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기로 정의됨)).
Figure 112005066532371-PAT00004
(식 중, R1, R'1, R2, R'2, R3, R'3, R4, R'4, R5, R'5, R6, R'6, R7, R'7, R8 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기로 정의됨)).
본 발명의 화학식 1 및 2 의 화합물은 하기 화학식 3의 물질을 출발물질로 하여 합성할 수 있다.
Figure 112005066532371-PAT00005
상기 화학식 3 의 테트라아미노캘릭스[4]아렌은 캘릭스[4]아렌 (calix[4]- arene)을 하기 참고문헌 1 의 방법에 따라 테트라니트로캘릭스[4]아렌으로 변환한 뒤 환원반응에 의해서 합성한다 [참고문헌 1: Journal of Organic Chemistry, 1990년 Vol 55, pp 5639-5643; Journal of Organic Chemistry, 1979년 Vol 44, pp 1233-1238].
본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2 의 화합물을 금 기질 또는 아민 작용기등의 화학결합이 가능한 작용기가 부착된 유리, 실리콘웨이퍼, 용융석영 등의 고체기질에 부착하여 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 및 이에 모든 종류의 단백질을 고밀도로 고정화시킨 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩 제조기술을 제공하는 것이다.
도 1 은 고체기질에 아미노캘릭스아렌 유도체를 부착하기 위해 다양한 작용기를 고체기질에 도입하는 방법 중 하나로서 아민 작용기를 유리 슬라이드 글래스에 도입하는 방법을 보여주고 있으며, 이를 제조하는 구체적인 방법은 다음과 같 다.　　
아민 작용기가 부착된 유리기질(유리 슬라이드 글래스)은 논문(Langmuir, 1997년 Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir,1996년 Vol 12, pp 5338-5342)에 발표된 방법에 따라 실라놀(-Si-OH) 작용기가 표면에 풍부한 유리기질의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가진 유리기질(아민 슬라이드 글래스, 혹은 아민 칩)형태로 제조하였다.
도 2 는 본 발명에서 제안된, 단백질을 고정화하여 단백질 단분자층을 제조하는데 사용되는 고체기질 중 하나인 아민슬라이드 글래스에 화학식 1, 화학식 2 의 유도체 중 알데히드 작용기를 가진 화합물을 부착하는 방법을 보여주고 있다. 화학식 1, 화학식 2 의 화합물을 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 클로로포름과 THF의 혼합용액(CHCl3 : THF = 9 : 1)에 아민 작용기가 부착된 유리기질, 즉 아민 슬라이드 글래스를 넣어둔다. 1 내지 5 시간 뒤 클로로포름과 아세톤, 에탄올 순으로 세척한 후 건조시키면, 도 2 와 같은 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층이 완성된다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다. 여기에 사용되는 유리기질은 일반적으로 시판되는 모든 종류의 슬라이드 글래스 혹은 유리이다. 단백질과 같은 생체물질은 대부분 PH가 7 내지 8 사이의 완충용액에 녹여서 제조하기 때문에, 이러한 용도로 사용할 때에는 아미노캘릭스아렌 유도체가 아민 슬라이드 글래스와 이민결합된 상태로 사용하여도 문제가 없다는 연구결과를 확인하였다. 장기간 사용을 요하는 제품개발시에는 유도체가 고체기질 에 결합된 이민결합을 잘 알려진 환원반응인 BH3/THF, 혹은 NaBH4 가 1-3 % 로 녹아있는 THF 혹은 메탄올 용매에서 1-5 분정도 담구어 이민을 아민작용기로 환원시키는 반응을 이용하여 고체기질과 아민결합된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하여 사용한다.
도 3 은 금 기질 위에서 아미노캘릭스아렌 유도체가 자기조립단분자층으로 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸다. 금 기질에 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다.　　
클로로포름 (CHCl3) 등의 유기용매에 화학식 1 또는 2 의 화합물 중 티올 부착된 화합물을 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 금 기질을 상기 제조된 용액에 넣어 1 내지 5 시간 동안 담근 후 꺼내어 이를 클로로포름 및 아세톤 그리고 물로 각각 세척한 후 건조시키면 도 3 과 같은 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층이 완성된다. 여기에 사용되는 금 기질은 어떤 종류의 금 박막이라도 가능하나 일반적으로 유리, 용융 석영(fused silica), 실리콘 웨이퍼, 플라스틱 기질 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti) 등을 2 내지 10 nm 로 진공증착 시킨 후, 금을 50 내지 200 nm 두께로 진공증착시킨 기질이다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라니아 용액 (Piranha solution : conc.H2SO2 : 30% H2O2 =3:1)에 1 분 정도 담근 뒤, 정제수에서 씻은 후, 질소를 불어주며 말려서 사용하는 것이 일반적이다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다.
추가로, 본 발명은 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층에 단백질의 암모늄기 혹은 알기닌의 구아니딘기의 하나 혹은 그 이상을 이온/분자 인식시켜, 다중 이온/분자 인식에 의한 무변성 단백질 고정화 방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 고정화 방식은 단백질 고정화를 이용한 모든 종류의 진단용 바이오칩, 연구용 단백질 칩 등을 제조하는, 즉 모든 종류의 단백질 고정화를 이용한 제품의 제조에 기반이 되는 기술로서 현재까지는 세계적으로 비슷한 연구결과조차도 발표된 적이 없는 발명이다.
도 4 는 본 발명에서 개발된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 항체 단백질이 자발적인 이온/분자 인식에 의해 고정화된 뒤, 고정화된 항체에 Cy-5 형광물질이 부착된 Cy-5-항원결합체(conjuate)를 항원-항체 반응을 통하여 결합시킴으로서, 고정화된 항체 단백질의 밀도와 활성을 확인하는 모식도이다.
도 5 는 도 4 의 모식도에서 진행되는 단백질의 고정화시, 아미노캘릭스아렌 유도체의 내부에 단백질의 암모늄기 또는 알기닌 등의 수소결합이 가능한 말단기가 인식될 때, 나머지 빈자리를 암모늄이온 등의 양이온이 채워서 단백질의 고정화가 진행되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 6 에서 나타내는 결과는 도 4 의 모식도에서 나타낸 바와 같이 C-반응성 단백질(C-reactive protein) (CRP)의 항원(Ag) 및 항체(Ab)를 사용하여 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 고정화를 진행한 실제 연구 결과이다. 이 결과는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에의 단백질의 고정화 속도 및 고정화 밀도, 그리고 고정화된 단백질의 활성까지도 동시에 보여주는 분석결과이다. 단백질의 고 정화는 NH4 + 이온 및 동일한 농도의 항체 단백질[표면에 고정화될 이론적 밀도(1.4 ㎍/cm2)의 3 배, 45 ㎍/㎖ 농도를 각각 3 ㎕씩 도포함]을 사용하여 진행하였다. 그리고, 고정화 시간을 10분, 30분 및 1시간으로 하여, 상기 시간동안 항체 단백질을 고정화하였다. 고정화된 항체단백질과 결합하기에 충분한 양의 형광부착된 항원단백질과 항체단백질이 항원-항체 반응에 의해 1:1 로 결합되게하여 고정화된 항체의 밀도분석을 수행하였다. 형광감도 분석은 스캐너(GSI lite, 미국)를 이용하여 결과를 확인하였다. 분석된 결과에 따르면 NH4 + 이온 0-100 mM 을 이용하여 고정화한 경우에는, 항체단백질 고정화가 1 시간 정도 진행되었을 때 이론적 최대치 형광의 40 % 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 반면, NH4 + 이온 400 mM 농도에서 항체단백질을 고정화한 실험 결과에서는, 1 시간에 도 7 에 나타나 있는 이론적 최대치 형광과 거의 동일한 수준을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 400 mM 농도에서는 30 분 정도의 고정화에서도 이론적 최대치 형광의 약 65% 수준이 나타나며, 이는 30 분에서 1 시간 정도의 단시간 내에 단백질 단분자층 수준으로의 단백질의 고정화가 고밀도로 이루어진다는 것을 보여주는 실제 실험결과이다. 또한, 상기 결과들은 단백질의 작용기들이 인식된 후 나머지 공간을 채워주는 이온의 농도가 높을수록 고정화가 빠르게 진행된다는 것을 보여주는 결과로서, 도 5에 제시된 모식도에서의 이온농도의 효과를 확인시켜주는 실제 연구결과이 다. 다만, 800 mM 농도의 결과는 400 mM 보다 더 낮은 수준으로 나타나는데, 이와 관련하여 고이온 농도에서는 항체 단백질의 활성 위치에 변성이 생겨 활성을 잃어버리는 경우가 많다는 것이 잘 알려진 사실이어서, 도 6에 나타난 800 mM의 결과는 고정화는 빠르게 고밀도로 진행되었지만 고정화된 단백질의 활성이 상당히 감소된 결과로 보인다. 한편, 본 실험에서는 항체 단백질을 아무런 변성 없이 그대로 사용하였다.
추가로, 본 발명은 무변성 단백질을 사용하여, 초고속으로, 높은 재현성으로, 그리고 최고밀도 수준으로 단백질 단분자층(즉, 단백질 칩)을 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 생성하여 제조되는 단백질칩 및 그의 제조 기술에 관한 것이다.
도 7 은 최대치로 고정화된 항체 (1.4 ㎍/cm2)와 항원(35 ng/0.0314 cm2, 직경 2 mm 건상 스팟(dry spot), 결합밀도는 1.1 ㎍/cm2)을 1:1 로 결합시킨 후, 동일한 양의 형광부착된 항원을 고체기질에 도포한 뒤 말려서 형광측정한 것과, 각각 그것의 2 배 및 1/2 배를 도포하여 형광밀도를 분석한 실제 실험 결과이다. 상기 실험결과 중 1 배 및 2 배의 양을 도포한 경우, 형광부착된 항원의 밝기는 도 6 에서 NH4 + 400 mM 를 사용하면서 1 시간 고정화시킨 항체에 대하여 형광부착된 항원이 나타내는 결과와 거의 동일한 반면, 1/2 배를 도포한 경우에는 형광이 절반으로 줄어있음을 보여준다.
도 8 은 항체 단백질의 고정화가 실제로 이온 인식을 통하여 일어나는지를 확인하기 위해, 암모늄 작용기를 가진 화합물들을 고정화 단계에서 첨가하여, 고정화 밀도에 미치는 영향을 분석하는 과정을 보여주는 경쟁반응의 모식도이다. PH 7에서 아민 화합물은 100 % 암모늄 이온형태로 존재하며, 이러한 아민 화합물을 적정량 넣어주면 단백질의 고정화가 방해받을 것이라는 것을 보여주는 모식도이다.
도 9 는 도 8 의 모식도에 따라 실제로 진행된 연구결과를 보여주고 있다. 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 암모늄 작용기를 가진 벤질아민(benzylamine), 암모늄 말단기를 가진 라이신(lysine), 그리고 아민작용기는 있으나 PH 7정도의 완충용액에서 암모늄이온으로 바뀌지 않는 아민 작용기를 가진 아닐린(aniline)을 10 mM 첨가하여 진행시킨 항체단백질 고정화 반응의 실제연구결과이다. 경쟁반응의 결과와 비교하기 위하여 아무런 아민화합물도 첨가하지 않은 채 고정화하는 실험도 함께 진행하였다(대조). 고정화된 항체 단백질과 1:1 수준으로 형광부착된 항원단백질을 결합시켜 고정화된 항체 단백질의 밀도를 정량적으로 분석하였다. 라이신과 벤질아민을 10 mM 첨가하여 고정화를 진행한 경우에는, 대조의 고정화에 비하여 항체 단백질 고정화가 1/4 수준밖에 진행되지 않아서 단백질의 고정화가 암모늄 작용기를 가진 화합물에 의해 심각한 방해를 받았음을 보여주고 있다. 구아니딘 말단기를 가진 알기닌을 첨가한 경우에도 고정화를 방해하는 결과가 나타났다. 이에 비해 고정화 조건에서는 암모늄으로 변하지 않는 아민 작용기를 가진 아닐린을 첨가한 경우에는, 아무것도 첨가하지 않은 경우와 비슷한 고정화 밀도를 보여주고 있어서, 아닐린은 고정화 과정을 전혀 방해 하지 않음을 확인할 수 있다. 이러한 결과들은 항체 단백질 고정화시에 실제로 단백질의 외부에 있는 암모늄 작용기 등이 실제로 아미노캘릭스아렌 유도체들의 내부에 이온/분자인식되어 고정화가 진행된다는 것을 보여주는 실제 실험결과이다.
도 10 은 형광판독을 위해 항체 단백질과 결합되는 항원 단백질에 Cy-5(텔리켐,미국) 형광물질을 부착하는 것을 보여주는 모식도이다.
추가로, 본 발명은 1 시간 이내의 단시간 내에 단백질의 고밀도 고정화가 가능한 초고속 고정화 기술, 단백질에 아무런 조작을 가하지 않은 단백질 그 자체, 즉 무변성 단백질 고정화를 가능하게 하는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 그의 표면에 단백질을 고정화하는 기술, 및 이를 이용하여 제조된 단백질 칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1
도 2의 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 1, 화학식 2의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 알데히드 말단기가 부착된 유도체를 0.1-5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 도 1과 같이 제조된 아민작용기가 부착된 슬라이드글래스(아민칩)를 상기 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어, 이를 클로로포름, 아세톤, 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면, 도 2 에 나타나 있는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층이 제조된다.
실시예 2
도 3 의 금 기질에서의 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조
CHCl3 등의 유기용매에 화학식 1, 화학식 2 의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 티올 말단기를 가진 유도체를 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 도 3과 같이, 금 기질을 상기 제조된 용액에 1 내지 24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤, 및 물로 각각 세척한 후 건조시키면 도 3에 나타나 있는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층이 제조된다. 여기에서 사용되는 금 기질은 여러 가지 형태로 사용될 수 있으나, 일반적으로 유리, 용융석영(fused silica), 실리콘웨이퍼, 플라스틱 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti) 등을 5 내지 20 nm 로 진공증착시킨 후 금을 100 내지 300 nm 두께로 진공증착 시킨 기질이다. 이와 같이 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라니아(piranha) 용액 (진한황산:과산화수소수 30% = 3:1로 섞은 혼합용액)에 10 초 내지 1 분 정도 담근 후 물로 세척하고, 질소교류하에 건조시켜 곧바로 사용한다. 단분자층의 생성은 표면반사적외선분광분석법(FTIR-ERS)을 이용하여 분석한다.
실시예 3
도 4의 분자인식에 의한 무변성 단백질 고정화시 암모늄 이온농도의 영향
암모늄 이온을 농도별로 포함한 항체 단백질의 고정화
실시예 2 에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 즉 아미노캘릭스아렌 유도체 칩 위에 단백질을 고정화시키는데 사용되는 세척용액, 블록킹 용액의 농도, 조성 등은 표 1 과 같다. 항체 단백질의 고정화를 위해 사용되는 고정화 용액으로서 암모늄 이온이 농도별로 포함된 고정화 용액 및 형광 부착된 항원을 반응시킬 때 사용하는 반응 용액은 표 2 와 같다. 먼저 단백질의 고정화를 위하여 2 mm 직경으로 구멍이 뚫린 웰 플라스틱(well plastic)을 칩 위에 부착시켜 사용하였다. 동일한 농도(이론적 고정화 최대치의 3 배농도 135 ng/0.0314 cm2)의 CRP 항체 단백질 및 각각 상이한 농도의 암모늄 이온이 포함된 표 2의 고정화 용액 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 각각 마이크로파이펫을 이용하여 3 ㎕ 씩 칩 위에 도포한 후, 습도가 유지되는 항온조에서 각각 10 분, 30 분 및 1 시간 동안 상온에서 고정화하였다. 1 시간 이상의 고정화에서 고정화되는 단백질의 밀도는 1 시간에서의 결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 항체 단백질이 도포되어 고정화된 스팟(spot) 이외의 부분을 블로킹(blocking)해 주기 위하여 표 1의 블로킹 용액에 담구는데, 칩 위에 부착된 웰 플라스틱은 탈착시킨 후 상온에서 30분 동안 담궈 두었다. 블로킹한 후 칩을 세척하기 위하여 표 1 의 세척용액 1 에 2 분 동안 담궈 둔 후, 표 1의 세척용액 2 에 2 분 동안 담궈 두었다가 꺼내어 건조시켰다.
형광부착된 항원 단백질과의 반응
아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 고정화된 항체 단백질 단분자층의 항체와 결합되는 형광부착된 CRP 항원 단백질을 반응시키는 방법은 다음과 같다. 표 2 에 기재되어 있는 형광 부착된 항원 용액(항원농도1.4㎍/㎖) 15 ㎖ 에 단백질을 고정화한 아미노캘릭스아렌 유도체 칩을 담궈서, 습도가 유지되는 항온조에서 1 시간 동안 37 oC를 유지하며 결합반응을 진행하였다. 항원-항체 반응이 끝난 후, 칩을 표 1 의 세척 용액 1 에 2 분 동안 담궈 두었다가, 세척 용액 2 에 2 분 동안 담근 후에 건조시켜 형광스캐너 (GSI Lumonics,USA) 를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 6 과 같다. 도 6 의 결과에 따르면 암모늄 이온농도(NH4 +)가 0 ~ 100 mM 정도의 저농도 수준으로 포함된 고정화 용액에서 고정화시에는, 1 시간 고정화하였을 때 단백질 고정화 밀도가 이론적 최대치 1 배양의 40 % 정도 수준으로서 약한 고정화 밀도를 나타낸다. 이에 비해 암모늄 이온농도(NH4 +)가 400 mM 정도인 경우에는 이론적 최대치의 90 % 수준으로 고정화 밀도를 나타내었으며, 고정화 시간 또한 30 분에서 1 시간 정도의 짧은 시간에서도 매우 고밀도로 단백질 고정화가 진행된다. 암모늄 이온농도가 800 mM 인 경우에는 이온 농도가 너무 높아서, 잘 알려진대로 항체 단백질의 활성 위치가 변성을 일으켜 활성 감소가 나 타나게 되므로, 단백질의 고정화는 400 mM 인 경우와 동일하게 최고밀도로 진행되었지만 고정화된 항체의 활성이 감소된 관계로 형광부착된 항원과의 결합반응이 400 mM 농도를 이용하였을 때보다 낮은 수준으로 나타나서, 실제로 부착된 형광부착된 항원은 이론적 최고치의 50 % 수준으로 나타나고 있다.
세척용액 및 블록킹 용액
1xPBS buffer (ＮaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g )/ DW 1000㎖
블록킹 용액 탈지분유 2.5g + 1xPBS　 50㎖ = 50㎖
세척용액1 트윈20 300㎕ + 1xPBS 1000㎖ =1000㎖
세척용액2 (ＮaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g )/ DW 1000㎖
고정화 용액 및 형광 부착된 항원용액
NH4 + 농도와 NH4 +Cl 첨가한 양 (90 %) 글리세롤 CRP Ab 300 ㎍/㎖ 증류수 (DW) 총부피
고정화용액1 0 mM 0 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 28.5 ㎕ 50 ㎕
고정화용액2 25 mM (0.5 M) 2.5 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 26 ㎕ 50 ㎕
고정화용액3 50 mM (0.5 M) 5 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 23.5 ㎕ 50 ㎕
고정화용액4 100 mM (0.5 M) 10 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 18.5 ㎕ 50 ㎕
고정화용액5 200 mM (0.5 M) 20 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 8.5 ㎕ 50 ㎕
고정화용액6 400 mM (4 M) 5 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 23.5 ㎕ 50 ㎕
고정화용액7 800 mM (4 M) 10 ㎕ 14 ㎕ 7.5 ㎕ 18.5 ㎕ 50 ㎕
형광부착된 항원 용액 항원농도 1.4 ㎍/㎖ = (5 % 우유 300 ㎕ + Cy5-CRP항원(818 ㎍/㎖) 27 ㎕ + 1xPBS 14.7 ㎖ = 15 ㎖)
실시예 4
단백질 고정화 최대밀도 분석을 위한 형광분석기술
도 7 의 실험결과는 이론적 최고 밀도로 고정화된 CRP 항체 단백질과 1:1 로 결합하는데 필요한 형광부착된 항원 단백질 필요량의 2 배, 1 배 또는 0.5 배를 동일한 면적의 유리슬라이드에 도포한 뒤 말려서 측정한 형광감도이다. 이 분석은 실시예 3 에서 진행된 항체단백질의 고정화 밀도가 이론적 최대치와 얼마나 접근하는지, 그리고 고정화된 항체 단백질의 활성이 어느 수준인지를 분석하기 위한 비교데이터를 얻기 위해 진행되었다.
아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층 표면의 1 cm2 의 면적에 CRP 항체단백질로서 이론적 고정화 최대치의 1 배를 덮는데 필요한 1.4 ㎍/cm2 의 항체 (CRP Ab 160 kD/mol) 와 1:1로 결합하는데 필요한 형광부착된 항원(CRP Ag 115 kD/mol)의 양(1.1 ㎍/cm2)의 0.5 배, 1 배, 및 2 배를 도포한 뒤 말려서 직접 형광스캐너(GSI Lumonics,USA) 로 형광감도를 분석하였다. 형광부착된 항원 1 ㎕ 를 도포하면 직경 2 mm의 원형 스팟(spot)이 생기며 이 면적은 0.0314 cm2 이므로, 35 ㎍/ml 의 형광부착된 항원 1 ㎕를 도포하면 1.1 ㎍/cm2 의 표면밀도로 항원의 양이 존재하는 직경 2 mm의 측정점이 생겨서, 1 배 양의 형광부착된 항원이 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 고정화된 항체 단백질과 1:1 비율로 결합된 결과와 동일한 개수의 형광부착된 항원이 물리흡착되어 있는 측정점(spot)이 생성되어 스캐너를 이용하여 형광감도를 측정한 결과가 도 7 의 결과이며, 이 결과를 도 6 에서 얻어진 항원-항체 반응을 통하여 얻어진 결과와 비교분석할 수 있게 된다. 2 배와 0.5 배는 각각 두 배 농도 및 0.5 배 농도의 형광부착된 항원을 동일한 방법으로 도포하여 결과를 얻었다. 이론적 최대치 1 배인 경우에는 도 6 에서 암모늄 이온 400 mM 을 이용하여 1 시간 고정화하고 형광부착된 항원과 반응시켜 얻어진 형광감도와 거의 동일한 수준으로 나타났기 때문에, 도 6 의 결과에서 항체단백질 고정화 밀도가 이론적 최대치와 비슷한 수준으로 단분자층을 이루며, 동시에 항원과 1:1 결합을 수행할만큼 활성이 뛰어나다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 5
단백질 고정화시 암모늄 작용기 화합물과의 경쟁반응을 통한 고정화 속도 감소측정
도 8 의 모식도에 나타낸 아미노캘릭스아렌 칩 위에서 아민 작용기 화합물과의 경쟁적인 단백질의 고정화는 실시예 3 의 암모늄 이온이 포함된 항체단백질 고정화 방법과 동일하게 400 mM 의 암모늄이온을 사용하여 1 시간 고정화하는 방식으로 진행하였으며, 사용한 아민 작용기 화합물이 포함된 샘플용액의 농도, 조성 등은 표 3 과 같다. 아민화합물이 없는 경우(대조)와 10 mM 의 아닐린(aniline), 벤질아민(benzylamine), 라이신(lysine) 등이 고정화용 항체 단백질과 혼합되어있는 경쟁용액 1, 2, 3 및 4 를 각각 3 ㎕ 씩 도포하여 1 시간 동안 고정화를 진행한 뒤, 실시예 3 의 항체단백질 고정화 후 처리방법과 동일하게 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 씻고 블로킹(blocking)을 진행하고, 표 2 의 형광부착된 항원용액을 이용하여 실시예 3 의 형광부착된 항원과의 반응과 동일하게 항체-항원 반응을 진행하였으며, 동일하게 처리하여 형광스캐너(GSI Lumonics,USA)를 이용하여 분석하였다. 결과는 도 9 와 같다. 아민화합물이 각각 10 mM 포함된 항체 단백질 고정화 조건에서 아민 작용기가 암모늄 작용기로 바뀌지 못하는 아닐린을 이용한 경우에는 항체 단백질 고정화 속도에 거의 영향을 미치지 못하여 아민화합물이 없는 경우와 동일한 수준의 항체 단백질 고정화 밀도를 나타냈다. 반면에 실험 조건에서 아민 작용기가 암모늄기로 존재하는 벤질아민 또는 라이신을 이용한 경우에는 형광의 급격한 감소가 나타나는데, 이는 아민화합물들이 항체 단백질과 경쟁적으로 아미노캘릭스아렌 유도체의 내부에 이온/분자인식되어 결과적으로 항체 단백질의 고정화를 방해하게 됨에 따라 고정화가 상당히 낮은 밀도로 이루어진 결과이다. 또한, 이는 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에서의 단백질의 고정화가 아민작용기(용액상에서 암모늄기)가 있는 부분이 비가역적인 이온/분자인식에 의해 고정화됨으로서 이루어진다는 것을 증명하는 결과이다.
10 mM 아민 작용기 화합물이 포함된 고정화 용액
아민화합물 10 mM 포함 아민 화합물 넣어준 양 (90 %) 글리세롤 CRP Ab 300 ㎍/㎖ 증류수 (DW) (4 M) NH4 +Cl 총부피
경쟁용액1 대조 0 ㎕ 28 ㎕ 15 ㎕ 47 ㎕ 10 ㎕ 100 ㎕
경쟁용액2 아닐린 (100 mM) 10 ㎕ 28 ㎕ 15 ㎕ 37 ㎕ 10 ㎕ 100 ㎕
경쟁용액3 벤질아민 (100 mM) 10 ㎕ 28 ㎕ 15 ㎕ 37 ㎕ 10 ㎕ 100 ㎕
경쟁용액4 라이신 (100 mM) 10 ㎕ 28 ㎕ 15 ㎕ 37 ㎕ 10 ㎕ 100 ㎕
추가로, 본 발명에서 제안된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에서의 단백질의 고정화는 분자/이온인식에 의해 단백질을 변성없이, 30분에서 1시간 정도의 짧은 시간에 이론적 최고밀도로, 즉 초고속/고밀도로 단분자층의 표면에 고정화가 진행되어 단백질 칩을 제작할 수 있는 무변성 단백질 고정화 기술이다.
실시예 6
도 10의 항원 단백질에 형광부착을 위한 Cy5(형광물질)와 항원의 결합반응
텔레켐사(미국)에서 제공되는 형광물질인 Cy-5를 제공된 단백질과의 결합반응 조건에 따라 다음과 같이 반응시켜 형광부착된 항원 단백질을 제조하였다.
탄산완충용액(Carbonate buffer)에 희석되어 있는 Cy-5 형광물질을 325 ㎕ 준비하여 tube에 넣었다. 상기 tube에 1 X PBS 완충용액에 희석되어 있는 CRP 항원 단백질(2.86 mg/ml) 175 ㎕ 를 넣은 후, 30 분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에 반응물은 칼럼정제(Column 정제, SephadexTM G-50)한 후, 텔레켐사에서 제공된 분석방법에 따라 단백질의 아미드작용기와 형광물질의 방향족 흡수밴드 비를 분석하여 각 단백질 당 부착된 형광의 수를 측정하여, 각 단백질 당 1 개 수준의 형광이 부착된 것을 확인한 후, 항체 단백질과의 결합반응에 사용하였다. 고정화된 항체 단백질과 결합된 형광부착된 항원단백질의 양은 형광 스캐너 (GSI Lumonics,USA)를 이용하여 측정한 후 형광분석을 통하여 고정화된 단백질의 밀도를 확인하였다.
본 발명은 세계적으로 일반화되어 사용되어지고 있는 기존의 화학결합, 물리흡착, 바이오틴-스트렙토에버딘 등을 이용하여 단백질을 고정화하여 단백질 칩을 제작하는 방식과 완전히 차별화된 기술로서, 10-800 mM 농도의 양이온을 포함한 수용액 상에서 무변성 단백질을 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 도포하기만 하면 초고속일 뿐 아니라 비가역적으로 단백질이 이온/분자 인식을 통해 단분자층 표 면에 고정화되며, 동시에 최고밀도의 고정화를 가능하게 하는 신기술이다. 추가로, 언제나 최고밀도로 단백질이 표면에 고정화되기 때문에 고정화된 단백질의 양, 즉 밀도가 균일하고, 초고속으로 고정화되어 단백질의 활성이 균일하게 유지되어 높은 재현성이 확보된 단백질 칩 제조 신기술에 관한 것이다.
본 발명에서 제안된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 이용하여 제조되는 단백질 단분자층, 즉 단백질칩은 기존의 다양한 단백질 고정화 방법에서 발생하는 고정화 밀도의 불균일성 및 활성감소 문제, 및 느린 속도로 고정화될 때 용액상에 오랜 시간 존재한 단백질의 활성 감소에 의한 고정화 단백질 활성의 불균일성 문제 등을 모두 해결할 수 있는 신기술이다. 추가로, 단백질의 활성을 나타내는 활성위치는 주로 수소결합에 의해 유지되며, 알데히드 칩 등을 이용하여 진행되는 화학결합시 수소결합력보다 강력한 고체기질과의 화학결합력에 의해 활성위치의 변성이 나타나 고정화된 단백질의 활성이 불규칙적으로 감소되는 문제가 나타나는데, 본 발명은 활성위치를 유지하는 수소결합력과 비슷한 힘인 분자/이온 인식을 고정화에 이용함으로써 상기 문제점의 해결을 가능하게 하는 신기술이다.
추가로, 본 발명은 단백질 고정화용 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층, 및 그를 이용한 단백질 칩 및 그의 제조방법을 제공하여 기존의 단백질 칩 제품화에서 가장 문제시되었던 단백질 칩의 재현성 문제를 완전히 해결한 단백질 칩 제조기술을 제공한다.
추가로, 본 발명은 다양한 화학결합을 통하여 화학식 1 또는 2 의 아미노캘릭스아렌 유도체를 아민, 알코올, 티올 등의 작용기가 부착된 유리기질(아민 슬라 이드 글래스), 실리콘웨이퍼, 용융실리카 (fused silica), 및 금 기질에 부착하여, 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층이 부착된 다양한 고체기질을 제공함으로서, 분자량에 관계없이 모든 종류의 단백질이 아무런 가공과정 없이 용액상에서 30 분~1 시간 정도의 짧은 시간 내에 초고속으로 고정화되는 다양한 고체기질과 그를 이용하여 제조된 단백질 단분자층 및 단백질 단분자층 제조기술을 제공한다.
추가로, 본 발명은 도 6 의 이온농도에 따른 고정화나 도 9 의 경쟁반응 등을 이용하여, 이온농도를 증가시켜 고정화 속도를 더욱 빠르게 하거나, 아민화합물을 일부 포함시켜 고정화 속도를 최적 상태로 조절가능한 세계 최초의 고정화 속도조절 기능을 가진 단백질 고정화용 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제공하여 10000(10kD) 이상의 다양한 크기 및 형태를 가진 단백질을 최적의 조건에서 최고 활성을 유지한 채 고정화를 진행하여 제조되는 단백질 칩 및 그의 제조기술을 제공한다.
추가로, 본 발명에서는 고정화 최고밀도를 이루는데 필요한 단백질 양의 3 배 수준의 소량의 단백질만으로도 초고속으로 단백질 칩의 제조가 가능하여, 단백질 칩 제조공정의 단순화 및 저가로 단백질 칩을 제조할 수 있는 단백질 칩 제조기술을 제공한다.
특히, 실시예에 따르면 고정화된 단백질은 이론적 최대수준의 고밀도를 유지하며 항원과 결합하는 활성도 높게 유지되어, 최고 감도를 보이는 진단용 단백질 칩을 제조할 수 있는 기술을 제공한다. 이러한 기술은 다양한 종류의 단백질 칩, 진단용 항체칩, 바이오칩 제조 신기술 개발 등에 응용될 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 아미노캘릭스아렌 유도체를 고체기질에 부착하여 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층:
    [화학식 1]
    Figure 112005066532371-PAT00006
    (식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨));
    [화학식 2]
    Figure 112005066532371-PAT00007
    (식 중, R1, R'1, R2, R'2, R3, R'3, R4, R'4, R5, R'5, R6, R'6, R7, R'7, R8 및 R'8 은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3,-CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군으로부터 선택된다(n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH2, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)).
  2. 제 1 항에 있어서, 아민, 알코올, 티올 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기가 부착되어 있는 유리, 실리콘웨이퍼 및 용융석영으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질에, 이민, 아민, 아미드, 우레아, 우레탄, 에스테르, 티오에테르, 티오에스테르, 티오우레탄, 에테르, 및 카보네이트 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학결합을 통해 부착하여 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 알데히드 작용기가 말단기에 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 아민 작용기가 부착되어 있는 유리, 실리콘웨이퍼 및 용융석영으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체기질에, 이민결합 및 이를 환원한 아민결합을 통해 부착하여 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층.
  4. 제 1 항에 있어서, 화학식 1 또는 화학식 2의 아미노캘릭스아렌 유도체 중 티올기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 금 기질에 부착하여 제조한 아미노캘 릭스아렌 유도체 단분자층.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층에 단백질을 고정화하여 제조한 단백질 칩.
  6. 제 5 항에 있어서, 단백질이 항체인 단백질 칩.
  7. 제 5 항에 있어서, 비가역적인 분자/이온 인식에 의해 자발적인 단백질 고정화에 의해 제조한 단백질 칩.
  8. 제 5 항에 있어서, 고정화되는 단백질의 분자량이 10 kD 이상인 단백질 칩.
  9. 제 5 항에 있어서, 양이온 10 mM 내지 800 mM 의 농도에서 제조한 단백질 칩.
  10. 제 9 항에 있어서, 양이온이 NH4 +인 단백질 칩.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009066867A1 (en) * 2007-11-19 2009-05-28 Biometrix Technology Inc Novel method of designing dna probe chip for room temperature hybridization and the dna probe chip
KR20150111015A (ko) * 2014-03-24 2015-10-05 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100698763B1 (ko) * 2000-10-23 2007-03-26 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 (자기조립)단분자층, 이를 이용한올리고ｄｎａ 고정화방법 및 이에 의해 제조된 ｄｎａ칩

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009066867A1 (en) * 2007-11-19 2009-05-28 Biometrix Technology Inc Novel method of designing dna probe chip for room temperature hybridization and the dna probe chip
KR100924243B1 (ko) * 2007-11-19 2009-10-29 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술
US10450600B2 (en) 2007-11-19 2019-10-22 Biometrix Technology Inc. Method of designing DNA probe chip for room temperature hybridization and the DNA probe chip
KR20150111015A (ko) * 2014-03-24 2015-10-05 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩

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