JP3280404B2 - イムノセンソリートランスデューサー - Google Patents
イムノセンソリートランスデューサーInfo
- Publication number
- JP3280404B2 JP3280404B2 JP29717191A JP29717191A JP3280404B2 JP 3280404 B2 JP3280404 B2 JP 3280404B2 JP 29717191 A JP29717191 A JP 29717191A JP 29717191 A JP29717191 A JP 29717191A JP 3280404 B2 JP3280404 B2 JP 3280404B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- residue
- group
- alkyl derivative
- sulfur
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/553—Metal or metal coated
Description
【０００１】本発明はイムノセンソリートランスデュー
サーおよびその製造方法に関する。
サーおよびその製造方法に関する。
【０００２】イムノアッセイの原理は、リガンド、たと
えば抗原（Ａｇ）またはハプテン（Ｈａｐ）の、抗リガ
ンド、たとえば抗体（Ａｂ）による選択的認識に基づく
ものである。通常、実際に用いられるイムノアッセイ
は、いわゆる競合的アッセイであるかまたはサンドイッ
チアッセイである。両操作とも、標識されたリガンドま
たは抗リガンドを用いて行われる。このいわゆる標識の
種類によって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）等に分かれる。
えば抗原（Ａｇ）またはハプテン（Ｈａｐ）の、抗リガ
ンド、たとえば抗体（Ａｂ）による選択的認識に基づく
ものである。通常、実際に用いられるイムノアッセイ
は、いわゆる競合的アッセイであるかまたはサンドイッ
チアッセイである。両操作とも、標識されたリガンドま
たは抗リガンドを用いて行われる。このいわゆる標識の
種類によって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）等に分かれる。
【０００３】すなわち、たとえばサンドイッチアッセイ
の場合は、まず抗原に対する第一の抗体が固相（いわゆ
る「被覆試験管」法では試験管、いわゆる「被覆ビー
ズ」法ではビーズ）上に固定化される。サンプル抗原お
よび標識された第二の抗体が互いにまた固相と、インキ
ュベートされる。この方法で、あらかじめ固定化された
第一の抗体によって形成された表面上の結合部位は、抗
原と第二の抗体によって満たされる。ついで、サンプル
抗原濃度の測定が、表面における標識の濃度の測定、す
なわち、ＥＩＡ法の場合は酵素基質、ＦＩＡ法の場合は
蛍光特性、ＲＩＡ法の場合は放射性照射線の測定を介し
て行われる。以上述べた操作はいずれも時間のかかる洗
浄およびインキュベート工程を必要とする。
の場合は、まず抗原に対する第一の抗体が固相（いわゆ
る「被覆試験管」法では試験管、いわゆる「被覆ビー
ズ」法ではビーズ）上に固定化される。サンプル抗原お
よび標識された第二の抗体が互いにまた固相と、インキ
ュベートされる。この方法で、あらかじめ固定化された
第一の抗体によって形成された表面上の結合部位は、抗
原と第二の抗体によって満たされる。ついで、サンプル
抗原濃度の測定が、表面における標識の濃度の測定、す
なわち、ＥＩＡ法の場合は酵素基質、ＦＩＡ法の場合は
蛍光特性、ＲＩＡ法の場合は放射性照射線の測定を介し
て行われる。以上述べた操作はいずれも時間のかかる洗
浄およびインキュベート工程を必要とする。
【０００４】したがって、最近の文献には、標識（放射
性同位元素、酵素、蛍光染料）の助けを借りないでＡｇ
−Ａｂ複合体の検出を可能にする測定技術の提案が次第
に多くなってきている。これらの操作は、イムノセンシ
ングという語で包括される。イムノセンサーは、一般的
に、物理的シグナルのトランスデューサーに厳密に連結
されるかまたはそれに統合される免疫学的に認識可能な
要素によって特徴づけられる。免疫学的に認識可能な要
素の役目は分析される溶液からの関心被検物質の選択的
認識および結合である。この要素の、それに伴う物理的
変化（たとえば、重量の増加、層厚の増加、または誘電
率の変化等）がトランスデューサーによって記録され、
シグナルに変換される。
性同位元素、酵素、蛍光染料）の助けを借りないでＡｇ
−Ａｂ複合体の検出を可能にする測定技術の提案が次第
に多くなってきている。これらの操作は、イムノセンシ
ングという語で包括される。イムノセンサーは、一般的
に、物理的シグナルのトランスデューサーに厳密に連結
されるかまたはそれに統合される免疫学的に認識可能な
要素によって特徴づけられる。免疫学的に認識可能な要
素の役目は分析される溶液からの関心被検物質の選択的
認識および結合である。この要素の、それに伴う物理的
変化（たとえば、重量の増加、層厚の増加、または誘電
率の変化等）がトランスデューサーによって記録され、
シグナルに変換される。
【０００５】これらのトランスデューサーの基盤になる
物理的測定操作は、たとえば表面プラズモレゾナンス
（Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍ．１８，３９５−３９９，１９７
６；Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ
３，７９−８８，１９８２／８３）、グリッドカップリ
ング法（Ａｎａｌｙｔ．Ｌｅｔｔ．１９，２０５−２１
６，１９８６；Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔ
ｏｒｓ １５，２７３−２８４，１９８８）、電位差測
定法（Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．１２５−１３２，１９７
７；Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １３６，９３
−９９，１９８２）、伝導度測定法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ａｃｔａ ６０，２３７４−２３７９，１９８８）
または圧電重量法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５５，２３３
３−２３３６，１９８３）である。グリッドカップリン
グ法の場合（誘電トランスデューサー表面）を除き、他
のすべての測定操作においては、免疫学的に認識可能な
要素は金属トランスデューサー表面に適用されねばなら
ない。
物理的測定操作は、たとえば表面プラズモレゾナンス
（Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍ．１８，３９５−３９９，１９７
６；Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ
３，７９−８８，１９８２／８３）、グリッドカップリ
ング法（Ａｎａｌｙｔ．Ｌｅｔｔ．１９，２０５−２１
６，１９８６；Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔ
ｏｒｓ １５，２７３−２８４，１９８８）、電位差測
定法（Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．１２５−１３２，１９７
７；Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １３６，９３
−９９，１９８２）、伝導度測定法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ａｃｔａ ６０，２３７４−２３７９，１９８８）
または圧電重量法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５５，２３３
３−２３３６，１９８３）である。グリッドカップリン
グ法の場合（誘電トランスデューサー表面）を除き、他
のすべての測定操作においては、免疫学的に認識可能な
要素は金属トランスデューサー表面に適用されねばなら
ない。
【０００６】金は、その腐食に対する抵抗性および、表
面プラズモレゾナンスにおいてはその光学的性質によ
り、好ましい金属である。上掲の測定技術はすべてよく
開発され、特性づけられているが、その相当するトラン
スデューサー表面に適当な型で選択的認識可能な要素を
適用する技術を欠いている。これらの操作はすべて標識
を使用せず、したがって、増幅効果を適用できる可能性
もないので、これらの要素には、きわめて高度な要求が
寄せられことになる。最も重要な要求は被検物質の結合
に関する高い活性と選択性である。これらの２つの要求
の適当な遂行は、免疫学的成分（たとえば、Ａｂ，Ａ
ｇ）の「被覆試験管」や「被覆ビーズ」法に用いられる
ような物理的吸着では、不可能である。この、とくに疎
水性表面に起こる吸着には、以下のような重大な欠点が
ある。 1) 吸着後、蛋白質は、表面上にランダムな方向性で存
在する。したがって、各蛋白分子の活性ドメイン（エピ
トープ、抗原結合部位）は一部、複合体の形成から遮蔽
されてしまう。 2) このような表面では強い疎水性相互作用によって、
蛋白質が変性される。したがって、唯一の被検物質に対
する表面の選択性はもはや保証されない。 3) 吸着による表面の不完全な被覆が、表面の強い吸着
力により、付随する蛋白質をも表面に吸着させることに
なる。この非特異的吸着により、間接的検出の場合のみ
でなく直接的検出の場合でも、試験結果はかなり不正確
になる。
面プラズモレゾナンスにおいてはその光学的性質によ
り、好ましい金属である。上掲の測定技術はすべてよく
開発され、特性づけられているが、その相当するトラン
スデューサー表面に適当な型で選択的認識可能な要素を
適用する技術を欠いている。これらの操作はすべて標識
を使用せず、したがって、増幅効果を適用できる可能性
もないので、これらの要素には、きわめて高度な要求が
寄せられことになる。最も重要な要求は被検物質の結合
に関する高い活性と選択性である。これらの２つの要求
の適当な遂行は、免疫学的成分（たとえば、Ａｂ，Ａ
ｇ）の「被覆試験管」や「被覆ビーズ」法に用いられる
ような物理的吸着では、不可能である。この、とくに疎
水性表面に起こる吸着には、以下のような重大な欠点が
ある。 1) 吸着後、蛋白質は、表面上にランダムな方向性で存
在する。したがって、各蛋白分子の活性ドメイン（エピ
トープ、抗原結合部位）は一部、複合体の形成から遮蔽
されてしまう。 2) このような表面では強い疎水性相互作用によって、
蛋白質が変性される。したがって、唯一の被検物質に対
する表面の選択性はもはや保証されない。 3) 吸着による表面の不完全な被覆が、表面の強い吸着
力により、付随する蛋白質をも表面に吸着させることに
なる。この非特異的吸着により、間接的検出の場合のみ
でなく直接的検出の場合でも、試験結果はかなり不正確
になる。
【０００７】合成表面またはガラス表面上への抗リガン
ドの適当な固定化は、たとえばアフィニティークロマト
グラフィーに関してよく知られているが、ガラス表面上
への蛋白質分子の特定の固定化がはじめて明らかにされ
たのはごく最近である（ＷＯ９０／０５３０３参照）。
この特許明細書には、高い感受性と適当な動的範囲を達
成するためには、三次元マトリックス（好ましくは、た
とえばデキストランからなる多糖マトリックス）の必要
なことが特に強調されている。この方法は高分子量多糖
の、チオウンデカン誘導体を介した固定化に関するもの
で、この物質は、金表面への多糖の共有結合的繋留に関
与する。しかしながら、三次元マトリックスの製造はか
なり高価につき、一回使用後に廃棄されるセンサーの実
現という点では問題がある。
ドの適当な固定化は、たとえばアフィニティークロマト
グラフィーに関してよく知られているが、ガラス表面上
への蛋白質分子の特定の固定化がはじめて明らかにされ
たのはごく最近である（ＷＯ９０／０５３０３参照）。
この特許明細書には、高い感受性と適当な動的範囲を達
成するためには、三次元マトリックス（好ましくは、た
とえばデキストランからなる多糖マトリックス）の必要
なことが特に強調されている。この方法は高分子量多糖
の、チオウンデカン誘導体を介した固定化に関するもの
で、この物質は、金表面への多糖の共有結合的繋留に関
与する。しかしながら、三次元マトリックスの製造はか
なり高価につき、一回使用後に廃棄されるセンサーの実
現という点では問題がある。
【０００８】本発明の目的は、認識分子（抗体、抗原）
のマトリックスへの被検物質の結合に関して高い活性と
選択性を有するイムノセンソリートランスデューサーを
提供することにある。
のマトリックスへの被検物質の結合に関して高い活性と
選択性を有するイムノセンソリートランスデューサーを
提供することにある。
【０００９】驚くべきことに、高い感受性と十分な動的
範囲を達成するためには、三次元マトリックスは必要で
はないことが明らかにされた。このような三次元マトリ
ックスを放棄することによって、固定化操作は著しく簡
略化される。
範囲を達成するためには、三次元マトリックスは必要で
はないことが明らかにされた。このような三次元マトリ
ックスを放棄することによって、固定化操作は著しく簡
略化される。
【００１０】問題点は、金担体、その表面に配置された
単分子有機中間層、およびこの上に固定化されたリガン
ドまたは抗リガンド層からなる本発明のイムノセンソリ
ートランスデューサーによって解決される。
単分子有機中間層、およびこの上に固定化されたリガン
ドまたは抗リガンド層からなる本発明のイムノセンソリ
ートランスデューサーによって解決される。
【００１１】本発明の方法は、含硫基を有するアルキル
誘導体の単分子層を自動化学吸着によって金属担体の表
面上に適用し、ついでこの層上に所望の免疫検出に適当
なリガンドまたは抗リガンドを固定化することを特徴と
する方法である。
誘導体の単分子層を自動化学吸着によって金属担体の表
面上に適用し、ついでこの層上に所望の免疫検出に適当
なリガンドまたは抗リガンドを固定化することを特徴と
する方法である。
【００１２】すなわち、この方法によれば、驚くべきこ
とに、蛋白質が金属表面に適当な様式で固定化できるこ
とが見出されたのである。このようにして得られた表面
は、表面上における免疫複合体の形成に関して、上述の
ような測定操作たとえば自動吸着またはシラン化もしく
はプラズマ重合による表面上へのポリマー薄層の適用、
ついで既知のアフィニティークロマトグラフィー操作に
よる固定化に関連してこれまで用いられてきた表面より
も、明らかに高い活性を有する。
とに、蛋白質が金属表面に適当な様式で固定化できるこ
とが見出されたのである。このようにして得られた表面
は、表面上における免疫複合体の形成に関して、上述の
ような測定操作たとえば自動吸着またはシラン化もしく
はプラズマ重合による表面上へのポリマー薄層の適用、
ついで既知のアフィニティークロマトグラフィー操作に
よる固定化に関連してこれまで用いられてきた表面より
も、明らかに高い活性を有する。
【００１３】蛋白質を特定の、方向性のある様式で表面
上に固定化させる場合には、この表面は二官能性をもつ
ように調製されなければならない。すなわち、表面に
は、蛋白質の自動吸着を防止する官能基と、その蛋白質
上に存在する基と共有結合する官能基とが与えられなけ
ればならない。
上に固定化させる場合には、この表面は二官能性をもつ
ように調製されなければならない。すなわち、表面に
は、蛋白質の自動吸着を防止する官能基と、その蛋白質
上に存在する基と共有結合する官能基とが与えられなけ
ればならない。
【００１４】本発明の方法の好ましい実施態様によれ
ば、金の表面に、第一工程として薄い有機補助層が与え
られる。これらの有機補助層の適用は、含硫基（チオー
ル、スルフィド、ジスルフィド）を有するアルキル誘導
体の既知の自動化学吸着に基づき、これらの化合物の溶
液から金の上への単層の形成によって行われる（Ｌａｎ
ｇｍｕｉｒ ５，７２３−７２７，１９８９；Ｌａｎｇ
ｍｕｉｒ ４，３６５−３８５，１９８８；Ｊ．Ｐｈｙ
ｓ．Ｃｈｅｍ．９１，６６６３，１９８７）。
ば、金の表面に、第一工程として薄い有機補助層が与え
られる。これらの有機補助層の適用は、含硫基（チオー
ル、スルフィド、ジスルフィド）を有するアルキル誘導
体の既知の自動化学吸着に基づき、これらの化合物の溶
液から金の上への単層の形成によって行われる（Ｌａｎ
ｇｍｕｉｒ ５，７２３−７２７，１９８９；Ｌａｎｇ
ｍｕｉｒ ４，３６５−３８５，１９８８；Ｊ．Ｐｈｙ
ｓ．Ｃｈｅｍ．９１，６６６３，１９８７）。
【００１５】化学吸着は、含硫基が金の表面に繋留し
て、アルカン鎖がこの表面からほぼ垂直に伸びるように
行われる。この操作で作成される層の厚さは、長さの異
なるアルカン鎖（Ｃ11〜Ｃ20）を用いることによって、
約１．３〜３nmの範囲で変動させることができる。
て、アルカン鎖がこの表面からほぼ垂直に伸びるように
行われる。この操作で作成される層の厚さは、長さの異
なるアルカン鎖（Ｃ11〜Ｃ20）を用いることによって、
約１．３〜３nmの範囲で変動させることができる。
【００１６】これらの化合物の単層の形成は、これらの
化合物が含硫基に対してω−位に、たとえば−ＣＯＯ
Ｈ、−ＮＨ２ 、−ＯＨ等の官能基を有する場合にも同
様に行われる。したがって、これらの試薬によれば金表
面に薄い有機層が設けられ、これらの有機補助層は高密
度に官能基が充填された境界面（有機層と周囲の媒体
間）を与える。すなわち、表面の組成は、吸着に使用す
る溶液中の相当する試剤の濃度比を変えることにより、
各種官能基の濃度を調節することが可能である。この操
作により、必要な二官能性を有する固定化のための表面
が驚くほど簡単に作成できる。
化合物が含硫基に対してω−位に、たとえば−ＣＯＯ
Ｈ、−ＮＨ２ 、−ＯＨ等の官能基を有する場合にも同
様に行われる。したがって、これらの試薬によれば金表
面に薄い有機層が設けられ、これらの有機補助層は高密
度に官能基が充填された境界面（有機層と周囲の媒体
間）を与える。すなわち、表面の組成は、吸着に使用す
る溶液中の相当する試剤の濃度比を変えることにより、
各種官能基の濃度を調節することが可能である。この操
作により、必要な二官能性を有する固定化のための表面
が驚くほど簡単に作成できる。
【００１７】さらに、有機補助層を合成するための含硫
基が、第二の官能基として、ヒドロキシル、ポリヒドロ
キシル、エチレングリコールおよびオリゴエチレングリ
コール、または単糖を構造要素に含む場合には、驚くべ
きことに、蛋白質の自動吸着が強力に抑制されることが
見出された。
基が、第二の官能基として、ヒドロキシル、ポリヒドロ
キシル、エチレングリコールおよびオリゴエチレングリ
コール、または単糖を構造要素に含む場合には、驚くべ
きことに、蛋白質の自動吸着が強力に抑制されることが
見出された。
【００１８】さらにまた、これらの末端基に存在するヒ
ドロキシル基は、それ自体公知の方法により、蛋白質の
共有結合のためのシアノゲンクロリド活性化、トシルク
ロリド活性化、エピクロルヒドリン活性化またはカルボ
ニルイミダゾール活性化に使用することができる（Ｍｅ
ｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５，３０−６
５，１９８７）。これらの操作では、ある程度攻撃性の
強い試剤を使わなければならないが、いったん形成され
た単層はこれらの活性化工程でも驚くほど無傷のまま維
持される。
ドロキシル基は、それ自体公知の方法により、蛋白質の
共有結合のためのシアノゲンクロリド活性化、トシルク
ロリド活性化、エピクロルヒドリン活性化またはカルボ
ニルイミダゾール活性化に使用することができる（Ｍｅ
ｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５，３０−６
５，１９８７）。これらの操作では、ある程度攻撃性の
強い試剤を使わなければならないが、いったん形成され
た単層はこれらの活性化工程でも驚くほど無傷のまま維
持される。
【００１９】本発明の方法の別の好ましい実施態様で
は、固定化に際しての蛋白質の自動吸着を防止するため
のヒドロキシル含有誘導体とともに、蛋白質の共有結合
のための特定の基を有する誘導体が表面上に使用され
る。この場合、表面に要求される二官能性は、自由に選
択される官能基の相対量に調節することが可能である。
これに匹敵する調節は、富ヒドロキシル表面の直接活性
化では、不可能である。官能基を介する共有結合に利用
できる試剤は、２つのグループに分けられる。第一のグ
ループには、さらに活性化工程を経てのみ共有結合に使
用できる官能基をもつ誘導体が包含される。この活性化
は、金表面への誘導体の化学吸着後に行われる。これら
は、含硫構造要素に加えて、カルボン酸機能〔クロロギ
酸エチルにより（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７４，
６７６−６７８，１９５２）、またはカルボジイミド、
ヒドロキシスクシンイミドもしくはチオニルクロリドと
の反応により（Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１３５，３０−６５，１９８７）活性化〕、アミノ基
〔無水コハク酸との反応、ついでそのカルボン酸の活性
化による（前出）活性化〕、芳香族アミノもしくはニト
ロ基〔ジアゾニウム塩への変換による（前出）活性
化〕、またはフェニルアジド基〔光化学的活性化（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６，５６５０−５６５４，１
９７７；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７、１４０３−１
４０８、（１９７８）〕を含有する誘導体である。この
場合も、ある程度激烈な活性化方法によっても、金の表
面のこれらの有機補助層は破壊されない。
は、固定化に際しての蛋白質の自動吸着を防止するため
のヒドロキシル含有誘導体とともに、蛋白質の共有結合
のための特定の基を有する誘導体が表面上に使用され
る。この場合、表面に要求される二官能性は、自由に選
択される官能基の相対量に調節することが可能である。
これに匹敵する調節は、富ヒドロキシル表面の直接活性
化では、不可能である。官能基を介する共有結合に利用
できる試剤は、２つのグループに分けられる。第一のグ
ループには、さらに活性化工程を経てのみ共有結合に使
用できる官能基をもつ誘導体が包含される。この活性化
は、金表面への誘導体の化学吸着後に行われる。これら
は、含硫構造要素に加えて、カルボン酸機能〔クロロギ
酸エチルにより（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７４，
６７６−６７８，１９５２）、またはカルボジイミド、
ヒドロキシスクシンイミドもしくはチオニルクロリドと
の反応により（Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１３５，３０−６５，１９８７）活性化〕、アミノ基
〔無水コハク酸との反応、ついでそのカルボン酸の活性
化による（前出）活性化〕、芳香族アミノもしくはニト
ロ基〔ジアゾニウム塩への変換による（前出）活性
化〕、またはフェニルアジド基〔光化学的活性化（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６，５６５０−５６５４，１
９７７；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７、１４０３−１
４０８、（１９７８）〕を含有する誘導体である。この
場合も、ある程度激烈な活性化方法によっても、金の表
面のこれらの有機補助層は破壊されない。
【００２０】第二のグループは、金の表面に適用したの
ちの活性化工程を要しない含硫アルキル誘導体からな
る。これらの試剤はまた、それ自体単層の型で金属表面
に配列する。これらは、蛋白質上の基と特異的に反応で
きる官能基を有する。これらの基の例には、マレイミド
（Ｆａｂ′フラグメントのＳＨ基と反応）、ｐ−ベンゾ
キノン、シアヌル酸クロリド、エポキシド、スルホン酸
誘導体、カルボン酸アジド（蛋白質のアミノ基と反応）
またはヒドラジド（酸化炭水化物残基のアルデヒド機能
と反応）がある。しかしながら、これらの化合物は、含
硫基がチオールではない場合に、あらかじめ製造するこ
とのみが可能である。したがって、第二の基の利点は、
固定化共有結合蛋白質と反応する基を金の表面に直接提
供できる点に存在する。
ちの活性化工程を要しない含硫アルキル誘導体からな
る。これらの試剤はまた、それ自体単層の型で金属表面
に配列する。これらは、蛋白質上の基と特異的に反応で
きる官能基を有する。これらの基の例には、マレイミド
（Ｆａｂ′フラグメントのＳＨ基と反応）、ｐ−ベンゾ
キノン、シアヌル酸クロリド、エポキシド、スルホン酸
誘導体、カルボン酸アジド（蛋白質のアミノ基と反応）
またはヒドラジド（酸化炭水化物残基のアルデヒド機能
と反応）がある。しかしながら、これらの化合物は、含
硫基がチオールではない場合に、あらかじめ製造するこ
とのみが可能である。したがって、第二の基の利点は、
固定化共有結合蛋白質と反応する基を金の表面に直接提
供できる点に存在する。
【００２１】免疫検出に使用できる分子（たとえば、Ａ
ｂ、Ａｇ、Ｆａｂ′フラグメントまたはハプテン等）の
金表面への固定化操作は、一般式
ｂ、Ａｇ、Ｆａｂ′フラグメントまたはハプテン等）の
金表面への固定化操作は、一般式
【化１】 の化合物の使用に基づくものである。式中、Ｒ1は基Ｓ
−Ｘであり、ＸはＨまたは−（ＣＨ2）ｍ−Ｒ2であり、
ｍおよびｐ＝ｎであり、ｎ＝１〜２０であるか、Ｒ1は
式
−Ｘであり、ＸはＨまたは−（ＣＨ2）ｍ−Ｒ2であり、
ｍおよびｐ＝ｎであり、ｎ＝１〜２０であるか、Ｒ1は
式
【化２】 （式中、ｑ＝１または２であり、ｎは上述の意味を有す
る）の環式ジスルフィド基であり、Ｒ2は式Ｙの官能基
であり、この基Ｙは、所望により蛋白質とカップリング
できる基Ｚに変換可能であるか、またはＲ2はそのまま
上述のＺの意味を有し、この場合、Ｒ2＝Ｚ、Ｒ1＝ＳＨ
である（すなわち、この化合物はチオレートとして製造
され、Ｙは製造後にＺへ変換されるか、または化合物は
Ｚを含有し、Ｒ1は−Ｓ−もしくは−Ｓ−Ｓ−であ
る）。
る）の環式ジスルフィド基であり、Ｒ2は式Ｙの官能基
であり、この基Ｙは、所望により蛋白質とカップリング
できる基Ｚに変換可能であるか、またはＲ2はそのまま
上述のＺの意味を有し、この場合、Ｒ2＝Ｚ、Ｒ1＝ＳＨ
である（すなわち、この化合物はチオレートとして製造
され、Ｙは製造後にＺへ変換されるか、または化合物は
Ｚを含有し、Ｒ1は−Ｓ−もしくは−Ｓ−Ｓ−であ
る）。
【００２２】Ｙの典型的な例は、
【化３】 である。
【００２３】Ｚの典型的な例は、 a) アルコールの活性化
【化４】 b) カルボン酸の活性化
【化５】 c) アミンの活性化
【化６】 である。
【００２４】例 例１ ２５４mg（０．５ミリモル）の２２−トシルオキシ−１
−ドコサノールを２０mlのエタノール中、２００mg
（１．７５ミリモル）のチオ酢酸カリウムと２時間還流
加熱した。ついで、室温で２mlの１Ｎ ＮａＯＨを加
え、この混合物を一夜攪拌した。１Ｎ ＨＣｌで酸性に
したのち、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃
縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エチル＝
２：１を用いて濾過すると、１６５mgの２２−ヒドロキ
シ−１−ドコサンチオールが得られた。生成物と抽出物
のＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル２：１）のＲｆ値はき
わめて類似しているが、抽出物は蛍光消光（芳香性）を
示す。
−ドコサノールを２０mlのエタノール中、２００mg
（１．７５ミリモル）のチオ酢酸カリウムと２時間還流
加熱した。ついで、室温で２mlの１Ｎ ＮａＯＨを加
え、この混合物を一夜攪拌した。１Ｎ ＨＣｌで酸性に
したのち、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃
縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エチル＝
２：１を用いて濾過すると、１６５mgの２２−ヒドロキ
シ−１−ドコサンチオールが得られた。生成物と抽出物
のＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル２：１）のＲｆ値はき
わめて類似しているが、抽出物は蛍光消光（芳香性）を
示す。
【００２５】出発原料として用いられる２２−トシルオ
キシ−１−ドコサノールは、以下のようにして製造され
た。２５．１ｇ（０．１モル）の１１−ブロモウンデカ
ノールの、乾燥ピリジン６０ml中溶液に、攪拌しながら
２０ｇ（０．１２モル）のビス−トリトリメチルシリル
アセトアミドを滴下した。滴下終了後、反応混合物をさ
らに２時間、室温で攪拌した。ついで、反応混合物を三
級ブチルメチルエーテルと水に取り、エーテル相を３回
水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエ
バポレーターで濃縮した。残留物をトルエンに取り、こ
の溶液をシリカゲルを通して濾過した。１１−ブロモ−
１−ウンデシルトリメチルシリルエーテルがほぼ定量的
収率で得られた。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．８
キシ−１−ドコサノールは、以下のようにして製造され
た。２５．１ｇ（０．１モル）の１１−ブロモウンデカ
ノールの、乾燥ピリジン６０ml中溶液に、攪拌しながら
２０ｇ（０．１２モル）のビス−トリトリメチルシリル
アセトアミドを滴下した。滴下終了後、反応混合物をさ
らに２時間、室温で攪拌した。ついで、反応混合物を三
級ブチルメチルエーテルと水に取り、エーテル相を３回
水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエ
バポレーターで濃縮した。残留物をトルエンに取り、こ
の溶液をシリカゲルを通して濾過した。１１−ブロモ−
１−ウンデシルトリメチルシリルエーテルがほぼ定量的
収率で得られた。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．８
【００２６】０．３３ｇ（１５ミリモル）の金属ナトリ
ウムをトルエン中、１２０°に攪拌しながら加熱して微
細に分散させた。室温に冷却したのち４．８５ｇ（１５
ミリモル）の１１−ブロモ−ウンデシルトリメチルシリ
ルエーテルを攪拌しながら滴下し、混合物を再び１２０
°に加熱すると、臭化ナトリウムが徐々に沈殿し、溶液
は青色になった。１時間後にテトラクロロ銅酸リチウム
をカップリング触媒として加え、混合物をさらに２時間
還流加熱した。室温に冷却したのち、混合物に５０mlの
三級ブチルメチルエーテルを加え、水を滴下して痕跡の
ナトリウムを分解した。有機相をシリカゲル上で濾過
し、ロータリーエバポレーターで濃縮した（収量２．８
ｇ＝７７％）。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．７５、Ｔ
ＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．９
ウムをトルエン中、１２０°に攪拌しながら加熱して微
細に分散させた。室温に冷却したのち４．８５ｇ（１５
ミリモル）の１１−ブロモ−ウンデシルトリメチルシリ
ルエーテルを攪拌しながら滴下し、混合物を再び１２０
°に加熱すると、臭化ナトリウムが徐々に沈殿し、溶液
は青色になった。１時間後にテトラクロロ銅酸リチウム
をカップリング触媒として加え、混合物をさらに２時間
還流加熱した。室温に冷却したのち、混合物に５０mlの
三級ブチルメチルエーテルを加え、水を滴下して痕跡の
ナトリウムを分解した。有機相をシリカゲル上で濾過
し、ロータリーエバポレーターで濃縮した（収量２．８
ｇ＝７７％）。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．７５、Ｔ
ＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．９
【００２７】上述の反応で得られた１，２２−ジ−（ト
リメチルシリルオキシ）ドコサンを３０mlの三級ブチル
メチルエーテルに溶解し、この溶解を攪拌しながら、２
０mlの１Ｎ ＨＣｌで処理した。１，２２−ジヒドロキ
シドコサンの結晶が直ちに分離した。１時間攪拌したの
ち、沈殿した物質を分離し、高真空下に乾燥した。収量
はほぼ定量的で約１．９ｇであった。ＴＬＣ（トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．２５
リメチルシリルオキシ）ドコサンを３０mlの三級ブチル
メチルエーテルに溶解し、この溶解を攪拌しながら、２
０mlの１Ｎ ＨＣｌで処理した。１，２２−ジヒドロキ
シドコサンの結晶が直ちに分離した。１時間攪拌したの
ち、沈殿した物質を分離し、高真空下に乾燥した。収量
はほぼ定量的で約１．９ｇであった。ＴＬＣ（トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．２５
【００２８】ピリジン５ml中、２３０mg（０．６７ミリ
モル）の１，２２−ジヒドロキシドコサンに、攪拌しな
がら、１mlのピリジン中１２７mg（０．６７ミリモル）
トシルクロリドを滴下し、ついで室温で２．５時間攪拌
した。次に、反応混合物を５０mlのトルエンとともに分
液濾斗に移し、３０mlの水と振盪した。水相を分離した
のち有機相を２Ｎ硫酸（ピリジンの除去）ついで重炭酸
塩溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリ
ーエバポレーターで蒸発させると、白色粉末が得られ
た。未反応ジオールと痕跡のジトシレートをシリカゲル
上、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いたクロマトグ
ラフィーによって除去すると、７４ｇの２２−トシルオ
キシ−１−ドコサノールが得られた。ＴＬＣ（トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．５５
モル）の１，２２−ジヒドロキシドコサンに、攪拌しな
がら、１mlのピリジン中１２７mg（０．６７ミリモル）
トシルクロリドを滴下し、ついで室温で２．５時間攪拌
した。次に、反応混合物を５０mlのトルエンとともに分
液濾斗に移し、３０mlの水と振盪した。水相を分離した
のち有機相を２Ｎ硫酸（ピリジンの除去）ついで重炭酸
塩溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリ
ーエバポレーターで蒸発させると、白色粉末が得られ
た。未反応ジオールと痕跡のジトシレートをシリカゲル
上、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いたクロマトグ
ラフィーによって除去すると、７４ｇの２２−トシルオ
キシ−１−ドコサノールが得られた。ＴＬＣ（トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．５５
【００２９】例２ ５０mg（０．１ミリモル）の２２−トシルオキシ−１−
ドコサノールを、２．５ml（０．０５ミリモル）の０．
０２Ｍの硫化ナトリウムのエタノール溶液とともに２時
間還流加熱した。ついで、混合物を水／クロロホルムに
取り、有機相を分離し、ロータリーエバポレーターで濃
縮した。残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エチル
＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付すと、１０mg
の純粋なジ−（２２−ヒドロキシドコシル）−スルフィ
ドが得られた。
ドコサノールを、２．５ml（０．０５ミリモル）の０．
０２Ｍの硫化ナトリウムのエタノール溶液とともに２時
間還流加熱した。ついで、混合物を水／クロロホルムに
取り、有機相を分離し、ロータリーエバポレーターで濃
縮した。残留物をシリカゲル上、トルエン：酢酸エチル
＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付すと、１０mg
の純粋なジ−（２２−ヒドロキシドコシル）−スルフィ
ドが得られた。
【００３０】例３ ２３０mg（０．６ミリモル）の４−（３′−ヒドロキシ
−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−
ジオキソランと、１４０mg（１．２ミリモル）のチオ酢
酸カリウムを４mlのエタノールに溶解し、この溶液を２
時間還流加熱した。ついで、この混合物をロータリーエ
バポレーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに
付すと、１９４mgの４−（３′−ヒドロキシ−１３′−
チオアセトキシトリデカニル）２，２−ジメチル−１，
３−ジオキソランが得られた。
−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−
ジオキソランと、１４０mg（１．２ミリモル）のチオ酢
酸カリウムを４mlのエタノールに溶解し、この溶液を２
時間還流加熱した。ついで、この混合物をロータリーエ
バポレーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエ
ン：酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに
付すと、１９４mgの４−（３′−ヒドロキシ−１３′−
チオアセトキシトリデカニル）２，２−ジメチル−１，
３−ジオキソランが得られた。
【００３１】４−（３′−ヒドロキシ−１３′−チオア
セトキシトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−
ジオキソランを５mlのメタノールに溶解し、１Ｎ ＫＯ
Ｈ０．５mlを加え、混合物を一夜、室温で攪拌し（チオ
アセテートの鹸化）、ついで溶液を１．５mlのイオン交
換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ８（Ｈ＋）と攪拌し、４
５°に加熱してアセトニドを切断した（トランスアセタ
ール化）。メタノールをロータリーエバポレーターで除
去したのち、残留物をシリカゲル上、クロマトグラフィ
ーに付した。９０mg（５１％）の１１，１４，１５−ヒ
ドロキシ−１−ペンタデカンチオールが得られた。ＴＬ
Ｃ（ＲＰ８；３％クロロホルム／エタノール）Ｒｆ＝
０．４
セトキシトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−
ジオキソランを５mlのメタノールに溶解し、１Ｎ ＫＯ
Ｈ０．５mlを加え、混合物を一夜、室温で攪拌し（チオ
アセテートの鹸化）、ついで溶液を１．５mlのイオン交
換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ８（Ｈ＋）と攪拌し、４
５°に加熱してアセトニドを切断した（トランスアセタ
ール化）。メタノールをロータリーエバポレーターで除
去したのち、残留物をシリカゲル上、クロマトグラフィ
ーに付した。９０mg（５１％）の１１，１４，１５−ヒ
ドロキシ−１−ペンタデカンチオールが得られた。ＴＬ
Ｃ（ＲＰ８；３％クロロホルム／エタノール）Ｒｆ＝
０．４
【００３２】出発原料として用いられる４−（３′−ヒ
ドロキシ−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−
１，３−ジオキソランは、以下の方法で製造された。
２．１ｇ（１０ミリモル）の４−ブロモメチル−２，２
−ジメチル−１，３−ジオキソランを２５mlのエーテル
中、常法によりマグネシウムと反応させてグリニアル試
薬に変換させた。得られたエーテル溶液を０°に冷却
し、これに攪拌しながら５mlのエーテル中１ｇ（６．２
５ミリモル）の１１−ブロモ−１−ウンデカナールの溶
液を滴下した。室温で一夜攪拌したのち、炭酸水素ナト
リウム溶液を加え、反応生成物をエーテルで抽出した。
有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポ
レーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：
酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付す
と、１．７ｇ（４５％）の４−（３′−ヒドロキシ−ブ
ロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオ
キソランが得られた。
ドロキシ−ブロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−
１，３−ジオキソランは、以下の方法で製造された。
２．１ｇ（１０ミリモル）の４−ブロモメチル−２，２
−ジメチル−１，３−ジオキソランを２５mlのエーテル
中、常法によりマグネシウムと反応させてグリニアル試
薬に変換させた。得られたエーテル溶液を０°に冷却
し、これに攪拌しながら５mlのエーテル中１ｇ（６．２
５ミリモル）の１１−ブロモ−１−ウンデカナールの溶
液を滴下した。室温で一夜攪拌したのち、炭酸水素ナト
リウム溶液を加え、反応生成物をエーテルで抽出した。
有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポ
レーターで濃縮し、残留物をシリカゲル上、トルエン：
酢酸エチル＝２：１を用いてクロマトグラフィーに付す
と、１．７ｇ（４５％）の４−（３′−ヒドロキシ−ブ
ロモトリデカニル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオ
キソランが得られた。
【００３３】例４ ｐ−アジドベンゾイルクロリドは、０．６２５ｇ（４ミ
リモル）の相当する酸から、チオニルクロリド中で、文
献の記載と同様にして製造した。濃縮後、得られた粗製
の酸クロリドを０．９９４ｇ（２ミリモル）のジ（１１
−チオウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩の懸濁
液に加え、混合物を一夜室温で攪拌した。次に、この混
合物を水流ポンプの真空下、７０°で濃縮し、残留物を
トルエン／濃塩酸に取り、シリカゲル上で濾過し、トル
エン；酢酸エチル＝２：１を用いて溶出した。純粋な分
画を含む溶出液を濃縮すると、１．１５ｇ（７９％）の
ジ〔１１−（ｐ−アジドベンゾイルメルカプト）−ウン
デシル〕ジスルフィド（Ｒｆ値＝０．１）が得られ、Ｎ
ＭＲおよび元素分析で確認された。
リモル）の相当する酸から、チオニルクロリド中で、文
献の記載と同様にして製造した。濃縮後、得られた粗製
の酸クロリドを０．９９４ｇ（２ミリモル）のジ（１１
−チオウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩の懸濁
液に加え、混合物を一夜室温で攪拌した。次に、この混
合物を水流ポンプの真空下、７０°で濃縮し、残留物を
トルエン／濃塩酸に取り、シリカゲル上で濾過し、トル
エン；酢酸エチル＝２：１を用いて溶出した。純粋な分
画を含む溶出液を濃縮すると、１．１５ｇ（７９％）の
ジ〔１１−（ｐ−アジドベンゾイルメルカプト）−ウン
デシル〕ジスルフィド（Ｒｆ値＝０．１）が得られ、Ｎ
ＭＲおよび元素分析で確認された。
【００３４】出発原料として用いられるジ（１１−チオ
ウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩は以下の方法
で製造された。６．５６ｇ（２０ミリモル）の１１−ブ
ロモ−１−ウンデカンを２００mlのエタノールに溶解
し、２０．８ｇ（２００ミリモル）のチオ酢酸カリウム
を加えた。この混合物を１６時間還流した。得られた溶
液を水流ポンプの真空下に濃縮し、残留物をついでトル
エンに取り、シリカゲル上で濾過し、トルエンを用いて
溶出した。溶出液を濃縮すると、６．３２ｇ（９９％）
１，１１−ジアセチルメルカプトウンデカンが黄色油状
物として得られ、ＭＳで確認された。
ウンデシル）ジスルフィド二ナトリウム塩は以下の方法
で製造された。６．５６ｇ（２０ミリモル）の１１−ブ
ロモ−１−ウンデカンを２００mlのエタノールに溶解
し、２０．８ｇ（２００ミリモル）のチオ酢酸カリウム
を加えた。この混合物を１６時間還流した。得られた溶
液を水流ポンプの真空下に濃縮し、残留物をついでトル
エンに取り、シリカゲル上で濾過し、トルエンを用いて
溶出した。溶出液を濃縮すると、６．３２ｇ（９９％）
１，１１−ジアセチルメルカプトウンデカンが黄色油状
物として得られ、ＭＳで確認された。
【００３５】３．１８５ｇ（１０ミリモル）の１，１１
−ジアセチルメルカプトウンデカンを１００mlのエタノ
ールに溶解した（攪拌すると最初、溶液が生成するが、
１時間後には結晶が析出する）。懸濁液をついで１６時
間室温で攪拌した。濾過し、残留物をエタノールで洗浄
し、乾燥した。０．８８ｇ（３３％）の１，１１−ウン
デカンジチオール二ナトリウム塩、融点６１−６２°が
得られ、正しい元素分析値を示した。濾液に２００mlの
水を加え、ついで濾過した。残留物を水で洗浄し、乾燥
すると、１．３６ｇ（５４％）のジ（１１−チオウンデ
シル）ジスルフィド二ナトリウム塩、融点２９２−２９
４°が得られ、ＮＭＲおよび元素分析が確認された。
−ジアセチルメルカプトウンデカンを１００mlのエタノ
ールに溶解した（攪拌すると最初、溶液が生成するが、
１時間後には結晶が析出する）。懸濁液をついで１６時
間室温で攪拌した。濾過し、残留物をエタノールで洗浄
し、乾燥した。０．８８ｇ（３３％）の１，１１−ウン
デカンジチオール二ナトリウム塩、融点６１−６２°が
得られ、正しい元素分析値を示した。濾液に２００mlの
水を加え、ついで濾過した。残留物を水で洗浄し、乾燥
すると、１．３６ｇ（５４％）のジ（１１−チオウンデ
シル）ジスルフィド二ナトリウム塩、融点２９２−２９
４°が得られ、ＮＭＲおよび元素分析が確認された。
【００３６】例５ １００mgのチオ酢酸１１−フタルイミドウンデシルエス
テルを５mlのヒドラジン中で、３日間還流した。つい
で、溶液を濃縮し、沸騰濃塩酸に溶解し、再び濃縮し
た。白色の結晶性粗生成物をメタノールに取り、シラン
化シリカゲル上クロマトグラフィーに付した。このよう
にして得られた１１−アミノウンデシルチオールは、塩
酸塩としてＭＳおよびＮＭＲで確認された。元素分析の
結果は、生成物が１９モル％の所望の化合物と８１モル
％のヒドラジニウム一塩酸塩からなることを示した。
テルを５mlのヒドラジン中で、３日間還流した。つい
で、溶液を濃縮し、沸騰濃塩酸に溶解し、再び濃縮し
た。白色の結晶性粗生成物をメタノールに取り、シラン
化シリカゲル上クロマトグラフィーに付した。このよう
にして得られた１１−アミノウンデシルチオールは、塩
酸塩としてＭＳおよびＮＭＲで確認された。元素分析の
結果は、生成物が１９モル％の所望の化合物と８１モル
％のヒドラジニウム一塩酸塩からなることを示した。
【００３７】出発原料として用いられるチオ酢酸１１−
フタルイミドウンデシルエステルは以下の方法で製造さ
れた。１２．５６ｇ（５０ミリモル）の１１−ブロモウ
ンデカノールを１００mlのＤＭＦに溶解し、１８．５２
ｇ（１００ミリモル）のフタルイミドカリウムを加え、
１６時間還流煮沸した。ついで混合物を水流ポンプの真
空下に濃縮し、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いて
クロマトグラフィーに付すと、１５．６ｇ（９８％）の
１１−フタルイミノ−ウンデカノールが得られた。融点
８６−８７°を示し、ＮＭＲで確認された。ＨＰＬＣ
（３０％ ＭｅＣＮ；ＲＰ１８ １２５−４）ｔＲ＝
３．５分。
フタルイミドウンデシルエステルは以下の方法で製造さ
れた。１２．５６ｇ（５０ミリモル）の１１−ブロモウ
ンデカノールを１００mlのＤＭＦに溶解し、１８．５２
ｇ（１００ミリモル）のフタルイミドカリウムを加え、
１６時間還流煮沸した。ついで混合物を水流ポンプの真
空下に濃縮し、トルエン：酢酸エチル＝２：１を用いて
クロマトグラフィーに付すと、１５．６ｇ（９８％）の
１１−フタルイミノ−ウンデカノールが得られた。融点
８６−８７°を示し、ＮＭＲで確認された。ＨＰＬＣ
（３０％ ＭｅＣＮ；ＲＰ１８ １２５−４）ｔＲ＝
３．５分。
【００３８】４．７６ｇ（１５ミリモル）の１１−フタ
ルイミドウンデカノールと４．３４ｇ（１８ミリモル）
のトシルクロリドをピリジン５０mlに溶解し、室温で２
時間攪拌した。ついで、混合物を飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液と１時間攪拌したのち、メチレンクロリドで抽出
した。有機相を水、１Ｎ塩酸、再び水で洗浄した。硫酸
ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると、５．９ｇ（８５
％）の１１−フタルイミド−ウンデシルトシレートが得
られ、ＮＭＲおよびＨＰＬＣで確認された。ＴＬＣ（ト
ルエン）Ｒｆ＝０．０８
ルイミドウンデカノールと４．３４ｇ（１８ミリモル）
のトシルクロリドをピリジン５０mlに溶解し、室温で２
時間攪拌した。ついで、混合物を飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液と１時間攪拌したのち、メチレンクロリドで抽出
した。有機相を水、１Ｎ塩酸、再び水で洗浄した。硫酸
ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると、５．９ｇ（８５
％）の１１−フタルイミド−ウンデシルトシレートが得
られ、ＮＭＲおよびＨＰＬＣで確認された。ＴＬＣ（ト
ルエン）Ｒｆ＝０．０８
【００３９】３ｇ（６．３６ミリモル）の１１−フタル
イミドウンデカニルトシレートを１５０mlのエタノール
に溶解し、１．４５ｇ（１２．７ミリモル）のチオ酢酸
カリウムとともに１６時間煮沸した。ついで、混合物を
濃縮し、トルエンに取った。懸濁液をシリカゲル上、ク
ロマトグラフィーに付した。高真空乾燥したチオ酢酸１
１−フタルイミドウンデシルエステルは、ＮＭＲで確認
された。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．１４
イミドウンデカニルトシレートを１５０mlのエタノール
に溶解し、１．４５ｇ（１２．７ミリモル）のチオ酢酸
カリウムとともに１６時間煮沸した。ついで、混合物を
濃縮し、トルエンに取った。懸濁液をシリカゲル上、ク
ロマトグラフィーに付した。高真空乾燥したチオ酢酸１
１−フタルイミドウンデシルエステルは、ＮＭＲで確認
された。ＴＬＣ（トルエン）Ｒｆ＝０．１４
【００４０】例６：糖残基上のアルデヒド機能を介し
た、ＳＰＲセンサーの金表面上へのＩｇＧの固定化 この固定化に際しては、ＩｇＧの糖残基上に酸化によっ
て遊離のアルデヒド機能を生成させ、ついでこれを金表
面上のヒドラジド機能と反応させた。
た、ＳＰＲセンサーの金表面上へのＩｇＧの固定化 この固定化に際しては、ＩｇＧの糖残基上に酸化によっ
て遊離のアルデヒド機能を生成させ、ついでこれを金表
面上のヒドラジド機能と反応させた。
【００４１】固定化に適当な金表面上にヒドラジド含有
有機補助層（３０％ヒドラジド、５０％ヒドロキシル機
能）を生成させるためには、金表面を、メルカプトウン
デカン酸（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）およびメルカプトウ
ンデカノール（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）のメタノール溶
液と１２時間接触させる。この処理で単分子層が自動的
に形成される。この単分子層に存在するカルボン酸機能
はクロロギ酸メチルで活性化され金、酸ヒドラジド機能
に変換される。活性化は、表面を不活性気体下に、メチ
レンクロリドおよびピリジン（４％ｖ／ｖ）中クロロギ
酸（５％ｖ／ｖ）溶液に１時間浸漬して行われる。活性
化カルボン酸機能のヒドラジドへの変換は、表面を、メ
チレンクロリド中ヒドラジン（約１％ｖ／ｖ）の溶液と
反応させて行われる。この表面をついで、この固定化操
作のために修飾した抗体と反応させることができる。
有機補助層（３０％ヒドラジド、５０％ヒドロキシル機
能）を生成させるためには、金表面を、メルカプトウン
デカン酸（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）およびメルカプトウ
ンデカノール（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）のメタノール溶
液と１２時間接触させる。この処理で単分子層が自動的
に形成される。この単分子層に存在するカルボン酸機能
はクロロギ酸メチルで活性化され金、酸ヒドラジド機能
に変換される。活性化は、表面を不活性気体下に、メチ
レンクロリドおよびピリジン（４％ｖ／ｖ）中クロロギ
酸（５％ｖ／ｖ）溶液に１時間浸漬して行われる。活性
化カルボン酸機能のヒドラジドへの変換は、表面を、メ
チレンクロリド中ヒドラジン（約１％ｖ／ｖ）の溶液と
反応させて行われる。この表面をついで、この固定化操
作のために修飾した抗体と反応させることができる。
【００４２】ＩｇＧ分子の修飾はそれ自体公知の方法に
より、蛋白質を過ヨウ素酸ナトリウムで処理して行われ
る。このためには、抗体を、酢酸緩衝液（pH５．５；
０．１Ｍ）中０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（２０mg／
ml）に溶解し、２０分間反応させる。このようにして修
飾された抗体の固定化には、この反応溶液を上述のヒド
ラジド表面と１時間接触させる。
より、蛋白質を過ヨウ素酸ナトリウムで処理して行われ
る。このためには、抗体を、酢酸緩衝液（pH５．５；
０．１Ｍ）中０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（２０mg／
ml）に溶解し、２０分間反応させる。このようにして修
飾された抗体の固定化には、この反応溶液を上述のヒド
ラジド表面と１時間接触させる。
【００４３】遊離システインのＳＨ機能を介した、ＳＰ
Ｒセンサーの金表面上へのＦａｂ′フラグメントの固定
化修飾に際しては、この固定化に際しては、Ｆａｂ′フ
ラグメントは、それ自体公知のジスルフィド橋の酸化に
より、抗体のＦａｂ′フラグメントから作成される。Ｆ
ａｂ′フラグメントは、公知の方法により、抗体を酵素
的に切断すると得られる。
Ｒセンサーの金表面上へのＦａｂ′フラグメントの固定
化修飾に際しては、この固定化に際しては、Ｆａｂ′フ
ラグメントは、それ自体公知のジスルフィド橋の酸化に
より、抗体のＦａｂ′フラグメントから作成される。Ｆ
ａｂ′フラグメントは、公知の方法により、抗体を酵素
的に切断すると得られる。
【００４４】Ｆａｂ′フラグメントの固定化に適当な金
表面上に補助層を生成させるためには、金表面を、１１
−アミノウンデカンアミン（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）の
メタノール溶液と４８時間接触させる。表面上にＳＨ−
特異的、反応基を導入するためには、アミノ基をＮ−ス
クシンイミヂル−３−（２−ピリジニル）ジチオプロピ
オネート、（Ｆｌｕｋａ）（イソプロパノール中１×１
０-3ｍｏｌ／ｌ）と反応させる。この表面をついで、固
定化用に調製した抗体Ｆａｂ′フラグメントと反応させ
ることができる。
表面上に補助層を生成させるためには、金表面を、１１
−アミノウンデカンアミン（１×１０-3ｍｏｌ／ｌ）の
メタノール溶液と４８時間接触させる。表面上にＳＨ−
特異的、反応基を導入するためには、アミノ基をＮ−ス
クシンイミヂル−３−（２−ピリジニル）ジチオプロピ
オネート、（Ｆｌｕｋａ）（イソプロパノール中１×１
０-3ｍｏｌ／ｌ）と反応させる。この表面をついで、固
定化用に調製した抗体Ｆａｂ′フラグメントと反応させ
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨゼフ フュブスカー スイス国ヌニンゲン，サースペルシュト ラーセ １ (72)発明者 ダニエル スクラッター スイス国オベルヴィル，ブルデルホルツ シュトラーセ 67 (56)参考文献 特表 平４−501605（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 591 G01N 27/327 G01N 33/553 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 金担体、含硫基を介して担体表面に配置
されたアルキル誘導体の単分子有機中間層、およびこの
中間層に固定化されたリガンドまたは抗リガンド層から
なるイムノセンソリートランスデューサーであって、ア
ルキル誘導体は含硫基に対してω―位に官能基を有し、
そして有機中間層は固定化を通じての蛋白質の自動吸着
を防止するヒドロキシル含有アルキル誘導体および蛋白
質の共有結合のための特定の基を有するアルキル誘導体
からなることを特徴とするイムノセンソリートランスデ
ューサー。 - 【請求項２】 ヒドロキシル含有アルキル誘導体が、ヒ
ドロキシル残基、ポリアルコール残基、エチレングリコ
ール残基、または単糖残基を有する、請求項１のイムノ
センソリートランスデューサー。 - 【請求項３】 蛋白質の共有結合のための特定の基が、
蛋白質固定化のために活性化が可能な残基、ヒドロキシ
ル、カルボキシル、アミノフェニル、ニトロフェニルま
たはフェニルアジドを含有する、請求項１のイムノセン
ソリートランスデューサー。 - 【請求項４】 蛋白質の共有結合のための特定の基が、
残基、シアネート、オキシカルボニルイミダゾール、２
−オキシキノン、２−オキシメチレンキノン、−オキシ
（ジクロロトリアジン）、１−オキシ−２，３−エポキ
シプロパン、（２−オキシエチル）−ビニルスルホン、
（２，２，２−トリフルオロエチル）−スルホニルオキ
シ、（ｐ−トリル）−スルホニルオキシ、ｐ−（オキシ
ベンゾリル）−ニトレン、ｐ−メルカプトベンゾイル）
−ニトレン、ｐ−（オキシベンジル）−ジアゾニウムク
ロリド、ピリジルジチオプロピオン酸エステル、混合酸
無水物、イソ尿素エステル、ヒドロキシスクシンイミド
エステル、酸クロリド、酸ヒドラジド、酸アジド、２−
アシルアミノエチルピリジルジスルフィド、マレイミ
ド、ｐ−（アミノベンゾイル）−ニトレン、ピリジルジ
チオ−プロピオンアミドまたはイソシアネートであり、
さらに活性化することなく蛋白質固定化に使用すること
ができる、請求項３のイムノトランスデューサー。 - 【請求項５】 請求項１−４のいずれか一つのトランス
デューサーの製造方法であって、含硫基を有するアルキ
ル誘導体の混合物の単分子層を自動化学吸着によって金
担体の表面に適用し、ここでアルキル誘導体は、含硫基
に対してω―位に官能基を有し、固定化を通じて蛋白質
の自動吸着を防止し、そして蛋白質の共有結合のための
特定の基を有するアルキル誘導体であり、次いで、この
層上に所望の免疫検出に適当なリガンドまたは抗リガン
ドを固定することを特徴とする、トランスデューサーの
製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH360690 | 1990-11-14 | ||
| CH03606/90-3 | 1990-11-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04268455A JPH04268455A (ja) | 1992-09-24 |
| JP3280404B2 true JP3280404B2 (ja) | 2002-05-13 |
Family
ID=4259607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29717191A Expired - Lifetime JP3280404B2 (ja) | 1990-11-14 | 1991-11-13 | イムノセンソリートランスデューサー |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0485874B1 (ja) |
| JP (1) | JP3280404B2 (ja) |
| CA (1) | CA2055117A1 (ja) |
| DE (1) | DE59106527D1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2098960C (en) * | 1992-07-10 | 2004-11-02 | Richard Barner | Bio specifically recognizing surfaces on solid supports and method for their preparation |
| SE9402472L (sv) * | 1994-07-13 | 1996-01-14 | Forskarpatent I Linkoeping Ab | Modifierade ytor |
| DE4433980C2 (de) * | 1994-09-23 | 1996-08-22 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren und Biosensorhit zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasma-Resonanz |
| SE9403245D0 (sv) * | 1994-09-26 | 1994-09-26 | Pharmacia Biosensor Ab | Improvements relating to bilayer lipid membranes |
| US6472224B1 (en) | 1998-04-17 | 2002-10-29 | Franz Schleicher | Biosensor with modified precious metal surface and process for the preparation thereof |
| DE19817180C2 (de) * | 1998-04-17 | 2000-04-27 | Biotul Bio Instr Gmbh | Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche und Verfahren zu seiner Herstellung |
| DE19916638C2 (de) * | 1999-04-13 | 2002-11-07 | Jandratek Gmbh | Oberflächen zur Verbesserung des Bindungsverhaltens von Analytmolekülen auf der Basis kovalent gebundener hydrophiler Spacer an Hydrogelen |
| DE10027397A1 (de) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Graffinity Pharm Design Gmbh | Oberfläche zur Immobilisierung von Liganden |
| FI118061B (fi) | 2001-09-24 | 2007-06-15 | Beanor Oy | Menetelmä ja bioanturi analyysiä varten |
| FI115166B (fi) | 2001-12-31 | 2005-03-15 | Biofons Oy | Diagnostisia menetelmiä |
| JP2006118920A (ja) * | 2004-10-20 | 2006-05-11 | Institute Of Physical & Chemical Research | 相互作用観察方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4529712A (en) * | 1981-09-18 | 1985-07-16 | Research Corporation | Coated cells and their use |
| SE462454B (sv) * | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
| CA2015938C (en) * | 1989-05-02 | 1999-09-07 | Kevin M. Knigge | Covalent attachment of specific binding members to a solid phase |
-
1991
- 1991-11-06 DE DE59106527T patent/DE59106527D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-06 EP EP19910118879 patent/EP0485874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 CA CA002055117A patent/CA2055117A1/en not_active Abandoned
- 1991-11-13 JP JP29717191A patent/JP3280404B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0485874A2 (de) | 1992-05-20 |
| JPH04268455A (ja) | 1992-09-24 |
| EP0485874A3 (en) | 1993-01-20 |
| DE59106527D1 (de) | 1995-10-26 |
| EP0485874B1 (de) | 1995-09-20 |
| CA2055117A1 (en) | 1992-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gao et al. | Oriented immobilization of antibodies onto sensing platforms-A critical review | |
| US9310373B2 (en) | Molecular conjugate | |
| JP3280404B2 (ja) | イムノセンソリートランスデューサー | |
| JP3423032B2 (ja) | 固体担体上のバイオ特異的認識表面およびそれらの製造方法 | |
| Yuan et al. | Sensitivity enhancement of SPR assay of progesterone based on mixed self-assembled monolayers using nanogold particles | |
| JP3831183B2 (ja) | 新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法 | |
| US8389298B2 (en) | Methods using novel chemiluminescent labels | |
| WO2008028206A2 (de) | Verfahren zur herstellung von reaktiven einmolekülschichteinheiten | |
| US4287345A (en) | Polyfunctional disulfide compounds having S--S exchange reactivity | |
| JPH0561279B2 (ja) | ||
| US20060205094A1 (en) | Methods using novel chemiluminescent labels | |
| KR100869589B1 (ko) | 바이오센서를 이용한 생체 물질의 정량적 측정 방법 | |
| JPH03501623A (ja) | 蛋白誘導体及びその調製法 | |
| EP1413886A1 (en) | Sensor surface | |
| US5646302A (en) | Heterotrifunctional compounds for photoaffinity labelling | |
| KR100823154B1 (ko) | 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및분자인지방법 | |
| JPS6356228B2 (ja) | ||
| JP5344450B2 (ja) | 電解発光物質を内封するリポソームを用いた迅速高感度アッセイ法 | |
| EP1369692A2 (en) | Sensor surface | |
| Pandurangi et al. | Chemistry of Bifunctional Photoprobes: 4. Synthesis of the Chromogenic, Cleavable, Water Soluble, and Heterobifunctional Sulfosuccinimidyl (N-methylamino Perfluoroaryl Azido Benzamido)-ethyl-1, 3′-Dithiopropionate: An Efficient Protein Cross-Linking Agent | |
| JP2006219499A (ja) | 新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法 | |
| KR100804022B1 (ko) | 비스아자크라운에테르칼릭사렌 연결체 및 이의 제조방법 | |
| JPS6052745B2 (ja) | 新規な化合物 | |
| JPH10313891A (ja) | 核酸，蛋白質等の標識物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090222 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090222 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 10 |