KR100823154B1 - 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및분자인지방법 - Google Patents

크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및분자인지방법 Download PDF

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2610/00—Assays involving self-assembled monolayers [SAMs]

Abstract

본 발명은 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및 분자인지방법에 관한 것으로, 구체적으로는 한쪽 말단에 크라운 에터 유도체와 다른 쪽 말단에 다이설파이드, 싸이올과 같은 다양한 반응기가 도입된 화합물로서, 상기 다이설파이드 또는 싸이올이 금속 박막과 결합하여 자기조립막을 형성하고, 이 자기조립막의 크라운 에터 유도체 부분에 생체분자가 고정되는 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및 분자인지방법에 관한 것이다. 본 발명의 크라운 에터 유도체는 자기조립단분자막을 형성할 수 있고, 항원-항체 반응을 인지하므로 화학 또는 바이오 센서로 이용할 수 있고, 이온 또는 유기단분자 화합물을 선택적으로 포획 내지 함유하므로 약물 수송 물질로 사용될 수 있고, 암모늄 이온을 갖는 분자의 인지 특성이 우수하므로 단백질 센서로서도 사용될 수 있으므로 경제성이 높다.
크라운 에터 유도체, 자기조립단분자막, 항원-항체 반응, 바이오센서

Description

크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및 분자인지방법{Crown ether derivatives and process for immobilization of biomolecules and process for recognizing molecules by using the same}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 크라운 에터 유도체의 자기조립단분자막에 항체와 항원을 접촉시킴에 따른 Quartz Crystal Microbalance(QCM) 데이터를 나타낸 그래프;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 크라운 에터 유도체의 자기조립단분자막에 서로 다른 농도의 항원을 접촉시킴에 따른 QCM 데이터를 나타낸 그래프; 및
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 크라운 에터 유도체의 자기조립단분자막에 서로 다른 단백질을 접촉시킴에 따른 QCM 데이터를 나타낸 그래프;
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 크라운 에터 유도체의 자기조립단분자막에 항체 및 카제인을 접촉시킴에 따른 QCM 데이터를 나타낸 그래프; 및
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 크라운 에터 유도체의 자기조립단분자막에 항체-항원 및 카제인을 접촉시킴에 따른 QCM 데이터를 나타낸 그래프.
본 발명은 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및 분자인지방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한쪽 말단에 크라운 에터 유도체와 다른 쪽 말단에 다이설파이드, 싸이올과 같은 다양한 반응기가 도입된 화합물로서, 상기 다이설파이드 또는 싸이올이 금속 박막과 결합하여 자기조립막을 형성하고, 이 자기조립막의 크라운 에터 유도체 부분에 생체분자가 고정되는 크라운 에터 유도체, 이를 이용한 고정화 방법 및 분자인지방법에 관한 것이다.
생체분자 고정화 방법은 오래전부터 개발되어 온 기술로 다양한 생체물질들을 분리, 정제하는 데 유용하고, 효소저해제 탐색, 산업적으로 의약품과 다른 유용물질의 제조 및 독성물질의 여과제로도 사용이 가능하여 많이 이용되어 왔다. 최근, 인간 유전자 해독이 대부분 완료되면서 단백질의 기능 및 생리활성 규명, 효소의 산업적 응용에 대한 필요성이 커지고 있다.
생체분자를 고정화시키는 방법에는 흡착법, 랑뮈에르-블로젯트(Langmuir-Blodgett: LB)법, 자기조립법(Self-Assembly, SA), 이온결합법, 막이용법 등 여러가지가 있다.
그 중 비공유 결합을 이용한 분자와 분자간의 상호작용을 통한 흡착에 의해, 고체 기질 표면으로의 결합이 일어나는 흡착법은, 기질 표면 물성이 흡착성 결합을 할 수 있는 충분한 안정성이 보장되는 기질에만 사용할 수 있는 단점이 있다.
LB법은 LB막을 제조하기 위한 적합한 물질을 물의 표면상에 적당히 살포하게 되면, 이 물질들이 물의 표면상에 넓게 확산되어 단일 분자막을 형성하고, 이것을 이용하여 원하는 작용기가 고체 기질의 표면 위쪽으로 분포하게 만든다. 가장 손쉽게 균일한 막을 제작할 수 있고, 단분자막의 두께를 얇게 조절할 수 있으나, 재료 사용의 제한과 결합이 매우 약하기 때문에 열 등과 같은 물리적 변화와 화학적 변화에 약하다.
또한, 생체분자를 고체 기질 표면상에 결합시키는 다른 방법으로 자기조립(Self-Assembly, SA)법이 있다. 유기 표면의 안정한 필름이 고체 기질 표면상에 흡착되는 동안 분자들의 자발적인 자기조립에 의해 형성되는 것을 이용한다.
이온결합방식으로 단백질 단분자층을 제조하는 방법은 캘릭사렌(Calixarene)이라는 고정화 분자를 제조하고, 이 분자는 새장(cage) 형태로 암모니아 이온만 선택적으로 결합하는 특성을 가지고 있어, 단백질의 경우, 라이신(Lysine)을 가지고 있는 아미노기가 새장 분자에 수용되는 것이다.
또한, 막(membrane)을 사용하여 고정화하는 방법은 주로 항원, 항체를 스크 리닝하는 데 많이 사용되어 왔으며, 사용되는 막으로는 나일론, 니트로셀룰로오즈를 이용하고, 단백질 용액을 기판상 막에 뿌려 줌으로써 고정화한다.
대한민국 특허공개공보 제2003-95645호에 기재된 불포화지방산을 이용한 크라운 에터 유도체의 제조방법, 이에 의해 제조된 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법은, 이중 결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 카복실기를 가지는 불포화지방산과 아크릴아미드의 수용성 모노머를 첨가중합시켜, 이들 성분내에 존재하는 이중결합들이 반응하여 공중합 고분자 물질의 골격사슬이 되며, 작용기인 카복실기를 가지는 불포화지방산의 알킬사슬이 스페이서 팔이 되는 고체 지지체의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 지지체에 관한 것이며, 또한 이러한 고체 지지체를 이용하여 효소의 활성을 유지하면서 효소를 고정화시키는 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 기술을 이용하면 기존의 생체 분자를 고정화시키는 시간을 30시간에서 15시간으로, 1개월 후의 활성을 70%에서 90% 이상으로 올릴 수 있으며, 공정 절차의 단순화 및 시약이 저렴하여 가격을 1/3 이하로 낮출 수 있으나, 고정화되는 단백질의 방향을 일정하게 제어하기 어렵다는 단점이 있다.
또한, 대한민국 등록특허 제10-377946호에 기재된 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법에서, 덴드리머의 단분자막은 금속 또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기, 또는 숙신이미드로 수식된 알칸싸이올 분자를 이용하여, 자기조립박막을 수득하는 단계; 및 전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 N-하이드 로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머를 반응시킴으로써 덴드리머의 단분자막을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 상기 제조된 단분자막은 단백질, 항원, 항체, 효소, 수용체, 및 리간드를 반응시켜 생체분자의 단분자막을 제조할 수 있으며, 이는 진단용 킷트, 바이오센서의 개발 및 유용물질의 생산을 위한 효소의 고정화, 단백질 칩 등 생명공학 및 생물공학 분야에 활용될 수 있다. 상기 기술을 이용하면, 알칸싸이올 분자에 의해 금을 포함한 금속 박막 기판과 결합을 하여 상기 금속 박막상에서 자기조립박막을 형성하나, 연결 분자가 구조적으로 단순하고, 다양한 작용기의 도입이 불가능하여 고정된 단백질의 활성이 저하되는 문제점이 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 한쪽 말단에 크라운 에터 유도체와 다른 쪽 말단에 다이설파이드, 싸이올과 같은 다양한 반응기가 도입된 화합물을 제조하고, 이 화합물의 다이설파이드 또는 싸이올이 금속 박막과 결합한 자기조립막을 형성하고, 이 자기조립막의 크라운 에터 유도체 부분에 생체분자가 고정됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 한쪽 말단에 크라운 에터 유도체와 다른 쪽 말단에 다이설파이드, 싸이올과 같은 다양한 반응기가 도입된 화합물로서, 상기 다이설파이드 또는 싸이올이 금속 박막과 결합하여 자기조립막을 형성하고, 이 자기조립막의 크라운 에터 유도체 부분에 생체분자가 고정되는 싸이아졸 고리를 포함하는 크라운 에터 유도체 및 이를 이용한 생체분자 고정화 방법 및 분자인지방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 5로 표시되는 다이설파이드 또는 싸이올기가 도입된 크라운 에터 유도체를 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112006034726057-pat00001
n=0, 2; A=
Figure 112006034726057-pat00002
, -SH, 또는
Figure 112006034726057-pat00003
이다.
<화학식 5>
Figure 112006034726057-pat00004
m=0, 1 이다.
또한, 본 발명은 크라운 에터 유도체를 형성하는 단계; 상기 크라운 에터 유 도체의 다이설파이드 반응기 또는 싸이올 반응기가 금속 박막과 결합하여 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 및 상기 자기조립단분자막의 상기 크라운 에터 유도체 작용기에 암모늄 이온을 포함하는 생체분자를 고정시키는 단계를 포함하는 생체분자 고정화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 크라운 에터 유도체를 형성하는 단계; 상기 크라운 에터 유도체의 다이설파이드 반응기 또는 싸이올 반응기가 금속 박막과 결합하여 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 상기 자기조립단분자막의 상기 크라운 에터 유도체 작용기에 암모늄 이온을 포함하는 생체분자를 고정시키는 단계; 상기 암모늄 이온을 포함하는 생체분자와 결합하는 분자를 상기 자기조립단분자막과 접촉시키는 단계를 포함하는 분자인지방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 크라운 에터 유도체는 암모늄 이온에 대한 선택성을 갖는 (싸이아졸벤조)크라운 유도체의 한쪽 말단에 금속 표면과 결합할 수 있는 다이설파이드 반응기 또는 싸이올 반응기를 가지고 있다.
상기 크라운 에터 유도체의 반대편에 있는 다이설파이드 또는 싸이올은 금속 박막과 결합하여 자기조립단분자막을 형성한다. 상기 금속 박막의 재료는 금, 은, 구리, 백금, 아연, 또는 알루미늄으로, 특히 금이 바람직하다.
자기조립단분자막(SAM:Self-Assembled Monolayers)은 주어진 기질(금속) 표면에 자발적으로 입혀진 규칙적으로 잘 정렬된 유기분자막을 말한다. 상기 자기조립단분자막은 기질(금속)과 결합하는 반응기(다이설파이드 또는 싸이올)와 규칙적인 분자막 형성을 가능하게 하는 알칸사슬, 그리고 분자막의 기능을 좌우하는 작용기(크라운 에터 유도체)로 구성되어 있다. 여기서, 단분자막의 배열이 일정하고, 배열의 방향성을 부여하는 것은 알칸의 결합각 때문이다.
상기 크라운 에터 유도체는 암모늄 이온을 갖는 생체분자와 결합할 수 있다. 여기서, 상기 생체분자는 암모늄 이온을 갖는 것이면 어느 것이든 무방하나, 특히 알부민을 포함한 항원, 암모니아를 포함한 단분자, 유기암모늄 화합물, 아미노산, 단백질을 예로 들 수 있다. 상기 생체 분자는 분자 크기가 상기 크라운 에터 유도체의 포어에 들어갈 수 있는 크기이므로 상기 생체분자가 상기 크라운 에터 유도체와 물리적, 화학적인 방법으로 결합할 수 있다. 또한, 하나의 크라운 에터 유도체가 아닌 수개의 크라운 에터 유도체가 함께 생체분자를 고정화할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 크라운 에터 유도체는 금속 표면에 자기조립단분자막을 형성하므로 생체분자의 종류에 따른 화학 센서, 바이오 센서, 약물 수송 물질 또는 단백질 센서로 이용할 수 있다.
즉, 암모늄 이온을 포함한 생체분자가 본 발명의 크라운 에터 유도체로 형성된 자기조립단분자막에 흡착시킨 후, 상기 생체분자와 결합하는 분자를 상기 자기조립단분자막과 접촉시킨다. 그러면, 상기 생체분자와 결합하는 분자가 상기 자기조립단분자막에 결합하므로, 그 결합 전후의 자기조립단분자막의 질량등의 물성 변화 측정을 통해 분자를 인지할 수 있다.
일 예로, 상기 생체분자는 항체이고, 상기 생체분자와 결합하는 분자는 항원일 수 있다. 또한, 상기 항체는 글로불린이고, 상기 항원은 알부민일 수 있다.
이와 같이 알부민-글로불린의 항원-항체 반응을 이용하면, 소변 내 알부민 농도를 감지하는 데 응용할 수 있다. 높은 알부민의 혈중 농도는 당뇨병의 증상이므로 본 발명의 크라운 에터 유도체는 당뇨병 진단용 칩에 응용할 수 있다.
본 발명의 크라운 에터 유도체의 바람직한 일 실시형태는 하기 화학식 2로 표시되는 싸이아졸로다이벤조크라운에터(BTB)-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 9)일 수 있다.
<화학식 2>
Figure 112006034726057-pat00005
본 발명의 크라운 에터 유도체의 바람직한 일 실시형태는 하기 화학식 3으로 표시되는 싸이아졸로다이벤조크라운에터(BTB)-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물(화합물 12)일 수 있다.
<화학식 3>
Figure 112006034726057-pat00006
본 발명의 크라운 에터 유도체의 바람직한 일 실시형태는 하기 화학식 4로 표시되는 싸이아졸로다이벤조크라운에터(BTB)-에틸아민-캐프로익-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 14)일 수 있다.
<화학식 4>
Figure 112006034726057-pat00007
본 발명의 크라운 에터 유도체의 바람직한 일 실시형태는 하기 화학식 6으로 표시되는 15-벤조크라운-5-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 16)일 수 있다.
<화학식 6>
Figure 112006034726057-pat00008
본 발명의 크라운 에터 유도체의 바람직한 일 실시형태는 하기 화학식 7으로 표시되는 18-벤조크라운-6-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 17)일 수 있다.
<화학식 7>
Figure 112006034726057-pat00009
또한, 본 발명의 크라운 에터 유도체의 제조방법은,
BTB-아미노, BTB-에틸아민 또는 벤조크라운-에터아민을 제조한 후, 싸이옥트산, 포타슘 싸이오아세테이트와 반응시켜 BTB-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물, BTB-에틸아민-캐프로익-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물, BTB-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물 또는 벤조크라운-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물을 제조하는 것이다.
상기 크라운 에터 유도체 BTB-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 9)의 제조방법은 하기 반응식 1과 같이 표시되고,
<반응식 1>
Figure 112006034726057-pat00010
(ⅰ) 1,2-비스[2-싸이오아미드]메틸옥시벤젠(화합물 1)과 1,3-디클로로아세톤을 벤젠 용매하에서 반응시켜 1,2-비스[2(4-클로로메틸)싸이아졸릴]메틸옥시벤젠(화합물 2)을 제조하는 단계;
(ⅱ) 상기 1,2-비스[2(4-클로로메틸)싸이아졸릴]메틸옥시벤젠(화합물 2)과 니트로 카테콜을 반응시켜 4-니트로-싸이아졸로다이벤조크라운에터(화합물 5)화합물을 제조하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 BTB-니트로 화합물(화합물 5)을 팔라듐 촉매와 반응시켜 BTB-아민 화합물(화합물 6)을 얻고, 싸이옥트산과 반응시켜 BTB-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 9)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 크라운 에터 유도체 BTB-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물(화합물 12)의 제조방법은 하기 반응식 2와 같이 표시되고,
<반응식 2>
Figure 112006034726057-pat00011
Figure 112006034726057-pat00012
(ⅰ) 상기 BTB-아민 화합물(화합물 6)을 제조하는 단계;
(ⅱ) 상기 BTB-아민 화합물(화합물 6)과 6-브로모헥사노익산을 반응시켜 BTB-아미노-6-브로모 화합물(화합물 11)을 제조하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 BTB-아미노-6-브로모 화합물(화합물 11)에 포타슘 싸이오아세테이 트와 반응시켜 BTB-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물(화합물 12)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 크라운 에터 유도체인 BTB-에틸아민-캐프릭-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 14)의 제조방법은 하기 반응식 3에 표시되는 것과 같이,
<반응식 3>
Figure 112006034726057-pat00013
(ⅰ) BTB-에틸아민 화합물(화합물 8)을 제조하는 단계;
(ⅱ) 상기 BTB-에틸아민 화합물(화합물 8)과 6-(카보벤질옥시아미노)캐프릭산을 반응시켜 BTB-에틸아민-6-(카보벤질옥시아미노)캐프릭산 화합물(화합물 13)을 제조하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 BTB-에틸아민-6-(카보벤질옥시아미노)캐프릭산 화합물(화합물 13)과 싸이옥트산을 반응시켜 BTB-에틸아민-캐프릭-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 14)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 크라운 에터 유도체인 15-벤조크라운-5-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 16)의 제조방법은 하기 반응식 4에 표시된 것과 같이,
<반응식 4>
Figure 112006034726057-pat00014
(ⅰ) 15-벤조크라운-5-에터아민 화합물(m=0 인 경우)을 제조하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 15-벤조크라운-5-에터아민 화합물(m=0인 경우)과 싸이옥트산을 반응시켜 15-벤조크라운-5-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 16)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 크라운 에터 유도체인 18-벤조크라운-6-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 17)의 제조방법은 하기 반응식 5에 표시된 것과 같이,
<반응식 5>
Figure 112006034726057-pat00015
(ⅰ) 18-벤조크라운-6-에터아민 화합물(m=1 인 경우)을 제조하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 18-벤조크라운-6-에터아민 화합물(m=1 인 경우)과 싸이옥트산을 반응시켜 18-벤조크라운-6-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 17)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 크라운 에터 유도체로 형성된 자기조립단분자막은 수정결정미세저울(QCM; Quartz Crystal Microbalance) 측정결과, 그 자체의 안정성, 항체와의 결합 안정성, 항원과의 결합 안정성 면에서 구체적인 실시예에 따라 변화하는 특성을 보이지만, 대체적으로 안정된 결합을 한다.
그 중 BTB-에틸아민-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 10)이 BTB-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 9)보다 자기조립단분자막(SAM) 형성시 에틸아민기에 의해 더 안정한 결합력을 나타내고, 항체는 큰 분자이므로 크라운 에터 여러 분자가 결합하는 관계로 항체와 결합시 에틸아민기는 큰 영향을 미치지 못하므로 항체 결합은 비슷하고, 항체와 결합한 후 항원과 결합할 때는 항체와 항원과의 분자 크기와 결합력에 따라 에틸아민기의 영향이 달라지나 화합물 10이 조금 더 안정된 결합을 한다.
18-벤조크라운-6-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 17)은 15-벤조크라운-5-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 16)보다 SAM 결합은 약하나, 항체 처리와 항원 처리를 하였을 때는 더 강한 결합을 한다.
그러므로, 자기조립단분자막 형성시, 본 발명의 크라운 에터 유도체를 항원-항체의 종류에 맞도록 선택할 수 있다.
SAM을 잘 형성하는 화합물은 내림 순서로 10 → 9 → 16 → 17이다.
항체 결합이 잘 일어나는 화합물은 내림 순서로 10 → 9 → 17 → 16이다. 이 결과는 생체분자와 결합하는 고리의 크기가 15-벤조크라운-5-에터보다 18-벤조크라운-6-에터가 적합하기 때문이다.
항원 결합이 잘 일어나는 화합물은 내림 순서로 10 → 17 → 9 → 16이다. 이 결과는 금속 박막에 의해 SAM 분자가 지탱되므로 너무 멀리 떨어져 있으면 항원 처리시 흔들려 결합이 저해되기 때문이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 크라운 에터 유도체의 제조
<실시예 1> BTB-아미노-싸이옥트산 컨쥬게이트 화합물(화합물 9)의 제조
(1) 1,2-비스[2(4-클로로메틸)싸이아졸릴]메틸옥시벤젠 (화합물 2)의 제조
1,2-비스[2-싸이오아미드]메틸옥시벤젠(화합물 1)(1.00 g, 3.90 mmol)과 1,3-디클로로아세톤(1.00 g, 8.58 mmol)을 벤젠(70 mL) 용매하에서 딘-스탁(Dean-Stark) 컬럼을 사용하여 물을 제거하면서 20시간 동안 환류 교반시킨 다음, 박막 크로마토그래피로 반응이 종결된 것을 확인한 후, 용매를 감압 증류하여 제거하고 디클로로메탄으로 추출하여 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음 실리카겔 컬럼(에틸아세테이트:헥산 = 1:4 부피비)으로 분리 정제하여 화합물 2(1.32 g, 3.28 mmol)를 84% 수율로 얻었다.
녹는점(mp): 116oC (CH2Cl2-hexane); Rf 0.48 (1:1 = 에틸아세테이트:헥산); IR (KBr) 1510, 1447, 1264, 1131, 1042, 709 cm-1; 1H NMR δ 7.33 (s, 1H, H-5' of Thz ), 7.04-6.97 (m, 2H, Ph), 5.42(s, 2H, OCH2Thz), 4.72 (s, 2H, ThzCH2 Cl); 13C NMR δ 168.3 (C-2 of Thz), 151.9 (C-4 of Thz), 147.9 (C-1 of Ph), 122.8 (C-4 of Ph), 118.2 (C-3 of Ph), 115.4 (C-5 of Thz), 68.7 (OCH2Thz), 40.7 (ThzCH2Cl); MS (상대세기, %) m/z 401 (M+, 0), 365 (1), 292 (4), 278 (1), 254 (3), 146 (100), 121 (27), 106 (12), 85 (8), 71 (24), 52 (10); 원소 분석 C16H14N2O2Cl2S2: 이론값, C 47.88, H 3.52, N 6.98, S 15.98. 측정값, C 47.98, H 3.59, N 6.94, S 16.25.
(2) [2-(3,4-디하이드록시페닐)에틸]-카바민산 tert -부틸 에스터 (화합물 4) 화합물의 제조
4-(2-아미노에틸)-벤젠-1,2-디올 화합물(1.00 g, 6.53 mmol)을 메탄올에 녹인 후 tert-부톡시카보닐-무수물(Boc-anhydride)(1.1 eq, 1.56 g)를 넣고 30분 동안 교반하다가 1M 수산화나트륨 수용액을 스포이드를 이용해서 소량씩 첨가하였다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인한 후 용매를 감압하에서 제거하고 반응 혼합물에 물을 넣은 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조한 후 감압하에서 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼(분리 용매는 75 % 에틸아세테이트-헥산 혼합용매)으로 분리 정제하여 화합물 4(5.22 mmol, 80 %)를 얻었다. 분석 시료는 디클로로메탄-헥산으로 재결정하였다.
녹는점(mp): 136-138℃; 박막크로마토그래피 Rf 0.58 (100 % 에틸아세테이트); 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 6.78 (d, J = 6.18 Hz, 1H, Ph), 6.69 (s, 1H, Ph), 6.59 (s, 1H, Ph), 4.59 (bs, 1H, -CH2CH2NH-Boc), 3.31 (s, PhCH2CH2-), 2.65 (t, J= 7.2 Hz, 2H, PhCH2CH2-), 1.43 (s, 9H, -OC(CH3)3); 13C NMR δ 157.2, 142.9, 141.0, 124.6, 121.2, 117.5, 116.2, 41.9, 35.5, 28.7.
(3) 싸이아졸로다이벤조크라운에터(BTB)-니트로 화합물(화합물 5)의 제조
4-니트로 카테콜 화합물 3(500 mg, 3.22 mmol)을 메틸에틸케톤(methyl ethyl ketone, 100 mL)에 녹인 후 탄산칼륨(2.2 eq(당량))과 요오드화나트륨(2.2eq)을 넣고 60℃에서 1시간 동안 환류교반 시켰다. 화합물 2(1.1eq)를 메틸에틸케톤에 녹인 용액을 적하관을 이용하여 반응 용액에 천천히 적하하였다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 용매를 감압하에서 제거하고 반응 혼합물에 물을 넣은 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압하에서 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼(분리 용매는 80% 에틸아세테이트-헥산 혼합용매)으로 분리 정제하여 778 mg의 BTB-NO2 화합물 5(1.61 mmol, 52%)를 얻었다. 분석 시료는 디클로로메탄-헥산으로 재결정하였다.
녹는점(mp): 227-228℃ (디클로로메탄-헥산); 박막 크로마토그래피 Rf 0.33 (에틸아세테이트-헥산 3:1); IR (KBr) 2926, 2361, 1589, 1503, 1344, 1277, 1242, 1003, 739 cm-1; 1H NMR δ 7.86 (s, 1H, H-5' of Thz), 7.81 (s, 1H, H-5' of Thz), 6.95 - 7. 95 (m, 7H, Ph), 5.20 (s, 8H, OCH2-Thz, Thz-CH2O); 13C NMR 163.7 (C-2'of Thz), 153.8 (C-11), 151.4 (C-4' of Thz), 151.1 (C-4' of Thz), 147.8 (C-10), 147.7 (C-1), 147.6 (C-2), 140.9 (C-13' of Ph), 122.0 (C-4' of Ph), 121.7 (C-5' of Ph), 121.6 (C-14' of Ph), 118.0 (C-15' of Ph), 117.0 (C-5' of Thz), 113.4 (C-12'of Ph), 111.8 (C-3' of Ph), 107.5 (C-6' of Ph), 65.9 (OCH2-Thz), 65.8 (OCH2-Thz), 65.4 (Thz-CH2O), 54.9 (Thz-CH2O); MS (상대세기, %) m/z 483 (M+, 6) 221 (11), 189 (27), 188 (16), 121 (19), 113 (8), 112 (33), 111 (100), 110 (94), 108 (8), 71 (61), 67 (18); 원소 분석 C22H17N3O6S2: 이론값, C 54.65, H 3.54, N 8.69, S 13.26. 측정값, C 53.84, H 3.50, N 8.41, S 13.55.
(4) 싸이아졸로다이벤조크라운에터(BTB)-아민 화합물(화합물 6)의 제조
화합물 5(500 mg, 1.03 mmol)를 디메틸포름아마이드(10 mL)에 녹인 다음 10% Pd/C 촉매 (20 mg)를 넣고 상온 1 기압 수소하에서 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 반응 혼합물을 셀라이트 컬럼을 통해 여과하여 촉매를 제거하고 에틸아세테이트로 여러 번 세척한 후 용매를 감압하에서 제거하고 정제하지 않은 혼합물 510 mg을 얻었다. 추가적인 분리 과정 없이 다음 반응으로 진행시켰다.
(5) BTB 에틸아민 tert - Boc 화합물(화합물 7)의 제조
화합물 2(1.00 g, 3.95 mmol)를 메틸에틸케톤(100 mL)에 녹인 후 탄산칼륨(2.2 eq)과 요오드화나트륨(2.2 eq)을 넣고 60℃에서 1시간 동안 환류 교반시켰다. 화합물 4(1.1 eq)를 메틸에틸케톤에 녹인 용액을 적하관을 이용하여 반응 용액에 천천히 적하하였다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 용매를 감압하에서 제거하고 반응 혼합물에 물을 넣은 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압하에서 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 1.65 g의 BTB 에틸아민-tert-Boc 화합물 7(2.85 mmol, 72 %)을 얻었다. 분리 용매는 50 % 에틸아세테이트-헥산, 분석 시료는 디클로로메탄-헥산으로 재결정하였다.
녹는점(mp): 164-166℃; 박막 크로마토그래피 Rf 0.31 (에틸아세테이트-헥산 2:1); IR (KBr) cm-1 ;1H NMR δ 7.79 (s, 2H, Thz-H), 7.29-7.16 (m, 2H, Ph), 7.04-6.97 (m, 4H, Ph), 6.76 (m, 1H, Ph), 5.26 (s, 4H, -OCH 2Thz), 5.05 (s, 2H, ThzCH 2 O-), 5.02 (s, 2H, ThzCH 2 O-), 3.17 (s, 1H, Ph-CH2CH 2NHCO), 2.67 (s, 1H, Ph-CH2CH 2NHCO), 1.38 (s, 9H, -OC(CH 3)3); 13C NMR δ 163.9, 163.8, 155.9, 152.6, 152.5, 148.1, 148.0, 146.7, 132.6, 122.1, 121.1, 120.9, 120.8, 114.6, 114.0, 113.4, 77.8, 66.1 (OCH3), 65.8 (OCH3), 35.4 (C(CH3)3), 28.7 (C(CH3)3); MS (상대세기, %) m/z 581 (M+, 14),525 (13), 508 (16), 452 (39), 330 (63), 221 (72), 189 (100), 111 (85), 57 (33).
(6) BTB 에틸아민 화합물(화합물 8)의 제조
화합물 7(1.00 g, 1.72 mmol)을 아르곤기류 하에서 건조된 디클로로메탄(50 mL)에 녹인 후 삼불화초산(15 eq)을 넣고 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 반응 혼합물에 남아 있는 삼불화 초산을 제거하기 위해 1N 수산화나트륨 수용액을 넣어 완전히 중화시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 추가적인 분리 정제 과정 없이 디클로로메탄 하에서 재결정을 통해서 580 mg의 화합물 8(1.21 mmol, 70 %)을 얻었다.
녹는점(mp): 171-173oC (디클로로메탄); 박막 크로마토그래피 Rf 0.13 (디클로로메탄-메탄올-수산화암모늄 16:5:1); IR (KBr) 3426, 3074, 2930, 1687, 1507, 1246, 1201, 1121, 1022, 799 cm-1; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.92 (bs, 2H, CH2CH2NH2), 7.84 (s, 1H, Thz-H), 7.83 (s, 1H, Thz-H), 7.19-7.16 (m, 2H, Ph), 7.08-6.98 (m, 2H, Ph), 7.05 (d, J= 8.1 Hz, Ph), 7.01 (bs, 1H, Ph), 6.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ph), 5.28 (s, 2H, OCH2-Thz), 5.27 (s, 2H, OCH2-Thz), 5.07 (s, 2H, Thz-CH2O), 5.03 (s, 2H, Thz-CH2O), 3.07 (t, J = 8.4 Hz, 2H, CH2CH2NH2), 2.82 (t, J = 8.4 Hz, 2H, CH2CH2NH2); 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 164.0, 151.9, 147.7, 147.5, 146.6, 129.9, 121.5, 120.7, 113.8, 65.5 (OCH2-Thz), 65.1 (Thz-CH2O), 40.6 (CH2CH2NH2), 32.6 (CH2CH2NH2); 원소 분석 C24H23N3O4S2: 이론값, C 59.86, H 4.81, N 8.73, S 13.32. 측정값, C 59.11, H 4.60, N 8.88, S 13.75.
(7) BTB-아미노-싸이옥트산 화합물(화합물 9)의 제조
화합물 5(500 mg, 1.03 mmol)를 디메틸포름아마이드(10 mL)에 녹인 다음 10% Pd/C 촉매(20 mg)를 넣고 상온 1 기압 수소하에서 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 반응 혼합물을 셀라이트 컬럼을 통해 여과하여 촉매를 제거하고 에틸아세테이트로 여러 번 세척한 후 용매를 감압하에서 제거하고 정제하지 않은 혼합물 505 mg을 얻었다. 추가적인 분리 과정 없이 다음 반응으로 진행시켰다. 먼저 싸이옥트산(430 mg, 2.06 mmol, 2.2 eq)을 아르곤 기류 하에서 건조된 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 1,3-디이소프로필카보디이미드(1,3-diisopropylcarbodiimide, DIC, 0.32 mL, 2.06 mmol, 2.2 eq)와 1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트(1-hydroxybenzotriazole hydrate, HOBt, 295 mg, 2.06 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 앞선 반응에서 얻은 정제하지 않은 혼합물(505 mg)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 460 mg의 화합물 9(0.72 mmol, 70%)를 얻었다.
녹는점(mp): 139-141oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.17 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3423, 2928, 1659, 1606, 1507, 1456, 1243, 1121, 1022, 836, 730 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.27 (s, 1H, -NH), 7.43 (s, 1H, -Ph), 7.16 (s, 1H, Thz-H), 7.13 (s, 1H, -Thz), 6.95 (s, 5H, -Ph), 6.78 (d, J = 8.0 Hz, 1H, -Ph), 5.13 (s, 2H, -OCH2-Thz), 5.10 (s, 2H, -OCH2-Thz), 4.92 (s, 2H, Thz-CH2O-), 4.85 (s, 2H, Thz-CH2O-), 3.44 (m, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.37 (m, 3H), 1.83 (m, 1H), 1.65 (m, 4H, -COCH2CH2CH2-), 1.44 (m, 2H, -COCH2CH2CH2-); 13C NMR δ 171.9, 167.7, 166.4, 166.1, 152.4, 151.6, 149.6, 149.2, 145.5, 140.5, 134.1, 123.7, 119.4, 118.5, 117.7, 108.8, 93.9, 68.7, 67.1, 62.6, 40.6, 38.9, 37.6, 35.1, 29.3, 25.7, 25.6, 23.0, 17.5; 원소 분석 C30H31N3O5S4: 이론값, C 56.14, H 4.87, N 6.55, S 19.98. 측정값, C 56.28, H 4.54, N 6.40, S 19.29.
< 실시예 2> BTB 에틸아민 - 싸이옥트산 - 컨쥬게이트 화합물(화합물 10)의 제조
싸이옥트산(290 mg, 1.39 mmol, 2.2 eq)을 아르곤 기류 하에서 건조된 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC, 0.22 mL, 1.39 mmol, 2.2 eq)와 1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBt, 198 mg, 1.39 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 실시예 1의 화합물 8(300 mg, 0.63 mmol)과 트리에틸아민(NEt3, 0.93 mL, 6.3 mmol, 10 eq)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 300 mg의 화합물 10 (0.45 mmol, 72 %)을 얻었 다.
녹는점(mp): 112-114oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.07 (100 % 에틸아세테이트); IR (KBr) 3427, 3107, 2924, 2859, 1642, 1502, 1246, 1135, 1018, 740 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.21 (s, 1H, Thz-H), 7.20 (s, 1H, Thz-H), 7.09 (m, 2H, Ph), 7.04 (m, 2H, Ph), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ph), 6.89 (d, J= 2.0 Hz,, 1H, Ph), 6.80 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H, Ph), 5.69 (bs, 1H, -CH2NH-), 5.22 (s, 4H, OCH2-Thz), 5.06 (s, 4H, Thz-CH2O), 3.53 (m, 3H), 3.12 (m, 2H), 2.77 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.44 (m, 1H), 2.14 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.89 (m, 1H), 1.65 (m, 4H), 1.44 (m, 2H); 13C NMR (400MHz, CDCl3) δ 172.7, 165.6, 165.5, 152.7, 152.5, 149.7, 149.1, 148.2, 133.4, 123.4, 122.5, 118.0, 117.9, 117.8(2), 117.6, 117.3, 117.2, 69.3, 69.2, 68.6, 68.4, 56.4, 40.5, 40.2, 38.5, 36.4, 35.2, 34.6, 34.6, 28.9, 25.4; 원소 분석 C32H35N3O5S4: 이론값, C 57.37, H 5.27, N 6.27, S 19.15. 측정값, C 57.28, H 5.34, N 6.00, S 18.71.
<실시예 3> BTB-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물(화합물 12)의 제조
(1) BTB-아미노-브로모헥사노익산 화합물(화합물 11)의 제조
6-브로모헥사노익산(262 mg, 1.32 mmol, 2.0 eq)을 아르곤기류 하에서 건조 된 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 DIC(0.21 mL, 1.32 mmol, 2.0 eq)와 HOBt(187 mg, 1.32 mmol, 2.0 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 실시예 1의 화합물 6(300 mg, 0.66 mmol)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 353 mg의 화합물 11(0.56 mmol, 85%)를 얻었다.
녹는점(mp): 130-132oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.40 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3065, 2933, 1671, 1606, 1508, 1455, 1243, 1025, 732, 641 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.07(s, 1H, -NH), 7.41 (d, J = 1.5 Hz, 1H, Ph), 7.11 (s, 1H, Thz-H), 7.07 (s, 1H, Thz-H), 5.12 (s, 2H, -OCH 2 Thz), 5.09 (s, 2H, -OCH 2 Thz), 4.92 (s, 2H, ThzCH 2 O-), 4.86 (s, 2H, -Thz-CH 2 O-), 3.32 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.41 (m, 2H); 13C NMR δ 171.7, 165.9, 165.5, 153.0, 152.2, 149.9, 149.4, 149.3, 145.9, 69.2, 69.0, 67.5, 37.5, 34.2, 32.9, 28.2, 25.1; 원소 분석 C32H35N3O5S4: 이론값, C 50.03, H 7.05, N 2.97, S, 13.60. 측정값, C 49.98, H 7.34, N 2.70, S 13.91.
(2) BTB-아미노-헥사노익-싸이올-컨쥬게이트 화합물(화합물 12)의 제조
화합물 11(300 mg, 0.48 mmol)을 에탄올(50 mL)에 녹인 후 포타슘 싸이오아세테이트(AcSK, potassium thioacetate, 167 mg, 1.44 mmol, 3 eq)를 넣고 10시간 동안 환류 교반시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하고 감압하에서 용매를 제거하고, 추가적인 분리 과정 없이 1 N 수산화나트륨(1.0 mL)을 넣고 에탄올(50 mL)하에서 3시간 더 환류 교반시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 157 mg의 화합물 12(0.27 mmol, 55%)를 얻었다.
녹는점(mp): 133-135oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.30 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3446, 2931, 2858, 1687, 1594, 1507, 1260, 1132, 1025, 958, 744, 626 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.14 (s, 1H, Thz-H), 7.13 (s, 1H, Thz-H), 7.03-6.94 (m, 6H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ph), 5.16 (s, 4H, -OCH 2 Thz), 5.01 (s, 2H, ThzCH 2 O-), 5.00 (s, 2H, ThzCH 2 O-), 3.39 (m, 2H), 2.79 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.52 (m, 4H), 1.32 (m, 3H); 13C NMR δ 196.4, 166.2, 166.1, 152.9, 152.8, 150.1, 149.6, 149.6, 149.5, 133.7, 123.9, 122.3, 118.4, 118.4, 118.1, 117.9, 117.5, 116.9, 72.8, 70.6, 69.7, 69.7, 69.1, 68.8, 31.0, 29.9, 29.8, 29.4, 29.0, 26.2; 원소 분석 C28H29N3O5S3: 이론값, C 57.61, H 5.01, N 7.20, S 13.70. 측정값, C 58.00, H 5.20, N 7.05, S 13.21.
<실시예 4> BTB-에틸아민-캐프릭-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 14)의 제조
(1) BTB-에틸아민-6-(카보벤질옥시아미노)캐프릭산 화합물(화합물 13)의 제조
6-(카보벤질옥시아미노)캐프릭산(244 mg, 0.90 mmol, 2.2 eq)을 아르곤기류 하에서 건조된 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 DIC (0.14 mL, 0.90 mmol, 2.2 eq)와 HOBt(130 mg, 0.90 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 실시예 1의 화합물 8 (200 mg, 0.41 mmol)을 넣고 상온에서 12시간 더 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로 메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 240 mg의 화합물 13(0.33 mmol, 80%)을 얻었다.
녹는점(mp): 101-102 oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.20 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3311, 3064, 2931, 2864, 1712, 1651, 1507, 1258, 1024, 736 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.22-7.19 (m, 5H, Ph), 7.10 (s, 1H, Thz-H), 7.09 (s, 1H, Thz-H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ph), 6.78 (s, 1H, Ph), 6.69 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H, Ph), 5.88 (s, 1H, -NH), 5.10 (s, 4H, -OCH 2 Thz), 4.96 (s, 2H), 4.94 (s, 4H, ThzCH 2 O-), 3.39 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 2.67 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.38 (m, 2H), 1.18 (m, 2H); 13C NMR δ 173.4, 166.0, 165.9, 156.9, 152.9, 152.7, 149.9, 149.4148.5, 137.1, 133.8, 128.9, 128.4, 123.7, 122.9, 118.4, 118.2, 118.1, 118.0, 117.5, 117.3, 69.4, 68.8, 68.5, 66.8, 41.2, 40.9, 36.8, 35.5, 30.0, 26.6, 25.7; 원소 분석 C38H40N4O7S2: 이론값, C 62.62, H 5.53, N 7.69, O 15.37. 측정값, C 62.68, H 5.50, N 7.59, O 15.49.
(2) BTB-에틸아민-캐프릭-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 14)의 제조
화합물 13(240 mg, 0.33 mmol)을 에탄올(10 mL)에 녹인 후 10% Pd/C 촉매 (20 mg)를 넣고 상온 1 기압 수소하에서 12 시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 반응 혼합물을 셀라이트 컬럼을 통해 여과하여 촉매를 제거하고 에틸 아세테이트로 여러 번 세척한 후 용매를 감압하에서 제거하였다. 추가적인 분리 과정 없이 잔류물을 다음 반응에 사용하였다. 먼저 싸이옥트산(152 mg, 0.73 mmol, 2.2 eq)을 아르곤기류 하에서 건조된 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 DIC(0.12 mL, 0.73 mmol, 2.2 eq)와 HOBt(103 mg, 0.73 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 앞선 반응에서 얻은 잔류 혼합물(250 mg)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 187 mg의 화합물 14(0.24 mmol, 72%)를 얻었다.
녹는점(mp): 94-96oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.20 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3417, 3111, 3064, 2911, 2864, 1672, 1517, 1258, 1135, 856, 710 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.29-7.21 (m, 6H), 7.13 (s, 1H, Thz-H), 7.10 (s, 1H, Thz-H), 6.90 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.20 (s, 4H, -OCH 2 Thz), 5.01 (s, 4H, ThzCH 2 O-), 3.53 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 2.81 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.54 (m, 4H), 2.19 (m, 4H), 1.88 (m, 2H), 1.56-1.51 (m, 8H), 1.33 (m, 4H); 13C NMR δ 185.6, 166.5, 166.4, 155.4, 155.4, 149.5, 149.5, 149.5, 148.0, 138.5, 124.8, 124.7, 124.7, 116.6, 116.6, 116.5, 116.4, 113.8, 113.7, 69.3, 69.2, 68.6, 68.3, 56.4, 43.1, 34.6, 34.3, 34.3, 31.0, 26.4, 26.0, 25.3; 원소 분석 C38H46N4O6S4: 이론값, C 58.29, H 5.92, N 7.15, S 16.38. 측정값, C 58.00, H 5.80, N 7.49, S 15.89.
<실시예 5> 15-벤조크라운-5-에터-아미노-싸이옥트산-컨쥬게이트 화합물(화합물 16)의 제조
15-벤조크라운-5-에터-니트로 화합물(300 mg, 0.96 mmol)을 메탄올(10 mL)에 녹인 다음 10% Pd/C 촉매(20 mg)를 넣고 상온 1 기압 수소하에서 5시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 반응 혼합물을 셀라이트 컬럼을 통해 여과하여 촉매를 제거하고 에틸아세테이트로 여러 번 세척한 후, 용매를 감압하에서 제거하고 정제하지 않은 15-벤조크라운-5-에터아민 혼합물(화합물 15; m=0 인 경우)(310 mg)을 얻었다. 추가적인 분리 과정 없이 다음 반응으로 진행시켰다. 먼저 싸이옥트산(440 mg, 2.11 mmol, 2.2 eq)을 아르곤기류 하에서 건조된 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후, DIC(0.33 mL, 2.11 mmol, 2.2 eq)와 HOBt(300 mg, 2.11 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 앞선 반응에서 얻은 정제하지 않은 15-벤조크라운-5-에터아민 혼합물(화합물 15; m=0 인 경우)(310 mg)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 558 mg의 화합물 16(1.19 mmol, 81%)을 얻었다.
녹는점(mp): 123-124oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.47 (50% 에틸아세테이트-헥산); IR (KBr) 3446, 2927, 1675, 1607, 1513, 1224, 1129, 1046, 937, 729, 641 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.50 (s, 1H, -NH), 7.27 (d, J = 2.1 Hz, 1H, Ph), 6.78 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H, Ph), 6.71 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ph), 4.03 (m, 4H, -OCH2CH2O-Ph), 3.80 (m, 4H, -OCH2CH2O-Ph), 3.67 (s, 8H), 3.48 (m, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.32 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.82 (m, 1H), 1.64 (m, 4H), 1.42 (m, 2H); 13C NMR δ 169.7, 147.9, 144.3, 130.7, 113.4, 110.9, 105.7, 69.6, 69.6, 69.5, 69.2, 68.9, 68.3, 68.0, 67.4, 54.9, 38.8, 37.1, 35.7, 27.4, 23.9; 원소 분석 C22H33N3O6S2: 이론값, C 50.03, H 7.05, N 2.97, S 13.60. 측정값, C 49.98, H 7.34, N 2.70, S 13.91.
<실시예 6> 18-벤조크라운-6-에터-아미노-싸이옥트산 컨쥬게이트 화합물(화합물 17)의 제조
18-벤조크라운-6-에터-니트로 화합물(300 mg, 0.84 mmol)을 메탄올(10 mL)에 녹인 다음 10% Pd/C 촉매 (20 mg)를 넣고 상온 1 기압 수소하에서 5 시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후 반응 혼합물을 셀라이트 컬럼을 통해 여과하여 촉매를 제거하고 에틸아세테이트로 여러 번 세척한 후 용매를 감압하에서 제거하고 정제하지 않은 18-벤조크라운-6-에터아민 혼합물(화합물 15; m=1 인 경우)(310 mg)를 얻었다. 추가적인 분리 과정 없이 다음 반응으로 진행시켰다. 먼저 싸이옥트산 (350 mg, 1.68 mmol, 2.2 eq)을 아르곤 기류 하에서 건조된 디클로로메탄 (15 mL )에 녹인 후, DIC(0.27 mL, 1.68 mmol, 2.2 eq)와 HOBt(240 mg, 1.68 mmol, 2.2 eq)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 앞선 반응에서 얻은 18-벤조크라운-6-에터아민 혼합물(화합물 15; m=1 인 경우)(310 mg)을 넣고 상온에서 다시 12시간 동안 반응시켰다. 박막 크로마토그래피로 반응이 완결된 것을 확인한 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 용매를 제거하였다. 얻은 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 분리 정제하여 255 mg의 화합물 17(0.49 mmol, 59%)을 얻었다.
녹는점(mp): 130-133oC; 박막 크로마토그래피 Rf 0.07 (100% 에틸아세테이트); IR (KBr) 3427, 2924, 1642, 1607, 1502, 1455, 1246, 1135, 1018, 939, 740, 644 cm-1; 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.70 (s, 1H, -NH), 7.42 (s, 1H, Ph), 7.08 (d, J = 2.5 Hz, 1H, Ph), 6.89 (d, J= 2.1 Hz, 1H, Ph), 4.11 (m, 4H, -OCH2CH2O-Ph), 3.89 (m, 4H, -OCH2CH2O-Ph), 3.69 (s, 12H), 3.48 (m, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.31 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.74 (m, 4H), 1.45 (m, 2H); 13C NMR δ 172.0, 144.9, 140.3, 133.7, 115.4,112.0, 106.7, 73.3, 73.0, 70.9, 70.8, 70.7, 70.2, 70.0, 51.8, 43.4, 37.3, 34.6, 33.9, 25.6, 25.3; 원소 분석 C32H35N3O5S4: 이론값, C 55.90, H 7.23, N 2.72, S 12.44. 측정값, C 56.99, H 7.65, N 2.40, S 12.04.
<실시예 7> 자기조립단분자막의 형성
본 실시예의 자기조립단분자막은 상기 실시예 1 내지 6의 크라운 에터 유도체로부터 형성하였다.
금 기질을 갖는 50 mL용기에 에탄올(EtOH)과 아세트니트릴(CH3CN)을 6대 4의 비율의 용액을 투입하고 여기에 암모늄 이온 수용체를 포함하는 실시예 1 내지 6의 크라운 에터 유도체를 분말 상태로 1 mg 투입하여 16시간 동안 자기조립단분자막을 형성하였다.
< 실험예 1> 자기조립단분자막 및 항체, 항원 결합된 표면의 특성분석
자기조립단분자막이 형성된 QCM 용기에 pH 7.2의 PBS(phosphate buffer solution)로 세정한 후 PBS를 49 mL 계량하여 용기에 넣어 3 ~ 4시간 동안 자기조립단분자막을 안정화시켰다. 안정화시킨 자기조립단분자막에 항체로서 글로불린을 흡착시켰고, 글로불린이 흡착된 자기조립단분자막에 알부민을 농도별(10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L)로 제조하여 1 mL씩 주사기로 투입하여 2.5초 간격으로 표면의 질량변화를 측정하고, 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다.
크라운 에터 유도체의 단계별 QCM 데이터
단계 단계-1(SAM 형성) 단계-2(항체 처리) 단계-3(항원 처리)
실시예 1 -20.0 -212.0 -10.5
실시예 2 -29.7 -215.0 -15.1
실시예 5 -16.4 -155.7 -8.0
실시예 6 -4.2 -195.0 -11.8
도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 단분자막이 형성되면서 실시예에 따라 -4.2 ~ -29.7의 주파수 감소가 일어났고, 항체가 결합하면서 실시예에 따라 -155.7 ~ -215.0의 주파수 감소가 일어났으며, 항원이 결합하면서 실시예에 따라 -8.0 ~ -15.1의 주파수의 감소가 일어남을 관찰하였다.
또한, 일단 주파수 감소가 일어난 후에는 그 주파수가 시간에 따라 거의 일정하게 유지되었다. 따라서, 자기조립단분자막의 형성, 항체의 결합, 항원의 결합이 안정하게 이루어졌음을 확인하였다.
특히, 표 1에 나타낸 수치를 통해 실시예 2의 화합물과 실시예 6의 화합물이 항원 결합을 잘하고, 실시예 1의 화합물과 실시예 2의 화합물이 항체 결합을 잘하고, 실시예 2의 화합물이 자기조립단분자막 형성을 잘하는 것을 알 수 있다.
< 실험예 2> 항체가 흡착된 자기조립단분자막의 항원 인지 분석
항체가 흡착된 본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막의 항원 인지능력을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
자기조립단분자막 형성을 잘 이루는 실시예 2의 화합물을 가지고 상기 실험예 1과 같은 방법으로 자기조립단분자막을 안정화시킨 후, 글로불린을 흡착시키고, 글로불린이 흡착된 단분자막에 농도별(0.02 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L)로 알부민을 투입하여 항원 인지 특성 여부를 실험예 1과 같은 방법으로 표면의 질량변화를 측정하고, 그 결과를 도 2 및 표 2에 나타내었다.
항원(알부민)의 농도에 따른 QCM 데이터
항원의 농도 0.02 mg/mL 1 mg/mL 2 mg/mL
실시예 2 -8.0 -18.7 -45.8
도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 항원의 농도에 대응하는 일정한 주파수 감소가 관찰되었다.
따라서 본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막은 항원-항체 반응을 인지하므로 화학 또는 바이오 센서로 사용될 수 있다.
< 실험예 3> 자기조립단분자막에 대한 단백질 인지 분석
본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막에 대한 단백질 인지능력을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
자기조립단분자막 형성을 잘 이루는 실시예 2의 화합물을 가지고 상기 실험예 1과 같은 방법으로 자기조립단분자막을 안정화시킨 후, 리소자임, 인간 혈청 알부민(HSA), 카제인, 글로불린, 피브리노겐 단백질을 투여하여 실험예 1과 같은 방법으로 표면의 질량변화를 측정하고, 그 결과를 도 3 및 표 3에 나타내었다.
단백질의 종류에 따른 QCM 데이터
델타 f (Hz)
리소자임 HSA 카제인 글로불린 피브리노겐
실시예2 30.0 52.5 129.8 188.0 238.5
도 3에 나타난 바와 같이, 단백질 결합에 대응되는 주파수 감소가 관찰되었다. 이로부터 단백질이 자기조립단분자막에 선택적으로 결합되는 것을 알 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용된 글로불린과 알부민을 비교하여 보면, 표 3에 나타낸 바와 같이, 항체인 글로불린이 항원인 알부민에 비해 자기조립단분자막에 더 강하게 결합함을 알 수 있다.
< 실험예 4> 자기조립단분자막에 대한 항체-항원의 선택적 인지
본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막에 대한 항체-항원의 선택성을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
자기조립단분자막 형성을 잘 이루는 실시예 2의 화합물을 가지고 상기 실험예 1과 같은 방법으로 자기조립단분자막을 안정화시킨 후, 항체로서 글로불린을 흡착시켰다. 이후, 글로불린과 유사한 선택성을 갖는 것으로 확인된 카제인을 결합시켰다. 또한, 상기 실험예 1의 자기조립단분자막에 항체-항원으로서 글로불린과 알부민을 순서대로 결합시킨 뒤에 카제인을 결합시켰다. 상기 결과에 대해 실험예 1과 같은 방법으로 표면의 질량변화를 측정하고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막에 항체 또는 항체-항원을 결합시켰을 때, 카제인의 방해 없이 상기 항체 또는 항체-항원이 선택적으로 인지됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따라 크라운 에터 유도체를 사용한 자기조립단분자막은 항원-항체를 선택적으로 인지하므로 화학 또는 바이오 센서로 사용될 수 있다.
본 발명의 크라운 에터 유도체는 자기조립단분자막을 형성할 수 있고, 항원-항체 반응을 인지하므로 화학 또는 바이오 센서로 이용할 수 있고, 이온 또는 유기단분자 화합물을 선택적으로 포획 내지 함유하므로 약물 수송 물질로 사용될 수 있고, 암모늄 이온을 갖는 분자의 인지 특성이 우수하므로 단백질 센서로서도 사용될 수 있으므로 경제성이 높다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 다이설파이드 또는 싸이올기가 도입된 크라운 에터 유도체.
    <화학식 1>
    Figure 112006034726057-pat00016
    여기서, n=0, 2; A=
    Figure 112006034726057-pat00017
    , -SH, 또는
    Figure 112006034726057-pat00018
    이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크라운 에터 유도체.
    <화학식 2>
    Figure 112006034726057-pat00019
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 3로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크라운 에터 유도체.
    <화학식 3>
    Figure 112006034726057-pat00020
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크라운 에터 유도체.
    <화학식 4>
    Figure 112006034726057-pat00021
  5. 하기 화학식 5로 표시되는 다이설파이드 또는 싸이올기가 도입된 크라운 에터 유도체.
    <화학식 5>
    Figure 112006034726057-pat00022
    여기서, m=0, 1 이다.
  6. 제5항에 있어서, 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크라운 에터 유도체.
    <화학식 6>
    Figure 112006034726057-pat00023
  7. 제5항에 있어서, 하기 화학식 7으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크라운 에터 유도체.
    <화학식 7>
    Figure 112006034726057-pat00024
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 크라운 에터 유도체를 형성하는 단계;
    상기 크라운 에터 유도체의 다이설파이드 반응기 또는 싸이올 반응기가 금속 박막과 결합하여 자기조립단분자막을 형성하는 단계; 및
    상기 자기조립단분자막의 상기 크라운 에터 유도체 작용기에 암모늄 이온을포함하는 생체분자인 알부민, 글로불린, 리소자임, 카제인 또는 피브리노겐을 고정시키는 단계를 포함하는 생체 외에서의 생체분자 고정화 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 금속 박막의 재료는 금, 은, 구리, 백금, 아연, 또는 알루미늄인 것을 특징으로 하는 생체 외에서의 생체분자 고정화 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 크라운 에터 유도체를 형성하는 단계;
    상기 크라운 에터 유도체의 다이설파이드 반응기 또는 싸이올 반응기가 금속 박막과 결합하여 자기조립단분자막을 형성하는 단계;
    상기 자기조립단분자막의 상기 크라운 에터 유도체 작용기에 항체인 글로불린을 고정시키는 단계;
    상기 글로불린과 결합하는 항원인 알부민을 상기 자기조립단분자막과 접촉시키는 단계를 포함하는 생체 외에서의 분자인지방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 금속 박막의 재료는 금, 은, 구리, 백금, 아연, 또는 알루미늄인 것을 특징으로 하는 생체 외에서의 분자인지방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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