WO2008028206A2 - Verfahren zur herstellung von reaktiven einmolekülschichteinheiten - Google Patents

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WO2008028206A2
WO2008028206A2 PCT/AT2007/000415 AT2007000415W WO2008028206A2 WO 2008028206 A2 WO2008028206 A2 WO 2008028206A2 AT 2007000415 W AT2007000415 W AT 2007000415W WO 2008028206 A2 WO2008028206 A2 WO 2008028206A2
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Hermann J. Gruber
Martin HÖLZL
Christoph D. Hahn
Christa Leitner
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Universität Linz
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the present invention relates to the field of synthesis of monolayer-forming molecules.
  • sensor molecules protein, DNA, ligands, chelators, etc.
  • affinity sensors the sensor molecules (eg, antibodies) serve as specific scavengers that selectively trap only complementary molecules (eg, the accompanying antigen), while all others .
  • Accompanying substances from the sample must not bind to the sensor surface. This binding can then be detected via a physical change in the boundary layer ("marker-free", eg via refractive index, mass loading, etc.) or via a marker (radiolabel, fluorescence, etc.) on the analyte molecule.
  • enzymes serve as sensor molecules, which convert only very specific substrate molecules and thereby provide by-products, which can be detected by the physical sensor part (the transducer, eg a metal electrode).
  • Biosensors with marker-free detection require special inorganic substrates, in particular thin films, on which the sensor molecules (DNA, antibodies, ligands, enzymes, etc.) are immobilized via a 1-100 nm thick linker layer.
  • the biomolecules are located on an approximately 40 nm thick metal layer (usually gold, possibly aluminum or silver), with analytes varying via the change in the OPR angle, i. the refractive index of the surface layer adjacent to the liquid (-200 nm) can be detected.
  • OPR surface plasmon resonance
  • QCM Quadrat Crystal Microbalance
  • biosensors have a (vapor-deposited) metal electrode on both sides of a piezoelectric crystal, one of which is functionalized with biomolecules.
  • Resonant mirror, optical waveguide light mode spectroscopy (OWLS) and reflectometric interference spectroscopy (RIfS) require a thin metal oxide layer with a high refractive index (eg Nb 2 O 5 or Ta 2 O 5 ) between the glass substrate and the sensor molecules.
  • OWLS optical waveguide light mode spectroscopy
  • RfS reflectometric interference spectroscopy
  • gold films facilitate the immobilization of the capture molecules and provide a high detection sensitivity.
  • mediators eg, a quinone
  • enzyme eg, glucose oxidase
  • this design allows the production of sensors in micro- and nanometer dimensions.
  • electrochemiluminescent labels e.g., ruthenium complexes, luminol, etc.
  • a conducting sensor surface emit or accept electrons to the labeled molecules.
  • a metal film is sufficient if the luminescence on the "water side" of the sensor layer is detected.
  • the sensor molecules must sit on an ITO (indium tin oxide) layer, which is transparent and electrically conductive at the same time.
  • the choice of support is the least critical, in principle any support can be used whose transparency is sufficiently high and whose background fluorescence is sufficiently low.
  • the use of metal oxide layers can also bring a great advantage here, namely, if this significantly facilitates the immobilization of the sensor molecules.
  • inorganic surfaces with "intelligent molecules” is not only limited to sensor technology, it will also gain importance in the future in actuators, data storage systems, fuel cells, etc.
  • sensor molecules can be bound directly to inorganic sensor surfaces.
  • the bond is either too weak for a permanent immobilization (For example, between protein and gold or between metal oxide and DNA) - or it is too strong and leads to denaturation of the biomolecule (in proteins on metal oxides) or to adsorption of the entire biomolecule on the inorganic support, so it does not function as a catcher can exercise more (eg on small DNA probe molecules on metal).
  • the inorganic substrates of the sensors are usually covered with a layer of synthetic linker molecules and only this layer is occupied by sensor molecules.
  • the linker layer should be physically inert to all substances which may be dissolved in the sample to be measured.
  • sensor surfaces with particularly low nonspecific protein adsorption one speaks of "protein-resistant" surfaces.
  • the application of the linker layer can take place in one step or in several steps.
  • a small silane molecule is coupled with an appropriate chemical moiety (e.g., with an epoxide or a labile bromine atom), and thereafter usually an inertizing hydrogel, e.g. a PEG (polyethylene glycol) derivative [Piehler 2000] or an ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) growing polyacrylamide derivative.
  • an appropriate chemical moiety e.g., with an epoxide or a labile bromine atom
  • an inertizing hydrogel e.g. a PEG (polyethylene glycol) derivative [Piehler 2000] or an ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) growing polyacrylamide derivative.
  • Examples of one-step processes are the electrostatic adsorption of polylysine-polyethylene glycol (PLL-PEG, together with PLL-PEG-biotin) on metal oxide [Huang 2002, Langmuir] or the coupling of PEG silanes onto glass [Wagner 2000 ].
  • Silanizations still bear the brunt of immobilization chemistry, despite the inherent problems: ethoxy or methoxysilanes find broader utility as linker layers than chlorosilanes, because they are more harmless and available with many more functional groups. Unfortunately, they have rather low reactivity towards oxide surfaces, so that most of the silane molecules covalently bind to the substrate only during "curing" (about 2 h incubation at ca. 14O 0 C). Nevertheless, under dry conditions they barely react with oxide surfaces and under moist conditions first form polysiloxane networks, which at room temperature only form hydrogen bonds to the oxide surfaces before they covalently bond to the surface during curing.
  • silane monolayers can be prepared only with great effort, in practice procedures are preferred with defined solvent / water mixtures in which the oxide surfaces are covered with undefined but reasonably reproducible polysiloxane networks.
  • the mono-layer formation succeeds relatively well with long-chain hydrophobic silanes such as octadecyltrichlorosilane or octadecyltriethoxysilane.
  • As a linker layer for the sensors are hydrophobic monolayer (one-molecule layers) but only in exceptional cases interesting, z. B if the carrier is to be covered with a phospholipid monolayer.
  • SAM self-assembling monolayer
  • Various molecules can be converted into a SAM former for a given inorganic substrate by introducing at one end a functional group characterized by high affinity for a given inorganic substrate.
  • the binding of such self-assembling monolayer formers to the substrate takes place spontaneously, ie also from dilute solution or from the gas phase.
  • a dense lateral packing forms, ie alkyl derivatives give a "turf" of regularly arranged (usually slightly inclined) alkyl chains.
  • Each type of SAM has a wide range of functional groups which are not bind organic substrate and therefore can be positioned on the outer surface of the SAMs. There they serve to adjust the physical properties (hydrophilicity, etc.) and to couple biomolecules.
  • a recent review article lists a large number of suitable high-affinity combinations of substrates with specific functional groups [Love 2005, Table 1].
  • the most relevant examples for biosensing are (1) SAMs of thiols, and disulfides on gold and silver, and (2) SAMs of phosphates and phosphonates on metal oxides (especially Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , TiO 2 , Al 2 O 3 , ITO).
  • the highest affinity for metal oxides was achieved with catechol groups, such as DOPA 3 , which provide good coverage with DOPA 3 -PEG variants.
  • SAM ⁇ SAM ⁇
  • SAMs of thiols and disulfides on gold have so far been best studied. They have the widest variety of physical properties and chemical coupling functions for a wide variety of applications.
  • the coupling groups on the SAMs can be subdivided into two categories: (1) into specific coupling groups that react only with a specific functional group, which rarely occurs in biomolecules or has to be artificially introduced, and (2) into broadly applicable coupling groups can be reacted directly with most biomolecules.
  • SAMs with specific coupling groups are ideal when the biomolecule to be coupled already has the complementary chemical group.
  • Maleimide groups require a free thiol on the biomolecule. However, this oxidizes easily and must be regenerated before the coupling usually reductive.
  • the "click chemistry" is based on the 1, 3-cycloaddition of a Acetylene group to an azide group. Therefore, one of these functions must be present at the SAM (which is the minor problem), while the complementary function on the sensor molecule to be immobilized must always be introduced artificially.
  • SAM functionalization via Diels-Alder cycloaddition requires a quinone on the SAM and a cyclopentadiene on the sensor molecule.
  • SAMs with biotin again require the biotinylation of the biomolecules to be coupled, unless they can be expressed as fusion proteins with a streptag or a (strept) avidin domain.
  • SAMs with aminooxy or hydrazide functions are suitable for the coupling of glycoproteins in whose oligosaccharide residues by means of periodate or oxidases aldehyde groups have been introduced [Wolfe 1995, Johnsson 1995].
  • DNA catcher molecules are commercially available for any sequence and are also supplied with a 5 'or 3' terminal amino group if desired.
  • SAMs with amino-reactive groups can be adapted, if necessary, with the above-mentioned specific coupling groups, e.g. with biocytin to a biotin-SAM, with lysine-NTA to an NTA-SAM, etc.
  • SAMs with epoxides are only moderately reactive towards amino groups and are rarely used for this purpose, or rather for sensor molecules with free thiol groups, because they couple very well to epoxides.
  • SAMs with activated COOH groups The carboxyl group is not reactive per se, therefore it must either be applied in pre-activated form as SAM [Wilkop 2004, Pierce Chemical Company Tech Tip # 2 can be found on www.piercenet.com] or activated later become.
  • aldehyde SAMs are suitable for the chemoselective ligation not only of amino groups but also of hydrazines, hydrazides, amides. o nooxy groups or N-terminal cysteines to form
  • aldehyde SAMs for gold: a) In the simplest case, an NH 2 -terminated SAM was first applied and coupled to it homobifunctional glutaraldehyde [Berchmanns 2002]. Many glutaraldehyde molecules react with only one of their two aldehyde ends, so that the second is available for the coupling of a biomolecule.
  • Disulfides are known to give the equivalent SAMs as thiols, only the rate of their chemisorption is lower.
  • e) In the same way, another group of authors has prepared aldehyde-terminated dialkyl disulfides and chemisorbed as SAM on gold [Liu 2002, Wadu-Mesthrige 1999 and 2001]. Although the authors claim that they prepared 3-mercaptopropanal and 11-mercaptoundecanol, this is unlikely because they have oxidized 3-mercaptopropanol and 11-mercaptoundecanol with pyridinium dichromate [Wadu-Mesthrige 1999].
  • this method of synthesis on the support has the disadvantage that the synthesis can always take place only in situ and no preparation of the monolayer formers e.g. allowed in the buil.
  • Another disadvantage is the uncontrolled looping between monolayer formers when a bifunctional reagent, e.g. is used to form the protein-resistant layer or the reactive layer, which can also react with two adjacent monolayer formers.
  • DE 102 51 229 A1 describes dithiolane derivatives with a diol group for the formation of monolayers on metal surfaces.
  • One of the hydroxyl groups of the diol is used to directly build oligonucleotides.
  • US 2005255514 A1 relates to monolayer-forming silane molecules. molecules which are prepared by coupling reactions of an alkene with another unit (eg PEG or fluorinated benzoic esters).
  • another unit eg PEG or fluorinated benzoic esters.
  • Al relates to monolayer-forming molecules (via thiol groups) for binding DNA molecules to chip surfaces.
  • the present invention therefore provides a process for preparing reactive monolayer monolayer moieties wherein a polyfunctional monolayer-forming moiety having a multifunctional carbonyl moiety comprising an optionally protected latent carbonyl group, preferably selected from a vicinal Diol, a protected vicinal diol, a vicinal aminoalcohol and a protected vicinal aminoalcohol, and converted to a carbonyl group in one step, optionally covalently linking the monolayer-forming component and the carbonyl moiety through one or more multifunctional compound component (s). covalently linked.
  • a polyfunctional monolayer-forming moiety having a multifunctional carbonyl moiety comprising an optionally protected latent carbonyl group, preferably selected from a vicinal Diol, a protected vicinal diol, a vicinal aminoalcohol and a protected vicinal aminoalcohol, and converted to a carbonyl group in one step, optionally covalently linking the monolayer-forming component and the carbony
  • latent carbonyl group is meant a chemical group which can be converted to a carbonyl group by a reaction in one step, in which sense “carbonyl component” should not be understood to mean that this component already has a carbonyl group.
  • Such a latent carbonyl group is preferably a vicinal diol, a protected vicinal diol, a vicinal amino alcohol or a protected vicinal aminoalcohol - which are converted into an aldehyde in one step by periodate treatment. Therefore, the transformation is preferably an oxidation, especially to an aldehyde.
  • diol component refers to a component that has a group that can be oxidized like a vicinal diol to a carbonyl (preferably an aldehyde or ketone) (eg, periodate ) and has a diol or an equivalent group (eg, a vicinal amino alcohol) which may optionally be protected.
  • the carbonyl component serves to provide a group on the monolayer-forming unit with which biomolecules or further (bioreactive) coupling groups can be bound in a simple manner, in particular on a monolayer formed with the units.
  • an optionally protected carbonyl group preferably selected from an aldehyde, a protected aldehyde, a ketone and a protected ketone, is used in the carbonyl component.
  • the order of the reactions is not important.
  • either the monolayer-forming moiety or the carbonyl moiety may be first attached to one linking moiety and then the other moiety added, or vice versa.
  • Both the monolayer-forming component or the carbonyl component, but also the compound component may be protected or unprotected in these steps.
  • Formation of a monolayer may also occur at any point in time (after deprotecting the monolayer-forming group of the monolayer-forming moiety) either before or after deprotection of the latent carbonyl group, or before or after covalent bonding of that group. Deprotection or conversion of the latent carbonyl group also takes place at any desired location.
  • a carbonyl component for example, it is possible first to attach a carbonyl component to a linking group, optionally to remove the protective group of the (latent) carbonyl group, and then to bind a monolayer-forming component (where the monolayer-forming group of this component may be protected and deprotected before or after binding).
  • the conversion of the latent carbonyl group (eg a diol or amino alcohol) into a carbonyl group (eg aldehyde or ketone) also takes place at an arbitrary stage - for example usually immediately before the binding of target molecules, such as biomolecules, for example when the carbonyl group is a reactive aldehyde group.
  • the monolayer and / or the covalent compound of the components is already formed at this time.
  • the inventive method is preferably carried out in solution or in fluid media, wherein the components (and optionally the unit) are dissolved.
  • the monolayer-forming component then forms monolayer layers on a support.
  • multifunctional indicates that the components have both a functional group for monolayer formation or carbonyl formation (in the case of the monolayer-forming component or the carbonyl component) and also a group for the conjugation of the two components (or more in the case of the connection component (s)).
  • the reaction is preferably carried out at room temperature or preferably at a temperature less than 45 ° C, preferably less than 40 0 C, most preferably less than 35 ° C.
  • Monolayer formers are molecules that bind with a certain chemical function (eg, thiol or disulfide) in a highly affine manner to a specific inorganic substrate (eg, silver or gold).
  • the molecules or components are preferably constructed so that they can be packed tightly.
  • the inorganic substrate has preferably no affinity towards most other functional groups.
  • the monolayer-forming component by definition, is itself capable of forming monolayers on suitable supports - and optionally having an affinity for a particular inorganic substrate - and would qualify as a "monolayer” -former
  • “monolayer formers” are used only for the synthesized product having both a monolayer carrier reactive portion (optionally protected) and a carbonyl portion (carbonyl or latent carbonyl with carbonyl, aldehyde or ketone formation).
  • the precursor and also the monolayer former and, of course, the carbonyl group (the carbonyl component) itself may optionally be protected.
  • any protective groups which are already well known, can be used.
  • the advantage of the method lies in the fact that, in contrast to known synthesis methods, the reactive groups (monolayer & carbonyl group) are not first formed by elaborate syntheses on the monolayer unit (such as after Horton [1997], Jang [2003]) and by the variety of possible starting materials - which are already commercially available - also desired properties (above the protein resistance) are freely selectable and achievable.
  • asymmetric monolayer formers can be produced, or symmetrical intermediates, which are subsequently asymmetrically modified and purified, can be avoided.
  • a latent carbonyl group e.g. in the case of a periodate-reactive moiety or modulus, this may delay the formation of the aldehyde or keto group (e.g., until after SAM formation), which minimizes conflicts with other functional groups or reaction steps.
  • the oxidation with aqueous periodate is also much faster and easier than the acidic cleavage of an acetal (ketal), e.g. of diethyl acetal.
  • the carbonyl moiety is a diol moiety having a vicinal diol, a protected vicinal diol, a vicinal aminoalcohol, or a protected vicinal aminoalcohol.
  • a latent carbonyl component in particular of a periodate-reactive component or of a module, allows the formation of the aldehyde or keto group to be postponed in time (eg, until after SAM formation), which conflicts with other functional groups or reaction steps minimized.
  • the oxidation with aqueous periodate is also much faster and easier than the acidic cleavage of an acetal (ketal), e.g. of diethyl acetal.
  • the monolayer-forming component is capable of self-assembling monolayer ⁇ ⁇ SAM - one self-assembling monolayer-forming component.
  • the present invention provides a practical modular synthesis system (the reactants or components are also referred to as "modulus") for the preparation of multifunctional SAM formers containing a carbonyl group or a latent carbonyl group in unprotected or protected form Since this system has only one stage of synthesis in the simplest case, complex purification steps of the intermediates are also eliminated.
  • the two modules one provides the SAM-forming group (eg a thiol, disulfide, phosphate, etc., usually in protected form, eg as trityl thioether, acetylsulfanyl group, etc.) and the other module contains the carbonyl or latent carbonyl group (eg a vicinal amino alcohol or a vicinal diol usually protected, eg as acetonide)
  • the most diverse SAM-formers for metals , Metal oxides, H-terminated silicon, etc.
  • carbonyls or eg aldehydes or vicinal diols as latent Aldehydes
  • SAM formation e.g. with aqueous periodate solution
  • a terminal bioreactive group e.g., keto or aldehyde group.
  • a compound component can also be inserted between these two modules as a protein-resistant module (eg an oligoethylene glycol "OEG", an oligopropylene sulfoxide, an oligosarcosine, and other inert, preferably linear, polymers).
  • component and monolayer-forming component may of course already have protein-resistant properties themselves. Therefore, in a further preferred embodiment, the monolayer-forming components and the carbonyl components are covalently linked by one or more compound component (s), preferably an inert linear polymer, in particular polyethylene glycol.
  • the reaction for this can be selected from the same group of reactions, in which, in the alternative, the carbonyl component is combined with the monolayer-forming component; This is preferably an acylation reaction between the reactants.
  • the monolayer-forming component and the carbonyl component are directly bonded together.
  • the coupling of the components is preferably mild and quantitative.
  • “Mild ⁇ ” means that at least 90%, in particular at least 95%, of the (mostly protected) SAM-forming group and the (mostly protected) diol groups remain intact in the coupling:
  • “Quantitative” means that more than 90% of the deficient component ( optionally, either the SAM-forming module or the carbonyl component) to the desired coupling product.
  • the chemical bond between the coupled components is preferably so stable that any protective groups present at the SAM-forming end or at the (latent) carbonyl end can be eliminated after that without any risk for the conjugate.
  • the monolayer-forming component, the carbonyl moiety and optionally the linking moiety are linked to one of the joined components or to each other by acyl conjugation, preferably carbonic acid, carbonic acid derivatives, carboxylic acids, carboxylic acid derivatives or activated esters.
  • acyl conjugation preferably carbonic acid, carbonic acid derivatives, carboxylic acids, carboxylic acid derivatives or activated esters.
  • Suitable reaction partners are all known coupling partners.
  • acyl conjugation is sufficiently mild so that, firstly, the monolayer-forming component can already have the final SAM-forming group before, whether in unprotected form (eg as disulfide, terminal double bond) or in weakly protected form (eg as thioester), which can be deprotected after acyl coupling by brief post-treatment, and secondly, the latent carbene Bonyl component in a weakly protected form (eg as the acetonide of a vicinal diol or O- and / or N-protected serine) may be present.
  • unprotected form eg as disulfide, terminal double bond
  • weakly protected form eg as thioester
  • the cleaning problems of the intermediate and final stages are very low for acyl couplings of two sub-modules. This is especially true when amino groups are acylated with carboxylic acids because the uncharged amide conjugate differs greatly in size and charge from the cationic amine in the acidic and the anionic carboxylic acid in the basic.
  • the carbonyl component - especially with the latent aldehyde group, the vicinal diol may also be present as such in the coupling or as acetal / ketal (e.g., acetonide), which can be cleaved after acyl coupling by short and very mild acid treatment.
  • acetal / ketal e.g., acetonide
  • the carbonyl moiety and / or the monolayer-forming moiety and optionally the linking moiety independently comprise a functional group selected from -COOH, NH 2 , activated acid ester, or acid chloride capable of binding to any of the other moieties is preferably selected from the group selected from OH, NH 2 or SH.
  • the molecular composition of the components can be chosen arbitrarily, apart from the reactive end groups of the unit (which are to be obtained) and the coupling partners.
  • the carbonyl component and / or the monolayer-forming component and optionally the compound component independently an optionally mono-, di-, or poly-0-, N-, S- or P-heterosubstituted group selected from CI_ 30 alkyl, Cx - ⁇ - aryl, C 2- 3 o ⁇ glycol, preferably Ci_ 30 -Ethylenglycol, or combinations thereof, which preferably separates the at least two functional groups of the respective component.
  • the covalent bonding of the units can be selected from reaction conditions from room temperature, and / or base catalysis, preferably weak base catalysis using bases which in their protonated form have a pKa of less than 12 (of course, the bases will become their deprotonated form used as bases), more preferably using tertiary amines in organic solvent (not bases - in the protonated form - with a pKa> 14 such as alkali or alcohol or sodium hydride, etc.) - under conditions which the protected or unprotected monolayer-forming Group (eg, thioesters or disulfides) and the protected or unprotected (latent) carbonyl component (eg, an acetone-protected vicinal diol or an N-protected serine residue) to at least 90% intact.
  • the protected or unprotected monolayer-forming Group eg, thioesters or disulfides
  • the protected or unprotected (latent) carbonyl component
  • Weak base catalysis means the use of bases which, in their protonated form, have a pKa value of less than 12, preferably the use of tertiary amines or pyridine variants (eg pyridine or dimethylaminopyridine), usually in an anhydrous medium, sometimes in mixed aqueous solutions, which include DMSO, DMF, dioxane, THF, acetonitrile and others may contain water-miscible solvents.
  • bases which, in their protonated form, have a pKa value of less than 12, preferably the use of tertiary amines or pyridine variants (eg pyridine or dimethylaminopyridine), usually in an anhydrous medium, sometimes in mixed aqueous solutions, which include DMSO, DMF, dioxane, THF, acetonitrile and others may contain water-miscible solvents.
  • Suitable coupling groups which must be present for the components for this purpose can be selected according to the knowledge of the prior art, but are preferably selected from the abovementioned groups for the acylation.
  • the process step for deprotection of the monolayer-forming component is a necessary step after the coupling of the components to form a monolayer on a support. It should be noted, however, that under mild coupling conditions, the mono- layer-forming component should not be protected (eg disulfide for SAMs on gold or vinyl groups for SAMs on H-terminated silicon).
  • the present invention relates to a process for producing a single molecule layer in which monolayer (“monolayer”) units are synthesized as described herein and bound to a support, preferably by adsorption to the support, such as thiol groups on gold surfaces (also called “chemisorption”, which is also referred to herein as adsorption).
  • monolayer monolayer
  • chemisorption also called “chemisorption”, which is also referred to herein as adsorption
  • the carbonyl component is deprotected. This can be done on the one hand on the monolayer on the support or even in the not yet bound to the support monolayer formers. If appropriate, the (latent) carbonyl group can be freed of one or more protective groups first at the support (and even before monolayer formation).
  • the latent carbonyl group may be converted to the carbonyl group in a further step, for example the diol component in a further step with periodate or a functionally equivalent oxidizing agent, preferably sodium periodate, especially sodium metaperiodate oxidized to a reactive carbonyl group, preferably aldehyde or keto group - on the monolayer formers or (more often) on the molecules on the support (SAM).
  • periodate or a functionally equivalent oxidizing agent preferably sodium periodate, especially sodium metaperiodate oxidized to a reactive carbonyl group, preferably aldehyde or keto group - on the monolayer formers or (more often) on the molecules on the support (SAM).
  • a (possibly synthetic) ligand molecule or biomolecule preferably selected from peptides, proteins, poly- or oligonucleic acids, which are optionally modified by adding an amino group, or a (synthetic) ligand to the
  • This step is provided in particular for already formed monolayers, preferably after bioreactive groups have been activated (eg by periodate treatment of the vicinal diols, amino alcohols, etc
  • the biomolecules eg small ligands such as biocytin hydrazide, proteins, amine-modified DNA, etc., if appropriate also synthetic ligand molecules or effector molecules
  • synthetic bi- or multi-functional adapter molecules can first be bound chemoselectively to the carbonyl groups on the monolayer, and the biomolecules (et al., Supra) can then be coupled to the outer ends of the adapter molecules.
  • multifunctional adapter molecules usually commercial heterobifunctional crosslinkers are used, such as 3- (maleimido) propionylhydrazid (MPH) or PDPH (3- (2-pyridyldithio) -propionylhydrazid).
  • MPH maleimido
  • PDPH PDPH
  • PDPH PDPH
  • adapters with two or more identical coupling groups for example with a plurality of hydrazide functions, of which one or some bind to the carbonyl groups of the monolayer and the remaining, for example, the aldehyde groups of periodate-treated glycoproteins.
  • biomolecule-binding crosslinkers are preferred adapters in a specific embodiment.
  • the monolayer-forming component has a thiol or disulfide group, optionally with the support having a gold surface.
  • the monolayer-forming component has a vinyl group
  • the support has a hydrogen-terminated pure element surface, preferably silicon hydride (or H-terminated silicon surfaces) or hydrogen-terminated diamonds.
  • the monolayer-forming component comprises an acid group or deprotonated acid group, preferably a phosphate, phosphonate or catechol group, wherein optionally the support has a metal oxide surface, preferably titanium oxide, tantalum oxide or ITO (indium tin oxide).
  • reactive functional groups are deactivated in a further step. This can be done, for example, by subsequent ethanolamine, cysteine or glycine treatment, wherein free amino-reactive Groups are masked by bonding.
  • aldehydes can also be blocked with cysteine, with both N and S simultaneously binding to form a thiazolidine ring.
  • Such a step is particularly useful if the monolayer has already been formed and if appropriate the desired biomolecules have been immobilized thereon.
  • the invention also relates to a
  • a monolayer (“monolayer”) unit comprising an optionally protected monolayer-forming portion, an optionally protected carbonyl moiety having an optionally protected carbonyl group, in particular an aldehyde group, or optionally protected latent carbonyl group, and optionally one or more compound portions, wherein the parts covalently linked together by ester groups (of carboxylic acids and carbonic acid), amide groups or urethane groups, preferably obtainable by a process as described herein, especially after acyl coupling, the components leading to the respective monolayer (“monolayer”) moiety moieties.
  • the present invention provides a monolayer layer of the monolayer units on a support, preferably obtainable by a method described herein, such as by self-assembly.
  • the one-molecule layer is less than 20%, preferably less than 10%, of the one-molecule layer units having a (latent) carbonyl group as defined herein, the one-molecule layer additionally having inert one-molecule layer units, especially without (latent) carbonyl groups , If the remaining one-molecule layer is composed of inert units, it is prevented that multiple bonds of the proteins occur or too dense packing, which could possibly impair the function of the biomolecules.
  • Such a one-molecule layer can be prepared, for example, by mixing the units and applying to a support or by incomplete periodate reaction or by partial inactivation of the activated carbonyl group (eg aldehyde, ketone) by dilute inactivating reagents as described herein (eg, brief exposure to a dilute glycine solution).
  • the activated carbonyl group eg aldehyde, ketone
  • dilute inactivating reagents as described herein (eg, brief exposure to a dilute glycine solution).
  • Fig. 1 A: time profile of the SPR angle during the modification of a SAM gem.
  • SPR Surface Plasmon Resonance - Surface Plasmon Resonance (OPR))
  • OPR Surface Plasmon Resonance
  • Fig. 2 time profile of the SPR angle during the modification of a SAM gem.
  • FIG. 3 time profile of the SPR angle during the modification of a SAM according to FIG. Example 3.2
  • Fig. 4 time profile of the SPR angle during the modification of a SAM gem.
  • Fig. 5 time profile of the SPR angle during the modification of a SAM gem.
  • Example 1 Coupling of SAM-Forming Modules with Periodate Reactive Modules via One or more Acylation Treatments 3.1 ⁇
  • a preferred embodiment of the present invention
  • Modules with vicinal diol groups or a vicinal amino alcohol add an aldehyde or a ketone with periodate.
  • These functional groups are particularly useful because they couple amines (protein, DNA, etc.), aminooxy groups, hydrazines, hydrazides and N-terminal cysteine residues spontaneously and chemoselectively, without further coupling reagent.
  • these carbonyl groups are long-term reactive under ambient conditions.
  • SAM-formers and periodate-reactive modules are combined via acyl couplings, whereby further modules can be inserted if necessary, eg oligoethylene glycol chains, which provide protein resistance (Scheme 1.1).
  • the periodate-reactive group is oxidized (before or) after SAM formation with periodate to a carbonyl group, which serves for the chemoselective ligation of amines (protein, DNA), hydrazines, etc.
  • Schemes 1.1 to 1.7 illustrate this reaction principle: Scheme 1.1 (see below): ⁇ cyl couplings of SAM-forming and perja- tate-reactive modules.
  • G ⁇ is a good leaving group, eg a halogen atom, an alcohol (especially phenol with one or more nitro groups or fluorine atoms), NHS, HOTB, imidazole and others. This can be introduced in advance, or in situ with an activator such as DSC, DSO, PyBOP, oxalyl chloride, CDI, etc.
  • an activator such as DSC, DSO, PyBOP, oxalyl chloride, CDI, etc.
  • Nu is a small nucleophilic group (such as NH 2 , NHR, OH, possibly SH), which in any case with a carboxyl group, a conjugate which is sufficiently stable in aqueous solution (eg amide, ester)
  • the groups G and Nu reacting with one another on two reactants can also be exchanged If necessary, it is essential for the components to have the appropriate groups G and Nu Nu * is a proprietary nucleophile that prevents self-polymerization from occurring, and self-polymerization is also prevented if the nucleophile Nu is unprotected and the coupling scheme shown in Scheme 1.2 is used. ** means that the vicinal diol or the vicinal Amino alcohol is either unprotected or carries one (two) protecting group (s), which may be cleaved before or after SAM formation en (see Scheme 1.3)
  • SAM-forming group can be either unprotected or with a protecting group.
  • the SAM creator must be deprotected before (during) SAM formation.
  • Scheme 1.2 Insertion of an asymmetric module with an unprotected nucleophile at one end and an unactivated COOH group at the other.
  • X 1 can be a heteroatom or any organic chemical moiety.
  • X 2 can be an organic-chemical part of the molecule, but it can also be dispensed with altogether, for example in the case of glyceric acid derivatives. derivatives (left row) or serine / threonine derivatives (right row).
  • R ', R'', and R' 1 ' are in the simplest case H atoms. If necessary or opportunity, it may also be alkyl or aryl radicals, possibly with substituents.
  • the deprotection of the vicinal diol or aminoalcohol can take place before or after the SAM formation.
  • the periodate reaction can occur before or after monolayer formation and has the purpose of generating aldehyde groups or keto groups which are available for the chemoselective coupling of a suitable molecule having a complementary group (an N base such as -NH 2 , -NHR, -O-NH 2 , -NH-NH 2 , or> C (NH 2 ) -CH 2 -SH or> C (SH) -CH 2 -NH 2 ).
  • an N base such as -NH 2 , -NHR, -O-NH 2 , -NH-NH 2 , or> C (NH 2 ) -CH 2 -SH or> C (SH) -CH 2 -NH 2 ).
  • Undecenoic acid + aminopropanediol gives, in a single step, a finished vic-diol-terminated SAM former for H-terminated silicon (compare Example 4.1).
  • Scheme 1.6 Example of a formal two-step synthesis, where the second step consists only in immersing the SAM in acid 1 .
  • the deprotection should be carried out only on gold, thereby also saving a synthesis step (see also Example 3.3 and FIG. 5).
  • the monolayer former shown last combines several very important structural features:
  • the PEG chain in the middle provides protein resistance (usually mixed with 5-20 equivalents of an analogous monolayer generator without vicinal diol).
  • Example 2 Modular system for the production of SAMs with Alde hyd- or keto groups as a preferred embodiment of the present invention
  • Scheme 2.1 describes a new systematic process for the preparation of SAMs with aldehyde or keto groups. is coupled, which only by the action of periodate (step e) has an aldehyde or keto group.
  • the core of this embodiment is that a SAM-forming module with a latent aldehyde / ketone component via an acylation reaction to a new SAM generator (structure 3)
  • the mentioned (at least) two modules are connected by acylation reactions, whereby not only acylations with reactive carboxylic acid derivatives, but also with reactive carbonic acid derivatives are considered.
  • X 1 and / or X 2 one of the three heteroatoms is O, N, or S (in particular one of the groups: -NH- or -NR- or -O- or -S-).
  • the vicinal diol group or aminoalcohol group
  • X 1 is a heteroatom
  • X 2 -X 3 can be omitted altogether.
  • glyceric acid instead of serine is difficult to imagine because glyceric acid is known only as an intermediate in cell metabolism.
  • the element X 3 can be eliminated altogether if X 1 is a heteroatom and X 2 is a CH 2 group or a small aliphatic / aromatic structure.
  • X 3 simply be a heteroatom (N, O, S) or a larger part of the molecule with a heteroatom next to the vicinal diol (or aminoalcohol) shown in structure 3, if this forms a labile hemiacetal function and on hydrolysis SAM image generator with a simple NH 2 , OH or SH end would result.
  • X 2 is a heteroatom (ie, 0, N, S, P)
  • X 3 When X 2 is a heteroatom, then X 3 must be at least one CH 2 group or any major aliphatic / aromatic structure. This may contain additional heteroatoms, except directly adjacent to the periodate-reactive group (as explained above).
  • either the SAM generator or the perjat-reactive module is one carboxylic acid (or activated carboxylic acid) and the other is an alcohol (possibly a thiol) or an N-base.
  • the conjugate is accordingly an ester (possibly thioester) or an amide, hydrazide or a similar N-acyl conjugate.
  • the structure 3 is also to be considered acylation product, when both X 1 and X 2 are simultaneously heteroatoms.
  • the structure 3 is then a derivative of carbonic acid (urea, thiourea, urethane, carbonate, etc.) and is prepared by acylation with a reactive carboxylic acid derivative.
  • a reactive carboxylic acid derivative usually results from the reaction of an alcohol or amine with double-reactive carbonic acid derivatives, such as phosgene (triphosgene), nitrophenyl chloroformate, disuccinimidyl carbonate and the like
  • radicals R, R 'and R may be H atoms or alkyl radicals or aryl radicals, with large radicals appearing less interesting.
  • radicals m and m 'in the structures 1 and 2a are preferably methyl groups because the acetonide of a vicinal diol has good stability and is nevertheless relatively easy to deprotect.
  • m and m 1 can also be H atoms or larger radicals than methyl groups.
  • the routes a and b are not necessarily provided.
  • the SAM generator (structure 3 in Scheme 2.1) can be prepared directly by a single acylation reaction. Examples would be the reaction of 16,16'-diiodothiadecanoic acid with a large excess of glycerol or 3-aminopropane-1,2-diol. In most cases, however, the synthesis with protected vicinal diols (or vicinal amino alcohols) is more convenient than with unprotected ones.
  • Path a is the deprotection of the SAM artist. Typical examples would be the reduction of a disulfide, the cleavage of a trityl thioether, the hydrolysis of a thioester, the liberation of a thiol, or the hydrolysis of esters (amides) of terminal phosphate or phosphonate groups. In most cases, it will be beneficial if the SAM former carries a protecting group which is cleaved only after acyl coupling with the periodate-reactive module.
  • Route b is the cleavage of a ketal or acetal group from the vicinal diol, usually with protic acids or Lewis acids, possibly also with periodate.
  • step a and b can be adapted to the respective requirements. In some cases, it is arbitrary.
  • periodate-reactive part of structure 3 in Scheme 2.1 is a vicinal aminoalcohol, then it is made way marked.
  • the OH group of serine or threonine need not necessarily be protected if precautions are taken to avoid O-acylation.
  • Xi is an oligoethylene glycol with a terminal NH 2 group, resulting in a protein-resistant module.
  • 1, 3-diaminopropanol-2 (or a homologous / analogous molecule) serves as a periodate-reactive module and is acylated by a SAM-forming module.
  • 1, 3-diaminopropanol can be dispensed with the use of N-protecting groups at all.
  • Path d is an alternative preparation of structure 3, which is characterized in that neither the SAM-forming module nor the periodate-reactive module carry a protective group during the acyl coupling.
  • An example would be the reaction of undecenoic acid with a large excess of glycerol (or 3-aminopropane-1,2-diol or 1,3-diamino-2-propanol) to the corresponding monoacylated compound or the esterification of glycerol with lipoic acid.
  • the timing of SAM formation may vary from case to case. As a rule, however, the SAM will be formed with the structure 3 and the periodate oxidation will take place on the SAM. Of course, the SAM formation after the periodate oxidation is also possible.
  • a SAM consists of 100% of a periodate-reactive molecular species or whether any percentage of an inert SAM component having no latent aldehyde or keto groups is admixed. If appropriate, further heterogeneous SAM formers can be used.
  • Scheme 3.1 shows a particularly simple implementation of the embodiment.
  • the protected form of mercaptohexadecanoic acid (5) was coupled with 3-aminomethyl-2, 2-dimethyl-1,3-dioxolane (6) to give the double-protected conjugate (7).
  • Acid was then used to cleave the acetonide protecting group and the thioester protecting base, which is the route through structure 2b in Scheme 2.1. This gave structure 8, which was used for SAM formation.
  • the chip shown in Figure 1 was prepurified with water / ammonia / H 2 O 2 mixture and incubated over the weekend at room temperature with a 100 ⁇ M solution of Compound 8 in ethanol, followed by washes in ethanol (3x) and water ( 3 times). After blow-drying with nitrogen gas, the chip in a BIAcore X ® was mounted unit and with PBS ( "phosphate-buffered saline", 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4 ) overflowed (10 ⁇ l / min). A short pulse with 0.1% SDS had no effect, ie there was no loose material adhering to the chip.
  • PBS "phosphate-buffered saline"
  • the diol groups have been vi cinalen the SAM by two consecutive injections of 50 mM NaIO 4 oxidized (100 ul in 10 min). After the periodate oxidation of the vicinal diol groups to aldehyde groups, different proteins were coupled in the two measuring cells. In each case, 100 ⁇ l protein solution (1 mg / ml in PBS) was injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min.
  • PBS was injected in the control cell with 20 mM NaCNBH 3 (freshly mixed from PBS and a solution of 1 M NaCNBH 3 in 10 mM NaOH) to reduce the Schiff bases formed between the aldehyde groups of the chip and the lysine residues of the protein to stable secondary amines.
  • biotin IgG was injected into the measuring cell (flow cell 1, FCl, solid line in FIG. 1A), with 20 mM NaCNBH 3 being present at the same time. This showed a slightly stronger coupling of Biotion IgG compared to the simple IgG in the control cell (more than 3000 Jo remain bound). Probably the simultaneous presence of NaCNBH 3 was beneficial here.
  • BSA was injected into both cells in order to saturate any remaining points on the chip and thus to prevent the unspecific adsorption of further proteins.
  • no appreciable amount of BSA was bound in any of the cells, indicating that the chip areas in both measuring cells were already covered by IgG or biotin IgG.
  • the biotin IgG molecules in the measuring cell were faster and thus more upright coupled than in the slightly slower coupling (without NaCNBH 3 ) in the control cell.
  • non-specific protein adsorption and biospecific binding were tested. This was always 100 ul sample with a protein concentration of 2 uM and a flow of 10 ul / min injected (corresponding to 0.12 mg / ml for streptavidin and 0.3 mg / ml for IgG or biotin IgG).
  • the non-specific adsorption test was carried out with "pre-blocked streptavidin" to which 200 ⁇ M d-biotin had been added prior to injection. This gave no significant change in the resonance angle (+22 RU or -3 RU in FCl and FC2). By contrast, non-blocked streptavidin was strongly bound to the biotin IgG immobilized in FCl (2140 RU).
  • the molecule with structure 10 was dissolved in acetonitrile and mixed with an acetonitrile solution of 10a [Hahn's synthesis 2005] so that the two thiols were in the molar ratio of 1:19 and the total thiol concentration was 20 ⁇ M.
  • Precleaned BIAcore ® chips were incubated for 36 h in this solution and washed according to standard procedure [Tinazli 2005], to produce protein-resistant SAMs. These were stored under water at 4 ° C. and tested for protein resistance and aldehyde coupling within 2 weeks.
  • the same BIAcore ® data (Fig 2-5 see..) Gave as the structurally related SAMs 14 and 14a (1:19 mol / mol), which are shown below in Scheme 3.3-3.4.
  • OEG-terminated alkanethiols are known to be able to produce SAMs with a particularly low protein adsorption or high protein resistance on gold. Almost all studies used OEG-terminated undecanethiol derivatives. Recently, tri- and tetraethylene glycol-terminated dodecanethiol derivatives have been prepared (14a), thus also achieving high protein resistance [Hahn 2005]. The trityl-S-undecyl-triethylene glycol (11) produced by this study was extended by one propionic acid residue (Scheme 3.3) to give a COOH-terminated SAM generator with a protein-resistant OEG chain (12).
  • the chip was overflowed (25 0 C) at a constant flow of 10 ul / min and then injected various proteins at a concentration of 1 mg / ml.
  • the first two injections (100 ⁇ l each) were made with fatty acid-free BSA (Roche Diagnostics), which had been dissolved in PBS without further purification.
  • BSA fatty acid-free BSA
  • the viciral diol groups on the chip were oxidized by two 10-minute injections of 10 mM each of periodate (in buffer 5.5, ie in 100 mM sodium acetate, pH 5.5 adjusted with HCl). These are the first two injections in FIG. 3.
  • the aldehyde groups generated in this case were further derivatized only in flow cell 2 (dotted line in FIG.
  • biotin residues were covalently coupled with hydrazone formation and the hydrazone reduced to the substituted hydrazine to prevent the redissolution of the biotin residues. Thereafter, the aldehyde residues of both flow cells were reacted with ethanolamine and tested the chip for nonspecific protein adsorption and specific binding of streptavidin or biotin IgG.
  • Fig. 2 shows that the chip has an extremely high protein resistance before the action of periodate. Only during the injections did the resonance angle increase temporarily due to the refractive index effect of dissolved protein, after which it always returned to baseline (2000 units corresponded to approximately one monolayer of protein). Even after exposure to perjodate and coupling of biocytin hydrazide or ethanolamine, the chip has a very high protein resistance, as has been proven in two ways: First, the control cell (FCl, solid line in FIG. 3) shows no significant protein adsorption, regardless which protein was injected. Second, the measuring cell (FC2, dotted line in FIG. 3) does not show any protein binding if no specific binding sites are available at the SAM or at the injected protein.
  • the chip has a high specific binding capacity for streptavidin. However, some of the streptavidin molecules are not tightly bound, resulting in significant dissociation of the less tightly bound moiety. Even a second injection of streptavidin does not change this behavior. The remaining streptavidin has a high specific binding capacity for biotin IgG and this in turn can bind significantly more streptavidin than the original SAM. The subsequent injection of biotin IgG again shows an increase in the binding capacity. This progressive increase in binding capacity with each cycle indicates that the biotin group density at the SAM was slightly lower after biocytic coupling than would be needed for maximal streptavidin binding. This is due to the only 5% proportion of the vicinal diol groups on the SAM, to the relatively low biocytin hydrazide concentration (10 mM) and above all to the low periodate concentration (10 mM).
  • the OEG-terminated SAM of 14 and 14a (1/19, mol / mol) gives a particularly good protein resistance, and that the 5% proportion of latent aldehyde groups in the SAM leads to the covalent coupling small ligand molecules (in this case biocytin hydrazide) via chemose ligation (eg hydrazone formation).
  • a chip was again coated with 14 and 14a, but after the periodate oxidation, instead of biocytin hydrazide, maleimidopropionyl hydrazide (MPH) was coupled and its suitability for the coupling of proteins with free SH groups tested (Figure 4).
  • MPH maleimidopropionyl hydrazide
  • the latent aldehyde groups were oxidized with periodate (first two injections in FIG. 4) and the resulting aldehyde groups were further reacted with 10 mM maleimidopropionylhydrazide.
  • 20 mM NaCNBH 3 was present to irreversibly fix the hydrazone bond.
  • covalent coupling of goat IgG, which vorivatarra with approximately 5 3- (acetylthio) propionyl residues (SATP) per IgG molecule and immediately before coupling with hydroxylamine had been de-acetylated [Haselgrübler 1995].
  • Binding occurred The measuring cell occupied with biotin-IgG did not bind pre-blocked streptavidin (the injection after cysteine injection) and no simple IgG (last injection), but very well streptavidin and biotin-IgG in two consecutive cycles.
  • OEG-terminated SAMs with a small percentage of vicinal diol groups represent a very high-quality and diverse sensor surface which undergoes periodate oxidation via chemoselective ligation (ie, with primary amines, hydrazides, hydrazines, aminooxy derivatives, and N-terminal Cysteine residues) can be easily further derivatized, wherein the derivatization reactions do not affect the protein resistance.
  • Lipoic acid and lipoic acid NHS esters are often used for SAM formation on gold surfaces because disulfides bind to gold as well as free thiols.
  • lipoic acid (15) was linked to 6 via an amide bond to obtain the amide conjugate 16.
  • the covalent coupling of protein was done in three steps. At each step, 100 ⁇ l of a protein solution (1 mg / ml in PBS, always containing 20 mM NaCNBH 3 ) was injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min. In the first step, simple IgG was coupled in the control cell (FC2, solid line in Fig. 5), biotin IgG in the second step in the measuring cell (FCl, dotted line in Fig. 5) and BSA in the third step in both cells.
  • the protein-covered chip surfaces showed only minimal unspecific binding of 12 or 17 RU over pre-blocked streptavidin (2 ⁇ M, saturated with 200 ⁇ M biotin).
  • the control IgG-occupied control cell FC2, solid line in Figure 5
  • only 32 RU were bound by non-pre-blocked streptavidin, while the specific binding of streptavidin in the same measurement cell was 2540 RU (FCl, dotted line in Figure 5).
  • biotin IgG in the amount of 2590 RU was bound in this cell.
  • a renewed cycle with streptavidin and biotin IgG again gave gains of 2220 and 2640 RU, respectively, in the same measuring cell, i. that again and again a dense layer of the respective protein came to it.
  • the unbiotinylated IgG coupled in FC2 contains few molecules of a biotin-carrying protein to which increasing amounts of the respective protein bind in the alternating injections of streptavidin and biotin IgG, because each streptavidin has four biotin binding sites and each IgG has about 5 biotin residues so that rapidly growing tree structures grow on any unwanted biotin residue in FC2.
  • the "undesired specific binding" is in the control cell no problem. It would be applied only in the measuring cell streptavidin and then again only in the measuring cell, the biotinylated probe molecule, which causes the specific binding of the desired analyte molecule. In this way, the specific binding can be easily limited to the measuring cell, so that only the non-specific analyte binding can act in the control cell.
  • Example 3.4 Illustration of aldehyde-chip functionalization with 3- (maleimido) -propionylhydrazide (MPH), biotin-IgG-SATP, streptavidin and biotin-IgG
  • Scheme 3.5 shows the reaction sequence for the production of an IgG-SAM by means of MPH coupling.
  • the original SAM consisted of thiols 4a and 5 (Scheme 3.5), which were converted to the aldehyde form within the BIAcore ® setup using periodate ind.
  • biotin-IgG molecules were immobilized on the chip surface, which were functional with the biocytin-hydrazide-functionalized surfaces shown so far.
  • the same tests for determining nonspecific adsorption were carried out with analogous results, with no / negligible nonspecific adsorption being found.
  • Scheme 3.6 shows the reaction sequence of the binding of PDPH to an aldehyde SAM.
  • the original SAM consisted of a mixture of aldehyde-reactive thiols (4a prepared by periodate treatment from a vicinal diol) and inert thiols (5).
  • thiols provide the binding sites for the maleimide-functionalized IgG molecules (biotin-IgG-SMCC (SMCC: N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) -cyclohexanecarboxylate)).
  • biotin-IgG molecules were analogous to the chip surface described above on the chip surface.
  • the same assays for nonspecific and specific binding were performed, with the same results obtained (nonspecific binding tested with pre-blocked streptavilin and with unlabeled IgG and for specific binding by capture of functional streptavidin and biotin IgG).
  • Example 4.1 SAM-formers with a terminal vinyl group and a latent aldehyde group for SAMs on H-terminated silicon and diamond
  • Alkene derivatives with one terminal double bond are known to give tightly packed SAMs on H-terminated silicon and H-terminated diamond, respectively. Without catalysis, the SAMs form only at high temperature (eg by a few hours reflux at 165 ° C in mesitylene), with the help of UV light or a stable nitroxide spin label but also at room temperature. In thermal SAM formation, there should be no protolysable groups, ie, carboxyl or alcohol groups should be esterified. In the catalyzed SAM formation, free OH groups and even COOH groups are allowed because the double bond reacts much faster with the H-terminated silicon than the oxygen-containing ones under catalysis functional groups.
  • Structure 19 was prepared (Scheme 4.1) because it is an amide conjugate between a SAM-forming carboxylic acid (18) and a latent periodate-reactive module (6), as envisaged by the inventive idea (Scheme 2.1).
  • acetonide cleavage (to 19a) can then be carried out on the SAM, analogously to the published examples with Boc protective groups (see above) and analogously to the present exemplary embodiment with lipon-APD-acetonide (Scheme 3.3 and 3.4). Together with the functional data shown in Scheme 3.4, the synthesis of 19 must therefore be considered as a valid embodiment.
  • Example 4.2 SAM-formers with a catechol function for fixed bonding to metal oxide and a periodate-reactive group for the immobilization of biomolecules
  • Metal oxide surfaces can also be readily de-derivatized with silanes (eg ITO with octadecyltrimethoxysilane), but the silane layers are sensitive to alkaline solutions, even just above pH 7.
  • silanes eg ITO with octadecyltrimethoxysilane
  • SAMs of alkylphosphonates are resistant to alkali metal oxides on metal oxides alkaline solutions, and this is true even for such SAMs, which have not too long undecyl chain and good wettability on the water side.
  • a hydrophobic SAM of octadecylphosphonic acid on superficially oxidized aluminum is even completely resistant to a mixture of phosphoric acid, acetic acid and nitric acid, despite the low SAM thickness of about 2 nm.
  • Shorter alkyl phosphates or phosphonates are good in deprotonated form water soluble (as micelles) and can therefore be grown from water to metal oxides, long-chain alkylphosphonates are applied more from organic solvent or by "micro contact printing".
  • hydroxamic acids and carboxylic acids also form SAMs on metal oxides, with the affinity decreasing for some metal oxides in this order and increasing in others.
  • catechol groups e.g., DOPA
  • DOPA catechol groups
  • a molecule was prepared (structure 24 in Scheme 4.2), which possesses a long hydrophobic pentadecyl chain, at the ends of which a catechol function (1, 2-dihydroxybenzene) and a perjodate-reactive module are attached.
  • the weak carboxyl activator TSTU is used to couple 16-bromohexadecanoic acid (20) to APD acetonide (6) to amide.
  • the second Step is the O-alkylation of protected pyrogallol (22) with the intermediate 21. Cleavage of both acetonide ends gives the product 24.
  • the analogous molecule 25 was prepared by alkylation of 22 with hexadecylbromide, dissolved in acetonitrile (3 mM) and purified ITO (indium-tin-oxide). Incubated for 36 h. Washing and drying resulted in a contact angle of 84 ⁇ 5 °, in contrast to 47 + 2 ° on ITO, which had been incubated in pure acetonitrile.
  • the high contact angle proves the coverage of the entire ITO surface with the new SAM-Bildner 25.
  • a good chemisorption of catechol to the metal oxide is to be expected for the bifunctional SAM-24, so that on the water side of the SAMs a sufficient density of vicinal aliphatic Diols for the periodate oxidation to coupling aldehyde groups is available.
  • Example 1 it was emphasized that the acyl conjugation of SAM-forming modules with latent aldehyde modules is so gentle that the SAM-forming functions and the latent aldehyde function already exist unprotected or in weakly protected form in the modules to be coupled during acyl conjugation may be. This was demonstrated in Examples 2 and 3 as well as in Example 4.1 on the basis of concrete statements. In Example 4.2, however, the SAM-forming function (the protected catechol) was absent during acyl conjugation in the corresponding module. Rather, acyl conjugation (amide formation) was first performed, and only then was the terminal bromine atom of structure 21 substituted by the reactive oxygen atom of structure 22 to introduce the SAM-forming function (the catechol).
  • the first step of the route shown in Example 4.2 demonstrates the well-known advantage of acyl conjugation that it proceeds quantitatively under very mild conditions:
  • the primary amine 6 undergoes the chosen reaction conditions exclusively acylated and in no way alkylated by the bromide.
  • the peculiar property of the bromine atom on a simple alkyl chain, ie without a proximity to a carbonyl group or similar activating groups is also decisive for this.
  • iodide instead of bromide the schemes shown in Example 5 would be hardly conceivable because there would be a much too great tendency for alkylation here.
  • Chloride instead of bromide would be quite conceivable, despite the rather low reactivity of alkyl chlorides, namely because negatively charged sulfur atoms (thioacetate in Example 5.1 or thiosulfate in Example 5.2) represent supernucleophiles and therefore even chlorine atoms are easily substituted by sulfur. Also tosylate or mesylate would be conceivable instead of bromide, just to leave this option unmentioned.
  • Example 5 demonstrates that the synthetic strategy presented in Example 4.2 (introduction of the SAM-forming function after amide linkage) is much broader and offers convenient synthetic access to commonly required multifunctional SAM-formers.
  • the TSTU in situ amide coupling of 26 with a slight excess of 6 proceeded smoothly and without any indication of alkylation of the primary amine by the alkyl bromide function.
  • the product 27 could be purified by washing a chloroform solution with 0.1 M phosphoric acid (blunted to pH 2.5 with NaHCO 3 ), 10% Na 2 CO 3, and saturated NaCl. Thereafter, the bromide was substituted in DMF by a threefold excess of thioacetate, pre-purified by extraction (chloroform / water) and purified in chloroform on Sephadex LH-20.
  • Structure 27 was stirred in water / acetonitrile (1/2, v / v) with the equimolar amount of sodium thiosulfate for 24 h at room temperature, which, according to thin layer chromatography (silica, in chloroform / methanol / water, 70/30/4) almost All starting material was converted into the desired product. The latter was isolated by preparative silica chromatography.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von reaktiven molekularen Einmolekülschichten („Monolayer„) -Einheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine mehrfachfunktionelle Monolayer-bildende Komponente mit einer mehrfachfunktionellen Carbonylkomponente, die eine gegebenenfalls latente Carbonylygruppe aufweist und in einem Schritt in eine Carbonylgruppe umgewandelt wird, kovalent verbunden werden, wobei gegebenenfalls die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente durch eine oder mehrere mehrfachfunktionelle Verbindungskomponente(n) kovalent verbunden werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von reaktiven Einmolekülschicht-
Ξinheiten
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Synthese von Einmolekülschicht („Monolayer") -bildenden Molekülen.
Die Immobilisierung von Sensormolekülen (Protein, DNA, Liganden, Chelatoren, etc.) auf anorganischen Oberflächen ist Voraussetzung für die Herstellung vieler Chemo- und Biosensoren. Bei Affinitätssensoren dienen die Sensormoleküle (z.B. Antikörper) als spezifische Fänger, welche selektiv nur komplementäre Moleküle (z.B. das dazugehörige Antigen) fangen, während alle anderen. Begleitstoffe aus der Probe nicht an die Sensoroberfläche binden dürfen. Diese Bindung kann dann über eine physikalische Änderung in der Grenzschicht ("markerfrei", z.B. über Brechungsindex, Massebeladung etc.) oder über einen Marker (Radiolabel, Fluoreszenz etc.) am Analytmolekül detektiert werden. Bei biokatalytischen Sensoren dienen Enzyme als Sensormoleküle, welche nur ganz bestimmte Substratmoleküle umsetzen und dabei Nebenprodukte liefern, welche vom physikalischen Sensorteil (dem Transducer, z.B. eine Metallelektrode) detektiert werden können.
Biosensoren mit markerfreier Detektion benötigen spezielle anorganische Substrate, insbesondere Dünnfilme, auf welchen die Sensormoleküle (DNA, Antikörper, Liganden, Enzyme, etc.) über eine 1-100 nm dicke Linkerschicht immobilisiert sind.
Bei Oberflächen-Plasmon-Resonanz (OPR) -Biosensoren sitzen die Biomoleküle auf einer ca. 40 nm dicken Metallschicht (meist Gold, eventuell Aluminium oder Silber) , wobei Analyten über die Änderung des OPR-Winkels, d.h. des Brechungsindex der an die Oberfläche grenzenden Flüssigkeitsschicht (-200 nm) detektiert werden.
QCM(Quartz Crystal Microbalance) -Biosensoren besitzen auf beiden Seiten eines piezoelektrischen Kristalls eine (aufgedampfte) Metallelektrode, von denen eine mit Biomolekülen funk- tionalisiert ist.
Resonant Mirror, optical waveguide lightmode spectroscopy (OWLS) und reflectometric interference spectroscopy (RIfS) benötigen eine dünne Metalloxidschicht mit einem hohen Brechungsindex (z.B. Nb2O5 oder Ta2O5) zwischen Glassubstrat und den Sensormolekülen .
Weniger strikt sind die Randbedingungen für ellipsometrische Detektion von biospezifischer Bindung oder für amperometrische Detektion von biokatalytischen Reaktionen, aber auch hier haben Goldfilme große Vorteile: (1) Bei ellipsometrischen Sensoren erleichtern Goldfilme die Immobilisierung der Fängermoleküle und sorgen für eine hohe Detektionsempfindlichkeit . Bei amperometri- schen Enzym-Biosensoren können Mediator (z.B. ein Chinon) und Enzym (z.B. Glucose-Oxidase) unmittelbar auf der Goldelektrode aufgebracht werden, sodass der Elektronentransport zwischen Enzym und Elektrode direkt erfolgen kann und nicht auf die langsame Moleküldiffusion angewiesen ist. Außerdem erlaubt diese Bauweise die Herstellung von Sensoren in Mikro- und Nanometer- Dimensionen.
Bei Detektionsverfahren mit markierten Analyten (oder markierten Detektorsonden-Molekülen bei sogenannten Sandwich-Verfahren) sind die Einschränkungen hinsichtlich des Substrates von Fall zu Fall verschieden:
Bei elektrochemilumineszierenden Markern (z.B. Rutheniumkomplexe, Luminol, etc.) ist es unerlässlich, dass eine leitende Sensoroberfläche Elektronen an die markierten Moleküle abgibt oder von ihnen aufnimmt. Ein Metallfilm genügt, wenn die Lumineszenz auf der "Wasserseite" der Sensorschicht detektiert wird. Soll das emittierte Licht aber auf der Rückseite des Substrates detektiert werden, dann müssen die Sensormoleküle auf einer ITO(indium Tin Oxide) -Schicht sitzen, welche gleichzeitig transparent und elektrisch leitend ist.
Bei Chip-Assays mit fluoreszenzmarkierten Analytmolekülen (oder fluoreszierenden Detektorsondenmolekülen) ist die Wahl der Unterlage am wenigsten kritisch, im Prinzip kann jeder Träger verwendet werden, dessen Transparenz ausreichend hoch u.nd dessen Hintergrundfluoreszenz ausreichend gering ist. Die Verwendung von Metalloxidschichten kann aber auch hier einen großen Vorteil bringen, wenn nämlich dadurch die Immobilisierung der Sensormoleküle wesentlich erleichtert wird.
Die Funktionalisierung von anorganischen Oberflächen mit "intelligenten Molekülen" beschränkt sich aber nicht nur auf die Sensorik, sie wird in Zukunft auch in Aktuatoren, Datenspeichern, Brennstoffzellen etc. an Bedeutung gewinnen.
In Ausnahmefällen können Sensormoleküle direkt an anorganische Sensorflächen gebunden werden. In der Regel ist aber die Bindung entweder zu schwach für eine dauerhafte Immobilisierung (z.B. zwischen Protein und Gold oder zwischen Metalloxid und DNA) - oder sie ist zu stark und führt zu einer Denaturierung des Biomoleküls (bei Proteinen auf Metalloxiden) bzw. zur Adsorption des gesamten Biomoleküls auf der anorganischen Unterlage, sodass es seine Funktion als Fänger nicht mehr ausüben kann (z.B. bei kleinen DNA-Sondenmolekülen auf Metall) .
Aus den genannten Gründen werden die anorganischen Substrate der Sensoren in der Regel mit einer Schicht von synthetischen Linkermolekülen bedeckt und erst diese Schicht wird mit Sensormolekülen besetzt. Die Linkerschicht soll physikalisch inert sein gegenüber allen Stoffen, welche in der zu messenden Probe gelöst sein können. Bei Sensorflächen mit besonders geringer unspezifischer Proteinadsorption spricht man von "Protein-resistenten" Oberflächen.
Das Aufbringen der Linkerschicht kann in einem Schritt oder in mehreren Schritten erfolgen. Auf Glas, Quarz, Silica, oxi- diertem Silizium oder Siliziumnitrid wird in der Regel ein Mehr- Schritt-Verfahren angewandt. Zuerst wird ein kleines Silanmole- kül mit einer passenden chemischen Gruppe gekoppelt (z.B. mit einem Epoxid oder einem labilen Bromatom) und danach meist ein inertisierendes Hydrogel, z.B. ein PEG (Polyethylenglycol) -Derivat [Piehler 2000] oder ein mit ATRP (Atom Transfer Radical Po- lymerization) aufwachsendes Polyacrylamid-Derivat . Beispiele für Ein-Schritt-Verfahren sind die elektrostatische Adsorption von Polylysin-Polyethylenglykol (PLL-PEG, zusammen mit PLL-PEG-bio- tin) an Metalloxid [Huang 2002, Langmuir] oder die Kopplung von PEG-Silanen auf Glas [Wagner 2000] .
Silanisierungen tragen nach wie vor die Hauptlast der Immobilisierungschemie, trotz der inhärenten Probleme: Ethoxy- bzw. Methoxysilane finden als Linkerschichten breitere Anwendung als Chlorsilane, weil sie ungefährlicher und mit viel mehr funktionellen Gruppen erhältlich sind. Leider besitzen sie eine eher geringe Reaktivität gegenüber Oxidoberflächen, sodass erst beim "Curing" (ca. 2 h Inkubation bei ca. 14O0C) die meisten Silanmo- leküle kovalent ans Substrat binden. Unter trockenen Bedingungen reagieren sie trotzdem kaum mit Oxidoberflächen und unter feuchten Bedingungen bilden sie zunächst Polysiloxan-Netzwerke, welche bei Raumtemperatur nur H-Brücken zu den Oxidoberflächen ausbilden, bevor sie beim "Curing" kovalent an die Oberfläche binden. Definierte Silan-Monoschichten lassen sich nur unter großem Aufwand herstellen, in der Praxis werden Prozeduren mit definierten Lösungsmittel/Wasser-Gemischen bevorzugt, bei denen die Oxidoberflächen mit Undefinierten aber dafür einigermaßen reproduzierbaren Polysiloxan-Netzwerken bedeckt werden. Die Mono- schichtbildung gelingt relativ gut mit langkettigen hydrophoben Silanen wie Octadecyltrichlorsilan oder Octadecyltriethoxysilan. Als Linkerschicht für die Sensorik sind hydrophobe Monolayer (Einmolekülschichten) aber nur in Ausnahmefällen interessant, z. B wenn der Träger mit einer Phospholipidmonoschicht bedeckt werden soll. Die meisten Anwendungen verlangen eine hydrophile Linkerschicht sowie eine hohe Zahl von kopplungsfähigen Gruppen zur Anbindung der Sensormoleküle, d.h. einen SAM (self-assemb- ling monolayer - selbst-assemblierte Mono- oder Einmolekülschichten) mit bifunktionellen Silanen. Leider geben bifunktionelle Silane in der Regel die oben beschriebenen ungeordneten und schlecht reproduzierbaren Linkerschichten.
Das effizienteste und vielseitigste Verfahren zur Oberflä- chenderivatisierung ist die Bildung einer selbst-assemblierenden Monoschicht (self-assembled monolayer, auch „SAM" bezeichnet) . Der Ausdruck "SAM" betrifft eine geordnete und dicht gepackte Einfachschicht von strukturell gleichen oder ähnlichen Molekülen auf flachen meist anorganischen Substraten bzw. Trägern, welche sich spontan ausbilden ("von selbst assemblieren") . Dies ist dann der Fall, wenn spezielle anorganische Substrate verwendet werden, welche mit ganz bestimmten chemischen Gruppen eine starke Bindung eingehen (z.B. Gold mit Mercaptanen (Thiolen) und Di- sulfiden) , während sie inert sind gegenüber anderen funktionellen Gruppen.
Verschiedenste Moleküle können zu einem SAM-Bildner für ein bestimmtes anorganisches Substrat umfunktioniert werden, wenn an einem Ende eine funktionelle Gruppe eingeführt wird, welche sich durch eine hohe Affinität für ein bestimmtes anorganisches Substrat auszeichnet. Die Bindung solcher selbst-assemblierenden Monolayer-Bildner ans Substrat erfolgt spontan, d.h. auch aus verdünnter Lösung oder aus der Gasphase. Bei elongierten Molekülen bildet sich eine dichte laterale Packung, d.h. Alkylderivate geben einen "Rasen" von regelmäßig angeordneten (meist leicht schräg stehenden) Alkylketten. Bei jedem SAM-Typ gibt es ein breites Spektrum von funktionellen Gruppen, welche nicht ans an- organische Substrat binden und daher auf der Außenfläche des SAMs positioniert werden können. Dort dienen sie zum Einstellen der pyhsikalischen Eigenschaften (Hydrophilie etc.) und zum Koppeln von Biomolekülen.
In einem neueren Übersichtsartikel findet sich die Auflistung zahlreicher geeigneter hochaffiner Kombinationen von Substraten mit bestimmten funktionellen Gruppen [Love 2005, Table 1] . Die für die Biosensorik relevantesten Beispiele sind (1) SAMs von Thiolen, und Disulfiden auf Gold und Silber sowie (2) SAMs von Phosphaten und Phosphonaten auf Metalloxiden (vor allem Nb2O5, Ta2O5; TiO2, Al2O3, ITO) . Die höchste Affinität für Metalloxide wurde mit Katecholgruppen, wie z.B. DOPA3, erzielt, die eine gute Bedeckung mit DOPA3-PEG Varianten erzielt.
Ein weiterer SAM-Typ wird durch Addition von endständigen Vinylgruppen an H-terminiertem Silizium (bzw. Diamant) gebildet [Linford 1995] . Die Bildung erfordert entweder hohe Temperatur (ca. 1400C), die Katalyse durch UV-Licht oder durch einen Ni- troxid-Spinlabel, sodass hier der Aspekt der spontanen Assemblierung nicht unmittelbar gegeben ist. Trotzdem wird auch hier mit Recht der Ausdruck „Monolayer" oder „SAMλλ verwendet, weil ein SAM-artiger "Rasen" von dicht gepackten Kettenmolekülen gebildet wird und die Wahl der wasserseitigen Molekülteile relativ frei ist.
SAMs von Thiolen und Disulfiden auf Gold wurden bislang am besten untersucht. Sie weisen die größte Vielfalt an physikalischen Eigenschaften und chemischen Kopplungsfunktionen für die verschiedensten Anwendungen auf. Die Kopplungsgruppen auf den SAMs lassen sich in zwei Kategorien unterteilen: (1) in spezifische Kopplungsgruppen, welche nur mit einer speziellen funktionellen Gruppe reagieren, die bei Biomolekülen selten vorkommt oder erst künstlich eingeführt werden muss, und (2) in breit anwendbare Kopplungsgruppen, welche mit den meisten Biomolekülen unmittelbar zur Reaktion gebracht werden können.
SAMs mit spezifischen Kopplungsgruppen sind dann ideal, wenn das zu koppelnde Biomolekül die komplementäre chemische Gruppe bereits besitzt. a) Maleimidgruppen verlangen ein freies Thiol am Biomolekül. Dieses oxidiert aber leicht und muss vor der Kopplung meist reduktiv regeneriert werden. b) Die „Click-Chemie" beruht auf der 1, 3-Cycloaddition einer Acetylengruppe an eine Azidgruppe. Daher muss eine dieser Funktionen am SAM vorliegen (was das kleinere Problem ist) , während die komplementäre Funktion am zu immobilisierenden Sensormolekül immer künstlich eingeführt werden muss. c) SAM-Funktionalisierung über Diels-Alder-Cycloaddition verlangt ein Chinon am SAM und ein Cyclopentadien am Sensormolekül. Wie bei der Click-Chemie ist letzteres nur schwer zu erfüllen, wenn die Mengen an Sensormolekülen begrenzt sind oder wenn Arrays mit vielen unterschiedlichen Sensormolekülen hergestellt werden sollen. d) SAMs mit Biotin verlangen wiederum die Biotinylierung der zu koppelnden Biomoleküle, außer wenn sie als Fusionsproteine mit einem Streptag oder einer (Strept) avidin-Domäne expri- miert werden können. e) SAMs mit NTA (nitrilotriacetic acid) -Nickel-Funktionen binden Protein mit einem Oligohistidintag. Bei klonierten und expri- mierten Proteinen ist dies oft automatisch gegeben. Falls nicht, dann stellt diese Vorbedingung ein großes Hindernis dar, vor allem wenn das Protein noch gar nicht kloniert worden ist. Außerdem ist diese Methodik naturgemäß auf Proteine beschränkt . f) SAMs mit Aminooxy- oder Hydrazidfunktionen eignen sich zur Kopplung von Glykoproteinen, in deren Oligosaccharidresten mittels Perjodat oder Oxidasen Aldehydgruppen eingeführt worden sind [Wolfe 1995, Johnsson 1995] .
Es gibt zwar keine universelle Kopplungsgruppe, aminoreaktive Kopplungsgruppen kommen jedoch dem Ideal einer möglichst breiten Anwendbarkeit aus mehreren Gründen sehr nahe:
• Fast alle Proteine besitzen eine größere Zahl von Lysinresten und können über einen zufällig ausgewählten Lysinrest an eine aminoreaktive Gruppe binden, ohne ihre Aktivität einzubüßen.
• DNA-Fängermoleküle sind für jede beliebige Sequenz kommerziell erhältlich und werden auf Wunsch auch mit einer 5'- oder 3 ' -terminalen Aminogruppe geliefert.
• SAMs mit aminoreaktiven Gruppen können bei Bedarf mit den oben genannten spezifischen Kopplungsgruppen adaptiert werden, z.B. mit Biocytin zu einem Biotin-SAM, mit Lysin-NTA zu einem NTA-SAM, usw.
In der Praxis werden drei Typen von amino-reaktiven SAMs angewendet : a) SAMs mit Epoxiden sind nur mäßig reaktiv gegenüber Aminogrup- pen und werden eher selten für diesen Zweck verwendet, eher noch für Sensormoleküle mit freien Thiolgruppen, weil diese sehr gut an Epoxide koppeln. b) SAMs mit aktivierten COOH-Gruppen: Die Carboxylgruppe ist per se nicht reaktiv, sie muss daher entweder in voraktivierter Form als SAM aufgebracht [Wilkop 2004, Pierce Chemical Company Tech Tip #2 zu finden auf www.piercenet.com] oder nachträglich aktiviert werden. In beiden Fällen ist die relativ rasche Hydrolyse der aktivierten Form (meist eines NHS-Es- ters) ein Problem (Pierce empfiehlt, die NHS-Ester-Mono- schicht möglichst rasch mit den Biomolekülen zu funktionalisieren, um der spontanen Deaktivierung zuvorzukommen [Pierce Chemical Company Tech Tip #2] ) . Ein zweites Problem besteht darin, dass viele COOH-Gruppen wegen Hydrolyse oder wegen inkompletter Aktivierung als negativ geladene Car- boxylatgruppen vorliegen, sodass negativ geladene Biomoleküle stark abgestoßen werden. Aus diesem Grund muss bei Proteinkopplung der pH-Wert in die Nähe des IEP oder des vermuteten IEP abgesenkt werden, d.h. dass die Kopplungsbedingungen für jedes Protein neu optimiert werden müssen. Auch bei DNA-Kopplung an Carboxyl-Oberflachen kann durch pH-Absenkung die elektrostatische Abstoßung verringert und die Kopplungseffizienz stark verbessert werden. Letzteres Beispiel betrifft aber keinen SAM, sondern silanisiertes Glas, welches mit PEG- Dicarboxylat acyliert worden ist. Für DNA-Immobilisierung auf Carboxyl-SAMs konnte in der Literatur kein Beispiel gefunden werden, wohl deshalb, weil die elektrostatische Abstoßung der negativ geladenen DNA durch die Carboxylgruppen zu stark ist, um eine effiziente Kopplung zuzulassen. c) SAMs mit Aldehydgruppen: Aldehydgruppen haben zwei entscheidende Vorteile gegenüber Carboxylgruppen: (1) Sie sind per se aminoreaktiv und in dieser Form auf der Oberfläche sogar lange Zeit stabil. (2) Sie besitzen keine elektrische Ladung und stoßen daher weder Proteine noch Nukleinsäuren elektrostatisch ab. Aus diesen Gründen erfreuen sich Aldehydgläser großer Beliebtheit für die Herstellung von Nukleinsäure-Ar- rays . Dazu kommt ein dritter Vorzug von Aldehyd-SAMs : Sie eignen sich für die chemoselektive Ligation nicht nur von Aminogruppen, sondern auch von Hydrazinen, Hydraziden, Ami- o nooxygruppen bzw. N-terminalen Cysteinen unter Bildung von
Hydrazonen, Oximen bzw. 1, 3-Thiazolidinringen.
Angesichts der Vorzüge von Aldehydgruppen für Immobilisierungszwecke ist es erstaunlich, dass nur vereinzelte Versuche mit Aldehydgruppen auf SAMs publiziert worden sind. Sehr unterschiedliche Strategien wurden zur Herstellung von "Aldehyd- SAMs" auf Gold angewendet: a) Im einfachsten Fall wurde zuerst ein NH2-terminierter SAM aufgebracht und daran der homobifunktionelle Glutaraldehyd gekoppelt [Berchmanns 2002] . Dabei reagieren viele Glutaral- dehydmoleküle nur mit einem ihrer beiden Aldehydenden, sodass das zweite für die Kopplung eines Biomoleküls zur Verfügung steht. Analog zum bifunktionalen Glutaraldehyd wurde auch ein multifunktionales Polymer (Perjodat-behandeltes Dextran, d.h. mit vielen Aldehydgruppen) verwendet um Biomoleküle an NH2- terminierte SAMs zu koppeln [Massia 2000] . b) Das zyklische Pentamethylensulfid (= Tetrahydrothiophen) wurde zum Sulfoxid oxidiert und dieses durch Umlagerung in 2-Hy- droxypentamethylensulfid umgewandelt. Letzeres steht im Gleichgewicht mit der linearen Form (5-Mercaptopentanal) und bildet daher auf Gold einen Aldehyd-terminierten SAM [Horton 1997] . c) In einer vergleichbaren Studie wurde 12-Acetylsulfanyldode- can-2-on deacetyliert und dabei 12-Mercaptododecan-2-on erhalten [Chan 2002] . Dieses bildete einen dichten SAM mit Methylketogruppen auf der Wasserseite. d) Aus 11-Brom-l-undecen wurde in mehreren Stufen 11, 11 ' -Dithio- bis- (undecan-l,2-diol) und dessen vicinale Diolgruppen mittels Perjodat quantitativ in Aldehydgruppen umgewandelt, bevor das dabei erhaltene 11, 11' -Dithio-bis-undecanal als SAM ans Gold chemisorbiert wurde [Peelen 2005] . Disulfide geben bekanntlich die äquivalenten SAMs wie Thiole, nur die Geschwindigkeit ihrer Chemisorption ist geringer. e) In gleicher Weise hat auch eine andere Autorengruppe Aldehydterminierte Dialkyldisulfide hergestellt und als SAM an Gold chemisorbiert [Liu 2002, Wadu-Mesthrige 1999 und 2001] . Die Autoren behaupten zwar, dass sie 3-Mercaptopropanal und 11- Mercaptoundecanol hergestellt hätten, dies ist aber unwahrscheinlich, weil sie 3-Mercaptopropanol und 11-Mercaptounde- canol mit Pyridiniumdichromat oxidiert haben [Wadu-Mesthrige 1999] . Nun ist aber bekannt, dass Pyridiniumchlorochromat [Salehi 2001] und Picoliniumchlorochromat [Khodaei 2004] Thiole zu Disulfiden oxidieren und dass diese Oxidation viel schneller verläuft als die eines primären Alkohols zu einem Aldehyd [Khodaei 2004] . Auch für Pyridiniumdichromat darf mit Recht angenommen werden, dass es freie Thiole zu Disulfid oxidieren kann. f) Eine andere Strategie findet sich in jenen zwei Studien, bei denen ein Alkanthiol [Jang 2003] oder ein Phosphin [Hainfeld 1995] hergestellt wurde, welches am anderen Molekülende eine vicinale Diolgruppe besaß. Letztere wurde erst am fertigen SAM durch eine wässrige Perjodatlösung in die aminoreaktive Aldehydgruppe umgewandelt. Jedoch liegt diesen Methoden aufwendige Synthesearbeit mit schlechten Gesamt-Ausbeuten von nur 3,5 % [Jang 2003] zugrunde, die eine breite Anwendung verhindert .
Bei dieser Übersicht von SAMs mit Aldehyd- bzw. Ketogruppen fallen Synthese-bedingte Schwachpunkte besonders auf. Auch auf Gold wurden nur sehr einfach strukturierte Aldehyd-SAMs hergestellt - obwohl sie zum Teil durch aufwendige Synthesarbeit hergestellt wurden - insbesondere ohne die sonst populären Protein-resistenten SAM-Bildner. Die WO 2004/017042 A2 beschreibt daher die Synthese direkt am Träger nach der Bildung des SAMs. Zunächst wird demnach ein Monolayer gebildet, auf diesen Monolayer wird eine Protein-resistente Schicht gebunden und als dritte Schicht eine Protein-reaktive Schicht gebunden, die sich letztendlich zur Bindung von Biomolekülen eignet. Diese Methode der Synthese am Träger, wie sie auch von Berchmanns [2002] beschrieben wurde, hat natürlich den Nachteil, dass die Synthese immer nur in situ stattfinden kann und keine Vorbereitung der Monolayer-Bildner z.B. im BuIk erlaubt. Ein weiterer Nachteil führt zur unkontrollierten Schleifenbildung zwischen Monolayer-Bildnern, wenn ein bifunktionelles Reagens, z.B. zur Bildung der Protein-resistenten Schicht oder der reaktiven Schicht, verwendet wird, welches auch mit zwei benachbarten Monolayer-Bildnern reagieren kann.
Die DE 102 51 229 Al beschreibt Dithiolan-Derivate mit einer Diolgruppe zur Bildung von Monolayern auf Metalloberflächen. Eine der Hydroxylgruppen des Diols werden benutzt um direkt Oli- gonukleotide aufzubauen.
Die US 2005255514 Al betrifft Monolayer-bildende Silanmole- küle, die durch Kopplungesreaktionen eines Alkens mit einer weiteren Einheit (z.B. PEG oder fluorierte Benzoesäureester) hergestellt werden.
Die WO 2006/048491 "Al betrifft Monolayer-bildende Moleküle (über Thiolgruppen) zur Bindung von DNA-Molekülen an Chipoberflächen.
Yadavalli et al. (Langmuir 22 (16) (2006): 6969-76) beschreiben Monolayer, wobei die Bildung an Oberflächen über Thio- Ie erfolgt und die Immobilisierung von Proteinen über die Bindung mit Hilfe einer N-Hydroxysuccinimidgruppe an Lysinreste des Proteins.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung synthetische Mittel zu liefern, auf einfachem Wege und mit guten Ausbeuten vollständige Einmolekülschichten („Monolayer" ) -Bildner oder -Einheiten bereitzustellen, die (in Variationen) auf diversen Trägern Einmolekülschichten ausbilden können.
Die vorliegende Erfindung liefert- daher ein Verfahren zur Herstellung von reaktiven molekularen Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheiten, wobei eine mehrfachfunktionelle Monolayer- bildende Komponente mit einer mehrfachfunktionellen Carbonylkom- ponente, die eine gegebenenfalls geschützte latente Carbonyl- gruppe, vorzugsweise ausgewählt aus einem vicinalen Diol, einem geschützten vicinalen Diol, einem vicinalen Aminoalkohol und einem geschützten vicinalen Aminoalkohol, aufweist und in einem Schritt in eine Carbonylgruppe umgewandelt wird, kovalent verbunden werden, wobei gegebenenfalls die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente durch eine oder mehrere mehrfachfunktionelle Verbindungskomponente (n) kovalent verbunden werden.
Unter „latente Carbonylgruppe" wird eine chemische Gruppe verstanden, die sich durch eine Reaktion in einem Schritt in eine Carbonylgruppe umwandeln lässt. Im diesen Sinn soll „Carbonylkomponente" nicht derart verstanden werden, dass diese Komponente eine Carbonylgruppe bereits aufweist. Eine solche latente Carbonylgruppe ist vorzugsweise ein vicinales Diol, ein geschütztes vicinales Diol, ein vicinaler Aminoalkohol oder ein geschützter vicinaler Aminoalkohol - die in einem Schritt durch Perjodatbehandlung in einen Aldehyd umgewandelt werden. Daher ist die Umwandlung vorzugsweise eine Oxidation, insbesondere zu einem Aldehyd. Sofern die Carbonylkomponente eine dieser vier Gruppen aufweist, wird sie hierin auch als „Diolkomponente" bezeichnet. Mit „Diolkomponente" wird somit eine Komponente bezeichnet, die eine Gruppe aufweist, die sich wie ein vicinales Diol zu einem Carbonyl (vorzugsweise einem Aldehyd oder Keton) oxidieren lässt (z.B. unter Perjodateinwirkung) und weist eine Diol- oder eine äquivalente Gruppe (z.B. einen vicinalen Amino- alkohol) auf, die gegebenenfalls geschützt sein kann. Die Car- bonylkomponete dient dazu, um an der Monolayer-bildenden Einheit eine Gruppe zur Verfügung zu stellen, mit der auf einfache Weise beispielsweise Biomoleküle oder weitere (bioreaktive) Kopplungsgruppen gebunden werden können - insbesondere an einem mit den Einheiten gebildeten Monolayer. In einer anderen Ausführungsform wird anstelle der (oder zusätzlich zur) gegebenenfalls geschützten latenten Carbonylgruppe eine gegebenenfalls geschützte Car- bonylgruppe, vorzugsweise ausgewählt aus einem Aldehyd, einem geschützten Aldehyd, einem Keton und einem geschützten Keton, in der Carbonylkomponente eingesetzt.
Die Reihenfolge der Reaktionen ist dabei nicht von Bedeutung. So kann entweder die Monolayer-bildende Komponente oder die Carbonylkomponente zuerst an eine Verbindungskomponente gebunden werden und dann die andere Komponente angefügt werden, oder umgekehrt. Sowohl die Monolayer-bildende Komponente oder die Carbonylkomponente, aber auch die Verbindungskomponente, können in diesen Stufen geschützt oder nicht geschützt sein. Eine Ausbildung eines Monolayers kann ebenfalls zu einem beliebigen Zeitpunkt erfolgen (nachdem die Monolayer-bildende Gruppe der Monolayer-bildende Komponente entschützt wurde) , entweder vor oder nach dem entschützen der latenten Carbonylgruppe oder vor oder nach dem kovalenten Binden dieser Gruppe. Entschützen oder umwandeln der latenten Carbonylruppe erfolgt ebenfalls an einer beliebigen Stelle: So ist es z.B. möglich zuerst eine Carbonylkomponente an eine Verbindungsgruppe zu binden, ggf. die Schutzgruppe der (latenten) Carbonylgruppe zu entfernen, und dann eine Monolayer-bildende Komponente zu binden (wobei die Monolayer bildende Gruppe dieser Komponente geschützt sein kann und vor oder nach dem Binden entschützt werden kann) . Auch die Umwandlung der latenten Carbonylgruppe (z.B. ein Diol oder Ami- noalkohol) in eine Carbonylgruppe (z.B. Aldehyd oder Keton) erfolgt zu einem beliebigen Stadium - z.B. meist unmittelbar vor der Bindung von Zielmolekülen, wie z.B. Biomolekülen, besonders wenn die Carbonylgruppe eine reaktive Aldehydgruppe ist. Vorzugsweise ist zu diesem Zeitpunkt der Monolayer und/oder die ko- valente Verbindung der Komponenten bereits ausgebildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in Lösung oder in fluiden Medien durchgeführt, wobei die Komponenten (sowie ggf. die Einheit) gelöst sind. Die Monolayer-bildende Komponente bildet dann auf einem Träger Einmolekülschichten aus . Der Begriff „mehrfachfunktionell" weist darauf hin, dass die Komponenten sowohl eine funktionelle Gruppe zur Monolayer-Bildung bzw. Carbonyl-Bildung aufweisen (im Fall der Monolayer-bildenden Komponente bzw. der Carbonylkomponente) und auch eine Gruppe zur Konjugation der beiden Komponenten (oder mehrere im Fall der Verbindungskomponente (n) ) .
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur vorgenommen bzw. insbesondere bei einer Temperatur kleiner als 45 °C, vorzugsweise kleiner als 400C, am meisten bevorzugt kleiner als 35°C.
Mit der erfindungsgemäßen Methode ist es nun möglich, durch eine einfache Kopplungsreaktion (vorzugsweise unter milden Bedingungen) , wie eine Reaktion bei Raumtemperatur, keine Säurekatalyse und/oder keine starke Basenkatalyse (Katalyse unter Verwendung von Basen mit einem pKa-Wert größer als 14) eine Mo- nolayer-Einheit (oder auch Monolayer-Bildner, Einmolekülschichten-Einheit oder Einmolekülschichten-Bildner genannt) herzustellen, die sowohl mit einem Träger reaktiv ist und sich auf einfache Weise mit in eine bioreaktive Carbonylgruppe umwandeln lässt (z.B. mit Perjodat durch Oxidierung der Diolkomponen- te - bzw. des Diolteils der fertigen Monolayer-Einheit) und somit aktivieren lässt, um sich z.B. mit Biomolekülen oder weiteren Kopplungspartnern zur Bindung von Biomolekülen kovalent funktionalisieren zu lassen. Bei der Kopplung der Komponenten kann eine Vielzahl an Kopplungsreaktionen herangezogen werden, wobei die Acylierung bevorzugt ist. Gegebenenfalls sind die Carbonylkomponente (auch in ihrer Vorstufe zum Carbonyl = latentes Carbonyl) und die Monolayer-bildende Komponente geschützt.
Monolayer-Bildner sind Moleküle, welche mit einer bestimmten chemischen Funktion (z.B. Thiol oder Disulfid) hochaffin an ein bestimmtes anorganisches Substrat (z.B. Silber oder Gold) binden. Die Moleküle oder Komponenten sind vorzugsweise so gebaut, dass sie sich dicht packen lassen. Das anorganische Substrat hat vorzugsweise keine Affinität gegenüber den meisten anderen funktionellen Gruppen. Die Monolayer-bildende Komponente ist per Definition auch selbst fähig, Monolayer auf geeigneten Trägern auszubilden - und weist gegebenenfalls eine Affinität für ein bestimmtes anorganisches Substrat auf - und würde sich als „Mo- nolayer-Bildner" qualifizieren. Der Klarheit wegen wird hierin der Ausdruck „Monolayer-Bildner" aber nur für das synthetisierte Produkt verwendet, das sowohl einen Monolayer-Träger reaktiven Teil (gegebenenfalls geschützt) als auch einen Carbonyl-Teil (Carbonyl oder latentes Carbonyl unter Carbonyl-, Aldehyd- oder Ketonbildung) aufweist. Auch der Vorläufer sowie der Monolayer- Bildner und natürlich die Carbonylgruppe (der Carbonylkomponen- te) selbst können gegebenenfalls geschützt sein. Hierfür können beliebige Schutzgruppen, die bereits ausführlich bekannt sind, herangezogen werden. Der Vorteil der Methode liegt darin, dass im Gegensatz zu bekannten Synthesemethoden die reaktiven Gruppen (Monolayer- & Carbonylgruppe) nicht erst durch aufwendige Synthesen an der Monolayer-Einheit gebildet werden (wie z.B. nach Horton [1997], Jang [2003]) und durch die Vielzahl der möglichen Ausgangsstoffe - die bereits handelsüblich erwerbbar sind - auch gewünschte Eigenschaften (voran die Proteinresistenz) frei wählbar und erzielbar sind. Durch diese Vorgehensweise können auch insbesondere asymmetrische Monolayer-Bildner hergestellt werden, bzw. symmetrische Zwischenstufen, die in weiterer Folge asymmetrisch modifiziert und aufgereinigt werden, vermieden werden.
Die Vorteile einer latenten Carbonylgruppe, wie z.B. bei einer Perjodat-reaktiven Komponente bzw. einem Modul liegen darin, dass damit die Bildung der Aldehyd- oder Ketogruppe zeitlich hinausgeschoben werden kann (z.B. bis nach der SAM-Bildung) , was Konflikte mit anderen funktionellen Gruppen oder Reaktionsschritten minimiert. Die Oxidation mit wässrigem Perjodat ist zudem viel schneller und einfacher als die saure Spaltung eines Acetals (Ketals) , z.B. von Diethylacetal .
Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform die Carbonyl- komponente eine Diolkomponente, die ein vicinales Diol, ein geschütztes vicinales Diol, einen vicinalen Aminoalkohol oder einen geschützten vicinalen Aminoalkohol aufweist. Mit dieser Ausführungsform ist es nun möglich, durch eine einfache Kopplungsreaktion eine Monolayer-Einheit (oder auch Monolayer-Bildner, Einmolekülschichten-Einheit oder Einmolekülschichten- Bildner genannt) herzustellen, der sowohl mit einem Träger reaktiv ist und sich auf einfache Weise mit Perjodat durch Oxidie- rung der Diolkomponente (bzw. des Diolteils der fertigen Monolayer-Einheit) bioreaktiv aktivieren lässt.
Die Vorteile einer latenten Carbonylkomponente, insbesondere einer Perjodat-reaktiven Komponente bzw. eines Moduls liegen darin, dass damit die Bildung der Aldehyd- oder Ketogruppe zeitlich hinausgeschoben werden kann (z.B. bis nach der SAM- Bildung) , was Konflikte mit anderen funktionellen Gruppen oder Reaktionsschritten minimiert. Die Oxidation mit wässrigem Perjodat ist zudem viel schneller und einfacher als die saure Spaltung eines Acetals (Ketals) , z.B. von Diethylacetal .
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Monolayer-bildende Komponente in der Lage, selbst Einmolekülschichten auf einem Träger auszubilden ( „self-assembling monolayerλ\ SAM) - also eine selbst-assemblierende Monolayer-bildende Komponente.
Somit liefert die vorliegende Erfindung ein praktisches mo- dulares Synthesesystem (die Edukte bzw. Komponenten werden auch als „Modul" bezeichnet) zur Herstellung von multifunktionellen SAM-Bildnern, welche eine Carbonylgruppe oder eine latente Car- bonylgruppe - in ungeschützter oder geschützter Form - enthalten. Da dieses System im einfachsten Fall nur eine Synthesestufe aufweist, entfallen auch aufwendige Reinigungsschritte der Zwischenprodukte. Von den beiden Modulen liefert einer die SAM-bil- dende Gruppe (z.B. ein Thiol, Disulfid, Phosphat, etc., meist in geschützter Form, z.B. als Tritylthioether, Acetylsulfanylgrup- pe, etc.) und der andere Modul die Carbonyl- oder latente Carbonylgruppe (z.B. einen vicinalen Aminoalkohol oder ein vicinales Diol meist geschützt, z.B. als Acetonid) enthält. Auf diese Weise sollen die verschiedensten SAM-Bildner (für Metalle, Metalloxide, H-terminiertes Silizium, etc.) mit Carbonylen (oder z.B. Aldehyden oder vicinalen Diolen als latente Aldehyde) ausgerüstet werden können, welche nach SAM-Bildung (z.B. mit wäss- riger Perjodatlösung) bei Bedarf eine terminale bioreaktive Gruppe (z.B. Keto- oder Aldehydgruppe) ergeben.
Zwischen diesen beiden Modulen kann bei Bedarf auch eine Verbindungskomponente als Protein-resistenter Modul (z.B. ein Oligoethylenglykol „OEG", ein Oligopropylensulfoxid, ein Oligo- sarcosin, und andere inerte, vorzugsweise lineare, Polymere) eingeschoben werden. Die beiden endständigen Moduli (Carbonyl- komponente und Monolayer-bildende Komponente) können natürlich auch selbst bereits Protein-resistente Eigenschaften aufweisen. Daher werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Monolayer-bildenden Komponenten und die Carbonylkomponenten durch eine oder mehrere Verbindungskomponente (n) , vorzugsweise ein inertes lineares Polymer, insbesondere Polyethylenglycol, kovalent verbunden. Die Reaktion hierfür kann aus der gleichen Gruppe an Reaktionen, mit der in der Alternative die Carbonyl- komponente mit der Monolayer-bildenden Komponente verbunden wird, ausgewählt werden; vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Acylierungsreaktion zwischen den Reaktionspartnern. In einer weiteren Ausführungsform werden die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente direkt miteinander verbunden.
Die Kopplung der Komponenten ist bevorzugt mild und quantitativ. "MildλΛ bedeutet, dass mindestens 90 %, insbesondere mindestens 95 %, der (meist geschützten) SAM-bildenden Gruppe und der (meist geschützten) Diolgruppen bei der Kopplung intakt bleiben: „Quantitativ" besagt, dass mehr als 90 % der Unterschusskomponente (gegebenenfalls entweder des SAM-bildenden Moduls oder der Carbonylkomponente) zum gewünschten Kopplungsprodukt umgewandelt werden.
Die chemische Bindung zwischen den aneinander gekoppelten Komponenten ist vorzugsweise so stabil, dass danach eventuell vorhandene Schutzgruppen am SAM-bildenden Ende bzw. am (latenten) Carbonyl-Ende ohne Gefahr für das Konjugat abgespalten werden können.
In besonders bevorzugten Verfahren werden die Monolayer-bildende Komponente, die Carbonylkomponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente durch Acylkonjugation, vorzugsweise von Kohlensäure, Kohlensäurederivaten, Carbonsäuren, Carbonsäurederivaten oder aktivierten Estern, an einer der verbundenen Komponenten oder miteinander verbunden. Als Reaktionspartner kommen alle bekannten Kopplungspartner in Frage. Das Verfahren der Acylkonjugation (als Amid, Ester, Urethan, Carbonat u. dergl.) ist ausreichend mild, sodass erstens die Monolayer-bildende Komponente bereits vorher die fertige SAM-bildende Gruppe besitzen kann, sei es in ungeschützter Form (z.B. als Disulfid, terminale Doppelbindung) oder in schwach geschützter Form (z.B. als Thioester) , welche nach der Acylkopplung durch kurze Nachbehandlung entschützt werden kann, und zweitens auch die latente Car- bonyl-Komponente in einer schwach geschützten Form (z.B. als Acetonid eines vicinalen Diols oder als O- und/oder N-geschütz- tes Serin) vorliegen kann.
Auch die Reinigungsprobleme der Zwischen- und Endstufen sind bei Acyl-Kopplungen von zwei Teilmodulen sehr gering. Dies gilt vor allem dann, wenn Aminogruppen mit Carbonsäuren acyliert werden, weil sich das ungeladene Amidkonjugat in Größe und Ladung stark von dem im Sauren kationischen Amin und der im Basischen anionischen Carbonsäure unterscheidet.
Das gleiche gilt für die Carbonylkomponente - insbesondere mit der latenten Aldehydgruppe, dem vicinalen Diol . Dieses kann ebenfalls bei der Kopplung schon als solches vorliegen oder als Acetal/Ketal (z.B. als Acetonid), welches nach der Acylkopplung durch kurze und sehr milde Säurebehandlung gespalten werden kann.
Es gibt ausreichend viele kommerzielle Module mit ungeschützten oder passend geschützten vicinalen Diolen (oder den gleichwertigen vicinalen Aminoalkoholen, z.B. N-Boc-Serin) , welche für das Verfahren - in der Ausführungsform unter Verwendung einer „Diolkomponente" als Carbonylkomponente unmittelbar genutzt werden können.
Die Modul-Verkopplung mittels Acylkonjugation (oder gleichwertig milden und effizienten Kopplungsreaktionen) schafft somit den Zugang zu einer unglaublichen Vielfalt an SAM-Bildnern mit (latenten) Carbonylgruppen. Dies steht in scharfem Kontrast zu bisherigen Synthesearbeiten, bei denen immer nur ein Spezial- fall gelöst worden ist, ohne Variationsmöglichkeit und ohne Übertragbarkeit auf andere SAM-Typen.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Carbonylkomponente und/oder die Monolayer-bildende Komponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente unabhängig voneinander eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus -COOH, NH2, aktivierter Säureester, oder Säurechlorid, auf, die zur Bindung an eine der anderen Komponenten, die vorzugsweise aus der Gruppe, ausgewählt aus OH, NH2 oder SH ist, verwendet wird.
Die molekulare Zusammensetzung der Komponenten kann - abgesehen von den reaktiven Endgruppen der Einheit (die erhalten werden sollen) und den Kopplungspartnern - beliebig gewählt werden. In speziellen Ausführungsformen weisen die Carbonylkomponente und/oder die Monolayer-bildende Komponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente unabhängig voneinander eine gegebenenfalls ein-, zwei-, oder mehrfach 0-, N-, S- oder P-heterosubstituierte Gruppe ausgewählt aus Ci_30-Alkyl, Cx-^-Aryl, c2-3o~Glykol, vorzugsweise Ci_30-Ethylenglycol, oder Kombinationen hiervon, auf, die vorzugsweise die mindestens zwei funktionellen Gruppen der jeweiligen Komponente trennt.
Die kovalente Bindung der Einheiten kann aus Reaktionsbedingungen ausgewählt werden aus Raumtemperatur, und/oder Basenkatalyse, vorzugsweise schwacher Basenkatalyse unter Verwendung von Basen, die in ihrer protonierten Form einen pKa-Wert kleiner als 12 haben (selbstverständlich werden die Basen in ihrer deproto- nierten Form - als Basen - eingesetzt) , besonders bevorzugt unter Verwendung tertiärer Amine in organischem Lösungsmittel (nicht Basen - in der protonierten Form - mit einem pKa > 14 wie Alkalilauge oder Alkohlate oder Natriumhydrid u.a.) - unter Bedingungen, welche die geschützte oder ungeschützte Monolayer- bildende Gruppe (z.B. Thioester oder Disulfide) und die geschützte oder ungeschützte (latente) Carbonylkomponente (z.B. ein als Aceton geschütztes vicinales Diol oder einen N-geschütz- ten Serinrest) zu mindestens über 90 % intakt lassen. Schwache Basenkatalyse bedeutet die Verwendung von Basen, die in ihrer protonierten Form einen pKa-Wert von kleiner als 12 aufweisen, vorzugsweise die Verwendung von tertiären Aminen oder von Pyri- din-Varianten (z.B. Pyridin oder Dimethylaminopyridin) , - meist in wasserfreiem Medium, mitunter in gemischt wässrigen Lösungen, welche auch DMSO, DMF, Dioxan, THF, Acetonitril u.a. mit Wasser mischbare Lösemittel enthalten können. Beispiele geeigneter Basen sind bspw. Trimethylamin (pKa = 9,76), Tripropylamin (pKa = 10,65), Triethylamin (pKa = 10,75), Pyridin (pKa = 5,17) und Dimethylaminopyridin (DMAP, pKa = 9,2) - pKa-Wert jeweils in der protonierten Form (wobei selbstverständlich die deprotonierte Form als Base wirkt) . Geeignete Kopplungsgruppen, die hierfür den Komponenten vorliegen müssen, können nach dem Wissen des Standes der Technik gewählt werden, sind jedoch bevorzugt aus den oben genannten Gruppierungen für die Acylierung ausgewählt.
Auch vorgesehen ist der Verfahrensschritt zur Entschützung der Monolayer-bildenden Komponente. Dies ist nach der Kopplung der Komponenten ein notwendiger Schritt um einen Monolayer auf einem Träger auszubilden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass gegebenenfalls unter milden Kopplungsbedingungen die Mono- layer-bildende Komponente nicht geschützt sein rauss (z.B. Disul- fide für SAMs auf Gold oder Vinylgruppen für SAMs auf H-termi- niertem Silizium) .
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Einmolekülschicht, bei welchem Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheiten wie hierin beschrieben synthetisiert und auf einem Träger gebunden werden. Diese Bindung erfolgt vorzugsweise durch Adsorption an den Träger, wie z.B. bei Thiolgruppen auf Goldoberflächen (auch „Chemi- sorption" genannt, die hierin auch unter den Begriff Adsorption fällt) .
Zur weiteren Verarbeitung, insbesondere zur Bindung von Biomolekülen, wird die Carbonylkomponente entschützt. Dies kann einerseits am Monolayer am Träger oder auch bei den noch nicht an den Träger gebundenen Monolayer-Bildnern vorgenommen werden. Die (latente) Carbonylgruppe kann gegebenenfalls - nach Wahl - erst am Träger (sowie bereits vor Monolayer-Bildung) von einer oder mehreren Schutzgruppen befreit werden. Im Speziellen kann die latente Carbonylgruppe in einem weiteren Schritt in die Carbonylgruppe überführt werden, bspw. die Diolkomponente in einem weiteren Schritt mit Perjodat oder einem funktionell gleichwertigen Oxidationsmittel, vorzugsweise Natriumperjodat, insbesondere Natriummetaperjodat, zu einer reaktiven Carbonylgruppe, vorzugsweise Aldehyd- oder Ketogruppe, oxidiert werden - an den Monolayer-Bildnern oder (häufiger) an den Molekülen am Träger (SAM) .
In einem weiteren Schritt wird ein (gegebenenfalls synthetisches) Ligandenmolekül oder Biomolekül, vorzugsweise ausgewählt aus Peptiden, Proteinen, PoIy- oder Oligonukleinsäuren, die gegebenenfalls durch Anfügen einer Aminogruppe modifiziert sind, oder auch ein (synthetischer) Ligand an die
Einmolekülschichten („Monolayer" ) -Einheiten gebunden - insbesondere an den Teil der Einheit der durch die Carbonylkomponente gebildet wird. Dieser Schritt ist insbesondere bei bereits ausgebildeten Monolayern vorgesehen, vorzugsweise nachdem bioreaktive Gruppen aktiviert wurden (z.B. durch Perjodatbehandlung der vicinalen Diole, Aminoalkohole, etc.). Die Biomoleküle (z.B. kleine Liganden wie Biocytinhydrazid, Proteine, Amin-modifizier- te DNA etc., gegebenenfalls auch synthetische Ligandenmoleküle bzw. Effektormoleküle) können gegebenenfalls direkt an die Mono- layer-bildende Einheit gekoppelt werden (z.B. an die Carbonyl- gruppe) . Alternativ können zuerst synthetische bi- oder multifunktionelle Adaptormoleküle chemoselektiv an die Carbonylgruppen auf der Monoschicht gebunden und die Biomoleküle (u.a., s.o.) erst danach an die äußeren Enden der Adaptormoleküle gekoppelt werden. Als multifunktionelle Adaptormoleküle werden meist kommerzielle heterobifunktionelle Crosslinker verwendet, wie z.B. 3- (Maleimido) -propionylhydrazid (MPH) oder PDPH (3- (2-Pyridyldithio) -propionylhydrazid) . Prinzipiell verwendbar sind aber auch Adaptoren mit zwei oder mehreren gleichen Kopplungsgruppen, z.B. mit mehreren Hydrazidfunktionen, von denen eine/einige an die Carbonylgruppen der Monoschicht binden und die restlichen z.B. die Aldehydgruppen von Perjodat-behan- delten Glycoproteinen. Solche Biomolekül-bindende Crosslinker (mit Kopplungsgruppen wie beispielsweise einleitend erwähnt) sind bevorzugte Adaptoren in einer speziellen Ausführungsform. Die Bindung von Biomolekülen über solche Adaptoren mit anderen Kopplungsgruppen hat kinetische Vorteile, insbesondere bei pro- teinresistenten Monolayern, an die Proteine direkt nur langsam binden wohingegen an Kopplungsgruppen der vorher immobilisierten Adaptoren, wie MPH oder PDPH, eine wesentlich raschere Bindung erfolgt.
In speziellen Ausführungsformen weist die Monolayer-bildende Komponente eine Thiol- oder Disulfidgruppe auf, wobei gegebenenfalls der Träger eine Goldoberfläche aufweist.
In anderen Ausführungsformen weist die Monolayer-bildende Komponente eine Vinylgruppe auf, wobei gegebenenfalls der Träger eine Wasserstoff-terminierte Reinelementoberfläche, vorzugsweise Siliziumhydrid (bzw. H-terminierte Silizium-Oberflächen) oder Wasserstoff-terminierte Diamanten, aufweist.
In weiteren Ausführungsformen weist die Monolayer-bildende Komponente eine Säuregruppe oder deprotonierte Säuregruppe, vorzugsweise eine Phosphat-, Phosphonat- oder Katecholgruppe, auf, wobei gegebenenfalls der Träger eine Metalloxidoberfläche, vorzugsweise Titanoxid, Tantaloxid oder ITO (Indium-Zinn-Oxid) , aufweist .
In speziellen Ausführungsformen werden in einem weiteren Schritt reaktive funktionelle Gruppen deaktiviert. Dies kann beispielsweise durch nachträgliche Ethanolamin-, Cystein- oder Glycinbehandlung vorgenommen werden, wobei freie aminoreaktive Gruppen durch Bindung maskiert werden. Mit Cystein können beispielsweise auch Aldehyde blockiert werden, wobei sowohl N als auch S gleichzeitig binden und einen Thiazolidinring bilden. Ein solcher Schritt ist insbesondere sinnvoll, wenn bereits der Mo- nolayer ausgebildet wurde und gegebenenfalls die gewünschten Biomoleküle daran immobilisiert wurden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine
Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheit, umfassend einen gegebenenfalls geschützten Monolayer-bildenden Teil, einen gegebenenfalls geschützten Carbonylteil, der eine gegebenenfalls geschütze Carbonylgruppe, insbesondere eine Aldehydgruppe, oder gegebenenfalls geschützte latente Carbonylgruppe aufweist, und gegebenenfalls einen oder mehrere Verbindungsteile, wobei die Teile durch Estergruppen (von Carbonsäuren und Kohlensäure) , Amidgruppen oder Urethangruppen miteinander kovalent verbunden sind, vorzugsweise erhältlich nach einem Verfahren wie hierin beschrieben, insbesondere nach Acylkopplung, wobei die Komponenten zu den jeweiligen Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheit- Teilen führen.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine Einmolekülschicht aus den Monolayer-Einheiten auf einem Träger, vorzugsweise erhältlich durch ein hierin beschriebenes Verfahren, wie durch Selbst-Assemblierung.
Vorzugsweise ist die Einmolekülschicht zu weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 10%, aus den Einmolekülschicht-Einheiten mit einer (latenten) Carbonylgruppe wie hierin definiert aufgebaut, wobei die Einmolekülschicht zusätzlich inerte Einmolekülschicht-Einheiten, insbesondere ohne (latente) Carbonyl- gruppen aufweist. Sofern die restliche Einmolekülschicht aus inerten Einheiten aufgebaut ist, wird verhindert, dass Mehrfachbindungen der Proteine auftreten bzw. eine zu dichte Packung, die gegebenenfalls die Funktion der Biomoleküle beeinträchtigen könnte. Eine solche Einmolekülschicht kann z.B durch Mischen der Einheiten und Auftragung auf einen Träger hergestellt werden oder durch unvollständige Perjodatreaktion oder durch partielle Inaktivierung der aktivierten Carbonylgruppe (z.B. Aldehyd, Ke- ton) durch verdünnte Inaktivierungsreagenzien, wie hierin beschrieben (z.B. kurzzeitige Einwirkung einer verdünnten Glycinlösung) .
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Figu- ren und Beispiele erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.
Figuren:
Fig. 1: A: Zeitprofil des SPR-Winkels während der Modifizierung eines SAMs gem. Beispiel 3.1 (SPR = surface plasmon reso- nance - Oberflächenplasmonresonanz (OPR) ) B: Der Zustand am Chip bei den letzten beiden Injektionen in (A)
Fig. 2: Zeitprofil des SPR-Winkels während der Modifizierung eines SAMs gem. Beispiel 3.2
Fig. 3: Zeitprofil des SPR-Winkels während der Modifizierung eines SAMs gem. Beispiel 3.2
Fig. 4: Zeitprofil des SPR-Winkels während der Modifizierung eines SAMs gem. Beispiel 3.2
Fig. 5: Zeitprofil des SPR-Winkels während der Modifizierung eines SAMs gem. Beispiel 3.3
B e i s p i e l e :
Beispiel 1: Kopplung von SAM-bildenden Modulen mit Perjodat-re- aktivsn Modulen über eine oder i&shrsre Acylierungsrs≥ktioiisii 3.1Ξ eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
Module mit vicinalen Diolgruppen oder einem vicinalen Amino- alkohol geben mit Perjodat einen Aldehyd oder ein Keton. Diese funktionellen Gruppen sind besonders nützlich, weil sie Amine (Protein, DNA, etc.), Aminooxygruppen, Hydrazine, Hydrazide und N-terminale Cysteinreste spontan und chemoselektiv koppeln, ohne weiteres Kopplungsreagenz. Außerdem sind diese Carbonylgruppen unter Umgebungsbedingungen langzeitigreaktiv.
SAM-Bildner und Perjodat-reaktive Module werden über Acyl- kopplungen kombiniert, wobei gegebenenfalls weitere Module eingeschoben werden können, z.B. Oligoethylenglykol-Ketten, welche für Protein-Resistenz sorgen (Schema 1.1). Die Perjodat-reaktive Gruppe wird (vor oder) nach SAM-Bildung mit Perjodat zu einer Carbonylgruppe oxidiert, welche zur chemoselektiven Ligation von Aminen (Protein, DNA), Hydrazinen etc. dient. Die folgenden Schemas 1.1 bis 1.7 verdeutlichen dieses Reaktionsprinzip: Schema 1.1 (s.u.): Äcylkopplungen von SAM-bildenden und Perjo- dat-reaktiven Modulen. Legende: „GλΛ ist eine gute Abgangsgruppe, z.B. ein Halogenatom, ein Alkohol (vor allem Phenol mit ein oder mehreren Nitrogruppen oder Fluoratomen) , NHS, HOTB, Imidazol u.a.. Diese kann vorher eingeführt werden, oder aber in situ mit einem Aktivator wie DSC, DSO, PyBOP, Oxalylchlorid, CDI, etc.. „Nu" ist eine kleine nukleophile Gruppe (wie NH2, NHR, OH, eventuell SH), welche jedenfalls mit einer Carboxylgruppe ein in wässriger Lösung ausreichend stabiles Konjugat gibt (z.B. Amid, Ester) . Die miteinander reagierenden Gruppen G und Nu an zwei Reaktionspartnern können gegebenenfalls auch ausgetauscht werden. Wesentlich ist für diese Ausführungsform, dass die Komponenten durch die passenden Gruppen G und Nu verbunden werden. Nu* ist ein geschütztes Nukleophil, welches verhindert, dass Selbstpolymerisation auftritt. Die Selbstpolymerisation wird auch verhindert, wenn das Nukleophil Nu ungeschützt ist und das in Schema 1.2 gezeigte Kopplungsschema verwendet wird. ** bedeutet, dass das vicinale Diol oder der vicinale Aminoalko- hol entweder ungeschützt vorliegt oder eine (zwei) Schutzgruppe (n) trägt. Diese kann vor oder nach der SAM-Bildung abgespalten werden (siehe Schema 1.3)
*** bedeutet, dass die SAM-bildende Gruppe entweder ungeschützt oder mit einer Schutzgruppe vorliegen kann. Der SAM-Bildner muss auf jeden Fall vor (während) der SAM-Bildung entschützt werden.
Modul mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol**
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Modul mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol*
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Nu +
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mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol*
SAM-Bildne Modul mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol*
Figure imgf000024_0005
SAM-Bildner*** Modul mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol*
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SAM-Bildne mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol*
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Schema 1.2: Einschub eines asymmetrischen Moduls mit einem ungeschützten Nukleophil an einem Ende und einer nicht aktivierten COOH-Gruppe am anderen.
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Aktivator, Nu. z.B. Carbodiimid sModu! mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol**
mit vicinalem Diol oder Aminoalkohol**
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Schema 1.3: Schutzgruppen am vicinalen Diol oder vicinalen Aminoalkohol .
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000025_0004
X1 kann ein Heteroatom oder irgend organisch chemischer Molekülteil sein. X2 kann ein organisch-chemischer Molekülteil sein, es kann aber auch ganz entfallen, z.B. im Fall von Glycerinsäurede- rivaten (linke Reihe) oder Serin/Threonin-Derivaten (rechte Reihe) .
R', R'', und R'1' sind im einfachsten Fall H-Atome. Bei Bedarf bzw. Gelegenheit können es auch Alkyl- bzw. Arylreste sein, u.U. mit Substituenten.
Die Entschützung des vicinalen Diols bzw. Aminoalkohols kann vor oder nach der SAM-Bildung erfolgen.
Schema 1.4: Generieren von Carbonylgruppen mittels Perjodat und Nutzung zur chemoselektiven Ligation
Diol oder Aminoalkohol
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"Cystein"
Figure imgf000026_0003
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H2N.
X
NaCNBH3
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Figure imgf000026_0004
Die Perjodat-Reaktion kann vor oder nach Monolayer-Bildung erfolgen und hat den Zweck, Aldehydgruppen oder Ketogruppen zu erzeugen, welche für die chemoselektive Kopplung eines passenden Moleküls zur Verfügung stehen, welches eine komplementäre Gruppe besitzt (eine N-Base wie -NH2, -NHR, -0-NH2, -NH-NH2, oder >C (NH2) -CH2-SH oder >C (SH) -CH2-NH2) .
Schema 1.5: Beispiel einer einstufigen Synthese: TU / DMF /Triethylamin
OH = Aminopropandiol
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Undecensäure + Aminopropandiol gibt in einem einzigen Schritt einen fertigen vic-Diol-terminierten SAM-Bildner für H-termi- niertes Silizium (vgl. Beispiel 4.1).
Schema 1.6: Beispiel einer formal zweistufigen Synthese, wobei die zweite Stufe nur im Eintauchen des SAMs in Säure1 besteht.
TSTU / DMF / Triethylamin
Figure imgf000027_0001
1. Chemisorption ans Gold
2. saure Entschützung
Figure imgf000027_0002
Im Fall der Liponsäure sollte die Entschützung erst am Gold erfolgen, man erspart sich dadurch auch einen Syntheseschritt (siehe auch Beispiel 3.3 und Figur 5).
Schema 1.7: Beispiel einer dreistufigen Synthese für einen Protein-resistenten Monolayer
Figure imgf000028_0001
TSTU / Triethylamin / DMF / Pyridin
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DMF
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Der zuletzt gezeigte Monolayer-Bildner vereinigt mehrere sehr wesentliche Strukturmerkmale:
• Er ist stark asymmetrisch, nur eine Seite ist hydrophob. Im Gegensatz dazu können Jang et al. nur symmetrische Grundkörper herstellen, wo auch auf der späteren "Wasserseite" des SAMs eine lange hydrophobe Alkylkette sitzt.
• Am hydrophoben Ende sitzt die SAM-Funktion. Das soll sie auch, weil auf diese Weise der SAM sowohl durch die kovalente Bindung am anorganischen Substrat als auch durch die Unlöslichkeit der Alkylkette im Wasser stabilisiert wird.
• Am hydrophilen Ende sitzt das vicinale Diol, welches als latente Aldehydgruppe dient .
• Die PEG-Kette in der Mitte sorgt für Protein-Resistenz (meist mischt man mit 5-20 Equivalenten eines analogen Monolayer- Bildners ohne vicinalem Diol) .
Trotzdem benötigt diese Synthese (ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten) nur drei Stufen, welche leicht bewältigt werden. Auch die Ausbeuten liegen sehr hoch, bezogen auf die teuerste Komponente (NH2-PEG-COOH) .
Beispiel 2 : Modulares System zur Herstellung von SAMs mit Alde- hyd- bzw. Keto-Gruppen als eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
Schema 2.1: beschreibt ein neues systematisches Verfahren zur Herstellung von SAMs mit Aldehyd- bzw. Ketogruppen. verkoppelt wird, welcher erst durch Einwirkung von Perjodat (Schritt e) eine Aldehyd- oder Ketogruppe besitzt.
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a = Abspaltung der Schutzgruppe "SG" gibt aktiven SAM-Bildner, b = Spaltung der Schutzgruppe am vicinalen Diol, c = Synthese eines Konjugates mit einem vicinalen Aminoalkohol d = direkte Synthese von Struktur 3 ohne Schutzgruppen e = Oxidation mit Perjodat oder gleichwertigem Reagenz zu Aldehyd/Keton
SAM-Bildung meist mit Struktur 3, in Sonderfällen schon mit Struktur 2a oder erst mit Struktur 4 Der Kern dieser Ausführungsform besteht darin, dass ein SAM- bildender Modul mit einer latenten Aldehyd-/Ketonkomponente über eine Acylierungreaktion zu einem neuen SAM-Bildner (Struktur 3)
Die genannten (mindestens) zwei Module werden durch Acylie- rungsreaktionen verbunden, wobei nicht nur Acylierungen mit reaktiven Carbonsäure-Derivaten, sondern auch mit reaktiven Kohlensäurederivaten in Betracht gezogen werden. Dies bedeutet, dass in Schema 2.1 X1 und/oder X2 eines der drei Heteroatome O, N, oder S sind (insbesondere eine der Gruppen: -NH- oder -NR- oder -0- oder -S-). Das Strukturelement X1-C (=0) -X2 ist entweder ein stabiles Carbonsäurederivat (Amid, Ester, Thioester) oder ein stabiles Kohlensäurederivat (Harnstoff, Urethan, Diester, eventuell auch ein Thioanaloges davon) .
Während der Herstellung des Linkers kann es nötig bzw. vorteilhaft sein, dass die vicinale Diolgruppe (oder Aminoalkohol- gruppe) eine Schutzgruppe trägt, z.B. ein Ketal mit m = m' = CH3 in Struktur 1 und 2a (oder z.B. eine Boc-Schutzgruppe im Fall eines Aminoalkohols) .
Bei manchen Problemfällen ist es nötig bzw. vorteilhaft, wenn die vicinale Diolgruppe (oder Aminoalkoholgruppe) auch noch während der SAM-Bildung eine Schutzgruppe trägt, z.B. ein Ketal mit m = m' = CH3 in Struktur 1 und 2a (oder z.B. eine Boc-Schutzgruppe im Fall eines Aminoalkohols) .
Wenn X1 ein Heteroatom ist (W, O1 S) , dann kann das Element X2-X3 irgendeine aliphatische oder aromatische Struktur sein, welche eine stabile Verbindung zwischen der zentralen C=O Gruppe und dem Perjodat-reaktiven Teil (dem vicinalen Diol oder Amino- alkohol) in Stuktur 3 erlaubt.
Wenn X1 ein Heteroatom ist, dann kann das Element X2-X3 insgesamt entfallen. Ein typisches Beispiel wäre eine Struktur 3 mit Xi = NH oder OH und einem daran gebundenen Serin- oder Threo- nin-Rest, d.h. mit einem vicinalen Aminoalkohol als Perjodat-re- aktive Komponente. Der analoge Fall mit Glycerinsäure statt Serin ist schwer vorstellbar, weil Glycerinsäure nur als Inter- mediat im Zellstoffwechsel bekannt ist.
Das Element X3 kann ganz wegfallen, wenn X1 ein Heteroatom ist und X2 eine CH2-Gruppe oder eine kleine aliphatische/aromati- sche Struktur. Ein typisches Beispiel wäre eine Struktur 3 mit X1 = NH oder OH und einem daran gebundenen 3, 4-Dihydroxybuttersäu- rerest (vorzugsweise geschützt als Acetonid) . In keinem Fall sollte X3 einfach ein Heteroatom sein (N, O, S) bzw. ein größerer Molekülteil mit einem Heteroatom neben dem in Struktur 3 gezeigten vicinalen Diol (bzw. Aminoalkohol) sofern dies eine labilen Halbacetal-Funktion bilden und unter Hydrolyse einen SAM-Bildner mit einem einfachen NH2-, OH- oder SH- Ende ergeben würde.
Wenn X2 ein Heteroatom (also 0, N, S, P) ist, dann kann Xi irgendeine aliphatische oder aromatische Struktur sein, welche eine stabile Bindung zwischen dem SAM-Bildner und der zentralen C=O Gruppe herstellt.
Wenn X2 ein Heteroatom ist, dann muss X3 mindestens eine CH2- Gruppe sein oder irgend eine größere aliphatische/aromatische Struktur. Diese darf weitere Heteroatome enthalten, außer direkt neben der Perjodat-reaktiven Gruppe (wie oben erklärt wurde) .
Wenn nur eines der beiden Elemente X1 oder X2 ein Heteroatom (N, 0, S) ist, dann ist entweder der SAM-Bildner oder der Perjo- dat-reaktive Modul eine Carbonsäure (oder aktivierte Carbonsäure) und der andere ist ein Alkohol (allenfalls ein Thiol) oder eine N-Base. Das Konjugat ist dementsprechend ein Ester (allenfalls Thioester) oder ein Amid, Hydrazid oder ein ähnliches N- Acyl-Konjugat .
Die Struktur 3 ist auch dann als Acylierungsprodukt anzusprechen, wenn sowohl X1 als auch X2 gleichzeitig Heteroatome sind. Die Struktur 3 ist dann ein Derivat der Kohlensäure (Harnstoff, Thioharnstoff, Urethan, Carbonat, u.a.) und wird durch Acylierung mit einem reaktiven Carbonsäurederivat hergestellt. Ein solches reaktives Carbonsäurederivat ergibt sich üblicherweise durch Reaktion eines Alkohols oder Amins mit doppelt reaktiven Kohlensäurederivaten, wie Phosgen (Triphosgen) , Nitrophenylchloroformat, Disuccinimidylcarbonat u.a.
Das Element X1-C=O kann auch ein Heteroatom (N, 0, oder S) mit einem Oxalylrest oder einem anderen Dicarbonsäurerest sein, d.h. dass in diesem Fall die Verbrückung zwischen dem SAM-bil- denden Modul und dem Perjodat-reaktiven Modul durch mehr als eine Acylierungsreaktion erfolgt.
Das Element X1 kann auch ein größerer Modul sein (z.B. ein Protein-resistenter, wie etwa ein Oligoethylenglykol oder eine gleichwertige Struktur (z.B. Tripropylensulfoxid oder Oligosar- cosin) , welcher neben der zentralen C=O Gruppe in Schema 2.1 jedenfalls ein C-, N-, 0-, oder S-Atom besitzen muss. Das Element X2 kann auch ein größerer Modul sein (z.B. ein Protein-resistenter, wie etwa ein Oligoethylenglykol) , welcher neben der zentralen C=O Gruppe in Schema 2.1 jedenfalls ein C-, N-, 0-, oder S-Atom besitzen muss. Es wird keine Festlegung getroffen, wie dieser Modul mit dem weiteren Perjodat-reaktiven Modul (d.h. mit X3 und dem vicinalen Diol oder Aminoalkohol) verknüpft sein soll. Eine Amidbindung (Acylkonjugat) hat sich aber auch hier bewährt .
Die Reste R, R' und R' ' können H-Atome oder Alkylreste oder Arylreste sein, wobei große Reste weniger interessant erscheinen.
Die Reste m und m' in den Strukturen 1 und 2a sind vorzugweise Methylgruppen, weil das Acetonid eines vicinalen Diol eine gute Stabilität aufweist und trotzdem relativ leicht zu ent- schützen ist. Im Prinzip können m und m1 aber auch H-Atome oder aber größere Reste sein als Methylgruppen.
Zur Synthese sind die Wege a und b nicht zwingend vorgesehen. Es gibt Fälle, bei denen der SAM-Bildner (Struktur 3 in Schema 2.1) durch eine einzige Acylierungreaktion direkt hergestellt werden kann. Beispiele wären die Reaktion von 16,16'-Di- thiodihexadecansäure mit einem großen Überschuss von Glycerin oder 3-Aminopropan-l, 2-diol . Meist ist aber die Synthese mit geschützten vicinalen Diolen (oder vicinalen Aminoalkoholen) bequemer als mit ungeschützten.
Weg a ist die Entschützung des SAM-Bildners . Typische Beispiele wären die Reduktion eines Disulfids, die Spaltung eines Tritylthioethers, die Hydrolyse eines Thioesters, was die Freisetzung eines Thiols anlangt oder etwa die Hydrolyse von Estern (Amiden) endständiger Phosphat- bzw. Phosphonatgruppen. In den meisten Fällen wird es günstig sein, wenn der SAM-Bildner eine Schutzgruppe trägt, welche erst nach der Acylkopplung mit dem Perjodat-reaktiven Modul abgespalten wird.
Weg b ist die Spaltung einer Ketal- oder Acetal-Gruppe vom vicinalen Diol, üblicherweise mit Protonen-Säuren oder Lewis- Säuren, allenfalls auch mit Perjodat.
Die Reihenfolge von Schritt a und b kann den jeweiligen Erfordernissen angepasst werden. In manchen Fällen ist sie beliebig wählbar.
Wenn der Perjodat-reaktive Teil von Struktur 3 in Schema 2.1 ein vicinaler Aminoalkohol ist, dann wird er auf dem mit c be- zeichneten Weg hergestellt. Im einfachsten Fall wird man einen SAM-Bildner mit einer terminalen NH2-Gruppe mittels N-Boc-Serin oder N-Boc-Threonin acylieren, d.h. X1 = NH und das Element X2-X3 entfällt überhaupt. Die OH-Gruppe von Serin oder Threonin muss dabei nicht unbedingt geschützt sein, wenn man Vorsorge trifft, um eine O-Acylierung zu vermeiden. Die gleiche Strategie liegt auch vor, wenn Xi ein Oligoethylenglykol mit einer terminalen NH2-Gruppe darstellt, wodurch ein Protein-resistenter Modul entsteht. In bestimmten Problemfällen erscheint auch der umgekehrte Fall denkbar, dass 1, 3-Diaminopropanol-2 (oder ein homologes/analoges Molekül) als Perjodat-reaktiver Modul dient und von einem SAM-bildenden Modul acyliert wird. Bei sehr großem Überschuss von 1, 3-Diaminopropanol kann auf die Verwendung von N-Schutzgruppen überhaupt verzichtet werden.
Weg d ist eine alternative Herstellung der Struktur 3, welcher sich dadurch auszeichnet, dass weder der SAM-bildende Modul noch der Perjodat-reaktive Modul während der Acylkopplung eine Schutzgruppe tragen. Ein Beispiel wäre die Reaktion von Undecen- säure mit einem großen Überschuss Glycerin (oder 3-Aminopropan- 1,2-diol oder 1, 3-Diamino-2-propanol) zur entsprechenden monoa- cylierten Verbindung oder die Veresterung von Glycerin mit Liponsäure .
Der Zeitpunkt der SAM-Bildung kann von Fall zu Fall verschieden sein kann. In der Regel wird aber der SAM mit der Struktur 3 gebildet werden und die Perjodat-Oxidation auf dem SAM erfolgen. Möglich ist natürlich auch die SAM-Bildung nach der Perjodat-Oxidation.
Für die Definition dieser Ausführungsform ist es unerheblich, ob ein SAM zu 100% aus einer Perjodat-reaktiven Molekülsorte besteht oder ob ein beliebiger Prozentsatz einer inerten SAM-Komponente beigemischt wird, welche keine latenten Aldehydoder Ketogruppen besitzt. Es können gegebenenfalls weitere heterogene SAM-Bildner eingesetzt werden.
Beispiel 3: Synthese von Perjodat-reaktiven SAM-Komponenten für Gold-Substrate
Beispiel 3.1: Mercaptohexadecansäure-Derivate
Der Mercaptohexadecansäure und ihre Derivate fanden breite Anwendung zur Bildung von SAMs auf Gold. Wegen ihrer terminalen COOH-Gruppe eignete sich Mercaptohexadecansäure besonders gut zur Umsetzung, wonach ein SAM-bildender Modul und ein Perjodat- reaktiver Modul über eine Acylierungsreaktion gekoppelt werden sollten, um eine SAM-Komponente mit einer latenten Carbonylfunk- tion zu geben.
a) Mercaptohexadecanoyl-APD (8)
Aus praktischen Gründen war es vorteilhaft, den IUPAC-Namen für 6 (3-Aminomethyl-2, 2-dimethyl-l, 3-dioxolan) durch die Bezeichnung 3-Aminopropan-l, 2-diol-acetonid zu ersetzen, kurz "APD-Acetonid" . Dieses gibt bei der Entschützung mit Säure 3- Aminopropan-1, 2-diol, kurz "APD", welches bei allen hier gezeigten Ausführungsbeispielen als Perjodat-reaktiver Modul fungierte.
Schema 3.1 zeigt eine besonders einfache Umsetzung der Ausführungsform. Die geschützte Form von Mercaptohexadecansäure (5) wurde mit 3-Aminomethyl-2, 2-dimethyl-l, 3-dioxolan (6) gekoppelt, um das doppelt geschützte Konjugat (7) zu ergeben. Dann wurde mit Säure die Acetonid-Schutzgruppe und mit Base die Thioester- Schutzgruppe gespalten, was dem Weg über Struktur 2b in Schema 2.1 entspricht. Damit ergab sich Struktur 8, welche für die SAM- Bildung verwendet wurde.
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TSTU, TEA, 3-Aminomethyl-2,2-dimethyl-1, 3-dioxolan "Aminopropandiol-Acetonid"
"APD-Acetonid"
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Η-NMR-Spektrum von 8 : δ [ppm, CDCl3 , 200 MHz ] 4 . 0-3 . 9 (m, 1 H , NH-CH2-C ( OH ) H-C ( OH ) H2 ) 3 . 68 ( d, 3J = 5 . 3 Hz , 2 H , NH-CH2-C ( OH ) H-
C ( OH ) H2 ) 3 . 65 -3 . 4 (m, 2 H, NH-CH2-C (OH) H-C ( OH) H2 ) 3 . 03 ( t , 3 uJ = =
7.2 Hz, 2 H, S-CH2) 2.6-2.4 (m, 5 H, H3C-CO-S und CH2-CO-NH) 1.9- 1.6 (m, 4 H, HS-CH2-CH2 und CH2-CH2-CO-NH) 1.6-1.3 (m, 22 H, (CH2)II-CH2-CH2-CO-NH) .
Die SAM-Bildung erwies sich als unkritisch hinsichtlich der Vorbehandlung des Chips (Schallen in Ethanol laut Instruktionen der Firma BIAcore® oder Vorreinigung in kochendem Wasser/Ammoni- ak/H2O2-Gemisch) , der Wahl des Lösungsmittels (Chloroform/Methanol 3/1 oder in Ethanol) und der Konzentration (1 mM über eine Nacht oder 100 μM über zwei Nächte hinweg) , immer ergaben sich gleichwertige funktionelle Daten, wie im nachfolgend gezeigten Beispiel (Fig. 1).
Der in Fig. 1 gezeigte Chip wurde mit Wasser/Ammoniak/H202- Gemisch vorgereinigt und übers Wochenende bei Raumtemperatur mit einer 100 μM Lösung von Verbindung 8 in Ethanol inkubiert, gefolgt von Waschungen in Ethanol (3 x) und in Wasser (3 x) . Nach Trockenblasen mit Stickstoffgas wurde der Chip in einem BIAcore X® Gerät montiert und mit PBS ( "phosphate-buffered saline", 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) überströmt (10 μl/min) . Ein kurzer Puls mit 0,1% SDS hatte keine Wirkung, d.h. es gab kein lose am Chip haftendes Material. Dann wurden die vi- cinalen Diolgruppen am SAM durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen mit 50 mM NaIO4 oxidiert (jeweils 100 μl in 10 min) . Nach der Perjodat-Oxidation der vicinalen Diolgruppen zu Aldehydgruppen wurden in den beiden Messzellen verschiedene Proteine gekoppelt. Dazu wurde jeweils 100 μl Proteinlösung (1 mg/ml in PBS) bei einem Fluss von 5 μl/min injiziert.
Im ersten Schritt wurde in der Kontrollzelle (Flusszelle 2, FC2, punktierte Linie in Fig. IA) Ziegen-IgG gekoppelt. Während der Injektion stieg der Resonanzwinkel stark an, am Ende der Injektion gab es einen kleinen Abfall, weil die Proteinlösung durch Puffer ersetzt wurde, welcher einen etwas kleineren Brechungsindex hatte. Der Resonanzwinkel war nach der Injektion um fast 2000 RU (= 2000 resonance units = 0,2°) höher als vor der Injektion, was in etwa einer Monoschicht von IgG entspricht. Danach wurde in der Kontrollzelle PBS mit 20 mM NaCNBH3 injiziert (frisch gemischt aus PBS und einer Lösung von 1 M NaCNBH3 in 10 mM NaOH) , um die zwischen den Aldehydgruppen des Chips und den Lysinresten des Proteins gebildeten Schiffbasen zu stabilen sekundären Aminen zu reduzieren.
Im zweiten Schritt wurde in der Messzelle (Flusszelle 1, FCl, ausgezogene Linie in Fig. IA) Biotin-IgG injiziert wobei hier 20 mM NaCNBH3 gleichzeitig zugegen war. Dabei zeigte sich eine etwas stärkere Kopplung von Biotion-IgG in Vergleich zum einfachen IgG in der Kontrollzelle (über 3000 Rü bleiben gebunden) . Wahrscheinlich wirkte hier die gleichzeitige Anwesenheit von NaCNBH3 förderlich.
Im dritten Schritt wurde in beiden Zellen BSA injiziert, um eventuell freigebliebene Stellen am Chip abzusättigen und so die unspezifische Adsorption weiterer Proteine zu unterbinden. Es wurde aber in keiner der Zellen eine nennenswerte BSA-Menge gebunden, was anzeigt, dass die Chipflächen in beiden Messzellen schon von IgG bzw. Biotin-IgG bedeckt waren. Vermutlich waren die Biotin-IgG-Moleküle in der Messzelle rascher und damit mehr aufrecht stehend gekoppelt worden als bei der etwas langsameren Kopplung (ohne NaCNBH3) in der Kontrollzelle.
Nach der kovalenten Kopplung wurde auf unspezifische Proteinadsorption und auf biospezifische Bindung getestet. Hierbei wurde immer 100 μl Probe mit einer Proteinkonzentration von 2 μM und einem Fluss von 10 μl/min injziert (entsprechend 0,12 mg/ml bei Streptavidin und 0,3 mg/ml bei IgG oder Biotin-IgG) . Der Test auf unspezifische Adsorption wurde mit "vorblockiertem Streptavidin" durchgeführt, welchem vor der Injektion 200 μM d- Biotin beigemischt worden war. Dies ergab keine signifikante Änderung des Resonanzwinkels (+22 RU bzw. -3 RU in FCl und FC2) . Mit nicht vorblockiertem Streptavidin hingegen erfolgte eine starke Bindung an das in FCl immobilisierte Biotin-IgG (2140 RU) . In FC2 erfolgte wieder keine signifikante Bindung von Streptavidin (14 RU), was auch der Erwartung entspricht, weil sich in dieser Flusszelle keine immobilen Biotinreste befinden sollten. Die Ergebnisse mit vorblockiertem und nicht vorblockiertem Streptavidin zeigen die guten Sensoreigenschaften des Chips: Es gab kaum unspezifische Bindung, wogegen die spezifische Bindung sehr stark war und im Ausmaß annähernd einer Mono- layerbedeckung ensprach [Lahiri 1999] .
b) Mercaptohexadecansäure-Derivat mit Protein-resistenter OEG- Kette und terminalem 1,2-Diol-Terminus (9)
Die in Schema 3.1 gezeigte Synthese konnte mit geringem Aufwand so modifiziert werden (Schema 2.1), dass im ersten Acylie- rungsschritt statt des APD-Acetonids (6) ein OEG-Derivat (gekauft als Fmoc-NH-OEG-COOH bei Neosystems, Strassburg, Frankreich) mit seiner terminalen Aminogruppe gekoppelt wurde (Schema 3.2). Die Carboxylgruppe am anderen Ende des OEG-Moduls wurde in einem zweiten Acylierungsschritt an APD gekoppelt, um Struktur 9 in Schema 3.2 zu erhalten. Die Abspaltung der terminalen Schutzgruppen in 9 erfolgte in der gleichen Weise wie beim OEG-freien Mercaptohexadecansäure-APD-Konjugat (7 in Schema 3.1).
Schema 3.2
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
Η-NMR-Spektrum von 10: δ [ppm, CDCl3, 500 MHz, ID und COSY] 7.2 (sb, 1 H, NH) 6.5 (sb, 1 H, NH) 3.77 (qn, 3J = 5.1 Hz, 1 H, NH- CH2-CiT(OH)-CH2-OH) 3.73 (t, 3J = 5.5 Hz, 2 H, 0-CH2-CH2-CO) 3.67- I 3 . 60 (m, 20 H, (CH2-CE2-O) 5-CH2-CH2-CO) 3 . 58-3 . 49 (m, 4 H, NH-CH2-
CH2-O und NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH) 3.46-3.39 (m, 4 H, NH-CH2-CH2-O und NH-CH2-CH(OH)) 2.52 (q, 3J = 7.5 Hz, 2 H, HS-CH2) 2.50 (t, 3J =
5.5 Hz, 2 H, 0-CH2-CH2-CO) 2.4-2.0 (sb, OH und H2O) 2.18 (t, 3J =
7.6 Hz, 2 H, CH2-CH2-CH2-CO) 1.67-1.57 (m, 4 H, HS-CH2-CH2 und CH2- CH2-CH2-CO) 1.44-1.24 (m, 23 H, (CH2) U-CH2-CH2-CO und HS)
ESI-MS von 10: gefunden: M. H+ 697.65 ± 0.5 g/mol; berechnet für C34H68N2O10S: 697.47 g/mol.
Das Molekül mit der Struktur 10 wurde in Acetonitril gelöst und mit einer Acetonitrillösung von 10a [Synthese nach Hahn 2005] gemischt, sodass die beiden Thiole im Molverhältnis von 1:19 vorlagen und die Gesamt-Thiolkonzentration 20 μM betrug. Vorgereinigte BIAcore®-Chips wurden in dieser Lösung 36 h inkubiert und laut Standardprozedur gewaschen [Tinazli 2005] , um Protein-resistente SAMs herzustellen. Diese wurden bei 4°C unter Wasser gelagert und binnen 2 Wochen hinsichtlich Protein-Resistenz und Aldehydkopplung getestet. Dabei ergaben sich die gleichen BIAcore®-Daten wie bei den strukturell ähnlichen SAMs von 14 und 14a (1:19, mol/mol) , welche unten in Schema 3.3-3.4 gezeigt werden (vgl. Fig. 2-5).
Beispiel 3.2: Merσaptododecan-Derivate
OEG-terminierte Alkanthiole sind bekannt dafür, dass mit ihnen auf Gold SAMs mit besonders geringer Proteinadsorption bzw. hoher Protein-Resistenz hergestellt werden können. In fast allen Studien wurden OEG-terminierte Undecanthiol-Derivate verwendet. Vor kurzem wurde Tri- und Tetraethylenglykol-terminierte Dode- canthiolderivate hergestellt (14a) und damit ebenfalls hohe Proteinresistenz erzielt [Hahn 2005] . Das im Zuge dieser Studie hergestellte Trityl-S-undecyl-triethylenglykol (11) wurde um einen Propionsäurerest verlängert (Schema 3.3), sodass sich ein COOH-terminierter SAM-Bildner mit einer Protein-resistenten OEG- Kette ergab (12) . Die COOH-Gruppe wurde mit 6 zum Amid umgesetzt (13) , die Acetonidgruppen wurden abgespalten und das Disulfid zum Thiol reduziert, sodass sich ein Mercaptododecanderivat mit einem Tetraethylenglykol-Spacer und einem Perjodat-reaktiven vi- cinalen Diol ergab (14). Schema 3 . 3 :
Jrityl
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Figure imgf000039_0002
^-NMR-Spektrum von 14: δ [ppm, CDCl3, 200 MHz] 3,4-3,85 (21 H, m, 0-CH2, NH-CH2-C(OH)H-C(OH)H2) 2.97 (2H, t, J= 7,3 Hz, CH2-CO- NH) 2,52 (2H, t, J= 5,4 Hz, S-CH2) 1,5-1,8 (4H, m, HS-CH2-CH2 und CH2-CH2-O) 1,2-1,5 (16H, m, HS-CH2-CH2- (CH2) 8) .
14 wurde mit einem 19-fachen molaren Überschuss von 14a gemischt und bei einer molaren Gesamt-Thiolkonzentration von 20 μM mit vorgereinigten Goldchips wie beschrieben inkubiert [Tinazli 2005], um OEG-terminierte SAMs herzustellen, welche eine hohe Proteinresistenz aufweisen und auf 5% aller OEG-Ketten eine latente Aldehydgruppe besitzen. Die Chips mit den SAMs wurden gewaschen und bei 40C unter Wasser bis zu drei Wochen aufbewahrt. Vor der Perjodat-Oxidation der vicinalen Diole wurde die Protein-Resistenz dieser Chips im BIAcore X® charakterisiert. Dazu wurde der Chip bei einem konstanten Fluss von 10 μl/min mit PBS überströmt (250C) und dann verschiedene Proteine bei einer Konzentration von 1 mg/ml injiziert. Die ersten zwei Injektionen (je 100 μl) erfolgten mit fettsäurefreiem BSA (Roche Diagno- stics) , welches ohne weitere Reinigung in PBS aufgelöst worden war. Nach einem Regenerierungsschritt mit 0,1% SDS wurde je 2 x 100 μl von Ziegen-IgG, BSA und Lysozym injiziert, welche auf einer Superdex-HR-200-Gelfiltrationssäule (Amersham) von aggre- gierten Molekülen befreit worden waren.
Nach einer nochmaligen Waschung mit SDS (0,1%, letzte Injektion in Fig. 2) wurden die vicirlalen Diolgruppen am Chip durch zwei 10-minütige Injektionen mit je 10 mM Perjodat oxidiert (in Puffer 5,5, d.h. in 100 mM Natriumacetat, pH 5,5 mit HCl eingestellt) . Dies sind die ersten beiden Injektionen in Fig. 3 Die dabei generierten Aldehydgruppen wurden nur in Flusszelle 2 (punktierte Linie in Fig. 3) mit 10 mM Biocytinhydrazid und 20 mM NaCNBH3 weiter derivatisiert, d.h. es wurden Biotinreste unter Hydrazonbildung kovalent gekoppelt und das Hydrazon zum substituierten Hydrazin reduziert, um die Wiederablösung der Biotinreste zu unterbinden. Danach wurden die Aldehydreste beider Flusszellen mit Ethanolamin abreagiert und der Chip hinsichtlich unspezifischer Protein-Adsorption und spezifischer Bindung von Streptavidin bzw. Biotin-IgG getestet.
Fig. 2 zeigt, dass der Chip vor Einwirkung von Perjodat eine außerordentlich hohe Protein-Resistenz besitzt. Nur während der Injektionen stieg der Resonanzwinkel wegen des Brechungsindexeffektes von gelöstem Protein vorübergehend an, danach kehrte er immer wieder zum Ausgangswert zurück (2000 Einheiten hätten in etwa einer Monoschicht von Protein entsprochen) . Auch nach Per- jodat-Einwirkung und Kopplung von Biocytinhydrazid bzw. Ethanolamin besitzt der Chip eine sehr hohe Protein-Resistenz, wie auf zwei Arten bewiesen wurde: Erstens zeigt die Kontrollzelle (FCl, ausgezogene Linie in Fig. 3) keine signifikante Proteinadsorption, egal welches Protein injiziert worden war. Zweitens zeigt auch die Messzelle (FC2, punktierte Linie in Fig. 3) dann keinerlei Proteinbindung, wenn am SAM oder am injizierten Protein keine spezifischen Bindungsstellen zur Verfügung stehen. Dies betrifft die Injektion von BSA und die darauffolgende Injektion von vorblockiertem Streptavidin (mit 200 μM d-Biotin bei einer Streptavidinkonzentration von 2 μM) , ebenso wie die beiden letzten Protein-Injektionen, d.h. eine nochmalige Injektion von vorblockiertem Streptavidin sowie eine Injektion von nicht biotinyliertem IgG.
Der Chip besitzt eine hohe spezifische Bindungskapazität für Streptavidin. Allerdings ist ein Teil der Streptavidin-Moleküle nicht besonders fest gebunden, was zu einer signifikanten Dissoziation des weniger fest gebundenen Anteils führt. Auch eine zweite Injektion von Streptavidin ändert nichts an diesem Verhalten. Das verbliebene Streptavidin besitzt eine hohe spezifische Bindungskapazität für Biotin-IgG und dieses kann wiederum deutlich mehr Streptavidin binden als der ursprüngliche SAM. Bei der nachfolgenden Injektion von Biotin-IgG zeigt sich wieder eine Steigerung der Bindungskapazität. Diese progressive Zunahme der Bindekapazität mit jedem Zyklus zeigt an, dass die Biotin- gruppendichte am SAM nach Biocytinkopplung etwas geringer war als für maximale Streptavidinbindung nötig gewesen wäre. Dies ist auf den nur 5%-igen Anteil der vicinalen Diolgruppen auf dem SAM zurückzuführen, auf die relativ geringe Biocytinhydrazid- Konzentration (10 mM) und vor allem auf die niedrige Perjodat- Konzentration (10 mM) .
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der OEG-ter- minierte SAM von 14 und 14a (1/19, mol/mol) eine besonders gute Protein-Resistenz bewirkt und dass der 5%-ige Anteil an latenten Aldehydgruppen im SAM die begueme kovalente Kopplung kleiner Li- gandenmoleküle (in diesem Fall Biocytinhydrazid) über chemose- lektive Ligation (z.B. Hydrazonbildung) erlauben.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde wieder ein Chip mit 14 und 14a beschichtet, nach der Perjodat-Oxidation wurde aber statt des Biocytinhydrazids das Maleimidopropionylhydrazid (MPH) gekoppelt und seine Tauglichkeit für die Kopplung von Proteinen mit freien SH-Gruppen getestet (Fig. 4). Zunächst wurde wieder die Protein-Resistenz vor Perjodat-Einwirkung getestet und dabei genau gleiche Befunde erhalten wie in Fig. 2.
Die latenten Aldehydgruppen wurden mit Perjodat oxidiert (erste zwei Injektionen in Fig. 4) und die dabei entstandenen Aldehydgruppen mit 10 mM Maleimidopropionylhydrazid weiterreagiert. Wie bei Biocytinhydrazid so war auch jetzt 20 mM NaCNBH3 zugegen, um die Hydrazonbindung irreversibel zu fixieren. Danach erfolgte (nur in FC2, punktierte Linie in Fig. 4) die kovalente Kopplung von Ziegen-IgG, welches mit ca. 5 3- (Acetylthio) pro- pionyl-Resten (SATP) pro IgG-Molekül vorderivatisiert und unmittelbar vor Kopplung mit Hydroxylamin de-acetyliert worden war [Haselgrübler 1995] . Die Effizienz der Kopplung (gut 1000 RU, ca. 50% der maximalen Bedeckung) zeigte sich erst nach Auswaschen von IgG mit Puffer. Danach wurden die ungenutzten Ma- leimid-Reste und gleichzeitig auch die Aldehydgruppen beider Flusszellen mit 20 mM Cystein blockiert (Thioetherbildung mit den Maleimidgruppen, Thiazolidin-Ring-Bildung mit den Aldehydgruppen) . Auch dieser OEG-terminierte Chip war nicht generell adsorptiv für Protein, weil in der Kontrollzelle (FCl, ausgezogene Linie in Fig. 4) überhaupt kein Protein gebunden wurde und weil in der Messzelle (FC2, punktierte Linie in Fig. 4) auch nur spezifische Bindung eintrat: Die mit Biotin-IgG besetzte Messzelle band nämlich kein vorblockiertes Streptavidin (die Injektion nach der Cysteinjektion) und kein einfaches IgG (letzte Injektion), sehr wohl aber Streptavidin und Biotin-IgG in zwei aufeinanderfolgenden Zyklen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass OEG-terminierte SAMs mit einem kleinen Prozentsatz an vicinalen Diolgruppen eine sehr hochwertige und vielfältige Sensorfläche darstellen, welche nach Perjodat-Oxidation über chemoselektive Ligation (d.h. mit primären Aminen, Hydraziden, Hydrazinen, Aminooxy-Derivaten und N- terminalen Cysteinresten) leicht weiter derivatisiert werden kann, wobei die Derivatisierungsreaktionen die Protein-Resistenz nicht beeinträchtigen.
Beispiel 3.3: Liponsäure-Derivate
Liponsäure und Liponsäure-NHS-Ester werden häufig für die SAM-Bildung auf Goldoberflächen verwendet, weil Disulfide ebenso auf Gold binden wie freie Thiole. Hier wurde Liponsäure (15) über eine Amidbindung mit 6 verbunden, um das Amid-Konjugat 16 zu erhalten.
Schema 3.4:
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TSTU, TEA nach SAM-Bildung
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000043_0003
1H-NMR-Spektrum von 16: δ [ppm, CDCl3, 200 MHz] 5.80 (sb, 1 H, NH) 4.3-4.15 (m, 1 H, C (O) H-CH3HbO) 4.1-4.0 (m, 1 H, C(O)H-CB3H13O) 3.7-3.5 (m, 3 H, NH-CfPH0 und C(O)H-CH3H13O und SS-CH) 3.4-3.25 (m, 1 H, NH-CH3H13) 3.25-3.1 (m, 2 H, CH2-SS) 2.55-2.45 (m, 1 H, SS- CH2-CH3H13) 2.2 (t, 3J= 7.3 Hz, 2 H, CH2-CO) 2.05-1.80 (m, 1 H, SS- CH2-CH3H0) 1.80-1.60 (m, 4 H, CH2-CH2-CH2-CH2-CO) 1.60-1.45 (m, 2 H, CH2-CH2-CH2-CO) 1.43 (s, 3 H, Methyl) 1.35 (s, 3 H, Methyl).
Beim ersten Syntheseversuch gelang es, 16 durch saure Ent- schützung in 17 umzuwandeln, ohne dass eine Polymerisation der Liponsäurereste auftrat [Hahn 2005] . Das Produkt 17 wurde mit 17a gemischt (95/5, g/g) und in Ethanol gelöst (insgesamt 100 μM) . Darin wurden nach der Standardprozedur [Tinazli 2005] vorbehandelte Goldchips übers Wochenende inkubiert, gewaschen, getrocknet, ins BIAcore® eingesetzt und mit der gleichen Prozedur getestet, wie in Fig. 1 für einen SAM der Verbindung 8 gezeigt wird.
Bei allen nachfolgenden Versuchen der Herstellung von 17 aus 16 wurde immer mehr als die Hälfte der Substanzmenge in ein Polymer mit intermolekularen Disulfidbrücken umgewandelt. Aus die- sem Grund wurde entschieden, den SAM mit der Verbindung 16 zu bilden (100 μM in Ethanol über zwei Nächte) und die Acetonid- schutzgruppe erst am Chip abzuspalten (90 min in THF / IM HCl,. 1/1, v/v, Bildung von 17) . Danach wurde 3 x in THF (beim dritten Mal 3 min im Ultraschallbad) , 3 x in Ethanol und 3 x in Wasser gewaschen (beim dritten Mal 3 min im Ultraschallbad) . Anschließend wurde der Chip noch 30 min mit 10 mM Perjodat behandelt, bevor er mit Wasser gewaschen, mit Stickstoff trockengeblasen und ins BIAcore® eingesetzt wurde.
Beim Überströmen mit PBS (10 μl/min) zeigte der Chip in den ersten zwei Stunden einen leichten Drift nach oben, danach war die Basislinie völlig stabil (siehe Fig. 5) . Dieses Verhalten ist typisch für jene Chips, bei denen der Acetonid-Rest erst auf der SAM-Oberflache gespalten wird, wobei der Drift meist binnen 1-2 Stunden abklingt.
Die kovalente Kopplung von Protein erfolgte in drei Schritten. Bei jedem Schritt wurden 100 μl einer Proteinlösung (1 mg/ml in PBS, immer mit 20 mM NaCNBH3) bei einem Fluss von 5 μl/min injiziert. Im ersten Schritt wurde in der Kontrollzelle (FC2, ausgezogene Linie in Fig. 5) einfaches IgG gekoppelt, im zweiten Schritt in der Messzelle (FCl, punktierte Linie in Fig. 5) Biotin-IgG und im dritten Schritt in beiden Zellen BSA. Die Kopplung von IgG bzw. Biotin-IgG war sehr effizient, wie man an den Resonanzwinkelzuwächsen von 4670 bzw. 4850 RU sehen kann (definiert als Winkel unmittelbar vor der BSA-Injektion minus Winkel vor den Injektionen von IgG bzw. Biotin-IgG) . Diese Werte sind ca. doppelt so groß wie die Bindung von Biotin-IgG an eine Streptavidin-Oberfläche (2590 bzw. 2640 RU in den späteren Injektionen von Biotin-IgG in Fig. 5) , obwohl in beiden Fällen eine dichte Monoschicht von IgG bzw. Biotin-IgG vorliegen sollte. Die Diskrepanz zwischen fast 5000 RU bei kovalenter Kopplung von (Biotin-) IgG und etwas über 2500 RU bei nichtkovalenter Bindung von Biotin-IgG dürfte darauf zurückzuführen sein, dass die IgG-Moleküle bei der kovalenten Kopplung eher aufrecht stehend gekoppelt werden, bei der nichtkovalenten Bindung eher flach liegend. In Fig. 3 hatten sich auch bei der kovalenten Kopplung dünnere Schichten von IgG bzw. Biotin-IgG ergeben (1970 bzw. 3120 RU) , wobei der niedrigere Wert auf das Fehlen von NaCNBH3 zurückzuführen sein dürfte.
Dieser Trend hat sich in allen bisherigen Versuchen gezeigt, dass langsamere Kopplung dünneren Schichten führt, d.h. zu eher flach liegenden IgG-Molekülen. Auch die dünneren Schichten scheinen aber dicht gepackt zu sein, weil bie nachfolgenden Injektion von BSA nie mehr nennenswerte Mengen gebunden werden konnten. Im Fall des in Fig. 5 gezeigten Chips war die BSA-In- jektion überhaupt ohne Wirkung, d.h. dass die Flächen vollkommen mit (Biotin-) IgG bedeckt waren.
Die mit Protein bedeckten Chipoberflächen zeigten nur eine minimale unspezifische Bindung von 12 bzw. 17 RU gegenüber vorblockiertem Streptavidin (2 μM, mit 200 μM Biotin gesättigt) . Bei der mit einfachem IgG besetzten Kontrollzelle (FC2, ausgezogene Linie in Fig. 5) wurden vom nicht vorblockierten Streptavidin auch nur 32 RU gebunden, während die spezifische Bindung von Streptavidin in derselben Messzelle 2540 RU betrug (FCl, punktierte Linie in Fig. 5) . Danach wurde in dieser Zelle noch Bio- tin-IgG im Ausmaß von 2590 RU gebunden. Ein nochmaliger Zyklus mit Streptavidin und Biotin-IgG ergab wieder Zuwächse von 2220 bzw. 2640 RU in derselben Messzelle, d.h. dass immer wieder eine dichte Lage des jeweiligen Proteins dazukam. Flach liegendes Biotin-IgG sollte trotz seiner sperrigen dreilappigen Struktur die gleiche Schichtdicke ergeben wie das annähernd kugelsymmetrische Streptavidin und dies scheint hier vorzuliegen. Leider baut sich in der Kontrollzelle eine zunehmende Bindungskapazität für Streptavidin und Biotin-IgG auf. Diese ist aber definitiv nicht auf unspezifische Bindung zurückzuführen sondern auf "unerwünschte spezifische Bindung" . Den Beleg dafür liefern die drei Injektionen mit vorblockiertem Streptavidin (vor den ersten zwei Treppenstufen, zwischen der zweiten und dritten Treppenstufe, nach der vierten Treppenstufe) und die Injektion von einfachem IgG (ganz am Ende des Sensorgramms), wobei niemals mehr als 17 RU an Resonanzwinkelzuwachs beobachtet worden waren. Die plausibelste Erklärung besteht darin, dass das in FC2 gekoppelte unbiotinylierte IgG wenige Moleküle eines Biotin-tragenden Proteins enthält, an welchen bei den abwechselnden Injektionen von Streptavidin und Biotin-IgG steigende Mengen des jeweiligen Proteins binden, weil jedes Streptavidin vier Biotin-Bindungs- stellen und jedes IgG ca. 5 Biotinreste besitzt, sodass auf jedem unerwünschten Biotinrest in FC2 rapid wachsende Baumstrukturen aufwachsen.
In der Praxis ist die "unerwünschte spezifische Bindung" in der Kontrollzelle kein Problem. Man würde nur in der Messzelle Streptavidin aufbringen und danach auch wieder nur in der Messzelle das biotinylierte Sondenmolekül, welches die spezifische Bindung des gesuchten Analytmoleküls bewirkt. Auf diese Weise lässt sich die spezifische Bindung leicht auf die Messzelle beschränken, sodass in der Kontrollzelle nur mehr die unspezifische Analytbindung wirken kann.
Beispiel 3.4: Illustration der Aldehyd-Chip Funktionalisierung mit 3- (Maleimido) -propionylhydrazid (MPH), Biotin-IgG-SATP, streptavidin und biotin-IgG
Schema 3.5 (s.u.) zeigt die Reaktionsfolge zur Herstellung eines IgG-SAM mittels MPH-Kopplung. Der ursprüngliche SAM bestand aus den Thiolen 4a und 5 (Schema 3.5) die mittels Perjodat ind in die Aldehydform innerhalb des BIAcore®-setup umgewandelt wurden.
Danach wurde MPH und NaCNBH3 appliziert, um Maleimid Funktionalitäten anstelle der ursprüngliche Aldehyd Gruppen einzuführen. Als nächstes wurden die Mercaptopropionyl Reste mit frisch entschützten Biotin-IgG-SATP gebunden. Dabei koppelten die freien Thiole am Protein mit der Maleimid-Oberflache durch Thioether bildung (rasche Reaktion) .
An der Chipoberfläche wurden somit kovalent gebundenen Biotin-IgG Moleküle immobilisiert, welche funktionell mit den bisher dargestellten Biocytin-Hydrazid-funktionalisierten Oberflächen waren. Die selben Tests zur Bestimmung der nichtspezifischen Adsorption wurden mit analogen Ergebnis durchgeführt, wobei keine/vernachlässigbare nicht-spezifische Adsorption gefunden wurde.
Schema 3 . . 5 :
Figure imgf000046_0001
NaCNBH,
Figure imgf000047_0001
Beispiel 3.5: Immobilisierung von Antikörpern über Aldehydkopplung von PDPH (3- (2-pyridyldithio) -propionyl hydrazid)
Schema 3.6 (s.u.) zeigt die Reaktionsfolge der Bindung von PDPH an einen Aldehyd-SAM. Der ursprüngliche SAM bestand aus einer Mischung aus Aldehyd-reaktiven Thiolen (4a die durch Peri- odatbehandlung aus einem vicinalen Diol hergestellt wurden) und inerten Thiolen (5) .
Anschließend wurde PDPH hinzugefügt (am Chip) wodurch 2-Py- ridyldithio-Funktionen an Stelle des ursprünglichen Aldehyds eingeführt. In diesem Fall war es essentiell, nicht gleichzeitig NaCNBH3 zuzufügen, da dies die Bildung freier Thiole bewirken würde, die wiederum gegenüber Aldehyden nicht inert wären. Aus diesem Grund wurde die NaCNBH3-Behandlung in einem separaten nächsten Schritt vorgenommen. Anschließend wurde mit DTT gespült - dieser Schritt ist gegebenenfalls unnötig, da die 2-Pyridyldi- thio Gruppen bereits durch NaCNBH3 reduziert wurden, jedoch wurde um sicher zu gehen trotzdem DTT zugesetzt, um eine komplette Reduktion der gebundenen Disulfide in die Thiole zu gewährleisten. Diese Thiole stellen die Bindungsstellen für die Maleimid-funk- tionalisierten IgG-Moleküle (biotin-IgG-SMCC (SMCC: N-Succinimi- dyl 4- (maleimidomethyl) -cyclohexancarboxylat) ) .
Als Folge waren an der Chipoberfläche kovalent gebundene Biotin-IgG Moleküle, die mit den vorhergehend beschriebenen Chipoberflächen analog war. Die selben Tests zur Bestimmung unspezifischer und spezifischer Bindung wurden durchgeführt, wobei die gleichen Resultate erzielt wurden (unspezifische Bindung getestet mit vor-blockiertem Streptaividin und mit ungelabelten IgG und für spezifische Bindung durch Einfangen von funktionellem Streptavidin und biotin-IgG) .
Schema 3.6: Vicinale Diole wurden zu Komponente 4a mit Periodat (bei pH 5.5) oxidiert und mit 3- (2-pyridyldithio) -propionyl hy- drazide (PDPH), gefolgt von NaCNBH3 und DTT Behandlung zur Umwandlung in eine Schiff Base Disulfid Spaltung. Anschließend wurde ein Biotin- und SMCC-derivatisierter IgG unter Kopplung des proteingebundenen Maleimids und der gebildeten Thiolgruppe an der Oberfläche immobilisiert. Der immobiliierte IgG wurde verwendet um exemplarisch die nacheinander folgende Bindung von Streptavidin und Biotin-IgG zu messen, wobei die unspezifische Adsoprption vernachlässigbar war.
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Beispiel 4: Synthese von Perjodat-reaktiven SAM-Komponenten für Metaloxide und H-terminiertes Silizium
Beispiel 4.1. SAM-Bildner mit einer terminalen Vinylgruppe und einer latenten Aldehydgruppe für SAMs auf H-terminiertem Silizium und Diamant
Alkanderivate mit einer terminalen Doppelbindung sind bekannt dafür, dass sie auf H-terminiertem Silizium bzw. H-terminiertem Diamant dicht gepackte SAMs geben. Ohne Katalyse bilden sich die SAMs nur bei hoher Temperatur (z.B. durch einige Stunden Rückfluss bei 165°C in Mesitylen) , mit Hilfe von UV-Licht oder einen stabilen Nitroxidspinlabel aber auch schon bei Raumtemperatur. Bei der thermischen SAM-Bildung dürfen keine proto- lysefähigen Gruppen vorhanden sein, d.h. Carboxyl- oder Alkoholgruppen sollten verestert sein. Bei der katalysierten SAM-Bildung sind freie OH-Gruppen und sogar COOH-Gruppen erlaubt, weil die Doppelbindung unter Katalyse viel schneller mit dem H-terminierten Silizium reagiert als die Sauerstoff-haltigen funktionellen Gruppen. Nur bei Molekülen ohne terminale Doppelbindung und langen Zeiten fungieren auch Alkohole und Aldehyde als SAM-Bildner. Primäre Aminogruppen wurden aber vor der UV-in- duzierten SAM-Bildung immer durch eine Boc- oder Trifluoroace- tyl-Gruppe geschützt. Ein Undecen-Derivat mit einem terminalen Carbazid wurde allerdings auch schon ungeschützt aufgebracht.
Schema 4 . 1 :
Figure imgf000050_0001
Struktur 19 wurde hergestellt (Schema 4.1), weil sie ein Amid- konjugat zwischen einer SAM-bildenden Carbonsäure (18) und einem latent Perjodat-reaktiven Modul (6) ist, wie es die Erfindungsidee (Schema 2.1) vorsieht.
^-NMR-Spektrum von 19: δ [ppm, CDCl3, 200 MHz] 5.67-5.92 (m, 2 H, NH und H2C=CH) 4.87-5.04 (m, 2 H, H2C=CH) 4.14-4.29 (m, 1 H, C(O)H-CHaHbO) 3.97-4.09 (m, 1 H, C(O)H-CH3H13O) 3.47-3.69 (m, 2 H, NH-CH2) 3.22-3.38 (m, 1 H, C(O)H-CH3H0O) 2.19 (t, 3J= 7.6 Hz, 2 H, CH2-CO) 2.03 (q, 1 H, H2C=CH-CH2) 1.63 (t, 2 H, 3J= 7.1 Hz CH2- CH2-CO) 1.60-1.45 (m, 2 H, CH2-CH2-CH2-CO) 1.43 (s, 3 H, Methyl) 1.34 (s, 3 H, Methyl) 1.30 (s, 10 H, (CH2)5).
Die Acetonidspaltung (zu 19a) kann dann am SAM durchgeführt werden, analog zu den publizierten Beispielen mit Boc-Schutz- gruppen (s.o.) und analog zum vorliegenden Ausführungsbeispiel mit Lipon-APD-Acetonid (Schema 3.3 und 3.4). Zusammen mit den in Schema 3.4 gezeigten funktionellen Daten muss die Synthese von 19 daher als gültiges Ausführungsbeispiel betrachtet werden.
Beispiel 4.2: SAM-Bildner mit einer Katecholfunktion zur festen Bindung an Metalloxid und einer Perjodat-reaktiven Gruppe zur Immobilisierung von Biomolekülen
Metalloxide-Oberflächen lassen sich auch mit Silanen gut de- rivatisieren (z.B. ITO mit Octadecyltrimethoxysilan) , die Silan- schichten sind aber empfindlich gegenüber alkalischen Lösungen, auch schon knapp über pH 7. Im Gegensatz dazu sind SAMs von Al- kylphosphonaten auf Metalloxiden alkaliresistent gegenüber alkalischen Lösungen, wobei dies sogar für solche SAMs gilt, welche eine nicht allzu lange Undecylkette und gute Benetzbarkeit auf der Wasserseite besitzen. Ein hydrophober SAM von Octadecylphos- phonsäure auf oberflächlich oxidiertem Aluminium sind sogar völlig resistent gegenüber einem Gemisch von Phosphorsäure, Essigsäure und Salpetersäure, trotz der geringen SAM-Dicke von ca. 2 nm. Kürzere Alkylphosphate bzw. -phosphonate sind in de- protonierter Form gut wasserlöslich (als Micellen) und können daher aus Wasser auf Metalloxide aufgezogen werden, langkettige Alkylphosph (on) ate werden eher aus organischem Solvens oder durch "micro contact printing" aufgebracht.
Neben Phosph (on) at-Gruppen bilden auch Hydroxamsäuren und Carbonsäuren SAMs auf Metalloxiden, wobei die Affinität bei manchen Metalloxiden in dieser Reihenfolge abnimmt, bei anderen zunimmt. Auch bei Katecholgruppen (z.B. DOPA) wurde eine außergewöhnlich hohe Affinität für Metalloxiden festgestellt, bislang ist aber erst eine Studie publiziert worden, in welcher wahrscheinlich ein dicht gepacktes SAM mit IV-2-Bromopropionyl- Dopamin als Ankergruppen vorlag.
Schema 4.2:
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
1H-NMR von 24: δ [ppm, CDCl3, 200 MHz] 6.70 (t, 3J = 8.2 Hz, IH, CH-Ar) 6.47 (d, 3J= 10.4 Hz, IH, CH-Ar) 6.42 (d, 3J= 8.6 Hz, IH, CH-Ar) 5.7 (s, breit, IH, NH) 4.3-4.2 (m, IH, NH-CH2-CH(O)- CH2-O) 4.1-4.0 und 3.7-3.6 (m, 2H, NH-CH2-CH(O)-CH2-O) 4.05 (t, superposed, 2H, -0-CH2-CH2) 3.6-3.5 und 3.4-3.2 (m, 2H, NH-CH2- CH(O)-CH2-O) 2.20 (t, 3J= 7.6 Hz, 2H, CH2-CO) 1.9-1.5 (m, 4H, O- CH2-CH2 and CH2-CH2-CO) 1.69 (s, 6H, C (CH3) 2) auf aromatischer Substruktur) 1.43 und 1.35 (s, 6H, C (CH3) 2) auf APD Substruktur) 1.26 (s, breit, 22H, 0-CH2-CH2- (CH2) H-CH2-CH2-CO-NH) .
Es wurde ein Molekül hergestellt (Struktur 24 in Schema 4.2), welches eine lange hydrophobe Pentadecylkette besitzt, an deren Enden ein Katecholfunktion (1, 2-Dihydroxybenzol) und ein Perjo- dat-reaktiver Modul hängen. Im ersten Schritt wird der schwache Carboxylactivator TSTU verwendet, um 16-Bromhexadecansäure (20) unter Amidbildung an APD-Acetonid (6) zu koppeln. Der zweite Schritt ist die O-Alkylierung von geschütztem Pyrogallol (22) mit dem Intermediat 21. Spaltung beider Acetonid-Enden gibt das Produkt 24. Dieses hat zwar an beiden Enden ein vicinales Diol, funktionell sind die beiden Enden aber extrem unterschiedlich, weil nur das "aromatische vicinale Diol" (das Katechol) eine hohe Affinität für Metalloxide besitzt. Um die SAM-Bildung dieses neuen Molekültyps auf Metalloxid rasch über den Kontaktwinkel nachweisen zu können, wurde das analoge Molekül 25 durch Alkylierung von 22 mit Hexadecylbromid hergestellt, in Acetoni- tril gelöst (3 mM) und gereinigtes ITO (indium-tin-oxide) 36 h inkubiert. Nach Waschen und Trocknen ergab sich ein Konntaktwinkel von 84±5°, im Gegensatz zu 47+2° auf ITO, welches in reinem Acetonitril inkubiert worden war. Der hohe Kontaktwinkel beweist die Bedeckung der ganzen ITO-Fläche mit dem neuen SAM-Bildner 25. Analog ist auch beim bifunktionellen SAM-Bildner 24 eine gute Chemisorption der Katecholfunktion ans Metalloxid zu erwarten, sodass auf der Wasserseite des SAMs eine ausreichende Dichte von vicinalen aliphatischen Diolen für die Perjodat-Oxidation zu kopplungsfähigen Aldehydgruppen zur Verfügung steht.
Beispiel 5 : Syntheserouten mit Einführung der Monolayer-bil- denden funktionellen Gruppe in einem sehr späten Schritt
In Beispiel 1 wurde hervorgehoben, dass die Acylkonjugation von SAM-bildenden Modulen mit latenten Aldehyd-Modulen so schonend ist, dass die SAM-bildenden Funktionen und die latente Aldehydfunktion während der Acylkonjugation ungeschützt oder in nur schwach geschützter Form in den zu koppelnden Modulen bereits vorhanden sein dürfen. Dies wurde in den Beispielen 2 und 3 sowie in Beispiel 4.1 anhand konkreter Ausführungen belegt. In Beispiel 4.2 war jedoch die SAM-bildende Funktion (das geschützte Katechol) während der Acylkonjugation im entsprechenden Modul noch gar nicht vorhanden. Vielmehr wurde zuerst die Acylkonjugation (Amidbildung) durchgeführt und danach erst das endständige Bromatom von Struktur 21 durch das reaktive Sauerstoffatom von Struktur 22 substituiert, um die SAM-bildende Funktion (das Katechol) einzuführen.
Der erste Schritt von der in Beispiel 4.2 gezeigten Route demonstriert den schon bekannten Vorzug der Acylkonjugation, dass sie unter sehr milden Bedingungen quantitativ verläuft: Das primäre Amin 6 wird unter den gewählten Reaktionsbedingungen ausschließlich acyliert und in keiner Weise vom Bromid alky- liert. Hierfür maßgeblich ist natürlich auch die besondere Eigenschaft des Bromatoms an einer einfachen Alkylkette, d.h. ohne Nachbarschaft zu einer Carbonylgruppe oder ähnlich aktivierenden Gruppen. Mit Jodid statt Bromid wären die in Beispiel 5 gezeigten Schemata kaum denkbar, weil hier eine viel zu große Neigung zur Alkylierung bestünde. Chlorid statt Bromid wäre durchaus denkbar, trotz der eher geringen Reaktivität von Alkylchloriden, weil nämlich negativ geladene Schwefelatome (Thioacetat in Beispiel 5.1 oder Thiosulfat in Beispiel 5.2) Supernukleophile darstellen und daher sogar Chloratome leicht durch Schwefel substituiert werden. Auch Tosylat oder Mesylat wäre statt Bromid denkbar, nur um diese Option nicht unerwähnt zu lassen.
Der zweite Schritt von der in Beispiel 4.2 gezeigte Route macht sich die bisher unerwähnte Tatsache zunutze, dass Amide besonders stabile und inerte Acylkonjugate darstellen, welche unter den stark basischen Bedingungen der Bromsubstitution völlig intakt bleiben. Dies gilt natürlich nicht für weniger stabilere Acylkonjugate wie etwa Carbonsäureester oder Carbonate. In Beispiel 5 wird aufgezeigt, dass die in Beispiel 4.2 vorgeführte Synthesestrategie (Einführung der SAM-bildenden Funktion nach Amidknüpfung) viel breiter anwendbar ist und einen bequemen synthetischen Zugang zu häufig benötigten multifunktionellen SAM-Bildnern bietet.
Beispiel 5.1: Synthese von N- (Mercaptododecanoyl) -3-Aminopropan- 1,2-diol
Die mit TSTU in-situ bewerkstelligte Amidkopplung von 26 mit einem leichten Überschuss von 6 verlief glatt und ohne ein Anzeichen der Alkylierung des primären Amins durch die Alkylbro- mid-Funktion. Das Produkt 27 konnte durch Waschung einer Chloroformlösung mit 0,1 M Phosphorsäure (mit NaHCO3 auf pH 2,5 abgestumpft), 10% Na2CO3 und gesättigtes NaCl gereinigt werden. Danach wurde das Bromid in DMF durch einen dreifachen Überschuss an Thioacetat substituiert, extraktiv vorgereinigt (Chloroform / Wasser) und in Chloroform auf Sephadex LH-20 gereinigt. Die Ent- schützung wurde beim hier gezeigten Dodecansäure-Derivat noch nicht vorgenommen, bei der ganz analogen Hexadecansäureverbin- dung hingegen wurden beide hier gezeigten Reihenfolgen mit ausgezeichnetem Erfolg durchgeführt, wobei die Reihenfolge mit zuerst K-t-Butoxid und dann HCl bequemer ist als die in Beispiel 3.1 verwendete Reihenfolge.
Schema 5.1:
Figure imgf000055_0001
IH-NMR von 27: δ [ppm, CDCl3, 200 MHz] 1,27 (14H, breites s, (CHz)7) 1,34 (3H, s, Acetonid-CH3) 1,43 (3H, s, Acetonid-CH3) 1,47-1,25 (4H, m, CiI2-CH2-CO und CH2-CH2-S) 2,20 (2H, t, J = 7,6 Hz, CH2-CO) 2,32 (3H, s, S-Acetyl) 2,86 (2H, t, J = 7,2 Hz, CH2- S) 3,20-3,40 (IH, m, CH2-N) 3,48-3,69 (2H, m, CH2-N und CH2 vom Dioxolan-Ring) 3,97-4,12 (IH, m, CH2 vom Dioxolan-Ring) 4,15-4,30 (IH, m, CH vom Dioxolan-Ring) .
Beispiel 5.2: Synthese von SAM-Bildnern mit Buntesalz-Funktion und latenter Aldehydfunktion
Buntesalze (Alkylthiosulfate) verlieren bei Kontakt mit Gold spontan SO3 unter Bildung eines Thiolats, welches am Gold den gleichen Thiol-SAM ausbildet wie das entsprechende Mercaptan [Lee, M. -T. et al . (2003) Langmuir 19, 5246-5253]. Der besondere Vorzug des Buntesalzes besteht darin, dass es aus Wasser aufgebracht werden kann und daher mit Apparaturen kompatibel ist, in welchen keine orgaischen Lösungsmittel verwendbar sind. Das hier gezeigte Schema zeigt einen einfachen Syntheseweg zu einem Alkylthiosulfat mit einer latenten Aldehydfunktion. Struktur 27 wurde in Wasser/Acetonitril (1/2, v/v) mit der äquimola- ren Menge an Natriumthiosulfat 24 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei laut Dünnschichtchromatogramm (Silica, in Chloroform / Methanol / Wasser, 70/30/4) fast alles Edukt ins gewünschte Produkt umgesetzt wurde. Letzteres wurde durch präparative Silica- Chromatographie isoliert.
Schema 5.2:
Figure imgf000056_0001
IH-NMR von 30: δ [ppm, D2O, 200 MHz] 1,36 (14H, breites Signal, (CH2)-,) 1,40 (3H, s, 0-CH3) 1,53 (3H, s, 0-CiJ3) 1,56-1,74 (2H, m, CH2-CH2-CO) 1,75-1,90 (2H, m, CH2-CH2-S-SO3Na) 2,04 (2H, t, J = 8,4 Hz, CH2-CO-NH) 3,18 (2H, t, J = 7,4 Hz, CH2-S-SO3Na) 3,44 (2H, d, J = 7,3 Hz, Dioxolanring-CH2-NH-CO) 3,75-3,86 (IH, m, O-CHΛHB-CH- 0) 4,13-4,48 (IH, m, O-CHAHB-CH-O) 4,32 (IH, m, O-CHAHB-CH-O) .
Die weiteren hier gezeigten Reaktionen wurden nicht durchgeführt, weil das gesuchte Endprodukt (29) ohnedies schon auf dem in Beispiel 5.1 gezeigten Weg hergestellt worden war, die gezeigten Reaktionsschritte stellen jedoch sehr gebräuchliche Reaktionen an vergleichbaren Buntesalzen dar, sodass diese Wege als gesichert angesehen werden können. Bei der Jod-Behandlung in Methanol tritt automatisch die Acetonid-Spaltung ein, was erst seit 2004 bekannt und mechanistisch verstanden worden ist [Sun, J. et al. (2004) J. Org. Chem. 69, 8932-8934].
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Claims

_ _Ansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von reaktiven molekularen Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine mehrfachfunktionelle Monolayer-bildende Komponente mit einer mehrfachfunktioneilen Carbonylkomponente, die eine gegebenenfalls latente Carbonylygruppe aufweist und in einem Schritt in eine Carbonylgruppe umgewandelt wird, kovalent verbunden werden, wobei gegebenenfalls die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente durch eine oder mehrere mehrfachfunktionelle Verbindungskomponente (n) kovalent verbunden werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylkomponente eine Diolkomponente ist, die ein vicinales Diol, ein geschütztes vicinales Diol, einen vicinalen Aminoalko- hol oder einen geschützten vicinalen Aminoalkohol aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente eine selbst-assemblieren- de Monolayer-bildende Komponente ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente durch eine oder mehrere
Verbindungskomponente (n) , vorzugsweise ein inertes, lineares Polymer, insbesondere Polyethylenglycol, kovalent verbunden werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente mit der Carbonylkomponente in Lösung verbunden werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente und die Carbonylkomponente direkt miteinander verbunden werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche der 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente, die Carbonylkomponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente durch Acylkonjugation, vorzugsweise von Kohlensäure, Kohlensäu- rederivaten, Carbonsäuren, Carbonsäurederivaten oder aktivierte Ester an einer der Komponenten, miteinander verbunden werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche der 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylkomponente oder die Monolayer- bildende Komponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente unabhängig voneinander eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus -COOH, NH2, aktivierter Säureester oder Säurechlorid, aufweist, die zur Bindung an eine der anderen Komponenten, die vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt aus OH, NH2 oder SH ist, verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche der 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylkomponente oder die Monolayer- bildende Komponente und gegebenenfalls die Verbindungskomponente unabhängig voneinander eine gegebenenfalls ein-, zwei-, oder mehrfach 0-, N-, S- oder P-heterosubstituierte Gruppe ausgewählt aus Ci_30-Alkyl, C^^-Ary!, C2_30-Glykol, vorzugsweise Ci_30-Ethylen- glycol, oder Kombinationen hiervon aufweist, die vorzugsweise die mindestens zwei funktionellen Gruppen der Komponente trennt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche der 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung der Komponenten zur Bildung der Einheiten unter Reaktionsbedingungen ausgewählt aus Raumtemperatur, und/oder Basenkatalyse, vorzugsweise schwacher Basenkatalyse unter Verwendung von Basen, die in ihrer proto- nierten Form einen pKa-Wert kleiner als 12 aufweisen, besonders bevorzugt unter Verwendung von tertiären Aminen oder Pyridin oder Dimethylaminopyridin in organischem Lösungsmittel, erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche der 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente entschützt wird.
12. Verfahren zur Herstellung einer Einmolekülschicht, dadurch gekennzeichnet, dass Einmolekülschichten ( „Monolayer") -Einheiten nach einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt werden und auf einem Träger gebunden werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die - -
Einheiten durch Adsorption an den Träger gebunden werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die gegebenenfalls geschützte Carbonylkomponente entschützt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylkomponente eine Diolkomponente ist und ihre latente Carbonylgruppe mit Perjodat, vorzugsweise Natriummetaperjodat, zu einer reaktiven Carbonylgruppe, vorzugsweise Aldehyd- oder Ketogruppe, oxidiert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ligandenmolekül oder ein Biomolekül, vorzugsweise ausgewählt aus Peptiden, Proteinen, PoIy- oder Oligonukleinsäuren, die gegebenenfalls durch Anfügen einer Ami- nogruppe modifiziert sind, an die Einmolekülschichten („Mono- layer") -Einheiten gebunden werden, insbesondere an die Carbonylgruppe .
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente eine Thiol- oder Disulfidgruppe aufweist und gegebenenfalls der Träger eine Goldoberfläche aufweist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente eine Vinylgrup- pe aufweist und gegebenenfalls der Träger eine Wasserstoffterminierte ReinelementOberfläche, vorzugsweise Wasserstoff-ter- miniertes Silizium (H-Si) oder Wasserstoff-terminierter Diamant, aufweist .
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer-bildende Komponente eine Säuregruppe oder deprotonierte Säuregruppe, vorzugsweise eine Phosphat-, Phosphonat- oder Katecholgruppe, aufweist und gegebenenfalls der Träger eine Metalloxidoberfläche, vorzugsweise Titanoxid, Tantaloxid oder ITO (Indium-Zinn-Oxid), aufweist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekenn- - - zeichnet, dass reaktive funktionelle Gruppen, vorzugsweise ami- noreaktive Gruppen, deaktiviert werden.
21. Einmolekülschichten („Monolayer") -Einheit, umfassend einen gegebenenfalls geschützten Monolayer-bildenden Teil, einen gegebenenfalls geschützten Carbonylteil, der eine gegebenenfalls ge- schütze Aldehydgruppe aufweist, und gegebenenfalls einen oder mehrere Verbindungsteile, wobei die Teile durch Estergruppen, Amidgruppen oder ürethangruppen miteinander kovalent verbunden sind, vorzugsweise erhältlich nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 und 13 bis 19, wobei die Komponenten zu den j eweiligen Einmolekülschichten ( „Monolayer" ) -Einheit-Teilen führen.
22. Einmolekülschicht aus den Einheiten nach Anspruch 21 auf einem Träger, vorzugsweise erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, vorzugsweise eine selbst- assemblierte Einmolekülschicht.
23. Einmolekülschicht nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Einmolekülschicht zu weniger -als 20%, vorzugsweise weniger als 10%, besonders bevorzugt weniger als 5% aus den Einmolekülschicht-Einheiten nach Anspruch 21 aufgebaut ist und die Einmolekülschicht zusätzlich inerte Einmolekülschicht-Einheiten, insbesondere ohne Carbonyl- oder latenten Carbonylgruppen, aufweist.
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