WO2006048491A1 - Biosensor basado en moléculas de ácido nucleico peptídico (pna) sobre superficies de oro, procedimiento de obtención y sus aplicaciones - Google Patents

Biosensor basado en moléculas de ácido nucleico peptídico (pna) sobre superficies de oro, procedimiento de obtención y sus aplicaciones Download PDF

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WO2006048491A1
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WO
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pna
biosensor
gold
molecules
molecule
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Application number
PCT/ES2005/070153
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English (en)
French (fr)
Inventor
José Ángel MARTÍN GAGO
Elisa ROMÁN GARCÍA
Cristina GÓMEZ-NAVARRO GONZÁLEZ
Carlos Briones Llorente
Eva MATEO MARTÍ
Víctor PARRO GARCÍA
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Instituto Nacional De Técnica Aeroespacial
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention focuses on the biotechnology and nanotechnology sectors.
  • the invention relates, in general, to the method of obtaining and applying a biosensor based on the immobilization of peptide nucleic acid (PNA) molecules on gold surfaces.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the biosensor can be applied in the detection and characterization of nucleic acid molecules (DNA or RNA) of biotechnological, human or veterinary, environmental, agricultural or food biosanitary interest.
  • DNA microarray technology also called DNA chips or microchips
  • DNA chips or microchips have been an important development (Southern et al., 1994; for a review see Nature Genetics 21, supplement, 1999), according to which thousands of molecular probes, mainly oligonucleotides, can be covalently fixed to a solid support (glass, nitrocellulose, nylon, etc.).
  • SNPs nucleotide polymorphism studies
  • mini-sequencing can be performed using DNA microarrays and typing of microorganisms. This technique exploits the experimental methodology developed by E.
  • nucleic acids can be fixed to a solid support and form stable hybrids with their complementary radiolabeled or fluorescently.
  • the stability of the hybrids is determined by the degree of complementarity of the nucleotide sequence and by external factors such as the ionic strength of the medium, pH or temperature. It is possible to design and synthesize DNA oligonucleotides, for example 10 to 30 nucleotides in length, in which some of their positions, generally the central position, differs from that present in the complementary chain of a given gene.
  • sequences of said gene are marked with radioactivity or with a fluorescent compound and are put in contact with a whole battery of identical oligonucleotides four by four except in the central position or "questioning position" , where nucleotide A, C, G or T appears respectively in each of the four.
  • a positive hybridization result immediately identifies the nucleotide present in the interrogated position of the gene (Hacia et al., 1998).
  • SAMs self-assembled monolayers
  • PNAs peptide nucleic acids
  • the PNA is characterized by its ability to hybridize stably and specifically with complementary DNA, in accordance with the Watson-Crick base parity rules (Egholm et al., 1993).
  • ssPNA single-chain PNAs
  • ssPNA single-chain PNAs
  • the difference in temperatures at which complete mating occurs and one in which one of the bases is mismatched is greater in the PNA-DNA case than in the DNA-DNA.
  • a biosensor in which immobilized probes are PNA will be potentially more efficient than another based on DNA for the detection of mutations and SNPs in a target nucleic acid molecule.
  • PNA is not sensitive to the action of biodegrading enzymes such as DNases, RNases or proteases, so that its biological stability is much greater than that of DNA or RNA.
  • the invention consists in the development of a biosensor obtained by immobilizing peptide nucleic acid (PNA) molecules on gold surfaces, and their applications in the detection and characterization of nucleic acid molecules (DNA or RNA ) of biosanitary, environmental or food interest.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the process of construction of said biosensors is based on the possibility of immobilizing in a controlled manner PNA molecules with a thiolated end on monocrystalline or polycrystalline gold surfaces, so that monolayers originate self-assembled (SAMs).
  • SAMs self-assembled
  • the biosensor based on PNA SAMs has the ability to specifically bind complementary DNA, with high sensitivity and a specificity that allows discriminating between DNA molecules that differ in a single mutation or polymorphism.
  • the biosensor activity is monitored using molecular characterization techniques such as atomic force microscopy (AFM) and X-ray photoemission (XPS), which, unlike the techniques used in conventional DNA microarrays, do not require prior marking of the target molecule that is analyzed.
  • molecular characterization techniques such as atomic force microscopy (AFM) and X-ray photoemission (XPS), which, unlike the techniques used in conventional DNA microarrays, do not require prior marking of the target molecule that is analyzed.
  • the present invention faces the problem of providing new tools for the identification of material and biological activity, and more specifically new biosensors with the ability to bind nucleic acids with high sensitivity and specificity.
  • the invention is based on the fact that the inventors have observed that the immobilization of single chain PNAs is possible
  • ssPNAs with a thiolated end to a gold surface, so that the PNA molecules are arranged as an ordered and self-assembled two-dimensional structure, which allows a correct presentation of said molecule to target nucleic acid molecules.
  • Hybridization of immobilized PNA and a target nucleic acid can be determined by surface physics techniques such as atomic force microscopy (AFM) or X-ray photoemission (XPS) (Ertl et al., 1985) without requiring the mareaje of the target nucleic acid molecules.
  • AFM atomic force microscopy
  • XPS X-ray photoemission
  • the XPS technique allows the hybridization event to be detected by the increase in the nitrogen signal (the one that provides the hybridized DNA to which the immobilized PNA already possessed) or by the appearance of a phosphorus signal (produced by the groups DNA phosphate or target RNA, while immobilized PNA lacked phosphorus functional groups).
  • the specificity of the biosensor is such that it allows the identification of a change of a nucleotide or mutation in the target nucleic acid.
  • the biosensor consists of a device formed by a plate that typically has dimensions of llxllxl mm, on one of whose larger faces a monolayer of ssPNAs has been deposited (Example 1).
  • this biosensor is stable in air (it maintains its structure and functionality for at least three months in air after its construction) and highly resistant to radiation (it is stable and bioactive after being exposed for 48 hours to X-rays of a synchrotron source with a flow of 10 12 photons / cm 2 ).
  • the biosensor PNA molecules maintain their ability to recognize complementary ssDNA molecules, which allows the use of this device in the discrimination of two target DNA molecules that differ only in a point mutation or SNP (Example 2).
  • an object of the present invention is a biosensor useful for the detection and characterization of target nucleic acid molecules, hereinafter biosensor of the present invention, comprising a small plate of material that provides a surface of gold as a physical support with peptide nucleic acid (PNA) molecules arranged in self-assembled monolayers immobilized on it and where said PNA molecule is constituted by the following elements, as shown in Figure 1: a) a junction zone that provides a thiol group or other group that provides a reactive sulfur atom, which allows the union of said PNA molecule to the gold surface, b) a spacer chain of organic and linear nature, which allows a physical separation of the sensing sequence of PNA and the gold surface, and c) a chain of PNA that acts as a sensor sequence or biosensor bait.
  • PNA peptide nucleic acid
  • biosensor refers to a device formed by biological molecules or molecules analogous to biological molecules, preferably PNA molecules, immobilized on a gold surface that acts as a physical support, with the ability to specifically bind or hybridize to other biological molecules. that the union process can be tracked.
  • nucleic acid refers to a sequence of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) or peptide nucleic acid (PNA), of length equal to or greater than 2 nucleotides (abbreviated as nt) that can be single stranded or double chain.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • probe refers to nucleic acids, 5- 250 nt (if single chain) or 5-250 base pairs (if double chain) in length consisting of specific nucleotide sequences that allow total hybridization or partial with complementary target sequences when defined conditions are imposed.
  • target refers to a nucleic acid sequence capable of hybridizing with immobilized probes. in the biosensor. Therefore, a particular embodiment of the invention is the biosensor of the invention in which the target nucleic acid is a deoxyribonucleic acid.
  • DNA DNA
  • RNA ribonucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • peptide nucleic acid refers to a molecule structurally analogous to DNA in which the structural skeleton is a polymer of a peptide nature formed by polymerization of N- (2-aminoethyl) glycine, to which the nucleic bases are linked by methylenecarbonyl bonds.
  • the PNA molecule that acts as a biosensor probe can have a length of between 4 and 250 monomers, that is, have as many nitrogenous bases, and have "amino-carboxyl" orientation.
  • the PNA can be single stranded (ssPNA) or double stranded (dsPNA). Therefore, another particular embodiment of the invention is the biosensor of the invention in which the PNA chain that acts as a sensing sequence or bait of the biosensor c) is single chain (ssPNA) or double chain (dsPNA). It is defined as “self-assembled monolayer” or “self-assembled monolayer (SAM)” to an arrangement of molecules on a surface, stabilized spontaneously by covalent bonds between these molecules and superpiers
  • biosensor of the invention is the biosensor of the invention where the physical support, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belongs to the following group: a single crystal of any noble or silicon metal, either of nature monocrystalline, in thin sheets or polycrystalline.
  • these noble metals are, in addition to gold, the following: silver, copper, platinum and some of its alloys.
  • noble metals have also been described, as in the case of gold, preferential binding of molecules through a reactive thiol group, resulting in self-assembled monolayers (Schreiber, 2000).
  • a functional group containing oxygen such as the alcohol group (Ulman, 1991).
  • the surface of the noble or silicon metal to which the PNA molecules will bind to originate the biosensor may have been treated with physico-chemical cleaning methods, such as ultrasound, acids or solvents.
  • the surface of the noble metal or silicon may also have been heated for between 1 and 30 minutes at a temperature between 500 and 700 ° C to promote the formation of terraces in the material (Ulman, 1991).
  • Another particular embodiment of the invention is the biosensor of the invention where the binding molecule of a) is a molecule, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belonging to the following group: Cysteine, Methionine, Methanethiol, Ethanethiol and elemental sulfur (Poirier et al., 1996; Schreiber, 2000; Lehn, 2002).
  • Another particular embodiment of the invention is the biosensor of the invention where the spacer molecule of b) is a molecule, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belonging to the following group: alkanes of between 4 and 12 atoms of carbon, alkenes of between 4 and 12 carbon atoms, 8-amino-3, 6-dioxaoctanoic acid, any of them can be in a or more copies attached in head-tail or head-head arrangement (Schreiber, 2000; Lehn, 2002).
  • a specific embodiment of the invention is constituted by the biosensor of the invention comprising a junction zone that provides a thiol group of a) constituted by a cysteine and a spacer chain of organic and linear nature constituted by an 8-amino acid molecule -3,6- dioxaoctanoic.
  • Another object of the present invention is a manufacturing process of the biosensor of the invention, hereinafter manufacturing process of the invention, characterized by the following phases: a) Incubation with the gold surface of a solution of PNA in water or any suitable buffer, at a concentration between 1 picomolar (pM) and 100 millimolar (mM), so that the orderly immobilization of the molecule on the gold surface that acts as a physical support and where the immobilization temperature can vary between 4 ° C and 80 ° C, and the immobilization time between 1 and 600 minutes, b) Washing in water or any suitable buffer of excessly immobilized PNA over the gold surface, and c) Checking by surface physics techniques of the structural characteristics of the immobilized PNA layer.
  • pM picomolar
  • mM millimolar
  • Another particular embodiment of the invention is the manufacturing process of the invention in which the PNA molecule can be between 4 and 250 nitrogenous bases in length, can have NC or CN orientation and where the PNA can be single chain (ssPNA) or double (dsPNA).
  • the PNA can be single chain (ssPNA) or double (dsPNA).
  • Another particular embodiment of the invention is the manufacturing process of the invention in the one that the gold surface of a) can be contributed by a single crystal or by a gold polycrystalline (Schreiber, 2000).
  • Another particular embodiment of the invention is the process of the invention where the physical support, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, is selected from the following group: a sheet-shaped structure such as that used as a support for microchips or microarrays (see Nature Genetics 21, supplement, 1999).
  • the manufacturing process of the present invention can be carried out by one skilled in the art of manufacturing self-assembled biosensors, microarrays or monolayers with the information described in the present invention.
  • Another particular embodiment of the invention is the process of the invention where checking by surface physics techniques of c) is carried out by a technique belonging to the following group: atomic force microscopy (AFM), tunnel effect microscopy ( STM), X-ray photoemission (XPS), X-ray absorption (XANES), X-ray fluorescence (XES), and Auger spectroscopy (AES).
  • AFM atomic force microscopy
  • STM tunnel effect microscopy
  • XPS X-ray photoemission
  • XANES X-ray absorption
  • XES X-ray fluorescence
  • AES Auger spectroscopy
  • Another object of the present invention is the use of the biosensor of the invention in a method of detection and characterization of complementary target nucleic acid molecules of biotechnological, sanitary or veterinary, environmental, agricultural or food interest, which may be complementary totally or partially to the PNA probe immobilized on gold and in which the hybridization process is monitored by surface physics techniques, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: microscopy of atomic force, tunnel effect microscopy (STM), X-ray photoemission (XPS), X-ray absorption (XANES), X-ray fluorescence (XES) and Auger spectroscopy (AES)
  • STM tunnel effect microscopy
  • XPS X-ray photoemission
  • XANES X-ray absorption
  • XES X-ray fluorescence
  • AES Auger spectroscopy
  • Another particular embodiment of the invention is the use of the biosensor of the invention in which the method of detection and characterization of nucleic acids consists, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, in a gene expression study, a study of nucleotide polymorphisms (SNPs) for the identification of mutations, mini-sequencing and typing of microorganisms (Parinov et al., 1996; Hacia et al., 1998;
  • nucleotide position refers to the place each nucleotide occupies in a nucleic acid sequence.
  • a “mutation” is an alteration of the nucleotide sequence of one nucleic acid with respect to another that serves as a reference. Said alteration may be a substitution of one nucleotide for another, an insertion or a deletion of one or more nucleotides.
  • Gene type or “wild genome” is defined as the genome of an isolate of an organism whose sequence is considered by the scientific community as wild type, and serves as a reference genome for that species.
  • the strain HXB2 (accession number in the GenBank database: K03455) is considered as a wild genome.
  • "Questioned position" is that nucleotide position of the sequence of a nucleic acid whose composition is to be known.
  • wild oligonucleotide is defined as one that has full sequence identity with the wild genome or corresponding type genome.
  • “Mutant oligonucleotide” is defined as one that has full sequence identity with the corresponding wild genome, except in the position (s) / is question / s, in which it has the sequence corresponding to a mutant strain in that position.
  • hybridization refers to a process whereby, under defined and suitable conditions, two complementary chains of nucleic acids are joined together by forming hydrogen bonds to form double-stranded nucleic acids, according to the pairing rules between nitrogen bases.
  • Total hybridization or “100% hybridization” refers to the hybridization that occurs when all nucleotides of a probe or oligonucleotide pair with a target sequence, or vice versa.
  • a “mismatch” occurs when at least one determined position of a double stranded nucleic acid, both strands possess two non-complementary nucleotides.
  • a “hybrid” is the result of the hybridization process between two single chain nucleic acids.
  • the mismatches in the central positions have a greater destabilizing effect than when they are located at the ends.
  • the stability is determined by the length, the number of mismatches, and external factors such as temperature, the ionic strength of the medium or the pH contributed by the solution in which the hybridization is performed. The longer the length, the lower the number of mismatches, The lower the ionic strength, the lower temperature and pH close to neutrality, the greater the stability of the hybrid.
  • FIGURES Figure 1 DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1.- General structure (shown as chemical structure and three-dimensional model) of the PNA molecules used in the invention, in which the three elements that constitute them are shown: a) the Cysteine provided by the thiol group reagent against gold; b) the spacer chain formed by two molecules of 8-amino-3, 6-dioxaoctanoic acid and total length of 3 nm; c) the ssPNA chain that acts as a biosensor sensing sequence or bait (only the first and last monomer of a PNA molecule with 11 monomers is shown in the scheme).
  • Figure 2. Images of AFM corresponding to the biosensor of the invention, obtained by immobilization of PNA P-G142 at a concentration of 1 ⁇ M on polycrystalline gold.
  • the profile of panel b) corresponds to the line marked in a).
  • panel c) an individual group of PNA molecules has been identified.
  • Figure 3. AFM images of biosensors obtained by immobilization of increasing concentrations of PNA. a) P-M41 at 0.1 ⁇ M concentration; b) and e): P-G142 at 0.5 ⁇ M concentration; d) P-G142 at 10 ⁇ M concentration.
  • the angles between the surface normal vector and the X-ray dollarization vector is 90 ° (dashed line) and 20 ° (solid line).
  • Figure 5. High resolution XPS spectra, normalized to the Au4f peak, corresponding to the NIs (a) and P2p (b) region. In both cases, the figures show the spectrum before (lower curve) and after (upper curve) of the Hybridization of the biosensor with a ssDNA target molecule perfectly complementary to the immobilized PNA.
  • Figure 6. Characterization of the biosensor of the invention, regarding the dependence of the concentration of immobilized ssPNA on the efficiency of hybridization to complementary ssDNA.
  • the variation of the NIs peak normalized to the Au4f peak (Nls / Au4F) obtained by XPS experiments is shown, depending on the concentration of the P-G142 PNA immobilized in the biosensor. In all cases, the concentration of the ssDNA hybridized to the biosensor has been 100 ⁇ M.
  • Figure 7. Value of the Nls / Au4f peak obtained in XPS experiments before and after hybridization of the biosensor to a perfectly complementary ssDNA target molecule (M) and another with a mutation or "mismatch" in its central position
  • MM The biosensor has been obtained with immobilized ssPNA at 1 ⁇ M concentration.
  • Columns 1 to 3 correspond to a biosensor with PNA P-G142, a hybridization buffer composed of 7 rtiM NaCl + 0.7 rtiM Na-citrate, pH 7.2, and a wash solution composed of 45 rtiM NaCl and 4.5 rtiM Na-citrate , pH 7.0. In these columns, it was also possible to quantify the P2p / Au4f peak obtained by means of high resolution XPS.
  • Columns 4 to 6 correspond to a biosensor with PNA P-M41, and the hybridization and washing solutions consisted of 60 rtiM NaCl + 6 rtiM Na-citrate + 0.72% laurylsarcosine.
  • Example 1 Manufacture of a biosensor of the invention with ssPNA on a gold surface with an arrangement in self-assembled monolayers.
  • P-G142 includes three triplets or codons that encode as many amino acids that constitute an antigenic determinant present in the protein capsid of the VP1 protein of FMDV (FMDV) (Martinez et al., 1997).
  • P-M41 contains codon number 41 of the reverse transcriptase gene of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-I), a position involved in resistance to the drug zidovudine (Yeni et al., 2002).
  • the cysteine anchored at the amino terminal end provides the thiol group (SH) that allows immobilization on gold surfaces.
  • the abbreviated spacer unit as "0-0" is 3.0 nm in length and corresponds to a dimer of the 8-amino-3, 6-dioxaoctanoic acid molecule.
  • the total length of the ssPNA has been estimated to be 7.1 nm (P-G142) and 6.4 nm (P-M41), considering a 4.2 nm loop helix with 13 base pairs per turn (Wittung et al., 1994; Eriksson et al., 1996).
  • the ssPNA immobilization experiments were carried out in a humid chamber at 22 ° C for 4 hours, on two substrates: layers of polycrystalline gold evaporated on glass and monocrystalline gold in orientation (111). After immobilization, the crystals were vigorously washed with water to avoid nonspecific adsorption of PNA molecules.
  • the structure analysis of adsorbed layers of ssPNA was performed using two complementary techniques: AFM and X-ray absorption (XANES).
  • the AFM experiments were performed with a NANOTEC equipment, in tapping or tapping mode and on air (Meyer, 1992).
  • the XANES experiments were performed using X-rays from the Super-ESCA line of the ELETTRA syncotron in Trieste (Italy), with angles of incidence on the 70 ° and 90 ° sample (Ertl, 1985).
  • High resolution XPS experiments were also performed, in the ELETTRA Super-ESCA line. In the XPS experiments, the resolution range (beam in the line + analyzer) of the spectrum was estimated at an approximate value of 80 meV. It has been proven that the samples were not damaged by X-ray radiation even after 48 hours of exposure.
  • Figure 2 shows AFM images of different samples of P-G142 obtained after immobilization of the molecule at 1 ⁇ M concentration in water.
  • the ordered protusions are 7 nm high with respect to the bare surface of gold and its width from 10 to 30 nm.
  • the radius of the AFM tip is around 20 nm, so the bumps can be interpreted as groups of molecules arranged perpendicular to the surface.
  • the apparent decrease in the length measured by AFM with respect to the theoretical length of the PNA (Fig. 1) may be related (apart from a certain degree of flexibility allowed by the skeleton of the PNA molecule) with a small inclination of the molecule on the gold surface, or due to the deformation of the layer of molecules induced by the tip of the AFM.
  • the actual height of the molecular layer adsorbed on the surface by the AFM tapping mode is an open topic, and deformations of up to 50% of the nominal value are often described for soft materials (Wang et al., 2001; Casero et al., 2003; Culha et al., 2003 ).
  • the sinuous structure of the ssPNA layers may be due to the free adsorption of molecules on the surface, with rotational symmetry around the molecular skeleton, which allows each molecule to find its closest neighbors for intermolecular interaction.
  • a systematic study has been carried out to quantify the dependence of the order with the immobilized PNA probe concentration.
  • 3a obtained with a concentration of 0.1 ⁇ M of ssPNA, shows a structure in the form of lines composed of segments with a length up to 10 nm (resolution of the AFM) distributed parallel to the crystallographic directions of the crystal surface. Two areas of clean gold are observed, from which the lines show an average height less than 1 nm, a value similar to that previously described for ssDNA by AFM (Lyubchenko et al., 1993). These ordered lines can be interpreted as individual molecules lying on the gold surface, joined by a sulfur atom and possibly the carbonyl or amino groups of some chemotabsorbed nucleic bases.
  • Fig. 3b was performed at a concentration of 0.5 ⁇ M of ssPNA: the layer is not complete and groups of molecules arranged foot form aligned islands, which are anchored to the top of the sides of the monoatomic steps of gold. It has been proven that these islands correspond to molecular layers of soft material through the use of force-distance curves.
  • Fig. 3c obtained at the same concentration, shows a wide area where the groups of molecules are aligned following the crystallographic directions, in three adjacent golden terraces.
  • ssPNA At concentrations of 1 ⁇ M ssPNA, images such as those shown in Fig. 2 are obtained. At higher concentrations of ssPNA, from 10 ⁇ M, images such as that shown in Fig 3c are obtained by AFM, in which by excess of material deposited unspecifically, the structure ordered in the form of SAM has been lost. These images suggest a mechanism of growth of the islands of groups of molecules from the walls of the steps, when the optimum immobilization concentrations are reached. This is also the reason for the alignment along the main crystallographic directions of the surface.
  • a mechanism is proposed in which the bioSAM formation of ssPNA in the biosensor of the invention takes place in two different steps: i) the ssPNA is condensed on the surface and adsorbed as individual lying molecules; ii) at a certain coating density a phase transition occurs and the skeleton of the molecule realign perpendicularly to the surface.
  • SAMs of alkanothiols A similar mechanism was described for SAMs of alkanothiols.
  • the spectrum can be decomposed into two narrow peaks corresponding to the molecular orbitals ⁇ * and one wide corresponding to the molecular orbitals ⁇ *.
  • the difference in energy between these peaks is in accordance with previously published DNA XANES on gold surfaces.
  • the angle between the polarization vector of the X-rays of the synchrotron source with respect to the molecular orbital that gives rise to the signal can increase or decrease a given transition.
  • randomly adsorbed molecules without preferential orientation produce matching spectra for different angles of incidence.
  • ordered molecules show clear differences between the spectrum obtained at different emission angles, which mainly influences the ratio of ⁇ * / ⁇ *.
  • the technologies of AFM and XANES support, by means of different evidences, a structural model of the biosensor of the invention in which the ssPNA molecules are self-assembled on gold surfaces in a manner similar to the alkanothiol molecules.
  • Example 2. Use of the biosensor of the invention for the identification and characterization of PNA-DNA hybridization, capable of discerning a point mutation or SNP.
  • the ability of the biosensor to detect hybridization between the immobilized ssPNA and a complementary ssDNA target has been studied, through a systematic series of XPS experiments.
  • the ssDNA target molecules designed and synthesized, 31 nucleotides in length correspond to the wild-type and mutant sequences of FMDV (G-142-31 and E142-31) or HIV-I (M41-31 and L41-31) (Martinez et al., 1997; Yeni et al., 2002), and are complementary to P-G142 or P-M41 in their 11 and 9 central bases, respectively.
  • G142-31 and M41-31 have perfect complementarity with the corresponding PNAs, while E142-31 and L41-31 have a mutation in the central nucleotide (transition G—> A and transversion A—> T r respectively).
  • Hybridization of the biosensor with DNA was performed, in the initial experiments, at low ionic strength, in a buffer solution containing 7 rtiM NaCl and 0.7 rtiM Na-citrate, pH 7.2.
  • the concentration of the ssPNA probe varied in different experiments from 1 to 100 ⁇ M, while the concentration of the ssDNA target was set at a value of 100 ⁇ M.
  • the hybridization time was 1 hour, and the temperature range tested was between 41 ° C to 58 ° C.
  • FIG. 5a A high resolution XPS spectrum for the NlS of 500 eV photon energy of a self-assembled layer of ssPNA is shown in Fig. 5a.
  • the maximum of the peak corresponding to NlS appears at 400.0 eV of ligation energy.
  • Ligation energy for a peptide skeleton has been found at 400.5 eV in (Vinnichenko et al., 2002) and that of the thymine nuclear base at 400.9 eV (Petrovykh et al., 2003) and a small increase in energy can be expected. for the nitrogen atoms of the different nucleotide bases.
  • Fig. 5a also shows the corresponding spectrum after hybridization with complementary DNA, quantifying a increase in the area of the normalized peak of NIs from 2.6 to 3.2 times after hybridization.
  • the number of N atoms per ssPNA molecule is 64, and for the complementary strand of DNA it is 116: therefore, an increase in the N signal by a factor of 2.8 could be expected for an approximate model based solely on in the counting of N.
  • hybridization of the ssDNA target to the biosensor causes the appearance of a clear phosphorus peak, contributed by the phosphate groups of the DNA and non-existent in the PNA, as shown in Fig. 5b.
  • This P2p signal together with a 2 to 3-fold increase in the NIs signal, is clear proof that hybridization of the complementary DNA with the PNA SAM has occurred, and allows the detection and quantification of the amount of nucleic acid Hybridized to the biosensor.
  • the combined use of XPS and AFM allows the construction of a model to explain the mechanism of action of the biosensor of the invention and its optimization.
  • 6a represents the peak of NIs normalized to Au4f obtained by XPS for different immobilization concentrations of ssPNA, before and after hybridization with complementary ssDNA. It is observed that the signal is proportional to the concentration of ssPNA on the surface, up to a saturation value of 10 ⁇ M corresponding to a complete blockage of the sites of adsorption available with neighboring ssPNA molecules. For concentrations between 0.1 and 1 micromolar, the increase in the N signal is around 3, which is equivalent to the value indicated above, which indicates the range at which the biosensor behaves optimally.
  • the surface is completely covered by the ssPNA and the XPS signal does not change after hybridization, indicating that the biosensor is saturated, outside its application range.
  • the Nls / Au4f peak after hybridization is even lower than for immobilized PNA, indicating that during hybridization and washing part of the strands of partially and nonspecifically immobilized ssPNA are removed or washed from the surface. Therefore, the biosensor has an optimal capacity when the ssPNA is immobilized at concentrations of up to 1 ⁇ M.
  • Fig. 6b shows typical AFM images corresponding to different immobilized layers and hybridizations, as indicated in Fig. 6a.
  • the biosensor's ability to discriminate between DNA target molecules that have a mutation has also been evaluated, in order to assess its usefulness for use in SNP detection experiments.
  • different hybridization and washing protocols were tested, under astringency conditions that allowed to reach an optimum in the specificity of the hybridization reaction. It has been determined that post-hybridization wash protocols based on an increase in ionic strength they do not allow a complete withdrawal of the target ssDNA that presents a mutation or SNP. However, the optimization of wash buffers so that detergent substances or denatured agents are included if they allow perfect discrimination between perfect hybridization (which is maintained after washing) and hybridization with a mutation in the central position (which is eliminated by washed) .
  • biosensor of the invention The specificity obtained with the biosensor of the invention is the greatest that can be achieved in biology and biotechnology, since it allows to differentiate between nucleic acid target molecules that differ in a single point mutation or SNP. In this sense, it is equivalent to the specificity recently obtained with conventional technologies (Brandt et al., 2003). Therefore, the biosensor of the invention (based on ssPNA SAMs) offers the possibility of being used for the identification of mutations and for mapping SNPs. These possibilities involve a wide range of applications in biotechnology and biomedicine.
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Abstract

La invención consiste en un biosensor obtenido mediante la inmovilización de moléculas de ácido nucleico peptidico (PNA) sobre superficies de oro, y sus aplicaciones en la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA) de interés biosanitario, medioambiental o alimentario. El procedimiento de construcción de dichos biosensores se basa en la posibilidad de inmovilizar de manera controlada moléculas de PNA con un extremo tiolado sobre superficies de oro monocristalino o policristalino, de forma que se originen monocapas autoensambladas (SAMs) . Este biosensor posee capacidad para unirse especif icamente a DNA complementario, con elevada sensibilidad y una especificidad tal que permite discriminar entre moléculas de DNA que se diferencian en una sola mutación o polimorfismo y no requieren el mareaje previo de la molécula diana que se analiza.

Description

TÍTULO
BIOSENSOR BASADO EN MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO PEPTÍDICO (PNA) SOBRE SUPERFICIES DE ORO, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se centra en los sectores de la biotecnologia y la nanotecnologia. La invención se relaciona, en general, con el procedimiento de obtención y aplicaciones de un biosensor basado en la inmovilización de moléculas de ácido nucleico peptidico (PNA) sobre superficies de oro. El biosensor puede ser aplicado en la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA) de interés biotecnológico, biosanitario humano o veterinario, medioambiental, agrario o alimentario.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En el ámbito de la biotecnologia ha supuesto un avance importante el desarrollo reciente de la tecnologia de microarrays de DNA, también llamados chips o microchips de DNA (Southern y col., 1994; para una revisión véase Nature Genetics 21, suplemento, 1999) , según la cual miles de sondas moleculares, principalmente oligonucleótidos, se pueden fijar covalentemente a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.) Mediante microarrays de DNA se pueden realizar experimentos de expresión génica, estudios de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) , minisecuenciación y tipado de microorganismos. Esta técnica explota la metodologia experimental desarrollada por E. Southern (Southern, 1975), según la cual los ácidos nucleicos se pueden fijar a un soporte sólido y formar hibridos estables con sus complementarios marcados radiactiva o fluorescentemente. La estabilidad de los hibridos viene determinada por el grado de complementariedad de la secuencia de nucleótidos y por factores externos tales como la fuerza iónica del medio, el pH o la temperatura. Es posible diseñar y sintetizar oligonucleótidos de DNA, por ejemplo de 10 a 30 nucleótidos de longitud, en los que alguna de sus posiciones, generalmente la posición central, difiere de la que está presente en la cadena complementaria de un gen determinado. Las secuencias de dicho gen (presentes en una muestra natural o de laboratorio) se marcan con radiactividad o con un compuesto fluorescente y se ponen en contacto con toda una bateria de oligonucleótidos idénticos de cuatro en cuatro excepto en la posición central o "posición interrogante", donde en cada uno de los cuatro aparece, respectivamente, el nucleótido A, C, G o T. En ciertas condiciones de fuerza iónica, pH y temperatura, sólo se formarán hibridos estables alli donde el apareamiento entre bases complementarias sea completo, es decir, no se produzca un desapareamiento en la posición central interrogante. Un resultado positivo en la hibridación identifica inmediatamente al nucleótido presente en la posición interrogada del gen (Hacia y col., 1998) . Si bien esta es la técnica más habitual para el estudio de SNPs mediante microarrays de DNA, se han descrito otras variantes metodológicas que proporcionan resultados comparables (Parinov y col., 1996; Hacia, 1999; Bulyk y col., 1999) .
A pesar de la generalización del empleo de microarrays de DNA para realizar estudios genéticos, la limitación principal de esta metodologia radica en la necesidad de marcar previamente (mediante reactivos fluorescentes o radiactivos) la molécula diana que se va a estudiar. De hecho, esto hace que el rendimiento global del método venga limitado por la eficiencia del proceso de mareaje, y por ello se han propuesto otras técnicas de detección para el trabajo con microarrays de DNA (Kambhampati y col., 2001; Buetow y col. , 2001) . Como alternativa al uso de microarrays, durante los últimos años se ha puesto a punto distintas tecnologias basadas en la cooperación entre los métodos de la biologia molecular y las técnicas de análisis de materiales desarrolladas por la fisica de superficies y la nanotecnologia. Una de las lineas más innovadoras en este área interdisciplinar va encaminada a la sintesis de monocapas autoensambladas (SAMs) de materiales biológicos sobre superficies metálicas, basándose en el hecho de que el autoensamblado y la autoorganización son las principales estrategias usadas por la naturaleza para construir sus agregados moleculares y maquinarias celulares a partir de sus unidades constituyentes (Ulman, 1991) . En particular, se ha dedicado mucho esfuerzo a la sintesis de SAMs de ácidos nucleicos sobre superficies metálicas, de forma que mantengan su capacidad para interaccionar con ácidos nucleicos complementarios .
Debido a su importancia tecnológica, se ha investigado en profundidad las monocapas formadas por moléculas de alcanotioles sobre superficies metálicas (Schreiber, 2000; Crain y col., 2001; Lehn, 2002), A partir de tales resultados se ha intentado la formación de SAMs de DNA tiolado sobre superficies de oro (Herne, 1997) . No obstante, los resultados han sido en general negativos, ya que el DNA tiende a formar estructuras globulares desordenadas sobre la superficie, cuya bioactividad queda muy reducida. Por otra parte, la formación de monocapas de DNA requiere siempre la co-inmovilización de moléculas espaciadoras de tioles, para dar lugar a capas moleculares mixtas o mezcladas (Herne y col., 1997; Wang y col., 2001; Culha y col., 2003; Casero y col., 2003) .
Por lo tanto, como alternativa al uso de DNA, diversas moléculas artificiales análogas de los ácidos nucleicos, más rigidas y carentes de carga eléctrica, podrian ser consideradas buenas candidatas para el crecimiento de SAMs bioactivas con eficiente capacidad de reconocimiento de ácidos nucleicos. Entre este tipo de moléculas similares al DNA destacan, por sus potenciales aplicaciones, los ácidos nucleicos peptidicos (PNAs) que son análogos de DNA aquirales y eléctricamente neutros, en los que el esqueleto de azúcar- fosfato ha sido reemplazado por un polimero de naturaleza peptidica formado por polimerización de N- (2- aminoetil) glicina, al cual las bases nucleicas están unidas mediante enlaces metilencarbonilo (Nielsen y col., 1991; Egholm y col., 1992; Egholm y col., 1993) .
El PNA se caracteriza por su capacidad para hibridarse de manera estable y especifica con DNA complementario, de acuerdo con las reglas de paridad de bases de Watson-Crick (Egholm y col., 1993) . De hecho, los PNAs de cadena sencilla (ssPNA) presentan mayor afinidad por el ssDNA complementario que el propio ssDNA de la misma secuencia. Esto se debe principalmente al carácter eléctricamente neutro del PNA, que evita fenómenos de repulsión entre cadenas (Nielsen y col., 1991; Wittung y col., 1994) . La alta afinidad del PNA por el DNA permite incluso la hibridación de ssPNA a DNA de cadena doble (dsDNA) mediante un proceso denominado "invasión de hebra" (Demidov y col., 1995; Nielsen, 2001; Demidov y col., 2002) y permite usar sondas de PNA para inducir recombinación y/o bloqueo especifico de genes concretos (Rogers y col., 2002) . Además, la interacción del PNA al DNA es muy especifica, y prácticamente para todos los pares de bases que pueden formarse, la diferencia en estabilidad térmica entre el apareamiento correcto y el incorrecto es mayor en un dúplex PNA-DNA que en el dúplex DNA-DNA (Egholm y col., 1993) . Por tanto, la diferencia de temperaturas a que se produce un apareamiento completo y uno en que una de las bases está desapareada es mayor en el caso PNA-DNA que en el DNA-DNA. Con ello, un biosensor en que las sondas inmovilizadas sean de PNA será potencialmente más eficiente que otro basado en DNA para la detección de mutaciones y SNPs en una molécula de ácido nucleico diana.
Por otra parte, dada la estructura de su esqueleto peptidomimético, el PNA no es sensible a la acción de enzimas biodegradadoras como DNasas, RNasas o proteasas, por lo que su estabilidad biológica es mucho mayor que la del DNA o RNA.
(Nielsen, 1999) . Finalmente, la insensibilidad del PNA a las variaciones de pH o de fuerza iónica hacen que posea también mucha mayor estabilidad quimica y ofrezca mayores posibilidades experimentales para su hibridación a distintas moléculas en diferentes composiciones del medio (Egholm y col., 1993; Kambhampati y col., 2001) .
Por todas estas razones, el PNA se está empleando cada vez más en diversos campos de la biotecnologia. Como ejemplo, recientemente se ha descrito la construcción de microarrays de PNA sobre vidrio activado quimicamente, siguiendo procedimientos análogos a los desarrollados en la tecnologia de microarrays de DNA (Matysiak y col., 2001) . Con ello, el estado de la técnica está suficientemente avanzado para el diseño y construcción de biosensores alternativos, basados en el uso de moléculas de PNA.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve La invención consiste en el desarrollo de un biosensor obtenido mediante la inmovilización de moléculas de ácido nucleico peptidico (PNA) sobre superficies de oro, y sus aplicaciones en la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA) de interés biosanitario, medioambiental o alimentario. El procedimiento de construcción de dichos biosensores se basa en la posibilidad de inmovilizar de manera controlada moléculas de PNA con un extremo tiolado sobre superficies de oro monocristalino o policristalino, de forma que se originen monocapas autoensambladas (SAMs) . El biosensor basado en SAMs de PNA pose capacidad para unirse especificamente a DNA complementario, con elevada sensibilidad y una especificidad tal que permite discriminar entre moléculas de DNA que se diferencian en una sola mutación o polimorfismo. El seguimiento de la actividad del biosensor se efectúa mediante técnicas de caracterización molecular como microscopia de fuerza atómica (AFM) y fotoemisión de rayos X (XPS) , que a diferencia de las técnicas empleadas en los microarrays de DNA convencionales no requieren el mareaje previo de la molécula diana que se analiza.
Descripción detallada
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas herramientas para la identificación de material y actividad biológica, y más concretamente nuevos biosensores con capacidad de unirse a ácidos nucleicos con elevada sensibilidad y especificidad.
La invención se basa en que los inventores han observado que es posible la inmovilización de PNAs de cadena sencilla
(ssPNAs) con un extremo tiolado a una superficie de oro, de forma que las moléculas de PNA se disponen como una estructura bidimensional ordenada y autoensamblada, que permite una correcta presentación de dicha molécula a moléculas de ácidos nucleicos diana. La hibridación del PNA inmovilizado y un ácido nucleico diana puede ser determinada mediante técnicas de fisica de superficies como la microscopia de fuerza atómica (AFM) o la fotoemisión de rayos X (XPS) (Ertl y col., 1985) sin que se requiera el mareaje de las moléculas de ácidos nucleicos diana. En concreto, la técnica de XPS permite detectar el evento de hibridación por el incremento en la señal de nitrógeno (el que aporta el DNA hibridado al que ya poseia el PNA inmovilizado) o por la aparición de una señal de fósforo (producida por los grupos fosfato del DNA o RNA diana, mientras que el PNA inmovilizado carecia de grupos funcionales con fósforo) . La especificidad del biosensor es tal que permite la identificación de un cambio de un nucleótido o mutación en el ácido nucleico diana.
En la presente invención se observa que a pesar de la longitud de hasta 7 nm de los PNAs, estas moléculas se ensamblan autónomamente de una forma ordenada sobre la superficie de oro, a través de un grupo tiol presente en el extremo de la molécula. Los PNAs autoensamblados se estabilizan sobre la superficie de oro mediante la interacción cadena-cadena por puentes de H y otros tipos de enlace no covalente entre nucleótidos no complementarios presentes en moléculas inmovilizadas vecinas. De esta forma, una realización práctica del biosensor consiste en un dispositivo formado por una placa que tipicamente tiene unas dimensiones de llxllxl mm, en una de cuyas caras mayores se ha depositado una monocapa de ssPNAs (Ejemplo 1) . Los inventores han demostrado que este biosensor es estable en aire (mantiene su estructura y funcionalidad durante al menos tres meses en aire tras su construcción) y altamente resistente a la radiación (es estable y bioactivo tras ser expuesto durante 48 horas a rayos X de una fuente sincrotrón con un flujo de 1012 fotones/cm2) . Además, las moléculas de PNA del biosensor mantienen su capacidad de reconocimiento de moléculas ssDNA complementario, lo que permite el uso de este dispositivo en la discriminación de dos moléculas de DNA diana que se diferencian únicamente en una mutación puntual ó SNP (Ejemplo 2) . Por tanto, un objeto de la presente invención lo constituye un biosensor útil para la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos diana, en adelante biosensor de la presente invención, que comprende una pequeña placa de material que aporta una superficie de oro como soporte físico con moléculas de ácido nucleico peptídico (PNA) dispuestas en monocapas autoensambladas inmovilizadas sobre ella y donde dicha molécula de PNA está constituida por los siguientes elementos, tal como se muestra en la Figura 1 : a) una zona de unión que proporciona un grupo tiol u otro grupo que aporte un átomo de azufre reactivo, que permite la unión de dicha molécula de PNA a la superficie de oro, b) una cadena espaciadora de naturaleza orgánica y lineal, que permita una separación física de la secuencia sensora de PNA y la superficie de oro, y c) una cadena de PNA que actúa como secuencia sensora o cebo del biosensor. El término "biosensor" se refiere a un dispositivo formado por moléculas biológicas o moléculas análogas a moléculas biológicas, preferentemente moléculas PNA, inmovilizadas sobre una superficie de oro que actúa como soporte físico, con capacidad para unirse o hibridarse específicamente a otras moléculas biológicas de forma que se pueda realizar un seguimiento del proceso de unión.
El término "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA) , ácido ribonucleico (RNA) o ácido nucleico peptídico (PNA) , de longitud igual o superior a 2 nucleótidos (abreviado como nt) que puede ser de cadena sencilla o cadena doble.
El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos, de 5- 250 nt (si son de cadena sencilla) o 5-250 pares de bases (si son de cadena doble) de longitud constituidos por secuencias de nucleótidos específicas que permiten una hibridación total o parcial con secuencias diana complementarias cuando se imponen unas condiciones definidas .
El término "diana" se refiere a una secuencia de ácido nucleico susceptible de hibridar con las sondas inmovilizadas en el biosensor. Por tanto, una realización particular de la invención lo constituye el biosensor de la invención en el que el ácido nucleico diana es un ácido desoxirribonucleico
(DNA) , o un ácido ribonucleico (RNA) o ácido nucleico peptidico (PNA) susceptibles de hibridar con las sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en un biosensor, preferentemente de PNA.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "ácido nucleico peptidico (PNA) " se refiere a una molécula análoga estructuralmente al DNA en la que el esqueleto estructural es un polimero de naturaleza peptidica formado por polimerización de N- (2-aminoetil) glicina, al cual las bases nucleicas están unidas mediante enlaces metilencarbonilo. En la presente invención la molécula PNA que actúa como sonda del biosensor puede tener una longitud de entre 4 y 250 monómeros, es decir, presentar otras tantas bases nitrogenadas, y poseer orientación "amino-carboxilo"
(N-C) o bien "carboxilo-amino" (C-N) (Nielsen y col., 1991;
Egholm y col., 1992; Egholm y col., 1993) . El PNA puede ser de cadena sencilla (ssPNA) o doble (dsPNA) . Por tanto, otra realización particular de la invención lo constituye el biosensor de la invención en el que la cadena de PNA que actúa como secuencia sensora o cebo del biosensor c) es de cadena sencilla (ssPNA) o doble (dsPNA) . Se define como "monocapa autoensamblada" o "self- assembled monolayer (SAM) " a una disposición de moléculas sobre una superficie, estabilizada de manera espontánea mediante enlaces covalentes entre dichas molécula y superpie
(Ulman, 1991) . Otra realización particular de la invención lo constituye el biosensor de la invención donde el soporte fisico, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, pertenece al siguiente grupo: un monocristal de cualquier metal noble o de silicio, bien sea de naturaleza monocristalina, en láminas delgadas o policristalina. Entre dichos metales nobles se encuentran, además del oro, los siguientes: plata, cobre, platino y algunas de sus aleaciones. A dichos metales nobles también se ha descrito, como en el caso del oro, la unión preferencial de moléculas a través un grupo tiol reactivo, dando lugar a monocapas autoensambladas (Schreiber, 2000) . En el caso del silicio, la unión de la molécula está promovida por un grupo funcional que contenga oxigeno, como por ejemplo el grupo alcohol (Ulman, 1991) . En todos los casos, la superficie del metal noble o de silicio a la que se unirán las moléculas de PNA para originar el biosensor podrá haber sido tratada con métodos fisico-quimicos de limpieza, como ultrasonidos, ácidos o disolventes. La superficie del metal noble o del silicio puede asimismo haber sido calentada durante entre 1 y 30 minutos a una temperatura de entre 500 y 700°C para promover la formación de terrazas en el material (Ulman, 1991) .
Otra realización particular de la invención en la cual dicho metal noble es el oro.
Otra realización particular de la invención lo constituye el biosensor de la invención donde la molécula de unión de a) es una molécula, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, perteneciente al siguiente grupo: Cisteina, Metionina, Metanotiol, Etanotiol y azufre elemental (Poirier y col., 1996; Schreiber, 2000; Lehn, 2002) .
Otra realización particular de la invención lo constituye el biosensor de la invención donde la molécula espaciadora de b) es una molécula, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, perteneciente al siguiente grupo: alcanos de entre 4 y 12 átomos de carbono, alquenos de entre 4 y 12 átomos de carbono, acido 8-amino- 3, 6-dioxaoctanoico, pudiendo estar cualquiera de ellos en una o más copias unidas en disposición cabeza-cola o cabeza- cabeza (Schreiber, 2000; Lehn, 2002) .
Una realización concreta de la invención lo constituye el biosensor de la invención que comprende una zona de unión que provee de un grupo tiol de a) constituida por una cisteina y una cadena espaciadora de naturaleza orgánica y lineal constituida por una molécula de ácido 8-amino-3,6- dioxaoctanoico.
Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de fabricación del biosensor de la invención, en adelante procedimiento de fabricación de la invención, caracterizado por las siguientes fases: a) Incubación con la superficie de oro de una solución de PNA en agua o cualquier tampón adecuado, a una concentración comprendida entre 1 picomolar (pM) y 100 milimolar (mM) , de forma que se logre la inmovilización ordenada de la molécula sobre la superficie de oro que actúa como soporte fisico y donde la temperatura de inmovilización puede variar entre 4°C y 80°C, y el tiempo de inmovilización entre 1 y 600 minutos, b) Lavado en agua o cualquier tampón adecuado del exceso de PNA inmovilizado inespecificamente sobre la superficie de oro, y c) Comprobación mediante técnicas de fisica de superficies de las caracteristicas estructurales de la capa de PNA inmovilizada.
Otra realización particular de la invención lo constituye el procedimiento de fabricación de la invención en el que la molécula de PNA puede tener una longitud de entre 4 y 250 bases nitrogenadas, puede tener orientación N-C o bien C-N y donde el PNA puede ser de cadena sencilla (ssPNA) o doble (dsPNA) .
Otra realización particular de la invención lo constituye el procedimiento de fabricación de la invención en el que la superficie de oro de a) puede ser aportada por un monocristal o bien por un policristal de oro (Schreiber, 2000) .
Otra realización particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde el soporte físico, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, se selecciona entre al siguiente grupo: una estructura en forma de lámina como la utilizada como soporte para los microchips o microarrays (ver Nature Genetics 21, suplemento, 1999) .
El procedimiento de fabricación de la presente invención puede ser llevado a cabo por un experto en la materia de fabricación de biosensores, microarrays o monocapas autoensambladas con la información descrita en la presente invención
Otra realización particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde la comprobación mediante técnicas de física de superficies de c) se lleva a cabo por una técnica perteneciente al siguiente grupo: microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía de efecto túnel (STM) , fotoemisión de rayos X (XPS) , absorción de rayos X (XANES) , fluorescencia de rayos X (XES) , y espectroscopia Auger (AES) .
Finalmente, otro objeto de la presente invención lo constituye el uso del biosensor de la invención en un procedimiento de detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos diana complementarios de interés biotecnológico, sanitario humano o veterinario, medioambiental, agrario o alimentario, que podrán ser complementarios total o parcialmente a la sonda de PNA inmovilizada sobre el oro y en los que el seguimiento del proceso de hibridación se realiza mediante técnicas de física de superficies, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: microscopía de fuerza atómica, microscopía de efecto túnel (STM) , fotoemisión de rayos X (XPS) , absorción de rayos X (XANES) , fluorescencia de rayos X (XES) y espectroscopia Auger (AES)
Otra realización particular de la invención lo constituye el uso del biosensor de la invención en el que el procedimiento de detección y caracterización de ácidos nucleicos consiste, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, en un estudio de expresión génica, un estudio de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) para la identificación de mutaciones, minisecuenciación y tipado de microorganismos (Parinov y col., 1996; Hacia y col., 1998;
Hacia, 1999; Bulyk y col., 1999; Matysiak y col., 2001) .
Definíclones A continuación se indican otras definiciones de términos relevantes utilizados en la presente invención:
El término "posición nucleotidica" se refiere al lugar que ocupa cada uno de los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico. Una "mutación" es una alteración de la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico respecto a otro que sirve de referencia. Dicha alteración puede ser una sustitución de un nucleótido por otro, una inserción o una deleción de uno o más nucleótidos . Se define "genoma tipo" o "genoma salvaje" como el genoma de un aislado de un organismo cuya secuencia está considerada por la comunidad cientifica como de tipo salvaje, y sirve como genoma de referencia para esa especie. Como ejemplo, en el caso concreto del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-I) , como genoma salvaje se considera la cepa HXB2 (número de acceso en la base de datos GenBank: K03455) . "Posición interrogada" es aquella posición nucleotidica de la secuencia de un ácido nucleico cuya composición se desea conocer.
Se define como "oligonucleótido salvaje" aquél que posee total identidad de secuencia con el genoma salvaje o genoma tipo correspondiente.
Se define como "oligonucleótido mutante" aquél que posee total identidad de secuencia con el genoma salvaje correspondiente, salvo en la/s posición/es interrogante/s, en las cuales posee la secuencia correspondiente a una cepa mutante en esa posición.
El término "hibridación" se refiere a un proceso mediante el cual, en unas condiciones definidas y adecuadas, dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos se unen mediante la formación de puentes de hidrógeno para formar ácidos nucleicos de cadena doble, según las reglas de apareamiento entre bases nitrogenadas .
"Hibridación total" o "hibridación 100%" se refiere a la hibridación que tiene lugar cuando todos los nucleótidos de una sonda u oligonucleótido aparean con una secuencia diana, o viceversa.
Un "desapareamiento" se produce cuando en al menos una posición determinada de un ácido nucleico de doble cadena, ambas cadenas poseen dos nucleótidos no complementarios . Un "hibrido" es el resultado del proceso de hibridación entre dos ácidos nucleicos de cadena sencilla. Los desapareamientos en las posiciones centrales tienen un efecto desestabilizador mayor que cuando se localizan en los extremos . La estabilidad viene determinada por la longitud, el número de desapareamientos, y los factores externos como la temperatura, la fuerza iónica del medio o el pH aportado por la solución en la que se realiza la hibridación. Cuanto mayor sea la longitud, menor el número de desapareamientos, menor la fuerza iónica, menor temperatura y pH cercano a la neutralidad, mayor será la estabilidad del hibrido.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Estructura general (mostrada como estructura quimica y modelo tridimensional) de las moléculas de PNA empleadas en la invención, en la que se muestra los tres elementos que las constituyen: a) la Cisteina que aporta el grupo tiol reactivo frente al oro; b) la cadena espaciadota formada por dos moléculas de ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico y longitud total de 3 nm; c) la cadena de ssPNA que actúa como secuencia sensora o cebo del biosensor (en el esquema se muestran únicamente el primer y último monómero de una molécula de PNA con 11 monómeros) . Figura 2.- Imágenes de AFM correspondientes al biosensor de la invención, obtenido por inmovilización de PNA P-G142 a concentración de lμM sobre oro policristalino. El perfil del panel b) corresponde a la linea marcada en a) . En el panel c) se ha señalado un grupo individual de moléculas de PNA. Figura 3.- Imágenes de AFM de biosensores obtenidos mediante inmovilización de concentraciones crecientes de PNA. a) P-M41 a concentración 0.1 μM; b) y e) : P-G142 a concentración 0.5 μM; d) P-G142 a concentración 10 μM. Figura 4.- Espectro de XANES, normalizado a la intensidad del pico σ*, en el rango de los picos de NIs. Se ha trabajado a diferentes ángulos de incidencia. Los ángulos entre el vector normal a la superficie y el vector de dolarización de los rayos X es de 90° (linea discontinua) y 20° (linea continua) . Figura 5.- Espectros de XPS de alta resolución, normalizados al pico de Au4f, correspondientes a la región del NIs (a) y P2p (b) . En ambos casos, las figuras muestran el espectro antes (curva inferior) y después (curva superior) de la hibridación del biosensor con una molécula diana de ssDNA perfectamente complementaria al PNA inmovilizado. Figura 6.- Caracterización del biosensor de la invención, en cuanto a la dependencia de la concentración de ssPNA inmovilizado en la eficiencia de la hibridación a ssDNA complementario. Se muestra la variación del pico de NIs normalizado al pico Au4f (Nls/Au4F) obtenido mediante experimentos de XPS, en función de la concentración del PNA P-G142 inmovilizada en el biosensor. En todos los casos, la concentración del ssDNA hibridado al biosensor ha sido de 100 μM.
Figura 7.- Valor del pico Nls/Au4f obtenido en experimentos de XPS antes y después de la hibridación del biosensor a una molécula diana de ssDNA perfectamente complementaria (M) y otra con una mutación o "mismatch" en su posición central
(MM) . El biosensor ha sido obtenido con ssPNA inmovilizado a concentración 1 μM. Las columnas 1 a 3 corresponden a un biosensor con PNA P-G142, un tampón de hibridación compuesto por 7 rtiM NaCl + 0.7 rtiM Na-citrato, pH 7.2, y una solución del lavado compuesta por 45 rtiM NaCl y 4.5 rtiM Na-citrato, pH 7.0. En estas columnas, se ha podido cuantificar también el pico P2p/Au4f obtenido mediante XPS de alta resolución. Las columnas 4 a 6 corresponden a un biosensor con PNA P-M41, y las soluciones de hibridación y lavado consistian en 60 rtiM NaCl + 6 rtiM Na-citrato + 0.72% laurylsarcosina.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1.- Fabricación de un biosensor de la invención con ssPNA sobre una superficie de oro con una disposición en monocapas autoemsambladas.
Se ha construido dos biosensores mediante la deposición de capas de dos distintos oligómeros de ssPNA modificados con una cisteina: P-G142, Cys-O-O-AATCCCCGCAT, y P-M41, Cys-O-O- GCCATCTCT (nombrados desde el grupo amino al grupo carboxilo terminal) . Estas secuencias fueron escogidas por su relevancia en virologia y medicina. P-G142 incluye tres tripletes o codones que codifican otros tantos aminoácidos que constituyen un determinante antigénico presente en la cápsida proteinica de la proteina VPl del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Martinez y col., 1997) . P-M41 contiene el codón número 41 del gen de la transcriptasa reversa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-I) , una posición implicada en la resistencia al fármaco zidovudina (Yeni y col., 2002) . La cisteina anclada en el extremo amino terminal proporciona el grupo tiol (SH) que permite la inmovilización sobre superficies de oro. La unidad espaciadora abreviada como "0-0" es de 3.0 nm de longitud y corresponde a un dimero de la molécula de ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico. La longitud total del ssPNA se ha estimado que es de 7.1 nm (P- G142) y 6.4 nm (P-M41) , considerando una hélice de bucle de 4.2 nm con 13 pares de bases por vuelta (Wittung y col., 1994; Eriksson y col., 1996) . Los experimentos de inmovilización de ssPNA fueron realizados en una cámara húmeda a 22°C durante 4 horas, sobre dos substratos: capas de oro policristalino evaporadas sobre vidrio y monocristal de oro en orientación (111) . Después de la inmovilización, los cristales fueron vigorosamente lavados con agua para evitar la adsorción inespecifica de moléculas de PNA.
El análisis de la estructura de capas adsorbidas de ssPNA se realizó mediante dos técnicas complementarias: AFM y absorción de rayos X (XANES) . Los experimentos de AFM se realizaron con un equipo NANOTEC, en modo de "tapping" o "golpeo" y al aire (Meyer, 1992) . Los experimentos de XANES se realizaron empleando rayos X procedentes la linea de Super-ESCA del sincotrón ELETTRA de Trieste (Italia) , con ángulos de incidencia sobre la muestra de 70° y 90° (Ertl, 1985) . También se realizaron experimentos de XPS de alta resolución, en la linea de Super-ESCA de ELETTRA. En los experimentos de XPS, el rango de resolución (haz en la linea + analizador) del espectro fue estimado en un valor aproximado de 80 meV. Se ha comprobado que las muestras no fueran dañadas por la radiación de rayos X incluso después de 48 horas de exposición.
La figura 2 muestra imágenes de AFM de diferentes muestras de P-G142 obtenidas después de la inmovilización de la molécula a concentración 1 μM en agua. Las protusiones ordenadas tienen 7 nm de altura respecto a la superficie descubierta de oro y su anchura de 10 a 30 nm. El radio de la punta de AFM es de en torno a 20 nm, por lo que las protuberancias pueden ser interpretadas como grupos de moléculas dispuestas perpendicularmente a la superficie. La disminución aparente de la longitud medida por AFM con respecto a la longitud teórica del PNA (Fig. 1) puede estar relacionada (aparte de con cierto grado de flexibilidad permitido por el esqueleto de la molécula de PNA) con una pequeña inclinación de la molécula sobre la superficie de oro, o bien debido a la deformación de la capa de moléculas inducida por la punta del AFM. Se debe tener en cuenta, que ambos efectos han sido anteriormente observados e inclinaciones de en torno a 30° han sido descritos en el caso de SAMs de alcanotioles (Schreiber, 2000; Lehn, 2002) . La inclinación en las cadenas de ssPNA podria facilitar la interacción cadena-cadena mendiante puentes de hidrógeno entre bases nucleicas no complementarias, emplazadas en diferentes posiciones de la cadena. Esta estabilización entre moléculas mediante contacto lateral promueve la formación y mantenimiento del patrón ordenado. Además, la altura real de la capa molecular adsorbida sobre la superficie mediante el modo de "tapping" de AFM es un tema abierto, y deformaciones de hasta un 50% del valor nominal son a menudo descritas para materiales blandos (Wang y col., 2001; Casero y col., 2003; Culha y col., 2003) . La estructura sinuosa de las capas de ssPNA puede ser debida a la libre adsorción de moléculas sobre la superficie, con una simetria rotacional alrededor del esqueleto molecular, lo que permite a cada molécula encontrar sus vecinos más próximos para la interacción intermolecular. Se ha realizado un estudio sistemático para cuantificar la dependencia del ordenamiento con la concentración de sonda de PNA inmovilizada. Algunos de los representativos resultados se muestran en la Figura 3. La Fig. 3a, obtenida con una concentración de 0.1 μM de ssPNA, muestra muestra una estructura en forma de lineas compuestas por segmentos de una longitud hasta 10 nm (resolución del AFM) distribuidas paralelamente a las direcciones cristalográficas de la superficie del cristal. Se observan dos zonas de oro limpio, desde las cuales las lineas muestran una altura promedido menor de 1 nm, un valor similar al previamente descrito para ssDNA mediante AFM (Lyubchenko y col., 1993) . Estas lineas ordenadas pueden ser interpretadas como moléculas individuales tumbadas sobre la superficie de oro, unidas mediante un átomo de azufre y posiblemente los grupos carbonilo o amino de algunas bases nucleicas quimiadsorbidas . Diferentes grupos de experimentos muestran una transición en la estructura del biosensor desde moléculas individuales tumbadas sobre la superficie a grupos de moléculas dispuestas casi perpendicularmente o "de pie" (con un ángulo de aproximadamente 70°C) sobre la superficie de oro, una transición favorecida por el incremento de concentración. La Fig. 3b fue realizada a una concentración de 0.5 μM de ssPNA: la capa no está completa y grupos de moléculas dispuestas de pie forman islas alineadas, que están ancladas a la parte superior de los lados de los escalones monoatómicos del oro. Se ha comprobado que estas islas corresponden a capas moleculares de material blando mediante el uso de curvas fuerza-distancia. La Fig. 3c, obtenida a la misma concentración, muestra una amplia área donde los grupos de moléculas están alineados siguiendo las direcciones cristalográficas, en tres terrazas de oro adyacentes. A concentraciones de ssPNA de 1 μM se obtiene imágenes como las mostradas en la Fig. 2. A concentraciones mayores de ssPNA, a partir de 10 μM, se obtienen por AFM imágenes como la mostrada en la Fig 3c, en las cuales por un exceso de material depositado inespecificamente se ha perdido la estructura ordenada en forma de SAM. Estas imágenes sugieren un mecanismo de crecimiento de las islas de grupos de moléculas desde las paredes de los escalones, cuando se va llegando a las concentraciones de inmovilización óptimas. Esta es también la razón del alineamiento a lo largo de las principales direcciones cristalográficas de la superficie. Por consiguiente, se propone un mecanismo en el cual la formación de bioSAM de ssPNA en el biosensor de la invención tiene lugar mediante dos diferentes etapas: i) el ssPNA se condensa sobre la superficie y es adsorbido como moléculas individuales tumbadas; ii) a cierta densidad de recubrimiento se produce una transición de fase y el esqueleto de la molécula se realinea perpendicularmente a la superficie. Un mecanismo similar fue descrita para SAMs de alcanotioles
(Poirier y col., 1996) y ello demuestra la importancia de la interacción molécula-molécula en los fenómenos de autoensamblado molecular. Cabe destacar que el incremento de recubrimiento favorece el reordenamiento de las SAMs de PNAs en la conformación de moléculas de pie sin que se requiera añadir alcanotioles u otras moléculas coadyuvantes que den lugar a monocapas mixtas, como ha sido descrito para el ssDNA (Herne, 1997; Culha, 2003) y ssPNA en experimentos anteriores (Ozkan y col., 2002) . Imágenes de AFM obtenidas en solución acuosa muestran morfologias similares a las mostradas en las Figs . 2 y 3, si bien las moléculas tumbadas no han sido detectadas . Esto indica que los puentes de hidrógeno entre los ssPNA y las moléculas de agua podrian favorecer una geometria de moléculas de pie incluso, para moléculas individuales a bajo grado de recubrimiento. Este modelo estructural, derivado de las diferentes experimentos con imágenes de AFM, es sorprendente debido a la extraordinaria longitud de la molécula de PNA inmovilizada que genera la SAM con respecto a SAMs de alcanotioles, que tienen un rango tipico de 0.2 a 2.5 nm de altura (Schreiber, 2000; Lehn, 2002) . Para verificar la orientación preferencial de las moléculas obtenida por AFM se han realizado medidas mediante la técnica de XANES. La evolución de espectros XANES de las SAMs de PNA a concentración 1 μM fue medida en el rango del nitrógeno a distintos ángulos de incidencia (Fig. 4) . El espectro puede ser descompuesto en dos picos estrechos correspondientes a los orbitales moleculares π* y uno ancho correspondiente a los orbitales moleculares σ* . La diferencia de energia entre estos picos está de acuerdo con previamente publicado XANES de DNA sobre superficies de oro. El ángulo entre el vector de polarización de los rayos X de la fuente sincrotrón con respecto al orbital molecular que da lugar a la señal puede aumentar o disminuir una determinada transición. Asi, moléculas adsorbidas aleatoriamente y sin orientación preferencial producen espectros coincidentes para diferentes ángulos de incidencia. Por el contrario, moléculas ordenadas muestran diferencias claras entre el espectro obtenido a diferentes ángulos de emisión, lo cual principalmente influye en el ratio de π* /σ*. Esta metodologia ha sido usada para encontrar orientaciones preferenciales en el alineamiento de cristales liquidos (Stohr y col., 2001) y para glicina seca (Gordon y col., 2003) . En este caso, los picos π* aumentan cuando el vector de polarización de los rayos X se aproxima a una incidencia normal a la superficie. Como la mayoria de los orbitales π* están ubicados a lo largo del esqueleto del PNA, mientras que los orbitales σ* son paralelos a los planos de las bases nucleicas, los resultados indican que los ejes de la molécula de PNA están perpendiculares a la superficie del oro, lo que corrobora el patrón de ordenamiento observado por AFM (Figs. 2 y 3) . Por consiguiente, las tecnologias de AFM y XANES apoyan, mediante evidencias diferentes, un modelo estructural del biosensor de la invención en el que las moléculas ssPNA se autoensamblan sobre superficies de oro de manera similar a las moléculas de alcanotioles .
Dos razones principales pueden tenerse en cuenta para explicar la ventaja clara del ssPNA sobre el ssDNA en la formación de SAMs: i) el esqueleto de PNA no está cargado eléctricamente, lo que evita las repulsiones electrostáticas entre moléculas vecinas (Nielsen y col., 1991; Egholm y col., 1993) ; ii) la molécula de PNA es mas rigida que la de DNA debido a los grupos amida planos de su esqueleto de poliamida (Nielsen y col., 1991), y las restricciones en su flexibilidad conformacional con respecto a la del ssDNA ha sido confirmada recientemente (Menchise y col., 2003) . Ejemplo 2.- Empleo del biosensor de la invención para la identificación y caracterización de la hibridación PNA-DNA, capaz de discernir una mutación puntual o SNP. Se ha estudiado la capacidad del biosensor para detectar la hibridación entre el ssPNA inmovilizado y una diana de ssDNA complementario, mediante una serie sistemática de experimentos de XPS. Las moléculas diana de ssDNA diseñadas y sintetizadas, de 31 nucleótidos de longitud, corresponden con las secuencias de tipo salvaje y mutante de FMDV (G-142- 31 y E142-31) o HIV-I (M41-31 y L41-31) (Martinez y col., 1997; Yeni y col., 2002), y son complementarias de P-G142 o P-M41 en sus 11 y 9 bases centrales, respectivamente. G142-31 y M41-31 poseen complementariedad perfecta con los PNAs correspondientes, mientras que E142-31 y L41-31 tienen una mutación en el nucleótido central (transición G—>A y transversión A—>Tr respectivamente) . La hibridación del biosensor con el DNA fue realizada, en los experimentos iniciales, a baja fuerza iónica, en una disolución tampón que contiene 7 rtiM NaCl y 0.7 rtiM Na-citrato, pH 7.2. La concentración de la sonda de ssPNA varió en distintos experimentos desde 1 a 100 μM, mientras que la concentración de la diana de ssDNA fue fijada en un valor de 100 μM. El tiempo de hibridación fue de 1 hora, y el rango de temperaturas ensayado estuvo comprendido entre 41°C a 58°C.
Un espectro de XPS de alta resolución para el NlS de 500 eV de energia de fotón de una capa autoensamblada de ssPNA se muestra en la Fig. 5a. El máximo del pico correspondiente a NlS aparece a 400.0 eV de energia de ligadura. La energia de ligadura para un esqueleto peptidico ha sido encontrada a 400.5 eV en (Vinnichenko y col., 2002) y la de la base nucleica timina a 400.9 eV (Petrovykh y col., 2003) y un pequeño incremento de energia puede ser esperado para los átomos de nitrógeno de las diferentes bases nucleotidicas . La forma general del pico de nitrógeno es muy parecida a la recientemente publicada para el DNA (Petrovykh y col., 2003) con una pequeña componente a la izquierda del espectro que puede estar relacionada con moléculas de PNA tumbadas sobre el sustrato de oro e interaccionando con él. La Fig. 5a muestra también el espectro correspondiente después de la hibridación con DNA complementario, cuantificándose un incremento en el área del pico normalizado de NIs de 2.6 a 3.2 veces después de la hibridación. El número de átomos de N por molécula de ssPNA es de 64, y para la hebra complementaria de DNA es de 116: por consiguiente, un incremento de la señal de N en un factor de 2.8 podria ser el esperado para un modelo aproximado basado únicamente en el reucuento de átomos de N. Asi, existe un buen acuerdo entre el incremento esperado en la señal de nitrógeno y el resultado obtenido experimentalmente, lo que sugiere que para condiciones óptimas la fracción de ssPNA hibridado con la diana de ssDNA es cercana al 100%. Este valor muestra la elevada eficiencia del biosensor de la invención, y es claramente superior al encontrado para la hibridación de DNA- DNA medida con las mismas técnicas (Casero y col., 2003; Petrovykh y col., 2003) .
Además, la hibridación de la diana de ssDNA al biosensor produce la aparición de un pico claro de fósforo, aportado por los grupos fosfato del DNA e inexistente en el PNA, tal como se muestra en la Fig. 5b. Esta señal de P2p, junto con un aumento de 2 a 3 veces la señal de NIs, es una prueba clara de que ha ocurrido la hibridación del complementario DNA con la SAM de PNA, y permite la detección y cuantificación de la cantidad de ácido nucleico hibridado al biosensor. El uso combinado de XPS y de AFM permite construir un modelo para explicar el mecanismo de actuación del biosensor de la invención y su optimización. La Fig. 6a representa el pico de NIs normalizado a Au4f obtenido por XPS para diferentes concentraciones de inmovilización de ssPNA, antes y después de la hibridación con ssDNA complementario. Se observa que la señal es proporcional a la concentración de ssPNA sobre la superficie, hasta un valor de saturación de 10 μM que corresponde a un bloqueo completo de los sitios de adsorción disponibles con moléculas ssPNA vecinas. Para concentraciones entre 0.1 y 1 micromolar el aumento de la señal de N es de en torno a 3, lo que equivale al valor indicado anteriormente, que indica el rango el que el biosensor se comporta ótpimamente. Para concentraciones más altas de 5 μM, la superficie esta completamente cubierta por el ssPNA y la señal de XPS no cambia después de la hibridación, indicando que el biosensor está saturado, fuera de su rango de aplicación. Además, a estas concentraciones de saturación, el pico Nls/Au4f después de la hibridación es incluso menor que para el PNA inmovilizado, lo que indica que durante la hibridación y lavado parte de las hebras de ssPNA parcial e inespecificamente inmovilizadas son eliminadas o lavadas de la superficie. Por consiguiente, el biosensor presenta una capacidad óptima cuando el ssPNA se inmoviliza a concentraciones de hasta 1 μM. La Fig. 6b muestra imágenes tipicas de AFM correspondientes a diferentes capas inmovilizadas e hibridazas, tal y como se indican en la Fig. 6a. Se observa que tanto el biosensor después de la hibridación (II en Fig. 6) como el biosensor sin hibridar pero en el que el PNA se ha inmovilizado a concentraciones superiores al rango de empleo del biosensor (III en Fig. 6) muestran morfologias compactas y cerradas en vez de las SAMs tipicas del biosensor antes de hibridar y con ssPNA inmovilizado en concentración óptima (I en Fig. 6) .
También se ha evaluado la capacidad del biosensor para discriminar entre moléculas diana de DNA que tienen una mutación, de cara a evaluar su utilidad para emplearlo en experimentos de detección de SNPs . Para ello se probaron diferentes protocolos de hibridación y lavado, en condiciones de astringencia que permitieran llegar a un óptimo en la especificidad de la reacción de hibridación. Se ha determinado que los protocolos de lavado de posthibridación basados en un incremento de la fuerza iónica no permiten una retirada completa del ssDNA diana que presenta una mutación o SNP. Sin embargo, la optimización de los tampones de lavado de forma que se incluyan sustancias detergentes o agentes desnaturalizados si permiten una perfecta discriminación entre hibridación perfecta (que se mantiene tras el lavado) e hibridación con una mutación en la posición central (que es eliminada por lavado) . En concreto, se ha logrado una especificidad total empleando como solución de hibridación y lavado una compuesta por 60 rtiM NaCl + 6 rtiM Na-citrato + 0.72% laurylsarcosina. Estos resultados se muestran en la Fig. 7.
La especificidad obtenida con el biosensor de la invención es la mayor que se puede conseguir en biologia y biotecnologia, puesto que permite diferenciar entre moléculas diana de ácidos nucleicos que se diferencian en una única mutación puntual o SNP. En este sentido, es equivalente a la especificidad recientemente obtenida con tecnologias convencionales (Brandt y col., 2003) . Por lo tanto, el biosensor de la invención (basado en SAMs de ssPNA) ofrece la posibilidad de ser empleado para la identificación de mutaciones y para realizar mapeos de SNPs. Estas posibilidades suponen un amplio rango de aplicaciones en biotecnologia y biomedicina.
Referencias
A continuación se muestra un listado de las referencias citadas en el texto:
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Biosensor útil para la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos diana caracterizado porque comprende una pequeña placa de material que aporta una superficie de oro como soporte fisico con moléculas de ácido nucleico peptidico (PNA) dispuestas en monocapas autoensambladas inmovilizadas sobre ella y donde dicha molécula de PNA está constituida por los siguientes elementos, (la Figura 1) : a) una zona de unión que proporciona un grupo tiol u otro grupo que aporte un átomo de azufre reactivo, que permite la unión de dicha molécula de PNA a la superficie de oro, b) una cadena espaciadora de naturaleza orgánica y lineal, que permita una separación fisica de la secuencia sensora de PNA y la superficie de oro, y c) una cadena de PNA que actúa como secuencia sensora o cebo del biosensor.
2.- Biosensor según la reivindicación 2 caracterizado porque el ácido nucleico diana es una secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA) , ácido ribonucleico (RNA) o ácido nucleico peptidico (PNA) , de longitud igual o superior a 2 nts que puede ser de cadena sencilla o cadena doble.
3.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque la molécula PNA puede tener una longitud de entre 4 y 250 bases nitrogenadas, y tener orientación amino-carboxilo (N-C) o bien carboxilo-amino (C-N) y ser de cadena sencilla (ssPNA) o doble (dsPNA) .
4.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque el átomo reactivo citado en el apartado a) es el azufre, y está aportado por un grupo alcohol u otro grupo quimico que contenga oxigeno,
5.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque el átomo reactivo citado en el apartado a) es el oxigeno, y está aportado por un grupo alcohol u otro grupo químico que contenga oxígeno.
6.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque la molécula de unión de a) es una molécula perteneciente al siguiente grupo: Cisteina, Metionina, Metanotiol, Etanotiol y azufre elemental.
7.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque la molécula espaciadora de b) es una molécula perteneciente al siguiente grupo: alcanos de entre 4 y 12 átomos de carbono, alquenos de entre 4 y 12 átomos de carbono, acido 8- amino-3, 6-dioxaoctanoico, pudiendo estar cualquiera de ellos en una o más copias unidas en disposición cabeza-cola o cabeza-cabeza.
8.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque la zona de unión que provee de un grupo tiol de a) constituida por una cisteina y una cadena espaciadora de naturaleza orgánica y lineal constituida por una molécula de ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico.
9.- Biosensor según la reivindicación 1 caracterizado porque el soporte fisico pertenece al siguiente grupo: un monocristal de cualquier metal noble o de silicio, bien sea de naturaleza monocristalina, en láminas delgadas o policristalina.
10.- Biosensor según la reivindicación 9 caracterizado porque el metal noble pertenece al siguiente grupo: oro, plata, cobre, platino y sus aleaciones.
11.- Biosensor según la reivindicación 9 caracterizado porque el metal noble es el oro.
12.- Biosensor según la reivindicación 11 caracterizado porque el oro está constituida por una superficie de oro monocristalino cristalino o policristalino.
13.- Procedimiento de fabricación del biosensor ;ΛO - ^V^ reivindicaciones 1 a la 12 caracterizado por las siguientes fases : a) Incubación con la superficie del metal noble o de silicio de una solución de PNA en agua o cualquier tampón adecuado, a una concentración comprendida entre 1 picomolar
(pM) y 100 milimolar (mM) , de forma que se logre la inmovilización ordenada de la molécula sobre la superficie del metal noble o de silicio puede ser aportada por un monocristal o bien por un policristal y donde la temperatura de inmovilización puede variar entre 4°C y 800C, y el tiempo de inmovilización entre 1 y 600 minutos, b) Lavado en agua o cualquier tampón adecuado del exceso de PNA inmovilizado inespecificamente sobre la superficie del metal noble o de silicio, y c) Comprobación mediante técnicas de fisica de superficies de las caracteristicas estructurales de la capa de PNA inmovilizada.
14.- Procedimiento de fabricación según la reivindicación 13 caracterizado porque la molécula de PNA puede tener una longitud de entre 4 y 250 bases nitrogenadas, puede tener orientación N-C o bien C-N y donde el PNA puede ser de cadena sencilla (ssPNA) o doble (dsPNA) .
15.- Procedimiento de fabricación según la reivindicación 13 caracterizado porque el metal noble es oro.
16.- Procedimiento de fabricación según la reivindicación 15 caracterizado porque el oro es aportado por un monocristal o bien por un policristal de oro.
17.- Procedimiento de fabricación según la reivindicación 13 caracterizado porque el soporte fisico se selecciona entre al siguiente grupo: una estructura en forma de lámina como la utilizada como soporte para los microchips o microarrays .
18.- Procedimiento de fabricación según la reivindicación 13 caracterizado porque la comprobación mediante técnicas de fisica de superficies de c) se lleva a cabo por una técnica perteneciente al siguiente grupo: microscopia de fuerza atómica (AFM) , microscopia de efecto túnel (STM) , fotoemisión de rayos X (XPS) , absorción de rayos X (XANES) , fluorescencia de rayos X (XES) , y espectroscopia Auger (AES) .
19.- Uso del biosensor según las reivindicaciones 1 a la 12 en un procedimiento de detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos diana complementarios de interés biotecnológico, sanitario humano o veterinario, medioambiental, agrario o alimentario.
20.- Uso según la reivindicación 19 caracterizado porque el procedimiento de detección y caracterización de ácidos nucleicos pertenece al siguiente grupo: un estudio de expresión génica, un estudio de polimorfismos de nucleótidos
(SNPs) para la identificación de mutaciones, minisecuenciación y tipado de microorganismo.
21.- Uso del biosensor según la reivindicación 19 caracterizado porque las moléculas de ácido nucleico son complementarios total o parcialmente a la sonda de PNA inmovilizada sobre el oro.
22.- Uso del biosensor según la reivindicación 19 caracterizado porque el seguimiento del proceso de hibridación se realiza mediante técnicas de fisica de superficies .
23.- Uso del biosensor según la reivindicación 22 caracterizado porque la técnica de fisica de superficies pertenece al siguiente grupo: microscopia de fuerza atómica, microscopia de efecto túnel (STM) , fotoemisión de rayos X
(XPS) , absorción de rayos X (XANES) , fluorescencia de rayos X
(XES) y espectroscopia Auger (AES)
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