JP2001512975A - 遺伝子シークエンサーおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子シークエンサー、バイオ−コンパクトディスク及び試料調製法が記載される。一定長オリゴヌクレオチドが調製され、そして記載されるバイオコンタクトディスク及び装置と共に、遺伝子シーケンシング及びそのためのストラテジーにおいて使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子シークエンサーおよび方法 産業上の利用分野 本発明は、一般に、遺伝子シーケンシングの分野に関する。特に本発明は、遺 伝子シークエンサー、それを用いると有用な高密度バイオコンパクトディスクお よびその試料調製方法に関する。高密度バイオコンパクトディスクおよび試料調 製方法は、オリゴヌクレオチドシーケンシングおよびＤＮＡシーケンシングなら びに一般的検出に用途を有する。 発明の要約 一局面において、本発明はオリゴヌクレオチド断片を含有する試料からｎ−ｍ ｅｒオリゴヌクレオチドを得るための試料調製方法であって、（ａ）支持体の表 面に付着された考え得るすべてのｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを有する固体支 持体を形成し；（ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体を、試料オリゴヌクレ オチドが固体支持体上の相補的ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ する条件下で、該試料と接触せしめ；（ｃ）工程（ｂ）から得られる固体支持体 を加水分解剤と接触させて；（ｄ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドから 未結合オリゴヌクレオチドを分離し；そして（ｅ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅ ｒオリゴヌクレオチドを変性して試料のｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る（ ここで、ｎは４〜１０，０００から、最も有益には６〜２８から選択される整数 である）工程を含んで成る方法を特徴とする。 別の局面では、本発明はオリゴヌクレオチド断片を含有する試料 からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得るための方法であって、（ａ）試料中の オリゴヌクレオチドと結合するよう適合された固体支持体を試料の少なくとも一 部と接触させ；（ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体を、ｎ−ｍｅｒオリゴ ヌクレオチドが固体支持体上で相補的ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとハイブリ ダイズするのに十分な時間、ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混合物と接触させ 、；（ｃ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドをハイブリダイズ していないオリゴヌクレオチドから分離し；（ｄ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅ ｒオリゴヌクレオチドを変性して、試料中に存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒ オリゴヌクレオチドを得る（ここで、ｎは４〜１０，０００から、最も好ましく は６〜２８から選択される整数である）工程を含んで成る方法を特徴とする。 さらに別の局面では、試料調製方法には、オリゴヌクレオチド断片を含有する 試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る方法であって、（ａ）試料からの オリゴヌクレオチドをその上に結合している固体支持体を、（ｋ＋ｍ）−ｍｅｒ （ここで、ｋ＋ｍ＝ｎ）を有する複数のオリゴヌクレオチドと、各々がｋ−ｍｅ ｒであり、その３‘末端に遊離ヒドロキシル基を有さない複数の第一のオリゴヌ クレオチドと、各々がｍ−ｍｅｒであり、その５’末端に遊離リン酸基を有さな い複数の第二のオリゴヌクレオチドとの混合物と接触させ；（ｂ）工程（ａ）か ら得られる固体支持体上でオリゴヌクレオチドを連結せしめ；（ｃ）連結されな いオリゴヌクレオチドを固体支持体から除去し；そして（ｄ）固体支持体上に残 存するハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを変性して、試料中に 存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る（ここで、ｋおよ びｎは６〜１０，０００から、最も好ましくは１２〜４０から選択される整数で あるが、但し、ｋ＋ｍ＝ｎ）； 工程を含んで成る方法が含まれる。 さらに別の局面では、試料調製方法には、オリゴヌクレオチド断片を含有する 試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る方法であって、（ａ）試料からの 複数のオリゴヌクレオチドをその上に結合している固体支持体を、各々３’−お よび５’−末端にリン酸基を有する複数のｈ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドと、３ ’末端にヒドロキシル、アミノまたはチオール基を有し、末端リン酸基を有さな い複数のｉ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドと、５’末端にヒドロキシル、アミノま たはチオール基を有し、末端リン酸基を有さない複数のｊ−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドと、の混合物と接触させ；（ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体上で オリゴヌクレオチドを化学的または酵素的に連結し；（ｃ）連結されないオリゴ ヌクレオチドを工程（ｂ）から得られる固体支持体から除去し；そして（ｄ）固 体支持体上に残存するハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを変性 して、試料中に存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る（ ここで、ｈ、ｉおよびｊは各々６〜１０，０００から、最も好ましくは１８〜６ ０から選択される整数であるが、但し、ｈ＋ｉ＋ｊ＝ｎ）、工程を含んで成る方 法が含まれる。 本発明のさらに別の局面では、スペーサー分子に付着されるよう適合された表 面上の複数の別々の領域を含めた表面を有する基質；別々の領域の各々で前記の 表面に第一の末端で付着される複数のスペーサー分子であって、その各々がその 第二の末端で金属表面または標識に付着されるよう適合され、その各々が、切断 され得るその第一の末端と第二の末端との間の部位を有するスペーサー分子；切 断部位とスペーサー分子の第一の末端との間で実質的にすべてのスペーサー分子 に付着された第一の配列を有する第一のｎ−ｍｅｒオ リゴヌクレオチド（ここで、基質の表面上の他の別々の領域は、そこに付着した 第一の配列を有するｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを有するスペーサー分子を実 質的に含有せず、ｎは４〜１０，０００の、最も好ましくは６〜２８の整数から 選択される整数である）を有する検定要素が記載される。 本発明は試料中に存在すると推定される遺伝子の（ｐ＋ｑ＋ｒ）−ｍｅｒセグ メントを決定するための方法であって、（ａ）試料、およびｑ−ｍｅｒオリゴヌ クレオチドの考え得るすべての配列を有するｑ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混 合物、または場合によってはこのような考え得るすべての配列のサブセットの溶 液を生成し；（ｂ）検定要素を工程（ａ）の溶液の少なくとも一部と接触させ、 ここで、前記検定要素は表面および表面に結合した複数のスペーサー分子を有し 、該スペーサー分子は表面に結合した第一の末端および金属表面または標識に結 合した第二の末端、及び第一の末端と第二の末端との間にある切断部位を有し、 スペーサー分子はさらに切断部位と第一の末端との間でそこに付着した第一のｐ −ｍｅｒオリゴヌクレオチド、及び切断部位と第二の末端との間でそこに付着し た第二のｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを有し、ｐ−ｍｅｒとｒ−ｍｅｒとの組 合せが、ｐ−ｍｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド のすべての組合せ、または場合によっては、すべてのこのような組合せのサブセ ットを含み、ｐ−ｍｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配列の特定の組 合せの各々が表面上の予定位置にあり；（ｃ）付着した生じたハイブリダイズし たオリゴヌクレオチドを前記の工程（ｂ）から得られるスペーサー分子に連結し ；（ｄ）表面上の各予定位置でのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの特定 の配列の組合せの存在または非存在を検出し；そして（ｅ）工程（ｄ）から得ら れる配列情報をプロセッシ ングして試料中に存在する（ｐ＋ｑ＋ｒ）−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配列を 推定する（ここで、ｐ、ｑおよびｒは４〜１０，０００の、最も好ましくは６〜 ２６の整数から選択される整数であり、そして（ｐ＋ｑ＋ｒ）は３０，０００を 超えず、最も好ましくは６０を超えない）工程を含んで成る方法も包含する。工 程（ａ）〜（ｅ）は一遺伝子の異なる多数のセグメントに関して平行して実行し 得る。 図面の簡単な説明 本発明は、以下の図面を参照することにより、より良く理解される。 図１は、固体支持体上での複数のｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの合成を示す 。 図２は、図１の固体支持体を用いて種々のｎ−ｍｅｒ長を有するオリゴヌクレ オチドの混合物を含有する試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを選択する方 法を示す。 図３は、固体支持体を用いてｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの試料を得るため の線状増幅の略図である。 図４は、標識化オリゴヌクレオチドの試料を得るための増幅を示す。 図５は、リガーゼを用いた一定長オリゴヌクレオチドの調製方法を示す。 図６は、化学的連結またはリガーゼを用いた一定長オリゴヌクレオチドの調製 方法を示す。 図７は、それらの表面に付着したオリゴヌクレオチドを有するバイオバイオコ ンパクトディスクの調製に用いられる２つの相補的スタンプを示す。 図８は、固体に付着されるべき定常オリゴヌクレオチドがスタンプに成形され た溝の壁に存在する、印刷用の図７のスタンプの使用についての一実施態様を示 す。 図９は、染色体において２回生じる約１６ｍｅｒの配列を決定するための選択 的認識、（８，｛１０｝，８）認識の使用を示す。 図１０は、疎水性表面に親水性窪みを有するスタンプを示す。 図１１は、ラテックス球が窪み中で化学的に結合される、図１０におけるスタ ンプを示す。 図１２は、遺伝子断片に関連したシーケンシング情報を決定するために用いら れる（４，４）−ｍｅｒ認識の説明である。 図１３は、遺伝子断片に関連したシーケンシング情報を決定するために用いら れる（４，｛５｝，４）−ｍｅｒ認識の説明である。 図１４Ａは、分別ディスクを示す。一次分別は中央１６区画域で実施され得る 。分画は、螺旋溝または毛管中でさらに分別され得る。 図１４Ｂは、図１４Ａに図示したディスク上にもう一つのディスクが取り付け られた後にさらに分別が実施され得ることを示す。図１４Ｃは、毛管と一種類の オリゴヌクレオチド帯の交差点の上面図を示す。 図１５は、中央分別域の略図である。試料は、特定の実施態様では１６の区画 を含有するこの領域周囲を循環させられる。各区画は、特異的サブクラスのオリ ゴヌクレオチドプローブを含有する。 図１６は、オリゴヌクレオチドが変性後にディスクを回すことにより毛管中に 溶出され得ることを示す。 発明の詳細な説明 添付の請求の範囲の範囲内の本発明の特定の実施態様を実施する ための有意の背景情報ならびに付加的指針は、現在、公開形態で公に利用可能な ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１８２６（この記載内容は、参照により本明細書中に含ま れる）に見出される。試料調製 オリゴヌクレオチドアレイは、遺伝子シーケンシングにおいて非常に有望であ る。現在、これらの方法は、遺伝子査照に主として限定されているが、この場合 、配列はいくつかの特定の点以外で分かっており、そしてアレイには限定された 組のオリゴヌクレオチドだけが必要である。考え得るすべての一定長オリゴヌク レオチドを含有する非常に大型のアレイは生成するのが難しいために、de novo シーケンシングは、より困難である。さらに、ランダムな長さの試料オリゴヌク レオチドが複雑化の原因となる。それらは、プローブオリゴヌクレオチドとより も強力な結合で互いにハイブリダイズし得る。最適長オリゴヌクレオチドは、長 すぎるオリゴヌクレオチドより迅速に、そしてより忠実にハイブリダイズする。 本発明は、あらゆるＤＮＡ試料から均一長オリゴヌクレオチドを調製するために 用い得る４つの方法を記載する。さらに、これらの方法は、プロセッシング化試 料がすべての不可欠な均一長オリゴヌクレオチドを含有し、これが混合物中で相 補的オリゴヌクレオチドを有さない、即ちそれらがいかなる二重鎖も形成できな いように、用い得る。これは、すべてが試料およびプローブオリゴヌクレオチド 間のハイブリダイゼーションを基礎にしているオリゴヌクレオチドアレイ法にお いて、非常に有益である。ハイブリダイゼーションは、例えば全均一長試料オリ ゴヌクレオチドにおけるアデノシンまたはシトシンに対する中心ヌクレオチドを 限定すること（ＡＣ−拘束）により阻止される。したがって、２つの試料オリゴ ヌクレオチドは互いにハイブリダイズできず、代わりにアレイにおけるプローブ オリゴヌクレ オチドとだけ完全にハイブリダイズできる。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、非常に有効なＤＮＡ増幅法である。しか しながら、ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドアレイ法に、そして大規模de novoシ ーケンシングに、例えば全染色体を一度にシーケンシングする場合に適用される と、重大な欠点を有する。ＰＣＲを用いるためには、反応を開始するための短い プライマーが必要である。プライマーを用いて染色体を完全に網羅するためには 、配列の有意部分は確実に分かっていなければならない。さらに、ＰＣＲの各周 期は、従来のものより短いオリゴヌクレオチドを生じる傾向がある。これらを一 緒に考慮することは、未知の試料のＰＣＲ増幅後に、染色体の種々のセグメント が不均質に表現され、いくつかの部分が全く表現されないことを意味する。 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、配列が分かっている場合は、均一長オリゴヌ クレオチドを提供する。本出願に記載した一方法は、配列についてのいかなる予 備知識も必要としない一般的場合に関するＬＣＲの延長である。 de novoシーケンシングは、高密度アレイを要する。これらは、従来は、リト グラフ法により生成されていた。その使用にもかかわらず、この方法は洗練され た計器操作を要し、有意量の不純物の生成を引き起こし得る。本出願では、μｍ 精度を可能にする２つの簡単なプリント法を説明する。図１０および１１に示し たように、第一の方法は、疎水性表面上の固定化多孔質ラテックス球を利用する 。ラテックス球は、化学的溶液、例えば水中オリゴヌクレオチドで湿潤され、成 分の１つ（オリゴヌクレオチド）を結合し得る別の表面に対してプレスされ得る 。この方法は、一般に多数のプリント工程を要するが、しかしそれは相補的プリ ントのためのマスタースタンプの二次加工に有用である。相補的スタンプは、そ れが複雑な混 合物からある成分を特定部位に結合し得るように、化学的にパターン化される。 スタンプは、種々の成分に関して、数百万の異なる部位を含有し得る。洗浄後、 非結合成分はすべて除去され、スタンプは化学的に所望の成分を結合し得る表面 と接触するようになる。成分はスタンプから分離されて、溝中に拡散され、そし て活性表面と反応する。したがって、数百万の化学的成分、例えばオリゴヌクレ オチドは、一プリント工程でμｍ精度で転写され得る。工程を反復することによ り、数十億のオリゴヌクレオチド対の組合せが作られ得る。他の方法、例えばリ トグラフ、インクジェットまたは従来のプリントでは、たった２工程でこのよう な高密度パターンを二次加工できない。さらに、洗練された計器操作も必要ない 。 ある化学物質の一度での高分解能プリントは周知である。さらに、種々の化学 物質が溝に沿って表面上に供給される化学的プリントも周知である。後者の方法 ではアレイが正確に産生され得るが、しかし密度は非常に高いという訳ではない 。流動要件のために、毛管はあまり狭くできない。数千のこのような毛管が一ス タンプ上に存在し得るが、しかし数百万の流動毛管があらゆる合理的大きさの表 面に存在し得るとは考えられない。他方で、μｍスケールの数百万の溝がプラス チック上にスタンプされ得る。これらの溝は、親水性にされ、その各々は、本出 願で別々に記載されている写真平板または好ましくは一組のラテックス球スタン プを用いてあるオリゴヌクレオチドで被覆される。 あるヒト染色体をシーケンシングし得るオリゴヌクレオチドは、明白に、二次 加工するのに圧倒的である。今までのところ、オリゴヌクレオチドアレイは約２ ０００塩基対（ｂｐｓ）をde novoシーケンシングできている。配列査照は、非 常に長い配列、例えば２０，０００ｂｐｓに関して実行され得る。ある染色体は ２５，０００ 万ｂｐｓを含有し得るが、これは本発明のオリゴヌクレオチドアレイにより便利 にシーケンシングされ得るものの約１００，０００倍である。本出願に記載した 試料調製法および高密度バイオコンパクトディスクは、シーケンシングを大いに 改良する。しかしながら、用いなければならないバイオコンパクトディスク数を 最小限にしながら、信頼できる結果を得るための適正なシーケンシングプロトコ ールが基本的に重要である。 本出願で採用されたアプローチは以下の通りである：１）染色体の一部である １６−ｍｅｒオリゴヌクレオチドすべてを決定し；そして２）２７−ｍｅｒオリ ゴヌクレオチドのすべての両８−ｍｅｒ末端を決定するが、これらの２７−ｍｅ ｒのうちの中間の１１−ｍｅｒは分からない。示した数字は単なる例であり、こ のアプローチにはいくつかの変更が可能である。これら２組のデータは、同様の 組のバイオコンパクトディスク、即ち（８，８）認識を用いるディスクで得られ る。データ組１（すべて１６−ｍｅｒ）は、データ組２の各２７−ｍｅｒ中の中 央１１−ｍｅｒ配列の確定を可能にする。したがって、全体配列の一部である２ ７−ｍｅｒ配列のすべてが分かる。これにより、元の配列がほぼ確実な推測が可 能になる。いくつかの長い反復配列だけが、この方法の能力外である。それらの 場合でさえ、二者択一的配列が分かる。長い反復配列を決定的に推測するために は、あつらえて作ったオリゴヌクレオチドアレイが必要とされ得る。 すべてのバイオチップアレイＤＮＡ検定において、定常オリゴヌクレオチドは 一定長を有し、即ちそれらはｍ−ｍｅｒ（ここで、ｍは既定のバイオチップアレ イにおいて８〜３０の固定数である）である。無作為加水分解により、化学的に または酵素的に試料を調製する。試料は種々の長さを有するオリゴヌクレオチド を含有する。 しかしながら、過加水分解を避けるために、標的化長は約５０塩基（５０−ｍｅ ｒ）である。過剰な且つ可変性の長さはハイブリダイゼーションを減速させ、望 ましくない相互作用を引き起こし得る。理想的試料は、一定長オリゴヌクレオチ ドｎ−ｍｅｒ（ここで、ｎは、ｍ−ｍｅｒ（ｎ≧ｍ）である定常オリゴヌクレオ チドの長さと等しいかまたはそれよりわずかに大きい値である）を含有する。一 定の且つ望ましい長さを有する試料オリゴヌクレオチドを生成する手法の４つの 変法を以下で説明する。 方法１．（ヌクレアーゼＳ。図１：ｎ−ｍｅｒの完全混合物の合成；図２：可 変長のオリゴマーからのｎ−ｍｅｒの調製；そして図３：線状増幅） 先ず、考え得るすべてのオリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒを固体支持体上で合成 する。これは、各カップリング工程で、アデノシン、シトシン、グアノシンおよ びチミジンホスホロアミダイト、またはこれらのヌクレオチドのその他の誘導体 の等モル混合物を用いることにより、容易に達成される。２つの合成工程を図１ に示す。ｎカップリング工程後、全ｎ−ｍｅｒは選択された固体支持体上に存在 する。２６−ｍｅｒまでのオリゴヌクレオチドの完全混合物が、この方法により 実際に合成され得る。表１は、１０ｍｇの混合物（支持体の重量は含まれていな い）中のあるオリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒの分子の数を示す。 混合物中の種々のｎ−ｍｅｒの量には、一定の統計学的変動が認められる。２ ８−ｍｅｒに関しては、いくつかの考え得るオリゴヌクレオチドは１０ｍｇ混合 物中に全く表されないが、一方その他のいくつかは２０より多いコピーを有し、 したがってコピーの平均数は１１である。考え得る２４−ｍｅｒはすべて１０ｍ ｇ混合物中では２×１０³より多いコピーを有し、したがって完全混合物である ために、変動は２４−ｍｅｒに関しては有意でない。 試料オリゴヌクレオチド断片を、固体支持体上に結合したｎ−ｍｅｒの完全混 合物とハイブリダイズさせる（図２）。一本鎖ＤＮＡを加水分解する加水分解剤 、例えばヌクレアーゼＳを付加する。ハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドセグ メントだけが、加水分解に対して保護される。試料オリゴヌクレオチドのオーバ ーハングを大々的に除去する。試料中にマッチングオリゴヌクレオチドを有さな い支持体上の定常ｎ−ｍｅｒも加水分解される（図２）。有用であるためには、 加水分解は理想的に完全である必要はない。例えば、ｎが１６であるとすると、 バイオコンパクトディスクを用いる場合、試料オリゴヌクレオチドの有用範囲は １６−〜２２−ｍｅｒである。同様に、定常ｎ−ｍｅｒが部分的にのみ加水分解 される場合、残りのｎ−ｍｅｒは試料の増幅に用いられる。 固体支持体は、ヌクレアーゼＳ処理といったような加水分解後、試料オリゴヌ クレオチドと相補的である定常組のｎ−ｍｅｒを含有する。図２に示すように完 全可溶性ｎ−ｍｅｒ混合物をこの定常組のｎ−ｍｅｒとハイブリダイズすること により、試料ｎ−ｍｅｒの完全コピーが得られる。工程は数回反復され得るが、 しかし増幅が時間と努力の線状関数であるために、効果がない。この工程は、Ｐ ＣＲ増幅により、または当業界で周知の類似の方法により、指数的であるよう修 正され得る。 塩基選択がｎ−ｍｅｒのある部位において抑制される場合には、分子の数は対 応的により大きくなる。例えば、これらのオリゴヌクレオチドの中心部で、アデ ノシンおよびシチジンだけが存在を許される場合（ＡＣ拘束）、各ｎ−ｍｅｒに 関するコピー数は表１に示した数の２倍となる。塩基制限は、特定の工程におい て、適切なアデノシンおよびシチジン誘導体を用いることにより、達成される。 ＡＣ拘束２５−ｍｅｒは、実際的試料調製および信頼できるシーケンシングを可 能にする妥協である。 方法２．（ハイブリダイゼーションのみ；図３および４：標識化または活性化 可能なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド） オリゴヌクレオチドの完全混合物を固体支持体に付着する代わりに、オリゴヌ クレオチドの断片化試料をそれに付着し得る。固体支持体はシリカ粒子、磁気球 体または毛管であり得る。標識（例えばフルオレセインまたは酵素）または反応 性官能基（例えばチオール）を任意に含有し得るｎ−ｍｅｒの完全混合物で、結 合試料を処理する。非ハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒを洗い落 とす。加熱によりハイブリダイズ化ｎ−ｍｅｒを取り出し、収集して、試料のｎ −ｍｅｒオリゴヌクレオチドと相補的でるｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド組を提 供する。必要な場合は何度でも、工程を反復し得る。 方法３．（連結。図５：リガーゼを用いた一定長オリゴヌクレオチドの調製） これは方法２の変法であり、図５に説明されている。「ｎ」が大きい数である 場合、例えば３０より大きい場合には、ｎ−ｍｅｒの完全混合物の調製は実行可 能でない。さらに、Ｎが大きい場合、オリゴヌクレオチド間のミスマッチングが 問題となる。これらの問題はともに、ｋ−ｍｅｒおよびｍ−ｍｅｒ（ここで、ｋ ＋ｍ＝ｎ）の２つの完全混合物を用いることにより回避され得る。本方法では、 ｋ−ｍｅｒの３’末端は遊離ヒドロキシル基を含有せず、ｍ−ｍｅｒの５’末端 は遊離リン酸塩を含有しない。これは、３’末端がジデオキシ末端化されるかあ るいはヒドロキシル基がホスホリル化され得るかまたは標識、例えばフルオレセ インを含有するｋ−ｍｅｒを用いることにより成し遂げ得る。ｍ−ｍｅｒの５’ 末端は遊離ヒ ドロキシル基、標識または活性官能基を有し得る。ハイブリダイゼーション後、 混合物を連結する。２つのオリゴヌクレオチドだけが連結により一緒に接合され 得る。温度を上げ、そして洗浄することにより、非連結オリゴヌクレオチドを除 去する。ｍ−ｍｅｒが５’末端にヒドロキシル基を有した場合、このヒドロキシ ル基はここで任意にホスホリル化され得る。新規のオリゴヌクレオチドは、ここ で５’末端に連結される。この工程を何度も反復し得る。ハイブリダイゼーショ ン後、試料中に存在するｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドと相補的であるｎ−ｍｅ ｒオリゴヌクレオチドの収集が提供される。 方法４．（化学的連結。図６：化学的連結を用いた一定長オリゴヌクレオチド の調製） ３つの試料オリゴヌクレオチドｈ−ｍｅｒ、ｋ−ｍｅｒおよびｍ−ｍｅｒが、 連結後、一緒になってオリゴヌクレオチドを形成すると、優れた結果が得られる 。化学的連結は非常に有効な方法であるが、しかし酵素も用い得る。 図６に示したように、この場合には、すべてのオリゴヌクレオチドは再び完全 混合物として用いられる。一シリーズは両端にリン酸基を有し、一方他の２つは 少なくとも活性形態での末端リン酸基を有さない。一完全混合物は３’末端にヒ ドロキシル、アミノまたはチオール基を有するが、一方その他は５’末端に同様 の基を有する。これら３つの種類のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズ され、適正に位置を定められる（頭−尾）と、それらは互いに化学的結合を形成 し得る。これは、リン酸基が活性化された場合に、最も良く成し遂げられる。そ れらは、例えば２つのエステル化基がペンタフルオロフェニルまたは同様の良好 な脱離基であるように、トリエステルであり得る。カップリング後、超ペンタフ ルオロフェニ ルは任意に加水分解される。脱ハイブリダイゼーション時に、試料中に存在する ｎ−ｍｅｒオリゴマーと相補的であるｎ−ｍｅｒオリゴマーの収集が提供される 。直線的増幅の指数的増幅への変換 前記の４つの直線的増幅のすべて、およびその他の類似の直線的増幅手法も、 下記の方法により指数的増幅に変換し得る。 直線的増幅法では、試料オリゴマーは相補的オリゴヌクレオチド組を生成する ための鋳型組として用いられる。工程は何度も反復し得るが、しかし、毎回ほぼ 同数の相補的オリゴヌクレオチドが得られる。これらのオリゴヌクレオチドをプ ールすると、オリゴヌクレオチドの総数は、線状に、増幅工程数に拠る。 直線的工程を指数的工程に変換するためには、第一工程で得られる相補的オリ ゴヌクレオチドは、それらが保護化チオール、例えば酢酸チオール、あるいは脂 肪族アミノ基を含有するように設計される。変性後、これらのオリゴヌクレオチ ドは、脂肪族アミノまたはチオール基を例えばマレイミドまたはイソシアナト基 で結合し得る反応性基を含有する二次カラム中に移す。運搬中、脱保護試薬、例 えばヒドロキシルアミンが付加され、チオール基が曝露される。相補的オリゴヌ クレオチドは直ちに固体支持体と結合する。ところでこの支持体は、直線的増幅 鋳型としても用い得る。増幅化オリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチ ドと相補的であり、即ち元の試料オリゴヌクレオチドと同一であるが、但し、そ れは保護化脂肪族アミノまたはチオール基を含有する。この物質は、保護基が除 去された後にアミノまたはチオール基誘導化オリゴヌクレオチドを結合し得る同 様の活性固体支持体を含有する元のカラムに向けられる。そのとき、第一カラム は。試料と同一であるオリゴヌクレオチドの元の数の２倍を含有する。これらが 増幅鋳型として用いられる 場合には、元の数の２倍の相補的オリゴヌクレオチドが得られる。これらを第二 カラムに結合後、そのカラムは、第一周期と比較して、３倍の数の相補的オリゴ ヌクレオチドを含有する。工程は数回反復し得る。ｎ工程後の増幅のおよその値 は、以下の等式から得られる： ａ＝５^*１．６２^n-4 （式中、ａは増幅係数、即ち、元の試料と比較した場合にオリゴヌクレオチドの 数が何倍増大したかを示す値である）。増大は指数的であるが、しかし数値は、 それがＰＣＲにおいて最適に増大するように、各周期で倍に成るわけではない。 ＰＣＲを上回る有意の利点は、この手法では、試料および相補的オリゴヌクレオ チド組は別々に保持されるという点である。これは、バイオチップアレイを用い る場合には、これらの手法がハイブリダイゼーションに強く依存しているために 、非常に重要である。試料中のすべてのオリゴヌクレオチドが混合物中で相補的 パートナーを有する場合には、アレイとのハイブリダイゼーションは有効でない 。高密度バイオコンパクトディスクの調製 実際のシーケンシングの第一工程では、バイオコンパクトディスク（ＢＣＤ） は試料中のすべての１６−ｍｅｒを認識するよう設計される。これは、（８，｛ ０｝，８）認識、即ちスペーサーが２つの８−ｍｅｒ側腕を有し、可溶性プロー ブオリゴヌクレオチドは用いられないことにより成し遂げられる。この認識は、 （８，８）認識としても表示される。異なる８−ｍｅｒが６４×１０³個、そし て２つの８−ｍｅｒの異なる対が４．３×１０⁹個ある（表４）。１つの金球体 を含有する一定領域は、バイオビットと呼ばれる。各バイオビットの面積は、約 １００μｍ²である。この面積は、側腕と同様の（８，８）対のオリゴヌクレオ チドを有する数千のスペー サーにより覆われる。各バイオビットは、ただ１種類の（８，８）対のオリゴヌ クレオチドを含有すべきであり、３つは考え得る異なる８−ｍｅｒ対の各々に関 して少なくとも１つのバイオビットでなければならない。現在利用可能なＣＤ− ＲＯＭ読取器は、１つのコンパクトディスク（ＣＤ）から０．６×１０⁹ビット を読み取ることができる。したがって、考え得るすべての８−ｍｅｒ組合せに関 して、約８個のＢＣＤが必要である。ＩＲレーザーの代わりにブルー半導体レー ザーを用いると、ＣＤの密度は何倍かに、可能性として２０倍に増大し得る。こ れは、ＢＣＤの性能増大をほぼ線状に反映する。 ここに記載した相補的プリント法を用いて、相補的スタンプが一旦作られたら 、−プリン工程で複雑な高分解能パターンを二次加工し得る（図７）。写真平板 法または匹敵する高分解能パターン法は、相補的スタンプを作るために必要とさ れる。下方側腕オリゴヌクレオチドはすべて、一相補的スタンプを用いて一工程 でプリントされ得る。同様に、上方側腕オリゴヌクレオチドはすべて、一工程で プリントされ得る。したがって２つのスタンプは、１つのＢＣＤを二次加工する ために必要である。８つの異なるＢＣＤが製造されねばならないために、異なる スタンプの総量は１６である。相補的スタンプの二次加工 一相補的スタンプは、数千回用い得る。しかしながら、一相補的スタンプの二 次加工は、１０の写真平板またはプリント工程を必要とする。本出願におけるプ リント法は、オリゴヌクレオチドがそれらを表面上に付着する前に精製され得る という点で、リトグラフ法を上回る基本的利点を有する。 （８、８）−および（８，｛１１｝，８）認識戦略に用い得る相補的スタンプ の二次加工を本明細書では説明する。全体で４つの異 なる対の相補的スタンプが製造されねばならず、各対は化学的に同一で、即ち、 それらは同一の１６．３８４個のオリゴヌクレオチド（８−ｍｅｒ）を含有する が、しかし螺旋溝は反対方向に向かう（図７）。６５，５３６個の異なる８−ｍ ｅｒオリゴヌクレオチドが存在するために、４つのスタンプは完全な組（４ｘ１ ６．３８４＝６５．５３６）を含有する必要がある。時計回りおよび反時計回り の螺旋スタンプの考え得る１６の組合せのすべてが、考え得る８−ｍｅｒオリゴ ヌクレオチドのすべての対として構築される４３０億個の異なる１６−ｍｅｒオ リゴヌクレオチドのすべてを生じる（表４）。 先ず、螺旋溝（１６．３８４）を軟質ポリカルボネート上にプリントする。各 溝は、幅約４μｍ、深さ１〜２μｍである。これはプリントコンパクトディスク と同様であり、この場合、μｍ分解能が標準である。完成スタンプにおいては、 疎水性稜線を有するのが好ましいが、一方溝は親水性である。稜線も幅４μｍで ある。この目的のために、ディスクは耐蝕膜で被覆され、螺旋溝をプリントする ために用いられた同一スタンプが、溝の底を曝露するために再び用いられる。酸 素エッチングを用いて、溝からあらゆる残留耐蝕膜を除去する。アンモニアプラ ズマにより、表面をアミノ基で被覆する。耐蝕膜層を稜線から除去する。両端に 、例えばイソチオシアナト基を有するポリエチレングリコールスペーサーをアミ ノ基に付着させる。余分量のスペーサーを用いて、一端だけが表面と結合し、他 方はさらに別の脂肪族アミノ基を有するオリゴヌクレオチドを結合するのに用い られる。 螺旋溝（１６，３８４）は、好ましくは、６４個の溝の２５６個の群（２５６ ｘ６４＝１６，３８４）を成す。これらの群は、インクジェット法または等価の 方法を用いて、脂肪族アミノ基を有する ある４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドで１群を成すよう分けられる。したがって、 既知の４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは６４の異なる近くの溝にある。考え得る ２５６個の４−ｍｅｒは各々、一度、そして一度だけ、２５６個の溝群のうちの １つに生じる。次の工程は６４の異なる４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを１群の ６４の溝の各々に別々に沈着させ、それを化学的に一次４−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドと結合させることである。１つのディスク上で、これらの二次４−ｍｅｒ オリゴヌクレオチドのすべてが同一の末端ヌクレオチド、例えばＡを有する。４ つの化学的に異なるディスクが二次加工された後、すべてのオリゴヌクレオチド （Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）が１つのディスクの末端一に出現する。２５６の異なる 群があるために、二次４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは各々、同一ディスク上に ２５６回出現する。二次４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、これらのすべての位 置に同時にプリントされ得る。汚染を避けるために、各オリゴヌクレオチドは献 呈されたスタンプを用いてプリントされる必要がある。スタンプはすべて、全く 同じように見Ｌ。それらは２５６個の等間隔（約０．６ｍｍ）の螺旋溝を有する 。１つの螺旋溝は幅が５〜８μｍである。溝は親水性であるが、一方、その間の 領域は疎水性である。オリゴヌクレオチド溶液で湿潤された後、溝だけが溶液を 保持し、これは基質と接触後、部分的に移される。別の方法は、親水性窪みを溝 の底に蝕刻することであり、この場合、溝は疎水性である（図１０）。好ましく は、これらの窪みは、多孔質で、親水性且つ弾性であるラテックス球で覆われる （図１１）。すべての溶液が球に保持されるように、溝それ自体は疎水性である 。これにより、スタンプにおけるそして基質上での、溶液の量および溶液の位置 が良好に制御される。球は、ラテックス球に適した方法で従来の結合化学を用い て、例えばスペーサーとラテックス球と の間のアミド結合を用いて、スタンプ上に化学的に結合される。任意に、ラテッ クス球はスタンプ上のへこみに置かれて、より強力な結合を得る。 さらに、オリゴヌクレオチド類似体は、前記のオリゴヌクレオチドに取って代 わり得る。これは、いくつかのオリゴヌクレオチド類似体がオリゴヌクレオチド より容易に水溶液中でカップリングするために、相補的スタンプで特に適用可能 である。例えば、水溶性カルボジイミドを用いて、アミノ基を含有する４−ｍｅ ｒは、カルボキシル基を含有する別の４−ｍｅｒとカップリングし得る。さらに 、いくつかのオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドそれ自体より強 力なハイブリダイゼーションを生じ、相補的スタンプに、そして最終的オリゴヌ クレオチドアレイに有用である。バイオコンパクトディスクの二次加工 以下の説明では、スタンプはすべてすでに作製されているものと仮定する。最 初に、下方側腕オリゴヌクレオチドをプリントする。８−ｍｅｒの完全混合物を 調製する。合成は、オリゴヌクレオチドの３’末端がポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）スペーサーに連結され、他端にチオール基を有するように実施する（あ るいは、チオール基は基質上の定常スペーサー中に存在し、イソシアノまたはマ レイミド基はＰＥＧスペーサー上に存在し得る）。完全混合物の溶液は、スタン プを湿潤するためのインクとして用いられる（図７，上左隅）。スタンプの一形 状において、定常オリゴヌクレオチドは深さ１μｍの溝の壁に存在する（図８： 凹面相補的プリント）。ハイブリダイゼーション後、余分のオリゴヌクレオチド を洗い落とす。湿潤スタンプをＢＣＤに対してしっかりプレスするが、これはス ペーサーの下方部分にマレイミド基を有する。チオール基は、マレイミド基と非 常に迅速に結合する。相対的に長距離のために、この 段階では２〜３のカップリングだけが起こり得る。オリゴヌクレオチドを放出す るために、そして反応を完了させるために、薄い水層をマイクロ波により、また は赤外線により約１分間加熱する。オリゴヌクレオチドをスタンプから放出し、 次に遊離拡散させる。オリゴヌクレオチドは、１秒間で１μｍ、１分間で８μｍ 、拡散し得る。余分のマレイミド基のために、すべてのチオール誘導化オリゴヌ クレオチドは有効に結合される。プリント工程を完了し、スタンプを取り外す。 切断可能スペーサー分子はここで、完全下方側腕を有する。保護基を上方側腕位 置から除去し、プリント工程を反復して、上方側腕オリゴヌクレオチドを挿入す る（図７。上右隅のスタンプ）。この場合、オリゴヌクレオチドの５’末端はポ リエチレングリコールスペーサーに連結される。洗浄および乾燥後、ＢＣＤは使 用の準備ができる。シーケンシング戦略 一度に全ゲノムをシーケンシング使用とする代わりに、染色体を分離し、各染 色体の２本の鎖を分離し得る。シーケンシングのためには、各染色体の鎖の１本 だけが必要である。他方の鎖のシーケンシングは任意で、二重チェックとして役 立つ。シーケンシングのためには、二度目を生じるために染色体中に存在するこ とがすでに分かっているｎ−ｍｅｒに関する確率が何かを知ることは重要である 。特性化オリゴヌクレオチドが長いほど、それが２回生じる確率は小さい。信頼 できるシーケンシングを成し遂げるためには、この確率は、特性化オリゴヌクレ オチドが染色体中で１度だけ生じるように小さい必要があり、即ち、この確率は ４×１０^-9より小さい必要がある。表２Ｂを細かく点検すると、２８−ｍｅｒに 関して、この確率は必要限界（１．７×１０^-9）より低いことが明らかになる。 ２４−ｍｅｒに関しては、対応する確率は４．４×１０^-9で、これ は、約１００分の１の２４−ｍｅｒが染色体中に２回生じ得ることを示す。した がって、２８−ｍｅｒを知ることは独特のシーケンシングを保証し、一方より短 いオリゴヌクレオチドは曖昧さをもたらし得る。 約６５×１０¹⁵の異なる２８−ｍｅｒがある。これらのオリゴヌクレオチドす べてを含有するアレイは、１３０エーカーの面積を有するが、但し１つのオリゴ ヌクレオチドは１０μｍ²を占有するだけである。この種のアレイは、製造、プ ロセッシングおよび読み取りには明らかに実際的でない。他方、表４は、すべて の１４−ｍｅｒバイオビットが単一ＢＣＤ（ＢＣＤ面積＝４．２×１０⁴ｍｍ²） 上に適合することを示す。したがって、（７，７）認識は、純粋に実際的見地か ら望ましい。表２Ａから分かるように、示された１４−ｍｅｒは０．３９３の確 率を有するものは全く見出されず、０．１７３および０．０５０の確率はそれぞ れ２回および３回見出される。反復配列の出現のために、これらの確率はより高 く、同様に、異なる１４−ｍｅｒの数値は低く、考え得るすべての１４−ｍｅｒ の半分未満が染色体中に見出されると思われる。しかしながら、これは有用なシ ーケンシングには非常に高すぎる確率で、１４−ｍｅｒは一度に全染色体のシー ケンシングに有用であるには短すぎる。 １６−ｍｅｒはde novoシーケンシングのための十分な情報を与える最も短い オリゴヌクレオチドであり、依然としてＢＣＤの実際的限界内である。シーケン シング戦略は、前記のように調製されるＢＣＤの使用を基礎にする。（８，｛０ ｝，８）認識は最初に用いられる。これは、染色体の一部である１６−ｍｅｒの すべてについての情報を与える。染色体中にすでに１度存在する１６−ｍｅｒは 、０．０２８の確率で２回生じ得る。染色体のサイズを考慮に入れ ると、この確率は、１００万個までの１６−ｍｅｒが染色体中に２回生じ得るこ とを示す。これらの各々は、配列情報の分岐点をもたらす。これは図９に示され ているが、この場合、αおよびβは到着配列を示し、そしてδおよびεはある１ ６−ｂｐ配列γからの出発配列を示す。同一の分岐は、この方法で得られた配列 中の他のいくつかの点で生じる。すべての分岐点を描けば、配列というよりむし ろ網目パターンが得られる。これらの分岐点から突き出る考え得る配列は、α− γ−δまたはα−γ−ε、およびβ−γ−δまたはβ−γ−εで表される（図９ ）。これらの可能性のうちの２つだけが本物の染色体である。配列γは、もちろ ん、それらの両方に生じるが、一方他の配列α、β、δまたはεの各々は、１度 だけ生じる。したがって、それは、配列α−γ−δまたはα−γ−εが特定の染 色体中にある場合には、見出すには十分である。他の何れがこの染色体中にある かもすぐに推測できる。用いられる方法は、他のものが二重チェックとして用い られるようにともに同時に見出す。 定常オリゴヌクレオチドの全長は、分岐点を含まない独自の配列を得るために は２６〜２８ヌクレオチドである必要がある。これは実際には不可能であるため に、他の戦略を用いなければならない。１つの可能性は、代替物として（８，｛ １１｝，８）認識を用いることであり、この場合、｛１１｝は１１−ｍｅｒの完 全混合物を示す。試料は前と同様に調製されるが、但し２７−ｍｅｒが標的長で ある。試料オリゴヌクレオチドは、前に用いられたのと同様の組のＢＣＤ上に適 用される。ハイブリダイゼーション後、１１−ｍｅｒの完全混合物を付加する。 いくつかの場合には、１１−ｍｅｒもハイブリダイズするのに残されたまさに十 分なスペースがある。結紮後、他のすべてを軽度の加熱および洗浄により除去す る。このスペースに用いられる１１−ｍｅｒがどれかは分からないが、しかし両 末端８−ｍｅｒは分かる。図９には、考え得る１つだけののハイブリダイゼーシ ョンが示されている。考え得るハイブリダイゼーション、即ち±１、±２、±３ 等のヌクレオチドだけ移動するものはすべて、観察される。これらの８−ｍｅｒ の組合せは、指数的方法で配列のほとんどを推測するのに十分な情報を保有する （図９Ｂ）。 （８、｛１１｝，８）認識は、実質的には２７−ｍｅｒの競合認識と等価であ る。１６個のヌクレオチドだけが各検定素子、即ち８−ｍｅｒの側腕を有する各 特定のスペーサー分子により認識されるが、しかしこの認識パターンはＤＮＡの １６−ｍｅｒ鎖を認識するより多くの情報を提供する。これは図１２および１３ に示されているが、この場合、簡便のために、例として（４，４）および（４， ｛５｝，４）認識の比較を用いる。ある８−ｍｅｒ配列がＤＮＡ中で２回生じる 、例えば図１２のＡ₈の場合、２つの代替的全配列が考えられる。しかしながら 、類似の場合、例えば図１３に示した（Ａ₄＋Ａ₄）の場合、（４，｛５｝，４） 認識は疑いの余地のない結果を提供する。これは、縮重前および後の結果が共通 の情報（図１３の下線）、即ちそれぞれＴＡＴＴ配列とＧＴＧＧ配列を含有する ためである。したがって、同様の方法で、（８，８）認識を用いずに２７−ｍｅ ｒセグメントをシーケンシングするためには（８，｛１１｝，８）認識を用い得 るが、しかし考えられる最も確実な結果を得るためには、両方の同時使用が好ま しい。 実際、いくつかのバイオコンパクトディスクは、ゲノムの完全配列のために用 いられる。好ましい実施態様では、スペーサー分子は２つの８−ｍｅｒオリゴヌ クレオチド側腕を用いて形成され、１つは、スペーサー分子の２つの末端の各々 と切断部位の間にある。８−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの考え得るすべての配列 は、側腕に示される。表面上のスペーサー分子に付着した配列の考え得る８−ｍ ｅｒ対の各々の位置は、あらゆる特定の配列存在または非存在が検出され得るよ うな製造工程で確定される。実際、各ディスクは、一般的に利用可能な計器操作 に利用され得る合理的サイズのバイオコンパクトディスクを有するために、考え 得るすべての配列の既知のサブセットを含有し得る。検定要素、即ち予定位置に 結合した前記のスペーサー分子を有する表面を接触させる前に、考え得るすべて の配列を有する可溶性１１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混合物がバイオコンパ クトディスクの表面に適用される。試料オリゴヌクレオチド断片のそれぞれの配 列はスペーサー分子上の相補的配列と結合し、そして結合セグメントが連結され る。それぞれの配列を、次に、前記と同様に、それぞれの配列を確定する。経済 的および効率の見地から、２７−ｍｅｒセグメントのすべてに関して、平行して 前記の方法を反復する。次に、２７−ｍｅｒセグメントから収集した情報は、既 知の方法によりゲノムの全配列を確定するのに利用する。前記の説明は（８，｛ １１｝，８）−ｍｅｒ認識の使用に向けられる一方、方法は概して、（ｐ，｛ｑ ｝，ｒ）−ｍｅｒ認識に適用可能である（ここで、ｐ、ｑおよびｒは４〜１０， ０００，最も有益には６〜２６から選択される整数であって、（ｐ＋ｑ＋ｒ）は ３０，０００を超えず、最も有益には６０である）。ｐ＝ｒおよびｑ＞ｐである のが一般的に好ましい。可溶性オリゴヌクレオチドプローブ（ｑ）はそれが定常 プローブ（ｐおよびｒ）とのハイブリダイゼーション中に試料オリゴヌクレオチ ドから分離されないよう強力に結合されるべきであるため、ｑ＞ｐである必要が ある。これは、非常に強力にハイブリダイズするいくつかの可溶性オリゴヌクレ オチド類似体、例えばペプチドオリゴヌクレオチドを用いることによっても成し 遂げ得る。一定温度ハイブリダイゼーションを成し遂げるためには、ｐおよびｒ は等しくあるべきである。しかしながら 、同じ理由のために、非常に少量のシチジンまたはグアニジンを含有するオリゴ ヌクレオチドプローブは、強力な結合を得るにはより長く作られる必要がある。 小ゲノムに関しては、そして個々のヒト遺伝子または遺伝子の群のシーケンシ ングに関しては、ｐ＝ｒ＝７およびｑ＝９が適切である。この場合、シーケンシ ングには１つのディスクで十分である。ヒトゲノムの大部分を構成する反復配列 を測定するためには、ｐ、ｑおよびｒは非常に大きく、約１００〜１０，０００ であり得る。遠心分離または電磁力を用いて、結合強度を測定し得る。結紮を用 いて、任意に二重螺旋におけるギャップの存在または非存在を査照し得る。 遺伝子発現レベルは、この系により測定し得る。しばしば、認識のために非常 に大きい断片を用いるのが好ましい。これはスペースを保全する。ミスマッチは 遺伝子発現の試験においては重大な問題ではなく、したがって、より小さいプロ ーブオリゴヌクレオチドを用いると大きい利益が得られない。試料の二次加工 オリゴヌクレオチド断片を含有する試料を、ＢＣＤの表面に直接適用し得る。 しかしながら、少なくとも一定のサブクラスに試料を分別するのが好ましい。示 されたサブクラスをＢＣＤ表面の一定面積上に置いた場合、分別およびＢＣＤパ ターン化が適切に設計されれば、ハイブリダイゼーションの確率は増大し、ミス マッチの確率は低減する。 ミスマッチは、オリゴヌクレオチドアレイの使用における最悪の問題の一つで ある。ミスマッチは、１つのヌクレオチドだけが異なるオリゴヌクレオチド間で 最も頻繁に生じる。これにもかかわらず、隣接オリゴヌクレオチド部位が１つの ヌクレオチドだけ異なるよ うに、多数のオリゴヌクレオチドアレイが二次加工される。以下の手法は、すべ てのオリゴヌクレオチドが少なくとも２つの塩基対で異なるオリゴヌクレオチド サブクラスを含有するアレイおよび分別系の二次加工を可能にする。この手法は 、そのサブアレイ中のあらゆる他のオリゴヌクレオチドと比較した場合に、各々 のオリゴヌクレオチドが少なくとも３つの異なるヌクレオチドを有するサブアレ イを作製するのにも拡張し得る。 あるサブクラスのオリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒを保証するために、各オリゴ ヌクレオチドは少なくとも２つのヌクレオチドだけ他のあらゆるものと異なり、 このサブクラスは表５からの二量体オリゴヌクレオチドのｎ／２クォーターを選 択することにより構築されるべきである。ｎが２で割り切れることが支持される 。一例として、四量体オリゴヌクレオチド（ｎ＝４）のサブクラスは、二量体の ２つの（４／２＝２）クォーター、例えばクォーター１および３を選択すること により生成される。１６個の四量体オリゴヌクレオチドは、クォーター１からの １つの二量体をクォーター３からの別の二量体と併合して生成し得る。これら１ ６個の四量体を表６に示す。１つの行の四量体は、１つの列の四量体と２個のヌ クレオチドだけ異なる。２つの異なる行および列から取り出した２つの四量体は 、４つのヌクレオチドが異なる。四量体オリゴヌクレオチドの１６のサブクラス は全部一緒に、表５を用いて生成し得る。各サブクラスは１６のオリゴヌクレオ チドを含有し、したがって２５６（１６ｘ１６＝２５６）の四量体オリゴヌクレ オチドがすべて生成され、各々は１つのそして１つだけのサブクラスの成員であ る。同様に、オリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒ（ここで、ｎは同一である）はすべ て、サブクラスに分けられる。サブクラスの数は４^n/2で、各々が４^n/2個のオリ ゴヌクレオチドを含有し、即ち総数は、そうあるべ きであるように、４ⁿである。 二量体からのオリゴヌクレオチドｎ−ｍｅｒの構築は、概念上だけであり、別 記しない限り、単量体、二量体等ヌクレオチド誘導体を用いて実行し得る実際の 合成に制限はない。しかしながら、二量体は、表５を用いて設計されるアレイの 合成のための最も実際的方法を提供する。 シーケンシングは、（８，８）−または（８，｛１１｝，８）認識またはこれ らの組合せを用いることにより、有益に実行される。試料オリゴヌクレオチドを 先ず、各オリゴヌクレオチドの３’末端の８量体配列を基礎にして４⁴（２５６ ）サブクラスに分別する。これらのサブクラスの各々を、各オリゴヌクレオチド の５’末端を基礎にして２５６サブクラスにさらに分別する。したがって、全体 で４⁸（６５，５３６）のサブクラスが得られる。これらのサブクラスは各々、 ４⁸（８，８）−オリゴヌクレオチド対を含有する。１つのサブクラスは、ＢＣ Ｄ上の約０．２５ｍｍｘ０．２５ｍｍを包含する。 ディスク上のそれらの適正な部位に４⁸のサブクラスを得るためには、試料は 分別されねばならない。この仕事は、（４，４）認識の場合に関して以下に記載 するように、密閉ＢＣＤ（Disklab）によっても実行し得る。図を簡単にするた めの一例として、短いオリゴヌクレオチドを用いる。ところで一次および二次認 識オリゴヌクレオチドはともに４²（＝１６）のサブクラスに分けられ、即ち１ ６ｘ１６（＝２５６）の組合せがある。個の例は、明白な方法で、より長いオリ ゴヌクレオチドに一般化し得る。 分別ディスクは、必要な場合にそれらが分離し得るように一緒に把持される２ つの別々のディスクから成る。他の半分の全体的構造は、図１４Ａに示す。ディ スクの構造は、内側から出発して、外側 に移動するよう記載されている。中心の最も小さい円は、取り扱いおよび回転の ための任意の孔である。２つの円の間の非構造化領域は、溶出緩衝液用の容器で ある。部分的二重壁により１６区画に分けられる領域は、円分別「カラム」であ る。一次分別は、個の部分で実行される。１６の螺旋溝は、二次分別工程に用い 得る。最後に、非構造化外周は、廃棄物の収集に用いる。 一次ディスクの上に、渦巻き線反時計方向パターンを形成するように１６のオ リゴヌクレオチドサブクラスで被覆される二次ディスク（図１４Ｂ）を配置する 。このディスクは、コレクターディスクと呼ばれる。コレクターディスクは、平 坦であるかまたは機械的に模様を付けられる。いかなる場合も、一次ディスクの 溝は、２つのディスクが一緒に把持された場合に、溶出緩衝液およびＤＮＡ断片 が覆いをした、適切には毛管と呼ばれる溝間で交換されないように、密封されね ばならない。図１４Ｃは、使用中のディスクの上面図である。分かり易くするた めに、１つのサブクラスゾーンだけを示す。このゾーンは、他の１５のゾーンと 同様に、１６の毛管すべてを横断する。本発明のこの実施態様では、全部で２５ ６の交差点がある。 円形一次分別ゾーンを含有するディスクの中心部分を、図１５にさらに詳細に 示す。１６の小室の各々は、緩く詰められた、あるサブクラスの８−ｍｅｒオリ ゴヌクレオチドで被覆された固体支持体を含入する。これらのオリゴヌクレオチ ドの４−ｍｅｒ末端、例えば３’末端は、表５にしたがって形成される。他の４ −ｍｅｒ末端（５’末端）は、考え得るすべての４−ｍｅｒの組合せを含有する 。１６の４−ｍｅｒの３‘末端サブクラスの各々は、１つのおよび１つだけの小 室に生じる。試料は、ポンプ作用により任意の温度中で循環される。ポンプは外 側または内側にある。平衡に達した後、 非結合試料を除去し、固体支持体を洗浄して、非結合オリゴヌクレオチドおよび 緩く結合したオリゴヌクレオチドを除去する。ディスクを、例えばＩＲ照射によ り加熱して、ハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドを変性し、遠心分離力のため にバルブが開けられるように、非常に速く、例えば２００〜５０，０００ｒｐｍ で回転させる。分別単位は、３２のバルブがすべて同時に開くように、ディスク の静止に対して回転され得る基本単位である。この場合、バルブは、ある位置で は覆われ、別の位置では開放される単なる孔である。溶出緩衝液は、変性オリゴ ヌクレオチドを、各々がそれらの１つの壁にゾーン方向に１６の８−ｍｅｒオリ ゴヌクレオチドサブクラスを有する毛管に運ぶ。この場合、各８−ｍｅｒサブク ラスは、表５にしたがって完全に形成される。したがって、１６の分画の各々は さらに、１６の分画に分けられる。これらの分画はすべて、他のディスクとは分 離されるコレクターディスクに付着される。 コレクターディスクを、同様に模様を付けられたシーケンシングディスクの上 に置く。シーケンシングディスクの分解能は、一般に、コレクターディスクより もはるかに高いが、しかし必ずしもそうとは限らない。 この分別法の目的は、それらの相補的プローブオリゴヌクレオチドに密接した 適切な種類の配列を濃縮することである。一定長オリゴヌクレオチドを用いて、 この分別をさらに改良する。いかなる場合も、この方法は、それらが検出され得 る場合の適切な種類のオリゴヌクレオチドの濃度を大いに増大する。 いくつかの特定の実施態様に関して本発明を説明してきたが、それに対する修 正、ならびにその等価物および変更は当業者には明らかであり、添付の請求の範 囲内であり、それに含まれるものとする、と理解される。表１ 表２Ａ 染色体中の所与のｎ−ｍｅｒ（ｎ＝１４、１６、１７、１８または１９）を全く 見出せない、または１度、２度または３度見出す確率 表２Ｂ 染色体中の所与のｎ−ｍｅｒ（ｎ＝２０、２１、２２、２４または２８）を全く 見出せない、または１度、２度または３度見出す確率 表３ １つの染色体は最大２５０×１０⁶の塩基対を含有する（第１染色体）。４００ μｍ²ドット／ＢＣＤの数は１０⁵である。ＢＣＤの面積は、４．２×１０⁴ｍｍ² である。表４ ｎ−ｍｅｒの数およびバイオビットの総面積 表５ オリゴヌクレオチドのサブクラスを構築するために用いられる二量体オリゴヌク レオチドの４つのクォーター 表６ 表５からのクォーター１および３を用いて生成される１６の四量体オリゴヌクレ オチドの一サブクラス

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチド断片を含有する試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドを得る方法であって、 （ａ）支持体の表面に付着された考え得るすべてのｎ−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドを有する固体支持体を形成し； （ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体を、試料オリゴヌクレオチドが固 体支持体上の相補的ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする条件下 で、該試料と接触せしめ； （ｃ）工程（ｂ）から得られる固体支持体を加水分解剤と接触させて； （ｄ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドから未結合オリゴヌクレオチ ドを分離し；そして （ｅ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを変性して試料の ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る（ここで、ｎは４〜１０，０００から、最 も好ましくは６〜２８から選択される整数である）； 工程を含んで成る方法。 ２．オリゴヌクレオチド断片を含有する試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドを得る方法であって、 （ａ）試料中のオリゴヌクレオチドと結合するよう適合された固体支持体を 試料の少なくとも一部と接触させ； （ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体を、ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドが固体支持体上で相補的ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする のに十分な時間、ｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混合物と接触させ； （ｃ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドをハ イブリダイズしていないオリゴヌクレオチドから分離し； （ｄ）ハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを変性して、試料 中に存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを得る（ここで、ｎ は４〜１０，０００から、最も好ましくは６〜２８から選択される整数である） ； 工程を含んで成る方法。 ３．オリゴヌクレオチド断片を含有する試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドを得る方法であって、 （ａ）複数の試料オリゴヌクレオチド断片をその上に結合している固体支持 体を、各々がその３‘末端に遊離ヒドロキシル基を有さない複数の一次ｋ−ｍｅ ｒオリゴヌクレオチドと、各々がその５’末端に遊離リン酸基を有さない複数の 二次ｍ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとの混合物と接触させ； （ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体上の試料オリゴヌクレオチドとハ イブリダイズした一次および二次オリゴヌクレオチドとを連結し； （ｃ）連結されないオリゴヌクレオチドを固体支持体から除去し；そして （ｄ）固体支持体上に残存するハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドを変性して、試料中に存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオ チドを得る（ここで、ｋおよびｍは各々、４〜１０，０００から、最も好ましく は６〜２８から選択される整数であるが、但し、ｋ＋ｍ＝ｎ）； 工程を含んで成る方法。 ４．オリゴヌクレオチド断片を含有する試料からｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドを得る方法であって、 （ａ）試料からの複数のオリゴヌクレオチドをその上に結合し ている固体支持体を、各々３‘−および５’−末端にリン酸基を有する複数のｈ −ｍｅｒオリゴヌクレオチド、各々３‘末端にヒドロキシル、アミノまたはチオ ール基を有し、末端リン酸基を有さない複数のｉ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、 および５’末端にヒドロキシル、アミノまたはチオール基を有し、末端リン酸基 を有さない複数のｊ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混合物と接触させ； （ｂ）工程（ａ）から得られる固体支持体上の試料オリゴヌクレオチドとハ イブリダイズしたオリゴヌクレオチドを化学的または酵素的に連結し； （ｃ）連結されないオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）から得られる固体支持 体から除去し；そして （ｄ）固体支持体上に残存するハイブリダイズしたｎ−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドを変性して、試料中に存在するものと相補的なｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオ チドを得る（ここで、ｈ、ｉおよびｊは各々４〜１０，０００から、最も好まし くは６〜２８から選択される整数であるが、但し、ｈ＋ｉ＋ｊ＝ｎ）工程から成 る方法。 ５．スペーサー分子に付着されるよう適合された表面上の複数の別々の領域を 含めた表面を有する基質； 別々の領域の各々で前記の表面に第一の末端で付着される複数のスペーサー 分子であって、その各々がその第二の末端で金属表面または標識に付着されるよ う適合され、その各々が、切断され得るその第一の末端と第二の末端との間の部 位を有する複数のスペーサー分子； 切断部位とスペーサー分子の第一の末端との間で実質的にすべてのスペーサ ー分子に付着された第一の配列を有する第一のｎ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド； 及び 実質的にすべてのスペーサー分子に付着する第二の配列を有す る第二のｍ−ｍｅｒヌクレオチド（ここで、ｎおよびｍは４〜１０，０００の、 最も有益には２〜２８の整数から選択される整数である） を包含する検定要素。 ６．試料中に存在すると推定される遺伝子の（ｐ＋ｒ）−ｍｅｒセグメントを 決定するための方法であって、 （ａ）検定要素を、遺伝子の未知の（ｐ＋ｒ）−ｍｅｒセグメントを含有す る試料溶液の少なくとも一部分と接触させ、ここで、この検定要素は表面と表面 に結合した複数のスペーサー分子を有し、スペーサー分子は表面に結合した第一 の末端及び金属表面または標識に結合した第二の末端を有して切断部位が第一次 および第二の末端の中間にあり、スペーサー分子はさらに、切断部位と第一の末 端との間でそれに付着する第一のｐ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドと、切断部位と 二次末端との間でそれに付着する第二のｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、ｐ−ｍ ｅｒとｒ−ｍｅｒの組合せ、例えば、ｐ−ｍｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドのオリゴヌクレオチド配列のすべての組合せ、または任意にこのような組 合せのサブセットを有し、ｐ−ｍｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配 列の特定の組合せは各々、表面上の予定位置にあり； （ｂ）表面上の各予定位置でのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの特 定の配列の組合せの存在または非存在を検出し；そして （ｃ）工程（ｂ）から得られる配列情報をプロセッシングして試料中に存在 する（ｐ＋ｒ）−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配列を推測する（ここで、ｐおよ びｒは４〜１０，０００の、最も好ましくは６〜２６の整数から選択される整数 であり、そして（ｐ＋ｒ）は３０，０００を超えず、最も好ましくは６０を超え ない）； 工程を含んで成る方法。 ７．表面上の各予定位置でのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの特定の 配列の組合せの存在または非存在を検出する前に、工程（ａ）から得られるスペ ーサー分子に付着した生じたハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結する 工程をさらに包含する請求項６に記載の方法。 ８．工程（ａ）〜（ｄ）が遺伝子の異なる多数のセグメントに関して平行して 実施される請求項６の方法。 ９．試料中に存在すると推定される遺伝子の（ｐ＋ｑ＋ｒ）−ｍｅｒセグメン トを決定するための方法であって、 （ａ）試料、およびｑ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの考え得るすべての配列 を有するｑ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの混合物、または任意にこのような考え 得るすべての配列のサブセットの溶液を生成し； （ｂ）検定要素を工程（ａ）の溶液の少なくとも一部と接触させ、ここで、 この検定要素は表面および表面に結合した複数のスペーサー分子を有し、スペー サー分子は表面に結合した第一の末端および金属表面または標識に結合した第二 の末端、及び第一の末端と第二の末端との間にある切断部位を有し、スペーサー 分子はさらに切断部位と第一の末端との間でそこに付着した一次ｐ−ｍｅｒオリ ゴヌクレオチド、及び切断部位と第二の末端との間でそこに付着した第二のｒ− ｍｅｒオリゴヌクレオチドを有し、ｐ−ｍｅｒとｒ−ｍｅｒとの組合せがｐ−ｍ ｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのすべての組合 せ、または場合によっては、すべてのこのような組合せのサブセットを含み、ｐ −ｍｅｒおよびｒ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配列の特定の組合せの各々が表 面上の予定位置にあり； （ｃ）表面上の各予定位置でのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの特 定の配列の組合せの存在または非存在を検出し；そして （ｄ）工程（ｃ）から得られる配列情報をプロセッシングして試料中に存在 する（ｐ＋ｑ＋ｒ）−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの配列を推測する（ここで、ｐ およびｑは４〜１０，０００の、最も好ましくは６〜２８の整数から選択される 整数であり、そして（ｐ＋ｑ＋ｒ）は３０，０００を超えず、最も好ましくは６ ０を超えない） 工程から成る方法。 １０．生じた工程（ｂ）から得られるスペーサー分子に付着したハイブリダイ ズしたオリゴヌクレオチドを連結する工程をさらに含んで成る請求項９に記載の 方法。 １１．工程（ａ）〜（ｄ）が遺伝子の異なる多数のセグメントに関して平行し て実施される請求項９の方法。 １２．ｐまたはｒの一方、あるいはｐおよびｒの両方がｑと等しくない請求項９ の方法。 １３．ｐおよびｒの両方が７〜９の整数であり、ｑが９〜１２の整数である請 求項９の方法。 １４．試料中に存在すると推定される未知の遺伝子の配列を決定する方法であ って、 （ａ）工程（ａ）〜（ｄ）が遺伝子の異なる多数の（ｐ＋ｒ）−ｍｅｒセグ メントに関して平行して実施される請求項６に記載のの方法を実行し； （ｂ）工程（ａ）〜（ｅ）が遺伝子の異なる多数の（ｐ＋ｑ＋ｒ）−ｍｅｒ セグメントに関して平行して実施される請求項９に記載の方法を実行し； （ｃ）上記工程（ａ）および（ｂ）から得られる配列情報をプロセッシング して試料中に存在する未知の遺伝子の配列を推定する（ここで、ｐおよびｑは４ 〜１０，０００の、最も好ましくは６〜２８の整数から選択される整数であり、 そして（ｐ＋ｑ＋ｒ）は３０，０００を超えず、最も有益には６０を超えない） 工程から成る方法。 １５．ｐまたはｒの一方、あるいはｐおよびｒの両方がｑと等しくない請求項 １４の方法。 １６．ｐおよびｒの両方が７〜９の整数であり、ｑが９〜１２の整数である請 求項１４の方法。