SK114499A3 - Gene sequencer and methods - Google Patents

Gene sequencer and methods Download PDF

Info

Publication number
SK114499A3
SK114499A3 SK1144-99A SK114499A SK114499A3 SK 114499 A3 SK114499 A3 SK 114499A3 SK 114499 A SK114499 A SK 114499A SK 114499 A3 SK114499 A3 SK 114499A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
oligonucleotides
mer
sample
oligonucleotide
solid support
Prior art date
Application number
SK1144-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Jorma Virtanen
Original Assignee
Burstein Lab Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Burstein Lab Inc filed Critical Burstein Lab Inc
Publication of SK114499A3 publication Critical patent/SK114499A3/sk

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B01J2219/00536—Sheets in the shape of disks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B01J2219/00619—Delimitation of the attachment areas by chemical means using hydrophilic or hydrophobic regions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00635—Introduction of reactive groups to the surface by reactive plasma treatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00644—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being present in discrete locations, e.g. gel pads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00646—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports
    • B01J2219/00648—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports by the use of solid beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709—Type of synthesis
    • B01J2219/00711—Light-directed synthesis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N35/00069—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides whereby the sample substrate is of the bio-disk type, i.e. having the format of an optical disk

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Génový sekvenátor a spôsoby
Oblasť techniky
Tento vynález sa všeobecne vzťahuje na oblasť sekvenovania génov. Presnejšie sa tento vynález týka génového sekvenátora, v ňom použitého bio-kompaktného disku vysokej hustoty a spôsobu prípravy vzorky. Bio-kompaktný disk vysokej hustoty a spôsob prípravy vzorky nachádzajú použitie v oblasti sekvenovania oligonukleotidov a sekvenovania DNA a detekcie všeobecne.
Podstata vynálezu
Z jedného pohľadu tento vynález charakterizuje spôsob prípravy vzorky pre získanie n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, ktorý tvorí: (a) vytvorenie pevného nosiča, ktorý obsahuje všetky možné n-méry oligonukleotidov pripojených na povrch nosiča; (b) styk prítomného pevného nosiča z kroku (a) so vzorkou v podmienkach spôsobujúcich hybridizáciu oligonukleotidov vo vzorke s komplementárnymi n-mér oligonukleotidmi na pevnom nosiči; (c) styk pevného nosiča z kroku (b) s hydrolyzačnou látkou; (d) oddelenie nenaviazaných oligonukleotidov od hybridizovaných oligonukleotidov; a (e) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov za získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky; kde n je číslo vybrané z 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28.
Z iného hľadiska vynález charakterizuje spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, ktorý tvorí: (a) styk pevného nosiča prispôsobeného spojiť sa s oligonukleotidmi vo vzorke alebo aspoň s časťou vzorky; (b) styk pevného nosiča z kroku (a) so zmesou n-mér oligonukleotidov počas takého času, ktorý je dostatočný pre hybridizáciu n-mér oligonukleotidov s komplementárnymi nmér oligonukleotidmi na pevnom povrchu; (c) oddelenie hybridizovaných n-mér oligonukleotidov od nehybridizovaných oligonukleotidov; (d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov za získania n-mér oligonukleotidov komplementárnych k tým, ktoré sú prítomné vo vzorke, kde n je číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28.
Z iného hľadiska spôsob prípravy vzorky zahrňuje spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, spôsob tvorí: (a) styk pevného nosiča s naviazanými oligonukleotidmi zo vzorky so zmesou rôznych oligonukleotidov, ktoré majú (k+m)-méry, kde k+m=n, so zmesou väčšiny z prvých oligonukleotidov, každý z nich je k-mér a nemá voľnú hydroxylovú skupinu na svojom 3'-zakončení a väčšinou z druhých oligonukleotidov, každý z nich je m-mér bez voľnej fosfátovej skupiny na svojom 5'-zakončení; (b) ligácia oligonukleotidov na pevný nosič z kroku (a) ; (c) odstránenie neligovaných oligonukleotidov z pevného nosiča; a (d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov zostávajúcich na pevnom nosiči za získania n-mér oligonukleotidov komplementárnych k tým, ktoré sú prítomné vo vzorke; kde m, k a n sú každé číslo vybraté zo 6 až 10 000, najvýhodnejšie 12 až 40, za predpokladu, že k+m=n.
Z iného hľadiska spôsob prípravy vzorky obsahuje spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, ktorý tvorí: (a) styk pevného nosiča s naviazanou väčšinou oligonukleotidov vzorky so zmesou väčšiny h-mér oligonukleotidov, kde každý z nich má fosfátovú skupinu na 3'- a 5'-zakončení, s väčšinou i-mér oligonukleotidov, kde každý z nich má hydroxylovú, amino alebo tiolovú skupinu na 3'-zakončení a nemá žiadnu koncovú fosfátovú sku pinu a s väčšinou j-mér oligonukleotidov, ktoré majú hydroxylovú, amino alebo tiolovú skupinu na 5'-zakončení a nemajú žiadnu koncovú fosfátovú skupinu; (b) chemická alebo enzymatická ligácia oligonukleotidov na pevný nosič z kroku (a) ; (c) odstránenie neligovaných oligonukleotidov z pevného nosiča z kroku (b); a (d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov zostávajúcich na pevnom nosiči za získania nmér nukleotidov komplementárnych k tým, ktoré sú prítomné vo vzorke; kde h, i a j sú každé číslo vybraté z čísiel 6 až 10 000, najvýhodnejšie 18 až 60, za podmienky, že h+i+j=n.
V inom hľadisku tohoto vynálezu je popísaný prvok stanovenia, obsahujúci substrát, ktorý má na povrchu rôzne plochy prispôsobené na naviazanie molekuly spacera; väčšina molekúl spacer je pripojených na prvé zakončenie uvedeného povrchu v každej z rôznych plôch, každá z týchto molekúl spacera je prispôsobená na pripojenie svojim druhým zakončením ku kovovému povrchu alebo ku značke, každá z uvedených molekúl spacera má miesto schopné štiepenia medzi svojim prvým zakončením a svojim druhým zakončením; prvý n-mér oligonukleotid má prvú sekvenciu pripojenú v podstate ku všetkým molekulám spacera medzi miestom štiepenia a prvým zakončením molekuly spacera a druhý n-mér oligonukleotid má druhú sekvenciu pripojenú v podstate ku všetkým molekulám spacera; kde v podstate žiadne iné plochy na povrchu substrátu neobsahujú molekuly spacera s n-mér oligonukleotidmi, ktoré majú k nim pripojenú prvú sekvenciu a n je číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28.
Tento vynález tiež zahrňuje spôsob stanovenia sekvencie (p+q+r)-mér segmentu génu predpokladaného, že je prítomný vo vzorke. Spôsob tvorí: (a) vytvorenie roztoku vzorky a zmesi q-mér oligonukleotidov, ktoré majú všetky možné sekvencie qmér oligonukleotidu, alebo voliteľne podskupinu všetkých ta kýchto možných sekvencií; (b) styk prvku pre stanovenie s aspoň časťou roztoku z kroku (a), prvok má na povrchu naviazané množstvo molekúl spacera, molekuly spacera majú prvé zakončenie naviazané k povrchu a druhé zakončenie naviazané na kovový povrch, alebo značku a miesto štiepenia medzi prvými a druhými zakončeniami, molekuly spacera majú prvý p-mér oligonukleotid pripojený medzi miesto štiepenia a prvé zakončenie a druhý r-mér oligonukleotid pripojený medzi miesto štiepenia a druhé zakončenie, kombinácia p-mérov a r-mérov vrátane všetkých kombinácii sekvencií oligonukleotidov p-mér a r-mér oligonukleotidov, alebo voliteľne podskupina všetkých takýchto kombinácií, každá jednotlivá kombinácia sekvencií pmér a r-mér oligonukleotidov sa nachádza na povrchu na vopred určenom mieste; (c) ligácia výsledných hybridizovaných oligonukleotidov pripojených k molekulám spacera z kroku (b) vyššie; (d) detekcia prítomnosti alebo neprítomnosti príslušnej kombinácie sekvencie hybridizovaných oligonukleotidov na každom vopred určenom mieste na povrchu; a (e) spracovanie sekvenčnej informácie z kroku (d) pre odvodenie sekvencie (p + q + r)-mér oligonukleotidu prítomného vo vzorke, kde p, q a r sú čísla vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 16, a (p+q+r) nie je viac ako 30 000 a najvýhodnejšie 60. Kroky (a) až (e) môžu byť uskutočnené paralelne pre rôzne, viacnásobné segmenty génu.
Popis obrázkov
Vynález bude lepšie pochopený pomocou nasledujúcich obrázkov, kde:
Obrázok 1 je schematické znázornenie syntézy rôznych nmér oligonukleotidov na pevnom povrchu.
Obrázok 2 schematický znázorňuje spôsob používajúci pevný nosič z Obrázku 1 na selekciu n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej zmes oligonukleotidov rôznej n-mér dĺžky.
Obrázok 3 je schémou lineárnej amplifikácie pre získanie n-mér oligonukleotidov zo vzorky použitím pevného nosiča.
Obrázok 4 schematický znázorňuje amplifikáciu pre získanie vzorky označených oligonukleotidov.
Obrázok 5 schematický znázorňuje spôsob prípravy oligonukleotidov konštantnej dĺžky použitím ligázy.
Obrázok 6 schematický znázorňuje spôsob prípravy oligonukleotidov konštantnej dĺžky použitím chemickej ligácie alebo lipázy.
Obrázok 7 schematický znázorňuje dve komplementárne matrice použité pri príprave bio-kompaktných diskov, ktoré majú naviazané na svojom povrchu oligonukleotidy.
Obrázok 8 je schematické znázornenie uskutočnenia použitím matríc z Obrázku 7 pre printing, kde stacionárne oligonukleotidy, ktoré majú byť pripojené sú na stenách vrysov vytvorených matricou.
Obrázok 9 schematický znázorňuje použitie vybraného rozpoznania (8,{10},8)-rozpoznanie, pre stanovenie sekvencie asi 16-mérov vyskytujúcich sa dvakrát na chromozóme.
Obrázok 10 je schémou matrice, ktorá má hydrofilné otvory v hydrofóbnom povrchu.
Obrázok 11 je schematickým znázornením matrice z Obrázku 10, kde sú latexové guličky chemicky viazané v otvoroch.
Obrázok 12 zaznamenáva rozpoznanie (4,4)-mér oligonukleotidov použité pre stanovenie sekvenčnej informácie vzťahujúcej sa k fragmentu génu.
Obrázok 13 zaznamenáva rozpoznanie (4,{5},4)-mér oligonukleotidov použité pre stanovenie sekvenčnej informácie vzťahujúcej sa k fragmentu génu.
Obrázok 14A schematický znázorňuje rozdelenie disku. Prvá frakcia môže byť v centrálnej, šestnásť kompartmentovej ploche. Frakcie môžu byť ďalej rozdelené špirálovité alebo kapilárne. Obrázok 14B zaznamenáva, že ďalšie frakcie môžu byť vytvorené po pripojení iného disku k disku vyobrazenému na Obrázku 14A. Obrázok 14C je horný pohľad prekrížení kapilár a jednej zóny jednej triedy oligonukleotidov.
Obrázok 15 schematicky zaznamenáva centrálnu rozdelenú plochu. Vzorka môže cirkulovať okolo tohoto miesta, v tomto konkrétnom uskutočnení obsahuje šestnásť kompartmentov. Každý kompartment obsahuje sondy pre špecifickú podtriedu oligonukleotidov.
Obrázok 16 zaznamenáva, že oligonukleotidy môžu byť eluované do kapilár otáčaním disku po denaturácii.
Podrobný popis vynálezu.
Významné informácie rovnako aj dodatočné návody pre rozdielne uskutočnenia podľa tohoto vynálezu v rozsahu pripojených patentových nárokov možno nájsť v PCT/US97/11826, teraz verejne dostupné v publikovanej forme, objasnenie ktorých je tu plne zahrnuté.
Príprava vzorky
Usporiadania nukleotidov dávajú veľký prísľub pre sekvenovanie génu. V súčasnosti sa tieto spôsoby väčšinou obmedzujú na kontrolu génu, ktorého sekvencia je známa s výnimkou niektorých špecifických bodov, a len obmedzené množstvo oligonukleotidov je potrebné pre usporiadanie. De novo sekvenovanie je ťažšie, pretože veľmi veľké usporiadania, obsahujúce všetky možné oligonukleotidy konštantnej dĺžky, je ťažko uskutočniť. Tiež oligonukleotidy náhodnej dĺžky spôsobujú vo vzorke komplikácie. Môžu navzájom hybridizovať medzi sebou silnejšou väzbou ako s oligonukleotidmi sondy. Oligonukleotidy optimálnej dĺžky hybridizujú rýchlejšie a presnejšie ako oligonukleotidy, ktoré sú veľmi dlhé. Tento vynález popisuje štyri spôsoby, ktoré môžu byť použité pre prípravu oligonukleotidov jednotnej dĺžky z akejkoľvek vzorky DNA. Okrem toho, tieto spôsoby môžu byť použité tak, že spracovávaná vzorka obsahuje všetky základné oligonukleotidy jednotnej dĺžky, ktoré nemajú komplementárny oligonukleotid v zmesi, t.zn., že nemôžu tvoriť duplexy. Je to veľmi výhodné pre spôsoby usporiadania oligonukleotidov, ktoré sú všetky založené na hybridizácii medzi vzorkou a oligonukleotidmi sondy. Hybridizácia je limitovaná, napríklad, keď centrálny nukleotid má adenozín alebo cytozín (AC-párovanie) vo všetkých oligonukleotidoch jednotnej dĺžky vo vzorke. Takže dva oligonukleotidy vo vzorke nie sú schopné hybridizovať navzájom medzi sebou a namiesto toho sú schopné úplne hybridizovať len s oligonukleotidmi sondy v usporiadaní.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je vysokoúčinný spôsob amplifikácie DNA. PCR má však vážne nedostatky, keď sa použije v spôsoboch usporiadania oligonukleotidu a pri intenzívnom de novo sekvenovaní, ako je sekvenovanie celého chromozómu súčasne. Pre zahájenie reakcie pri PCR sú potrebné krátke priméry. Aby sa úplne pokryl chromozóm primérmi, musí byť s istotou známa podstatná časť sekvencie. Každý cyklus PCR má tiež tendenciu poskytovať kratšie oligonukleotidy ako predchádzajúci cyklus. Znamená to, že rôzne segmenty chromozómu sú prítomné nepravidelne a niektoré časti nemusia byť vôbec prítomné po PCR amplifikácii neznámej vzorky.
Ligázová reťazová reakcia (LCR) poskytuje oligonukleotidy jednotnej dĺžky, keď je známa sekvencia. Jeden spôsob v tejto žiadosti popisuje rozšírenia LCR pre všeobecný prípad, keď nie je vopred potrebné poznanie sekvencie.
De novo sekvenovanie si vyžaduje usporiadania vysokej hustoty. Toto sa v minulosti dosiahlo pomocou litografických spôsobov. Napriek používaniu, tento spôsob si vyžaduje velmi komplikované zariadenia a môže viesť k tvorbe významného množstva nečistôt. V tejto žiadosti sú popísané dva spôsoby printingu, ktoré umožňujú presnosť vyjadrenú v mikrometroch. Ako ukazujú Obrázky 10 a 11, prvý spôsob využíva imobilizované porózne latexové guličky na hydrofóbnom povrchu. Latexové guličky môžu byť navlhčené chemickým roztokom, ako oligonukleotid vo vode, a tlačené oproti inému povrchu, ktorý je schopný viazať jednu zo zložiek (oligonukleotid). Tento spôsob si všeobecne vyžaduje kroky printingu, ale je užitočný pre vytvorenie hlavnej matrice pre komplementárny printing. Komplementárna matrica je chemicky modelovaná tak, že môže viazať na špecifické miesto určitú zložku z komplikovanej zmesi. Matrica môže obsahovať milióny rôznych miest pre rôzne zložky. Po premytí sú odstránené všetky nenaviazané zložky a matrica je vystavená kontaktu s povrchom, ktorý je schopný chemicky viazať požadované komponenty. Komponenty sú uvoľnené z matrice, potom difundujú kanálikom a reagujú s aktívnym povrchom. Takže milióny chemických zložiek, ako sú oligonukleotidy, môžu byť prenesené s presnosťou vyjadrenou v mikrometroch jedným krokom printingu. Opakovaním procesu môže byť vytvorená miliarda párov oligonukleotidov. Žiadne iné spôsoby, litografické, alebo konvenčný printing neumožňujú vytvoriť model takej hustoty len v dvoch krokoch. Okrem toho, nie sú potrebné komplikované zariadenia.
Vysokoúčinný printing jednej chemickej látky je dobre známy. Tiež je dobre známy chemický printing, pri ktorom rôzne chemické látky sú nanášané na povrch pozdĺž kanálikov. Tento spôsob skutočne umožňuje tvorbu usporiadaní, ale hustota nie je veľmi veľká. V dôsledku potreby prietoku nemôžu byť kapiláry rovné. Hoci stovky takýchto kapilár môžu byť jednou matricou, nie je mysliteľné, že milióny prietokových kapilár môže mať povrch vhodnej veľkosti. Na druhej strane, milióny kanálikov mikrometrovej veľkosti môže byť vtlačených na plastický materiál. Tieto kanály sa môžu stať hydrofilnými a každý z nich môže byť pokrytý určitým oligonukleotidom použitím buď fotolitografie, alebo výhodnejšie sadou latexových guličkových matríc, popísaných osobitne v tejto žiadosti.
Bolo by neuveriteľným úspechom pripraviť také usporiadanie oligonukleotidu, ktorý by bol schopný bez pochybnosti sekvenovať jeden ľudský chromozóm. Až doposiaľ usporiadania oligonukleotidov boli schopné de novo sekvenovať asi 2 000 párov báz (bps). Kontrola sekvenovania môže byť uskutočnená pre oveľa dlhšie sekvencie, napríklad 20 000 bps. Jeden chromozóm môže obsahovať 250 miliónov bps, čo je asi 100 000 krát viac, ako môže byť bežne sekvenované súčasným usporiadaním oligonukleotidov. Spôsoby prípravy vzorky a bio-kompaktného disku vysokej hustoty, popísané v tejto žiadosti, značne zlepšujú sekvenovanie. Avšak vhodný protokol pre sekvenovanie je zásadne dôležitý pre získanie spoľahlivých výsledkov pri minimalizácii počtu bio-kompaktných diskov, ktoré musia byť použité.
Spôsob v tejto žiadosti je nasledovný: 1) stanovenie všetkých 16-mér oligonukleotidov, ktoré sú časťou chromozómu; a 2) stanovenie 8-mér zakončení vo všetkých 27-mér oligonukleotidoch bez poznania strednej 11-mér sekvencie v týchto 27méroch. Skutočné čísla sú len príkladmi a sú možné mnohé obmeny tohoto spôsobu. Tieto dve sady dát možno získať pomocou podobnej sady bio-kompaktných diskov, t.zn. diskov, ktoré používajú (8,8) rozpoznanie. Sada dát 1 (všetky 16-méry) umožňuje stanoviť centrálnu 11-mér sekvenciu v každom 27-mére v sade dát 2. Takže budú známe všetky 27-mér sekvencie, ktoré sú časťou celkovej sekvencie. Umožní to takmer jednoznačné odvodenie pôvodnej sekvencie. Len niektoré opakované dlhé sekvencie sú mimo schopnosti tohoto spôsobu. Dokonca aj v takýchto prípadoch sú známe alternatívne sekvencie. Potrebné oligonukleotidy môžu byť pripravené na požiadanie, aby sa konečne odvodili dlhé opakujúce sa sekvencie.
Vo všetkých stanoveniach bio-čip pre usporiadanie DNA majú stacionárne oligonukleotidy určitú dĺžku, napr. sú to mméry, kde m je určité číslo medzi 8 a 30 v danom bio-čip usporiadaní. Vzorka sa pripraví náhodnou hydrolýzou, buď chemicky alebo enzymaticky. Vzorka obsahuje oligonukleotidy, ktoré majú rôznu dĺžku. Avšak aby sa predišlo nadbytočnej hydrolýze, cieľová dĺžka je asi 50 báz (50-mér). Veľká a rôzna dĺžka spomaľuje hybridizáciu a môže viesť k neželaným reakciám. Ideálna vzorka obsahuje oligonukleotidy konštantnej dĺžky, n-méry, kde n sa rovná, alebo je trochu väčšie ako dĺžka stacionárnych oligonukleotidov, ktorými sú m-méry (n>m). Nižšie sú popísané štyri obmeny postupu, ktorý poskytuje oligonukleotidy konštantných a želateľných dĺžok.
SPÔSOB 1 (Nukleáza S. Obr. 1: Syntéza kompletnej zmesi nmérov; Obr. 2: Príprava n-mérov z oligomérov rôznej dĺžky; a Obr. 3: Lineárna amplifikácia).
Po prvé, všetky možné oligonukleotid n-méry sú syntetizované na pevnom nosiči. Dosiahne sa to ľahko v každom kroku pripojenia ekvimolárnou zmesou fosforamidov adenozínu, cytozínu, guanozínu a tymidínu, alebo iných derivátov týchto nukleotidov. Na Obr. 1 sú znázornené dva kroky syntézy. Po n krokoch pripojenia sú všetky n-méry na vybranom pevnom nosiči. Týmto spôsobom môže byť prakticky syntetizovaná kompletná zmes oligonukleotidov do 26-mér. Tabuľka 1 uvádza počet molekúl určitého oligonukleotidu n-méru v 10 miligramoch zmesi (hmotnosť nosiča nie je zahrnutá).
Existuje určité štatistické kolísanie v množstvách rôznych n-mérov v zmesi. Pre 28-méry sa očakáva, že niekoľko možných oligonukleotidov nie je prítomných vôbec v 10-miligamovej zmesi, zataľ čo niektoré iné majú viac ako 20 kópií, takže priemerný počet kópií je 11. Kolísanie je nevýznamné pre 24-méry, pretože všetky možné 24-méry majú viac ako 20 x 103 kópií v 10-miligramovej zmesi, a to je tak kompletnou zmesou.
Fragmenty oligonukleotidov vo vzorke sú hybridizované s kompletnou zmesou n-mérov naviazanou na pevnom nosiči (Obr. 2). Pridá sa hydrolyzačná látka, ako Nukleáza S, ktorá hydrolyzuje jednovláknitú DNA. Voči hydrolýze sú chránené len segmenty hybridizovaných oligonukleotidov. Nadbytky oligonukleotidov vo vzorke sú väčšinou odstránené. Tiež sú hydrolyzované stacionárne n-méry na pevnom nosiči, ktoré nemajú partnerské oligonukleotidy vo vzorke (Obr. 2) . Nie je potrebné aby úspešná hydrolýza bola ideálne kompletná. Napríklad, keď n je 16, užitočný rozsah oligonukleotidov vo vzorke je medzi 16- a 22 mérmi použitím bio-kompaktného disku. Podobne, keď stacionárne n-méry sú len čiastočne hydrolyzované, zvyšné n-méry môžu byť použité pre amplifikáciu vzorky.
Pevný nosič obsahuje po hydrolýze, ako napríklad pôsobením Nukleázy S, stacionárnu sadu n-mérov, ktoré sú komplementárne k oligonukleotidom vo vzorke. Hybridizáciou rozpustnej n-mér zmesi s touto stacionárnou fázou, ako ukazuje Obr. 2, sa získa kompletná kópia n-mérov vzorky. Postup možno opakovať niekoľkokrát, ale je neúčinný nakoľko amplifikácia je lineárnou funkciou času a úsilia. Tento postup môže byť modifikovaný tak, aby bol exponenciálny pomocou PCR amplifikácie alebo analogickými spôsobmi známymi v odbore.
Keď základný výber je párovaný v určitom mieste n-mérov, počet molekúl je príslušne väčší. Napríklad, keď v strede týchto oligonukleotidov sú len adenozin a cytidin (AC-párovanie), počet kópií pre každý n-mér je dvakrát číslo uvedené v Tabuľke 1. Zásadné obmedzenie sa dosiahne použitím, v špecifickom kroku, zmesi vhodných derivátov adenozínu a cytidinu. AC-párované 25-méry sú kompromisom, ktorý umožňuje prípravu vzorky a spoľahlivé sekvenovanie.
SPÔSOB 2 (Len hybridizácia; Obr. 3 a 4: Amplifikácia označených alebo aktivovatelných m-mér oligonukleotidov.)
Namiesto pripojenia kompletnej zmesi oligonukleotidov na pevný nosič, môžu byť pripojené fragmenty oligonukleotidov. Pevným nosičom môžu byť kremíkové častice, magnetické guličky alebo kapiláry. Na naviazanú vzorku pôsobí kompletná zmes nmérov, ktorá môže voliteľne obsahovať značku (ako fluoresceín alebo enzým), alebo reakčnú funkčnú skupinu (ako tiol). Nehybridizované oligonukleotidy n-méry sú odmyté. Zahriatím sú odstránené a potom zozbierané hybridizované n-méry, za vzniku sady n-mér oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne k n-mér oligonukleotidom vo vzorke. Postup môže byť opakovaný toľkokrát, koľko je potrebné.
SPÔSOB 3 (Ligácia, Obr. 5: Príprava oligonukleotidov konštantnej dĺžky použitím ligázy.)
Je to obmena Metódy 2 a je zaznamenaná na Obr. 5. Keď „n je väčšie číslo, napríklad väčšie ako 30, príprava kompletnej zmesi n-mérov nie je praktická. Okrem toho, keď n je veľké číslo, je problémom nesprávne párovanie medzi nukleotidmi. Týmto problémom sa možno vyhnúť použitím kompletných zmesí k-mérov a m-mérov, kde k+m=n. V tomto spôsobe 3'zakončenie k-mérov neobsahuje voľnú hydroxylovú skupinu a 5'zakončenie m-mérov neobsahuje voľný fosfát. Možno to dosiah nuť použitím k-mérov, ktoré majú na 3'-zakončení dideoxy alebo hydroxy skupinu, a ktoré môžu byť fosforylované alebo obsahovať značku, ako fluoresceín. 5'-zakončenie m-mérov môže mať hydroxylovú skupinu, značku alebo aktívnu funkčnú skupinu. Po hybridizácii je zmes ligovaná. Ligáciou môžu byť spojené len dva oligonukleotidy. Neligované oligonukleotidy sú odstránené zvýšením teploty a premytím. Keď m-méry majú voľnú hydroxylovú skupinu na 5'-zakončení, táto hydroxylová skupina môže byť voliteľne fosforylovaná. Nový oligonukleotid môže byť ligovaný na 5'-zakončení. Tento postup sa môže opakovať niekoľkokrát. Po dehybridizácii sú zozbierané n-mér oligonukleotidy, ktoré sú komplementárne s n-mér oligonukleotidmi prítomnými vo vzorke.
SPÔSOB 4 (Chemická ligácia, Obr. 6: Príprava oligonukleotidov konštantnej dĺžky použitím chemickej ligácie.)
Vynikajúce výsledky sa môžu dosiahnuť vtedy, keď' tri oligonukleotidy vo vzorke, h-mér, k-mér a m-mér vytvoria spolu po ligácii oligonukleotid n-mér. Chemická ligácia je veľmi účinná metóda, hoci môžu byť použité tiež enzýmy.
Ako zaznamenáva Obr. 6, v tomto prípade sú opäť použité všetky oligonukleotidy ako kompletné zmesi. Jedna séria má fosfátovú skupinu na oboch zakončeniach, zatiaľčo ďalšie dve nemajú koncové fosfáty, alebo tieto nie sú v aktívnej forme. Jedna kompletná zmes má hydroxylové, amino alebo tiolové skupiny na 3'-zakončení, kým iné majú podobné skupiny na 5'zakončení. Keď takéto tri typy oligonukleotidov sú hybridizované a správne uložené (hlava ku chvostu) navzájom, sú schopné vytvoriť chemickú väzbu navzájom medzi sebou. Dosiahne sa to najlepšie vtedy, keď fosfátové skupiny sú aktivované. Môžu byť napríklad, triestry v ktorých dve z esterifikovaných skupín sú pentafluorofenyly alebo podobné, dobre odstupujúce skupiny. Po naviazaní, nadbytočný pentafluorofenyl môže byť voliteľne odhydrolyzovaný. Po dehybridizácii sa uskutoční zozbieranie n-mér oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne s n-mér oligonukleotidmi prítomnými vo vzorke.
TRANSFORMÁCIA LINEÁRNEJ AMPLIFIKÁCIE NA EXPONENCIONÁLNU AMPLIFIKÁCIU
Vyššie popísané štyri spôsoby amplifikácie a tiež iné analogické lineárne amplifikačné postupy môžu byť nasledujúcou metódou transformované na exponencionálne postupy.
Pri lineárnej amplifikácii sa používajú oligonukleotidy vzorky ako templátová sada pre prípravu komplementárnej sady oligonukleotidov. Postup môže byť opakovaný niekoľkokrát, ale každýkrát sa získa približne rovnaký počet komplementárnych oligonukleotidov. Po zmiešaní týchto oligonukleotidov je celkový počet oligonukleotidov lineárne závislý od počtu amplifikačných krokov.
Pre transformáciu lineárneho spôsobu na exponencionálny postup sú komplementárne oligonukleotidy získané v prvom kroku upravené tak, že obsahujú ochrannú tiol skupinu, ako tiolacetát, alebo alifatickú amino skupinu. Po denaturácii sú tieto oligonukleotidy prenesené na druhú kolónu, ktorá obsahuje reaktívnu skupinu schopnú viazať alifatickú amino alebo tiolovú skupinu, ako napríklad maleimido alebo izokyano skupiny. Počas prenosu sa pridá činidlo odoberajúce ochranné skupiny, ako hydroxylamín, a tým sa odkryje tiolová skupina. Komplementárne oligonukleotidy sa okamžite naviažu na pevný nosič. Tento nosič môže byť tiež použitý ako templát lineárnej amplifikácie. Amplifikovaný oligonukleotid je komplemen tárny ku komplementárnemu oligonukleotidu, t. zn., že je identický s pôvodným oligonukleotidom vo vzorke, s výnimkou, že obsahuje ochrannú alifatickú amino alebo tiolovú skupinu. Tento produkt sa nanesie na pôvodnú kolónu, ktorá obsahuje rovnaký aktívny pevný nosič, ktorý je schopný viazať tiolovú skupinu derivátov oligonukleotidov po odstránení ochranných skupín. Prvá kolóna obsahuje teda dvojnásobné množstvo oligonukleotidov, ktoré sú identické s oligonukleotidmi vo vzorke. Keď sú tieto oligonukleotidy použité ako amplifikačné templáty, získa sa dvojnásobný počet komplementárnych oligonukleotidov. Po ich väzbe na druhú kolónu, bude táto kolóna obsahovať trojnásobný počet komplementárnych oligonukleotidov pri porovnaní s prvým cyklom. Postup možno opakovať niekoľkokrát. Amplifikácia po n krokoch sa získa približne z rovnice:
a = 5 x l,62n 4 kde a je amplifikačný koeficient, t.zn., koľkonásobné je zvýšenie počtu oligonukleotidov pri porovnaní s pôvodnou vzorkou. Zvýšenie je exponencionálne, ale počet sa optimálne nezdvojnásobuje v každom cykle tak, ako pri PCR. Významnou výhodou oproti PCR je to, že pri tomto spôsobe vzorka a sada komplementárneho oligonukleotidu sú oddelené. Je to veľmi dôležité pri použití bio-čip usporiadania, pretože tieto spôsoby sú veľmi závislé na hybridizácii. Keď každý oligonukleotid vo vzorke má svojho komplementárneho partnera v zmesi, bude hybridizácia usporiadaním neúčinná.
PRÍPRAVA BIO-KOMPAKTNÉHO DISKU VYSOKEJ HUSTOTY
V prvom kroku sekvenovania sú bio-kompaktné disky (BCD) navrhnuté tak, aby rozpoznávali všetky 16-méry vo vzorke. Dosiahne sa to(8,{0},8)-rozpoznaním, t.zn., spacer má dve 8mérové bočné ramienka a použijú sa nerozpustné oligonukleo tidové sondy. Toto rozpoznanie bude znamenať tiež (8,8) rozpoznanie. Existuje asi 64 x 103 rôznych 8-mérov a 4,3 x 109 rôznych párov dvoch 8-mérov (Tabuľka 4). Určitá plocha obsahujúca jednu zlatú guličku sa nazýva biobit.·Plocha každého biobitu je asi 100 μιη2. Táto plocha je pokrytá stovkami spacerov, ktoré majú podobné (8,8)-páry oligonukleotidov ako bočné ramienka. Každý biobit by mal obsahovať len jeden typ (8,8)-páru oligonukleotidov a musí byť prítomný najmenej jeden biobit pre každý možný rozdielny pár 8-méru. V súčasnosti dostupné CD-ROM čítače sú schopné prečítať 0,6 x 109 bitov z jedného kompaktného disku (CD). Takže je potrebných asi osem BCD pre všetky možné kombinácie 8-mérov. Použitím modrých polovodičových laserov namiesto IR-laserov môže byť hustota CD niekoľkonásobne zvýšená, potencionálne 20x. Odzrkadlí sa to temer v lineárnom zvýšení účinnosti BCD.
Spôsob tu popísaného komplementárneho printingu sa môže použiť na prípravu komplikovaných vysokoúčinných modelov v jednom kroku, potom ako bola vytvorená komplementárna matrica (Obr. 7). Pre vytvorenie komplementárnej matrice sú potrebné fotolitografické spôsoby alebo porovnateľné vysokoúčinné spôsoby modelovania. Všetky nižšie bočné ramienka oligonukleotidov môžu byť otlačené v jednom kroku použitím jednej komplementárnej matrice. Podobne, všetky vyššie vedľajšie ramienka oligonukleotidov môžu byť otlačené v jednom kroku. Takže sú potrebné dve matrice pre prípravu jedného BCD. Pretože musí byť pripravených osem rôznych BCD, je celkové množstvo rôznych matríc 16.
PRÍPRAVA KOMPLEMENTÁRNEJ MATRICE
Jedna komplementárna matrica môže byť použitá niekoľko stokrát. Avšak príprava jednej komplementárnej matrice môže vyžadovať desiatky fotolitografických alebo značiacich kro17 kov. Spôsob „printingu (vtláčania) v tejto žiadosti má zásadnú výhodu pred litografickými spôsobmi v tom, že oligonukleotidy môžu byť prečistené pred ich naviazaním na povrch.
Je tu popísaná príprava komplementárnych matríc, ktoré môžu byť použité pre (8,8)- a (8,(11),8)- stratégiu rozpoznávania. Celkovo musia byť pripravené štyri rôzne páry komplementárnych matríc, každý pár je chemicky identický, t.zn., že obsahujú rovnakých 16 384 oligonukleotidov (8-mérov), ale špirálovité kanáliky majú opačný smer (Obr. 7). Pretože existuje 65 536 rôznych 8-mér oligonukleotidov, sú potrebné štyri matrice, aby obsahovali úplnú sadu (4 x 16 384 = 65 536) . Všetkých možných 16 kombinácii v smere hodinových ručičiek a proti smeru hodinových ručičiek špirálových matríc dáva 4,3 miliárd rôznych 16-mér oligonukleotidov vytvorených ako páry všetkých možných 8-mér oligonukleotidov (Tabuľka 4).
Po prvé, špirálovité kanáliky (16 384) sú vtlačené do mäkkého polykarbonátu. Každý kanálik je široký asi 4 pm a hlboký 1 až 2 pm. Je to podobné ako u kompaktného disku, kde mikrorozmery sú štandardným rozmerom. Je výhodné aby výsledná matrica mala hydrofóbne hrebene a hydrofilné kanáliky. Hrebene sú široké tiež 4 pm. Pre tento účel je disk pokrytý odolnou a rovnakou matricou, ktorá bola použitá pre vtlačenie špirálovitých kanálikov, na odhalenie dna kanálikov. Pre odstránenie zvyškov ochranného povrchu z kanálikov sa použije vyškrabávanie kyslíkom. Povrch sa pokryje amino skupinami z plazmy. Z hrebeňov sa odstráni ochranná vrstva. Polyetylénglykolové spacere, ktoré majú napríklad izotiokyanátové skupiny na oboch koncoch, sú pripojené k aminoskupinám. Použitím nadbytku spacerov bude len jeden koniec naviazaný na nosič a druhý koniec môže byť použitý pre väzbu s oligonukleotidmi, ktoré majú dodatočnú alifatickú aminoskupinu.
Špirálovité kanáliky (16 384) sú výhodne usporiadané do
256 skupín v 64 kanálikoch (256 x 64 = 16 384). Tieto skupiny sú oddelené tak, že môže byť použitý spôsob ink-jet, alebo iný ekvivalentný spôsob na pokrytie jednej skupiny určitým 4mér oligonukleotidom s alifatickou aminoskupinou. Takže, známy 4-mér oligonukleotid je v 64 rôznych susediacich kanálikoch. Každý z 256 možných 4-mérov sa nachádza v jednej z 256 skupín kanálikov len jediný raz. Ďalší krok je uloženie 64 rozdielnych 4-mér oligonukleotidov oddelene na každý zo 64 kanálikov v jednej skupine a chemické naviazanie s prvým 4mér oligonukleotidom. Na jednom disku, všetky tieto druhé 4mér oligonukleotidy môžu mať rovnaký koncový nukleotid, napríklad, A. Po príprave štyroch chemicky rozdielnych diskov sa objavia všetky oligonukleotidy (A, C, G a T) na koncových polohách jedného disku. Keďže existuje 256 rôznych skupín, každý zo sekundárnych 4-mér oligonukleotidov sa objaví 256 krát na tom istom disku. Sekundárne 4-mér oligonukleotidy môžu byť vtlačené na všetky tieto miesta súčasne. Aby sa vyhlo kontaminácii, každý oligonukleotid by mal byť vtlačený príslušnou matricou. Všetky matrice majú presne rovnaký vzhľad. Majú 256 rovnakých (asi 0,6 mm) špirálovitých kanálikov. Jeden špirálový kanálik je široký 5 až 8 pm. Kanáliky môžu byť hydrofilné a plocha medzi nimi je hydrofóbna. Po navlhčení roztokom oligonukleotidu, roztok zadržia len kanáliky a roztok je čiastočne prenesený po kontakte so substrátom. Iný spôsob je vyškrabanie hydrofilných otvorov na spodu kanálikov, ktoré sú v tomto prípade hydrofóbne (Obr. 10). Výhodne sú tieto otvory pokryté latexovými guličkami, ktoré sú porézne, hydrofilné a elastické (Obr. 11) . Kanálik samotný je hydrofóbny, takže celý roztok je zachytený v guličkách. Umožňuje to lepšiu kontrolu množstva roztoku a umiestnenie roztoku po matrici a na substráte. Guličky sú chemicky naviazané na matricu pomocou konvenčnej chemickej väzby vhodnej pre la texové guličky, napríklad, použitím amidovej väzby medzi spacerom a latexovou guličkou. Pre silnejšiu väzbu je možné aby latexová gulička bola umiestnená v zube matrice.
Analógy oligonukleotidu môžu nahradiť oligonukleotidy popísané vyššie. Je to zvlášť žiadúce v komplementárnej matrici, pretože niektoré analógy oligonukleotidu sa ľahšie viažu vo vodných roztokoch ako samotné oligonukleotidy. Napríklad, použitím vo vode rozpustného karbodiimidu, 4-méry obsahujúce aminoskupinu sa môžu viazať s iným 4-mérom obsahujúcim karboxylovú skupinu. Okrem toho, analógy oligonukleotidu dávajú silnejšiu hybridizáciu ako samotné oligonukleotidy a sú užitočné v komplementárnej matrici a pri konečnom usporiadaní oligonukleotidu.
PRÍPRAVA BIO-KOMPAKTNÉHO DISKU
V nasledujúcom popise sa predpokladá, že všetky matrice sú už hotové. Najprv sú vtlačené nižšie bočné ramienka oligonukleotidov a je pripravená celá zmes 8-mérov. Syntéza sa uskutoční tak, že 3'-zakončenie oligonukleotidov sa pripojí k polyetylénglykolovému (PEG) spaceru, ktorý má tiolovú skupinu na druhom konci. (Alternatívne môže byť tiolová skupina na substráte na stacionárnom spaceri a izokyano alebo maleimidová skupina môžu byť na PEG spaceri.) Na navlhčenie matrice sa použije roztok celkovej zmesi ako atrament (Obr. 7, vľavo hore). Pri jednej konfigurácii matrice sú stacionárne oligonukleotidy na stenách žliabku hlbokého 1 pm (Obr. 8: Konkávny komplementárny printing). Po hybridizácii je prebytok oligonukleotidov odmytý. Mokrá matrica je pevne stlačená oproti BCD, ktorý má maleimidové skupiny v dolnej časti spacera. Tiolové skupiny sa naviažu veľmi pevne s maleimidovými skupinami. Pre relatívne veľkú vzdialenosť, môže v tomto stave vzniknúť len málo väzieb. Pre uvoľnenie oligo nukleotidov a ukončenie reakcie, je tenká vrstva vody zahriata mikrovlnami alebo infračerveným ožiarením počas asi jednej minúty. Oligonukleotidy sú uvoľnené z matrice a ponechajú sa difundovať. Oligonukleotid môže difundovať 1 pm za sekundu a 8 pm za minútu. Z dôvodu nadbytku maleimidových skupín, všetky tiolové deriváty oligonukleotidov budú účinne naviazané. Printing je ukončený a matrica môže byť odstránená. Molekuly spacera, ktoré môžu byť štiepené, majú teraz úplné nižšie vedľajšie ramienko. Ochranná skupina je odstránená z vyššieho vedľajšieho ramienka a printing je opakovaný aby sa vložili oligonukleotidy vyššieho vedľajšieho ramienka (Obr. 7.: Matrica v pravo hore). V tomto prípade 5'-zakončenie oligonukleotidu je spojené s polyetylénglykolovým spacerom. Po premytí a vysušení je BCD pripravený pre použitie.
SEKVENOVANIE
Namiesto sekvenovania celého genómu naraz, chromozómy môžu byť oddelené a môžu byť rozpojené dva reťazce každého chromozómu. Stačí sekvenovať len jeden reťazec každého chromozómu; sekvenovanie druhého je voliteľné a slúži ako dvojitá kontrola. Pre účely sekvenovania je dôležité vedieť, aká je pravdepodobnosť pre n-mér, ktorý je už známy, že sa nachádza v chromozóme druhýkrát. Čím je dlhší oligonukleotid, ktorý je charakterizovaný, tým je menšia pravdepodobnosť, že sa vyskytne druhýkrát. S cieľom dosiahnuť spoľahlivé sekvenovanie, táto pravdepodobnosť by mala byť tak malá, že charakterizované oligonukleotidy sa vyskytujú len raz na chromozóme, t.zn., že táto pravdepodobnosť by mala byť menšia ako 4 x 10 9. Pozorné hodnotenie Tabuľky 2B odhalí, že pre 28-méry je pravdepodobnosť nižšia ako požadovaný limit (1,7 x 109) . Pre 24-méry príslušná pravdepodobnosť je 4,4 x 107, čo zna mená, že asi sto 24-mérov sa môže vyskytovať dvakrát na chromozóme. Takže poznanie 28-mérov zaručuje jedinečnú sekvenciu, kým kratšie oligonukleotidy môžu viesť k pochybnostiam
Existuje asi 65 x 1015 rôznych 28-mérov. Usporiadanie obsahujúce všetky takéto oligonukleotidy by malo plochu 130 akrov za predpokladu, že jeden oligonukleotid obsadí plochu len 10 μπι2. Tento spôsob usporiadania je zjavne nepraktický pre prípravu, proces a čítanie. Na druhej strane, Tabuľka 4 zaznamenáva, že všetky 14-mérové biobity môžu byť na jednom BCD (plocha BCD = 4,2 x 104 mm2). Čisto z praktického hľadiska bude želateľné (7,7)-rozpoznávanie. Ako je vidieť z Tabuľky 2A, daný 14-mér nie je vôbec zistený s pravdepodobnosťou 0, 393 a môže byť nájdený dvakrát a trikrát s pravdepodobnosťou. 0,173 a 0,050. Z dôvodu výskytu opakovaných sekvencií sú tieto pravdepodobnosti vyššie a zodpovedajúce číslo rôznych 14-mérov je nižšie; a je pravdepodobné, že menej ako polovica všetkých možných 14-mérov je nájdená na chromozóme. Avšak je to veľmi vysoká pravdepodobnosť pre užitočné sekvenovanie a 14-méry sú veľmi krátke, aby boli užitočné pre sekvenovanie celého chromozómu naraz.
16-méry môžu byť najkratšími oligonukleotidmi, ktoré dávajú dostatočnú informáciu pre de novo sekvenovanie a sú v medziach praktického limitu BCD. Stratégia sekvenovania je založená na použití BCD pripravených tak, ako je popísané vyššie. Najprv sa použije rozpoznanie (8,(0),8). Poskytne to informáciu o všetkých 16-méroch, ktoré sú súčasťou chromozómu. 16-mér, ktorý je už raz na chromozóme, sa môže vyskytovať s pravdepodobnosťou 0,028 tiež druhýkrát. Berúc do úvahy veľkosť chromozómu, táto pravdepodobnosť naznačuje, že na chromozóme sa môže vyskytovať až milión 16-mérov dvakrát. Každý z nich vedie k miestu uzatvorenia slučky v sekvencií informácie. Je to znázornené na Obr. 9, kde a a β označujú prichádzajúce sekvencie a δ a ε znamenajú odstupujúce sekvencie z určitej 16-bp sekvencie γ. Identické rozvetvenie sa vyskytuje v niektorom inom bode sekvencie získanej týmto spôsobom. Keď sa znázornia všetky body vetvenia, získa sa vzor siete a nie sekvencia. Možné sekvencie nad týmito bodmi vetvenia možno označiť α-γ-δ alebo α-γ-ε a β-γ-δ alebo β-γ-ε (Obr. 9) . Len dve z týchto možností sa nachádzajú na skutočnom chromozóme. Sekvencia γ sa vyskytuje samozrejme v oboch, kým každá z iných sekvencii α, β, δ alebo ε sa vyskytujú len raz. Takže je ťažké zistiť, či sekvencia α-γ-δ alebo α-γ-ε sa nachádza na danom chromozóme. Okamžite sa môže odvodiť, ktorá z iných sa nachádza tiež na chromozóme. Použitá metóda zistí simultánne obe, takže iné môžu byť použité ako dvojitá kontrola.
Aby sa získala jedinečná sekvencia' bez bodov vetvenia mala by byť celková dĺžka stacionárnych oligonukleotidov 26 až 28 nukleotidov. Keďže je to prakticky nemožné, musia byť použité iné prístupy. Jedna možnosť je použiť (8,{11),8) rozpoznávanie ako alternatívu, kde {11} označuje kompletnú zmes 11-mérov. Vzorka sa pripraví tak, ako je uvedené vyššie s výnimkou, že 27-méry sú cieľovou dĺžkou. Oligonukleotidy vzorky sú nanesené na podobnú sadu BCD, ako bolo použité vyššie. Po hybridizácii je pridaná úplná zmes 11-mérov. V niektorých prípadoch zostal dostatočný priestor tiež pre hybridizáciu 11-mérov. Po ligácii sú odstránené všetky ostatné miernym zahriatím a odmytím. Nebude známe, ktoré 11-méry využili tento priestor, ale budú známe oba terminálne 8-méry. Na Obr. 9 je ukázaná len jedna možná hybridizácia. Pozorujú sa všetky možné hybridizácie, t.zn., posun o ±1, ±2, ±3 atď.
nukleotidy. Kombinácia týchto 8-mérov nesie dostatok informácie pre takmer jednoznačný predpoklad sekvencie (Obr. 9B).
(8,{11},8)- rozpoznávanie je v podstate ekvivalentné súťaživému rozpoznaniu 27-mérov. Každým prvkom stanovenia je rozpoznaných len 16 nukleotidov, t.zn., že každá jednotlivá molekula spacera má 8-mérové bočné ramienka, tento vzor rozpoznania poskytuje viac informácie ako rozpoznávanie 16-mérových reťazcov DNA. Je to znázornené na Obr. 12 a 13, kde pre zjednodušenie, je ako príklad použité porovnanie (4,4)- a (4, {5},4)-rozpoznanie. Keď sa určitá sekvencia 8-méru vyskytuje dvakrát v DNA, napr. Ae na Obr. 12, sú možné dve alternatívne sekvencie. Avšak, v analogickom prípade (A4 + A4), ako je ukázané na Obr. 13, (4,{5},4)-rozpoznanie poskytuje nejasný výsledok. Je to preto, že subsekvencie predchádzajúce a následné za degeneráciou obsahujú spoločnú informáciu (podčiarknuté na Obr. 13), t.zn., TATT sekvencia a GTGG sekvencia. Podľa toho, rovnakým spôsobom, možno použiť (8,(11),8)rozpoznanie pre sekvenovanie 27-mérového segmentu bez použitia (8,8)- rozpoznania, hoci je výhodné súčasné použitie oboch pre získanie čo možno najistejších výsledkov.
Pre úplné sekvenovanie genómu sa v praxi používa niekoľko bio-kompaktných diskov. Vo výhodnom uskutočnení sa molekuly spacera spoja s dvomi 8-mérovými bočnými ramienkami oligonukleotidu, jeden medzi každým z dvoch zakončení molekuly spaceru a miestom štiepenia. Všetky možné sekvencie 8mér oligonukleotidov sú prítomné na bočných ramienkach. Umiestnenie každého možného 8-mérového páru sekvencii pripojených k molekulám spacera na povrchu je stanovené tak, že môže byť určená prítomnosť alebo neprítomnosť niektorej určitej sekvencie. Prakticky každý disk môže obsahovať známu podskupinu všetkých možných sekvencii, bio-kompaktný disk musí mať vhodnú veľkosť, aby mohol byť použitý s bežne dostupnými prístrojmi. Pred kontaktom prvku stanovenia, t.zn., povrchu s obsahom vyššie popísaných molekúl spacera pripojených na vopred určených miestach, je zmes rozpustných 11mérových oligonukleotidov, ktoré majú všetky možné sekvencie, pridaná k vzorke, ktorá má byť testovaná, a výsledný roztok je nanesený na povrch bio-kompaktného disku. Príslušné sekvencie fragmentu oligonukleotidu vzorky sa viažu s komplementárnymi sekvenciami molekúl spacera a naviazané segmenty sú ligované. Príslušné sekvencie sú potom stanovené tak, ako už bolo popísané. Pre finančnú úsporu a časové nároky, nadchádzajúca metóda môže byť opakovaná paralelne pre všetky 27mérové segmenty. Získané informácie z 27-mérových segmentov sú potom použité pre stanovenie celkovej sekvencie genómu známymi metódami. Kým vyššie uvedený popis je nasmerovaný pre použitie rozpoznaní (8,{11},8)-mérov, spôsob je aplikovateľný na rozpoznanie (p, {q}, r)-mérov všeobecne, kde p, q a r sú >
čísla vybraté z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 26 a (p+q+r) nie sú viac ako 30 000, najvýhodnejšie 60. Všeobecne je výhodné, aby p = r a q > p. Pretože rozpustná oligonukleotidová sonda (q) by mala byť tak pevne naviazaná, že sa neuvoľni z oligonukleotidu vzorky počas hybridizácie so stacionárnymi sondami (p a r), vyžaduje sa, aby q > p. Môže sa to tiež dosiahnuť použitím rozpustných analógov oligonukleotidov, ako peptidových oligonukleotidov, ktoré veľmi pevne hybridizujú. Pre dosiahnutie konštantnej hybridizačnej teploty p a r by mali byť rovnaké. Aby sa dosiahla pevnejšia väzba mali by byť pripravené dlhšie oligonukleotidové sondy obsahujúce veľmi málo cytidínu alebo guanidínu.
Pre malé genómy a pre sekvenovanie jednotlivých ľudských génov alebo skupín génov p=r=7, a q = 9. V tomto prípade pre sekvenovanie stačí jeden disk.
Pre meranie opakujúcich sa sekvencii, ktoré tvoria väčšiu časť ľudského genómu, p, q a r môžu byť veľmi veľké, asi 100 až 10 000. Na meranie pevnosti väzby môže byť použitá odstredivá alebo elektromagnetická sila. Na kontrolu prítomnosti alebo neprítomnosti medzier v dvojitej zá’vitnici môže byť použitá voliteľne ligácia.
Týmto systémom môže byť meraná úroveň génovej expresie. Často sa dáva prednosť používaniu veľmi veľkých fragmentov rozpoznávania. Šetrí to priestor. Nepresné usporiadanie nie je vážnym problémom pri štúdiu génovej expresie, preto nie je veľkou výhodou použitie menších oligonukleotidových sond.
ROZDELENIE VZORKY
Vzorka obsahujúca fragmenty oligonukleotidov môže byť nanesená priamo na povrch BCD. Je však výhodné, aby vzorka bola rozdelená najmenej na určité podtriedy. Daná podtrieda môže byť umiestnená na určitú plochu povrchu BCD, čo .-zvyšuje pravdepodobnosť hybridizácie a znižuje pravdepodobnosť nepresnosti, keď je správne rozdelenie vzorky a usporiadanie BCD.
Nepresnosť je najhorším problémom pri používaní usporiadania oligonukleotidov. Najčastejšie je nepresnosť medzi oligonukleotidmi, ktoré sa líšia len jedným nukleotidom. Napriek tomu, mnohé usporiadania oligonukleotidov sú vytvorené tak, že susedné oligonukleotidy sa líšia len jedným nukleotidom. Nasledujúci postup umožňuje pripraviť usporiadania a rozdelenie systémov, ktoré obsahujú podtriedu oligonukleotidov, kde všetky oligonukleotidy sa líšia najmenej v dvoch pároch báz. Tento postup môže byť rozšírený na vytvorenie podusporiadania, kde každý oligonukleotid má najmenej tri rôzne nukleotidy pri porovnaní s ktorýmkoľvek iným oligonukleotidom v usporiadaní.
Na zabezpečenie toho, aby sa v niektorej podtriede oligonukleotid n-mérov každý oligonukleotid líšil od iných najmenej dvomi nukleotidmi, mala by táto podtrieda byť vytvorená výberom n/2 štvrtín dimérny'ch oligonukleotidov z Tab. 5. Predpokladá sa, že n je delitelné 2. Ako príklad, podtrieda tetramérnych oligonukleotidov (n=4) je vytvorená výberom dvoch (4/2 = 2) štvrtín dimérov, napríklad, štvrtiny 1 a 3. Šestnásť tetramérnych oligonukleotidov môže byť vytvorených kombináciou jedného diméru z kvartetu 1 s iným dimérom z kvartetu 3. Týchto šestnásť tetramérov je zaznamenaných v Tabuľke 6. Tetraméry v jednom riadku sa líšia dvomi nukleotidmi, tak ako tetraméry v jednom stĺpci. Dva tetraméry vybraté z dvoch rôznych riadkov a stĺpcov sa líšia štyrmi nukleotidmi. Pomocou Tabuľky 5 môže byť vytvorených všetkých šestnásť podtried tetramérnych oligonukleotidov. Každá podtrieda obsahuje šestnásť oligonukleotidov a tak bude vytvorených všetkých 256 (16 x 16 = 256) tetramérnych oligonukleotidov a každý oligonukleotid bude členom jednej, jedinej podtriedy. Podobne, všetky oligonukleotidy n-méry (kde n je párne číslo) môžu byť rozdelené do podtried. Počet podtried je 4n/2 a každá obsahuje 4n/2 oligonukleotidov, · t. zn., celkovo je 4, tak ako má byť.
Vytvorenie oligonukleotid n-mérov z dimérov je len ideálne a neexistuje obmedzenie pre syntézu, použitím monomérnych, dimérnych, atď., derivátov nukleotidov, ako je popísané inde. Diméry sú však viac praktické pre syntézu podľa Tabuľky 5.
Výhodne sa sekvenovanie uskutočňuje použitím (8,8)-, alebo (8, {11}, 8)-rozpoznávania, alebo ich kombináciou. Oligonukleotidy vzorky môžu byť najprv rozdelené do 44 (256) podtried na základe 8-mérnej sekvencie na 3'-zakončení každého oligonukleotidu. Každá z týchto podtried je ďalej rozdelená do 256 podtried podľa 5'-zakončenia každého oligonukleotidu. Takže, spolu sa získa 48 (65 536) podtried. Každá z týchto podtried obsahuje 48 (8,8)- ilogonukleotidových párov. Jedna podtrieda pokryje asi 0,25 nim x 0; 25 mm na BCD.
Aby 48 podtried bolo na príslušných miestach na disku, vzorka musí byť rozdelená. Táto úloha môže byť splnená uzavretým BCD (Disklab), ako je popísané v nasledujúcom prípade (4,4)-rozpoznávania. Pre zjednodušenie sa použijú krátke oligonukleotidy. Prvé a druhé rozpoznávané oligonukleotidy môžu byť rozdelené na 42 (=16) podtried, t.zn., existuje 16 x 16 (=256) kombinácií. Tento príklad môže byť bežne zovšeobecnený pre dlhšie oligonukleotidy.
Rozdelený disk obsahuje dva samostatné disky, ktoré sú spojené spolu tak, že keď je potrebné, môžu byť navzájom od seba rozpojené. Celková štruktúra druhej polovice je znázornená na Obr. 14A. Štruktúra disku je . popísaná začínajúc z vnútra smerom von. Najmenší kruh ,v strede je diera, ktorá môže slúžiť pre manipuláciu a otáčanie. Neštrukturovaná plocha medzi dvoma kruhmi je kontajner pre elučný pufer. Plocha, ktorá je rozdelená na šestnásť kompartmentov čiastočnými dvojitými stenami je kruhový rozdeľovači stĺpec. Prvé rozdelenie sa uskutoční v tejto časti. V druhom kroku rozdeľovania môže byť použitých šestnásť špirálových kanálikov. Na zozbieranie odpadu sa nakoniec použije neštrukturovaný vonkajší perimeter.
Na vrchu prvého disku je umiestnený druhý disk (Obr. 14B), ktorý je pokrytý šestnástimi podtriedami oligonukleotidov tak, že tieto tvoria špirálovitý vzor v proti smere hodinových ručičiek. Tento disk sa nazýva zberný disk. Zberný disk môže byť hladký alebo mechanicky vzorovaný. V každom prípade kanáliky na prvom disku musia byť uzatvorené, aby sa elučný pufer a fragmenty DNA nedostali do uzatvorených kaná likov, ktoré sa správnejšie nazývajú kapiláry, keď dva disky sú spolu spojené. Obr. 14C znázorňuje horný pohľad operačného disku. Pre zjednodušenie je zaznamenaná len jedna zóna podtriedy. Táto zóna, tak ako všetkých ostatných pätnásť zón, pretína všetkých šestnásť kapilár. V tomto usporiadaní existuje celkovo 256 prekrížení.
Centrálna časť disku, ktorá obsahuje cirkulačnú zónu prvého rozdelenia je podrobne zaznamenaná na Obr. 15. Každá zo šestnástich komôrok obsahuje voine naplnený pevný nosič pokrytý určitou podtriedou 8-mérnych oligonukleotidov. Jedno 4-mérne zakončenie, napríklad 3'-zakončenie, z týchto oligonukleotidov je vytvorené podlá Tabuľky 5. Iné 4-mérne zakončenie (5'-zakončenie) obsahuje všetky možné kombinácie 4mérov. Každá podtrieda 3'-zakončenia zo šestnástich 4-mérov sa vyskytuje len jediný raz v komôrke. Vzorka cirkuluje pumpovaním pri optimálnej teplote. Pumpa môže byť externá alebo interná. Po dosiahnutí rovnováhy, je nenaviazaná vzorka odstránená a pevný nosič je pre premytý, čím sa odstránia voľne
I naviazané oligonukleotidy. Disk sa zahreje, napríklad, IČ ožiarením, čim sa denaturujú hybridizované oligonukleotidy; disk sa otáča veľmi rýchlo, napríklad 200 až 50 000 rpm, takže pôsobením centrifugačnej sily sú záklopky otvorené. Frakčná jednotka môže byť tiež modulom ktorý rotuje vzhľadom na zvyšok disku, takže 32 záklopiek sa otvorí súčasne. V tomto prípade záklopky môžu byť jednoduché otvory, ktoré sú zavreté v jednej polohe a otvorené v inej polohe. Elučný pufer nesie denaturované oligonukleotidy do kapilár, z ktorých každá má na jednej stene šestnásť podtried 8-mérnych oligonukleotidov. V takomto prípade každá 8-mérna podtrieda je úplne vytvorená podľa Tabuľky 5. Takže, každá zo šestnástich frakcií bude ďalej rozdelená na šestnásť frakcií. Tieto všetky frakcie môžu byť pripojené na zberný disk, ktorý je oddelený od iného disku.
Zberný disk je umiestnený na vrchu sekvenačného disku, ktorý je modelovaný analogicky. Účinnosť sekvenačného disku je všeobecne, ale nie nevyhnutne, omnoho vyššia, ako účinnosť zberného disku. ’
Cieľom rozdelenia je správne skoncentrovať sekvencie tak, aby boli v blízkosti oligonukleotidovej sondy. Použitím oligonukleotidov konštantnej dĺžky sa ich rozdelenie ďalej zlepší. V každom prípade táto metóda rozdelenia zvyšuje koncentráciu správnych oligonukleotidov a tieto môžu byť detekované.
Hoci tento vynález bol popísaný vzhľadom na určité špecifické uskutočnenia, rozumie sa, že ich modifikácie a ekvivalenty ako aj ich obmeny budú jasné pre odborníka a sú zahrnuté do rozsahu tu pripojených patentových nárokov.
Tabuľka 1
Hmotnosť všetkých Priemerný počet kópií každého
n-mérov (mg) oligonukleotidu v
16-méry 34,3xl0-9 3x10
24-méry 32,2xl0’4 3x10
26-méry 57xl03 180
28-méry 0,86 11
31-méry 71,3
Tabuľka 2A
Pravdepodobnosť žiadneho zistenia, alebo zistenia raz, dvakrát alebo trikrát daného n-méru (n=14, 16, 17, 18 alebo 19) na chromozóme.
14-mér
16-mér
17-mér
18-mér
19-mér p (0) pd)
P(2) p (3) p(2,3) p(l,3)
Celkový počet oligonukleotidov s frekvenciou>l
0,393 0, 943 0,986 0, 996 0, 999
0, 366 5,5xl02 1, 4xl0-2 3, 6xl0-3 9,lxl0-4
0,173 1, 6xl0-3 Ι,ΟχΙΟ-4 6,6xl0-® 4,lxl0-7
0,050 3,lxl0-5 5,lxl0-7 8,0xl0-9 l,3xlO-10
0,397 2, 8xl0-2 7,3xl03 l,8xl0-3 4,6xl04
60x10® 7,0x10® 1,8x10® 0,45x10® 0,11x10®
Tabuľka 2B
Pravdepodobnosť nájdenia raz, dvakrát alebo trikrát daný ήπιέ r (n=20, 21, 22, 24 alebo 28) na chromozóme.
20-mér 21-mér 22-mér 24-mér 28-mér
p (1) 2,3xl0-4 5, 7xl0-5 l,4xl0-5 8,9xl0-7 3,5xl0-9
p (2) 2,6xl0-8 1,6xl0-9 Ι,ΟχΙΟ-10 3, 9xl0-13 6,0xl0-18
p(3) 2,0xl0-12 3,lxl0-14 4,8xl0-1® l,2xl0-19 7,0xl0-27
P(2,3) Ι,ΙχΙΟ-4 2,8xl0-5 7,1x10® 4,4xl0-7 l,7xl0-9
p(l,3)
Celkový počet oligonukleotidov s frekvenciou>l 28xl03 7,lxl03 Ι,ΙχΙΟ3 111
0,43
Tabulka 3
Dôležité skutočnosti
Jeden chromozóm obsahuje maximálne 250xl06 párov báz (chromozóm 1).
Počet 400 pm2 dot/BCD je 105.
Plocha BCD je 4,2x 104 mm2.
Tabuľka 4
Počet n-mérov a celková plocha biobitov.
Dot obsahujúce
n 4n všetky n-méry ako Dot/BCD
100 pm2 oligopixely
4 256
5 1024
6 4096 0, 4 mm2 Ι,ΟχΙΟ5
7 16xl03 1,6 mm2 2,5xl04
8 65xl03 6, 5 mm2 6,2xl03
9 260xl03 26 mm2 l,6xl03
10 1,0x10® 100 mm2
11 4,2x10® 400 mm2
12 16,8x10® 1,6xl03 mm2
13 67,1x10® 6,4xl03 mm2
14 268x10® 26xl03 mm2
15 Ι,ΙχΙΟ9
16 4,3xl09
Tabuľka 5
Štyri štvrtiny oligonukleotidov, ktoré môžu byť použité pri tvorbe podtried oligonukleotidov
1 2 3 4
AA AC AG AT
CC CG CT CA
GG GT GA GC
TT TA TC TG
Tabuľka 6
Jedna podtrieda tetramérnych oligonukleotidov pripravená
pomocou štvrtín 1 a 3 z Tabuľky
AA-AG CC-AG GG-AG TT-AG
AA-CT CC-CT GG-CT TT-CT
AA-GA CC-GA GG-GA TT-GA
AA-TC CC-TC GG-TC TT-TC
ZOZNAM SEKVENCIÍ • (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ: BURSTEIN LABORATORIES, INC.
(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: GÉNOVÝ SEKVENÁTOR A SPÔSOBY (iii) POČET SEKVENCIÍ: 23 (iv) ADRESA PRE KOREŠPODENCIU:
(A) ADRESA: Howrey & Šimon (B) ULICA: 1299 Pennsylvania Avenue N. W.
(C) MESTO: Washington (D) ŠTÁT: DC (E) KRAJINA: USA (F) PSČ: 20004 (v) POČÍTAČOVO ČÍTACIA FORMA:
(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilné (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Version 2.0 (vi) BEŽNÉ ÚDAJE A ŽIADOSTI:
(A) ČÍSLO ŽIADOSTI: PCT/US98/03362 (B) DÁTUM PODANIA: 20.február 1998 (C) KLASIFIKÁCIA:
(vii) DÁTUM PRIORITY:
(A) DÁTUM PODANIA:
(B) ČÍSLO ŽIADOSTI:
(viii) INFORMÁCIE O PRÁVNOM ZÁSTUPCOVI:
(A) MENO: Halluin, Albert P (B) ČÍSLO REGISTRÁCIE: 25,227 (C) ČÍSLO ODKAZU: 01296.0011.PC00
(ix) INFORMÁCIE O TELEKOMUNIKAČNOM SPOJENÍ:
(A) TELEFÓN: 650-463-8109
(B) TELEFAX: 650-463-8400
(C) TELEX:
(2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.l:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 16 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.l:
GGTTAAAAAA AACCCC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.2:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 16 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.2:
CCCCAAAAAA AATTTT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.3:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID Č.3:
GGTTAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID Č.4:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 4: GTTAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.5:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.5: GTAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.6:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 6: TAAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.7:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.7:
AAAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.8:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 8:
AAAAAAAC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.9:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.9:
AAAAAACC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.10:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.10:
AAAAACCC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 11:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 11: AAAACCCC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 12:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.12: CCCCAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.13:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA .
(xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 13: CCCAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.14:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 14:
CCAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.15:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č. 15:
CAAAAAAA (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 16:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.16:
AAAAAAAT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 17:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.17:
AAAAAATT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 18:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.18:
AAAAATTT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č. 19:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.19:
AAAATTTT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.20:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 16 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.20:
GGTTAAAAAA AATTTT (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.21:
(i) ZNAKY SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 16 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.21:
CCCCAAAAAA AACCCC (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.22:
Ho
(i) ZNAKY SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna
(ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA
(xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.22: GGGGAAAATT ATTAAAACCC GG 22
(2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID č.23:
(i) ZNAKY SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNITOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna
(ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA
(xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID č.23: CCCCAAAAGG TGGAAAAGGG CC 22
7^
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (16)

1/6
1. Spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, spôsob ktorý tvorí:
(a) vytvorenie pevného nosiča, ktorý má všetky možné nméry pripojené k molekule spacera, ktorý je pripojený k povrchu nosiča;
(b) styk pevného nosiča z kroku (a) so vzorkou v podmienkach umožňujúcich hybridizáciu oligonukleotidov vzorky s komplementárnymi n-mér oligonukleotidmi na pevnom povrchu;
(c) styk pevného povrchu z kroku (b) s hydrolyzačnou látkou;
(d) oddelenie nenaviazaných oligonukleotidov od hybridizovaných oligonukleotidov; a (e) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov za získania n-mér oligonukleotidov vzorky;
kde n je číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28.
2. Spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky oligonukleotidových fragmentov, ktorý tvorí:
(a) styk pevného nosiča, upraveného pre väzbu oligonukleotidov vo vzorke, s aspoň časťou vzorky;
(b) styk pevného nosiča z kroku (a) so zmesou n-mér oligonukleotidov v čase dostatočnom pre hybridizáciu n-mér oligonukleotidov s oligonukleotidmi vzorky na pevnom nosiči;
(c) oddelenie hybridizovaných n-mér oligonukleotidov od nehybridizovaných oligonukleotidov;
(d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov za získania n-mér oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne k n-mér oligonukleotidom vzorky;
kde n je číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28.
P
3. Spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, spôsob tvorí:
(a) styk pevného nosiča, ktorý je prispôsobený viazať molekuly spacera, uvedený pevný nosič má na sebe naviazanú väčšinu oligonukleotidových fragmentov vzorky, so zmesou väčšiny prvých k-mér oligonukleotidov, z ktorých každý nemá voľnú hydroxylovú skupinu na svojom 3'- zakončení a s väčšinou druhých m-mér oligonukleotidov, z ktorých každý nemá fosfátovú skupinu na svojom 5'-zakončení;
(b) ligácia prvých a druhých oligonukleotidov hybridizovaných s oligonukleotidmi vzorky na pevnom nosiči z kroku (a) ;
(c) odstránenie neligovaných oligonukleotidov z pevného nosiča; a (d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov zostávajúcich na pevnom nosiči za získania n-mér oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne k n-mér oligonukleotidom prítomným vo vzorke;
kde k a m sú každé číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28, za podmienky, že k+m=n.
4. Spôsob získania n-mér oligonukleotidov zo vzorky obsahujúcej fragmenty oligonukleotidov, spôsob tvorí:
(a) styk pevného nosiča, ktorý je prispôsobený viazať molekuly spacera, uvedený pevný nosič má na sebe naviazanú väčšinu oligonukleotidov zo vzorky, s väčšinou h-mér oligonukleotidov, z ktorých každý má voľnú fosfátovú skupinu na svojom 3'- a 5'- zakončení a s väčšinou i-mér oligonukleotidov, z ktorých každý má hydroxylovú, amino alebo tiolovú skupinu na 3'- zakončení a neobsahuje koncovú fosfátovú skupinu, a s väčšinou j-mér oligonukleotidov, ktoré majú hydroxylovú, amino a tiolovú skupinu na 5'- zakončení a neobsahujú fosfátovú skupinu;
V 3 (b) chemická alebo enzymatická ligácia oligonukleotidov hybridizovaných s oligonukleotidmi vzorky na pevnom nosiči z kroku (a);
(c) odstránenie neligovaných oligonukleotidov z pevného nosiča z kroku (b); a (d) denaturácia hybridizovaných n-mér oligonukleotidov zostávajúcich na pevnom nosiči za získania n-mér oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne k n-mér oligonukleotidom prítomným vo vzorke;
kde h, i a j sú každé číslo vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28, za podmienky, že h+i+j=n.
5. Prvok stanovenia obsahuje:
substrát, ktorého povrch má množstvo odlišných plôch prispôsobených pripojiť molekuly spacera;
množstvo molekúl spacera pripojených prvým zakončením k danému povrchu v každej odlišnej ploche, uvedené jednotlivé molekuly spacera sú prispôsobené tak, aby boli pripojené svojim druhým koncom ku kovovému povrchu alebo značke, každá z uvedených molekúl spacera má miesto schopné štiepenia, ktoré sa nachádza medzi svojím prvým a druhým koncom;
prvý n-mér oligonukleotid má prvú sekvenciu pripojenú k podstate všetkým molekulám spacera medzi miesto štiepenia a prvý koniec molekuly spacera; a druhý m-mér oligonukleotid má inú sekvenciu, pripojenú k podstate všetkým molekulám spacera;
kde n a m sú každé čísla vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 2 až 28.
6. Spôsob určenia sekvencie (p+r)-mér segmentu génu, ktorého prítomnosť sa predpokladá vo vzorke, spôsob tvorí:
(a) styk prvku stanovenia s aspoň časťou roztoku vzorky obsahujúcej neznámy (p+r)-mérny segment génu, prvok stanovenia má na povrchu naviazaných množstvo molekúl spacera, (b) molekuly spacera majú prvý koniec naviazaný na povrch a druhý koniec naviazaný na kovový povrch alebo značku a majú ďalej miesto štiepenia, ktoré sa nachádza medzi prvým a druhým koncom, molekuly spacera majú ďalej pripojený prvý p-mér oligonukleotid medzi miesto štiepenia a prvý koniec a ďalej majú pripojený druhý r-mér oligonukleotid medzi miesto štiepenia a druhý koniec, kombinácia p-mérov a r-mérov vrátane všetkých kombinácií oligonukleotidových sekvencii p-mér a r-mér oligonukleotidu, alebo prípadne podsadu všetkých týchto kombinácií, každá jednotlivá kombinácia sekvencii pmér a r-mér oligonukleotidov je na vopred určenom mieste na povrchu;
(c) zistenie prítomnosti alebo neprítomnosti určitej sekvenčnej kombinácie hybridizovaných oligonukleotidov na každom vopred určenom mieste na povrchu; a (d) spracovanie informácie o sekvencii získanej v kroku (b) pre odvodenie sekvencie (p+r)- oligonukleotidu prítomného vo vzorke;
kde p a r sú čísla vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28, a (p+r) nie je viac ako 30 000, a najvýhodnejšie je 60. ,
7. Spôsob podľa nároku 6 ďalej obsahuje krok ligácie výsledných hybridizovaných oligonukleotidov pripojených k molekulám spacera z kroku (a) pred určením prítomnosti alebo neprítomnosti určitej sekvenčnej kombinácie hybridizovaných oligonukleotidov na každom vopred určenom mieste na povrchu.
8. Spôsob podľa nároku 6, kde kroky (a)-(d) sa uskutočňujú paralelne pre rôzne, viacnásobné segmenty génu.
9. Spôsob určenia sekvencie (p+q+r)-mér segmentu génu, ktorého prítomnosť sa predpokladá vo vzorke, spôsob tvorí:
(a) vytvorenie roztoku vzorky a zmesi q-mér oligonukleotidov, ktoré majú všetky možné sekvencie q-mér oligonukleotidu, alebo prípadne podtriedu všetkých takýchto možných sekvencii;
(b) styk prvku stanovenia s najmenej aspoň časťou roztoku z kroku (a), prvok stanovenia má na povrchu naviazaných množstvo molekúl spacera, molekuly spacera majú prvý koniec naviazaný na povrch a druhý koniec naviazaný na kovový povrch alebo značku a majú miesto štiepenia medzi prvým a druhým koncom, molekuly spacera majú ďalej pripojený prvý p-mér oligonukleotid medzi miesto štiepenia a prvý koniec a majú pripojený druhý r-mér oligonukleotid medzi miesto štiepenia a druhý koniec, kombinácia p-mérov a r-mérov vrátane všetkých kombinácií oligonukleotidových sekvencii p-mér a r-mér oligonukleotidov, alebo prípadne podtriedu všetkých takýchto kombinácií, každá príslušná kombinácia sekvencii p-mér a r-mér oligonukleotidov je na vopred určenom mieste na povrchu;
(c) určenie prítomnosti alebo neprítomnosti určitej sekvenčnej kombinácie hybridizovaných oligonukleotidov na každom vopred určenom mieste na povrchu; a (d) spracovanie sekvenčnej informácie získanej v kroku (c) na odvodenie sekvencie (p+q+r)-mér oligonukleotidu prítomného vo vzorke;
kde p a q sú čísla vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnejšie 6 až 28, a (p+q+r) nie je viac ako 30 000, a najvýhodnejšie je 60.
10. Spôsob podlá nároku 9 ďalej obsahuje krok ligácie výsledných hybridizovaných oligonukleotidov pripojených na molekuly spacera z kroku (b).
11. Spôsob podlá nároku 9, kde kroky (a)-(e) sa uskutočňujú paralelne pre rôzne, mnohonásobné segmenty génu.
12. Spôsob podlá nároku 9, kde buď jeden z p alebo r nie je, alebo oba par nie sú q.
13. Spôsob podlá nároku 9, kde obe p a r sú čísla vybrané z čísiel 7 až 9 a q je číslo 9 až 12.
14. Spôsob určenia sekvencie neznámeho génu, o ktorom sa predpokladá, že je prítomný vo vzorke.
Spôsob tvorí:
(a) použitie spôsobu podľa nároku 6, kde kroky (a)-(d) sa uskutočnia paralelne pre rôzne, mnohonásobné (p+r)-mér segmenty génu;
(b) použitie spôsobu podľa nároku 9, kde kroky (a)-(e) sa uskutočnia paralelne pre rôzne, mnohonásobné (p+q+r)-mér segmenty génu;
(c) spracovanie sekvenčnej informácie získanej v krokoch (a) a (b) pre odvodenie sekvencie neznámeho génu prítomného vo vzorke;
kde p a q sú čísla vybrané z čísiel 4 až 10 000, najvýhodnej šie 6 až 28, a (p+q+r) nie je viac ako 30 000, a najvýhodnejšie je 60. 15. Spôsob podľa nároku 14, kde buď j eden z p alebo r nie
je, alebo par nie sú q.
16. Spôsob podľa nároku 14, kde oba p a r sú čísla od 7 do 9 a q je číslo od 9 do 12.
SK1144-99A 1997-02-21 1998-02-20 Gene sequencer and methods SK114499A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3902797P 1997-02-21 1997-02-21
PCT/US1998/003362 WO1998037238A2 (en) 1997-02-21 1998-02-20 Gene sequencer and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK114499A3 true SK114499A3 (en) 2000-09-12

Family

ID=21903274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1144-99A SK114499A3 (en) 1997-02-21 1998-02-20 Gene sequencer and methods

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6274373B1 (sk)
EP (1) EP0968307A1 (sk)
JP (1) JP2001512975A (sk)
KR (1) KR20000075555A (sk)
CN (1) CN1251617A (sk)
AP (1) AP9901654A0 (sk)
AU (1) AU745673B2 (sk)
BR (1) BR9808646A (sk)
CA (1) CA2281764A1 (sk)
EE (1) EE9900357A (sk)
HU (1) HUP0002038A2 (sk)
ID (1) ID22708A (sk)
IL (1) IL131486A0 (sk)
IS (1) IS5158A (sk)
NO (1) NO994009L (sk)
NZ (1) NZ337893A (sk)
OA (1) OA11149A (sk)
PL (1) PL335226A1 (sk)
SG (2) SG105505A1 (sk)
SK (1) SK114499A3 (sk)
TR (1) TR199902473T2 (sk)
WO (1) WO1998037238A2 (sk)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9418981D0 (en) 1994-09-21 1994-11-09 Univ Glasgow Apparatus and method for carrying out analysis of samples
US6327031B1 (en) 1998-09-18 2001-12-04 Burstein Technologies, Inc. Apparatus and semi-reflective optical system for carrying out analysis of samples
CA2260361A1 (en) * 1996-07-08 1998-01-15 Burstein Laboratories, Inc Cleavable signal element device and method
US6342349B1 (en) 1996-07-08 2002-01-29 Burstein Technologies, Inc. Optical disk-based assay devices and methods
US6331275B1 (en) 1996-07-08 2001-12-18 Burstein Technologies, Inc. Spatially addressable, cleavable reflective signal elements, assay device and method
JP3394181B2 (ja) * 1998-03-30 2003-04-07 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 試料添加方法及び試料添加装置
JP2002521666A (ja) * 1998-07-21 2002-07-16 バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド 光ディスクをベースとするアッセイ装置および方法
KR100369694B1 (ko) * 1998-09-17 2003-01-29 인터내셔널 비지네스 머신즈 코포레이션 화학적 태그의 합성 방법
US20040185462A1 (en) * 1999-08-06 2004-09-23 Tum Gene, Inc. Method of and detecting apparatus and detecting chip for single base substitution SNP and point mutation of genes
US6888951B1 (en) 1999-08-23 2005-05-03 Nagaoka & Co., Ltd. Methods and apparatus for analyzing operational and analyte data acquired from optical disc
CN1223851C (zh) 1999-10-20 2005-10-19 内田和彦 基因检测芯片、检测装置及检测方法
AU2002227181A1 (en) 2000-11-16 2002-05-27 Burstein Technologies, Inc. Optical biodiscs with reflective layers
US7054258B2 (en) 2000-12-08 2006-05-30 Nagaoka & Co., Ltd. Optical disc assemblies for performing assays
WO2002046721A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Burstein Technologies, Inc. Optical discs for measuring analytes
DE10113711A1 (de) * 2001-03-16 2002-09-26 Lifebits Ag Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen und Messträger zur Durchführung des Verfahrens
US7138506B2 (en) * 2001-05-09 2006-11-21 Genetic Id, Na, Inc. Universal microarray system
US20030194798A1 (en) * 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
US20040166593A1 (en) * 2001-06-22 2004-08-26 Nolte David D. Adaptive interferometric multi-analyte high-speed biosensor
EP1543155A4 (en) * 2002-07-17 2006-08-16 Us Genomics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING POLYMERS USING CHIMERIC MARKERS
JP2006522940A (ja) * 2003-04-10 2006-10-05 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド マイクロチャネルにおけるポリマーの操作
EP2259050A3 (en) 2003-08-26 2010-12-22 Blueshift Biotechnologies, Inc. Time dependent fluorescence measurements
WO2005081801A2 (en) * 2004-02-09 2005-09-09 Blueshift Biotechnologies, Inc. Methods and apparatus for scanning small sample volumes
JP2008505321A (ja) 2004-07-02 2008-02-21 ブルーシフト・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド 蛍光体微小環境の探索
US20060040273A1 (en) * 2004-08-17 2006-02-23 Alison Chaiken Method and apparatus for magnetic sensing and control of reagents
WO2006083915A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-10 Purdue Research Foundation Multiplexed and differentially encoded biological analyzer planar array apparatus and methods
US20070023643A1 (en) * 2005-02-01 2007-02-01 Nolte David D Differentially encoded biological analyzer planar array apparatus and methods
US7910356B2 (en) * 2005-02-01 2011-03-22 Purdue Research Foundation Multiplexed biological analyzer planar array apparatus and methods
US7663092B2 (en) * 2005-02-01 2010-02-16 Purdue Research Foundation Method and apparatus for phase contrast quadrature interferometric detection of an immunoassay
US20070128083A1 (en) * 2005-07-18 2007-06-07 U.S. Genomics, Inc. Microfluidic methods and apparatuses for sample preparation and analysis
WO2007131103A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Quadraspec, Inc. Direct printing of patterned hydrophobic wells
US7522282B2 (en) * 2006-11-30 2009-04-21 Purdue Research Foundation Molecular interferometric imaging process and apparatus
US20080144899A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-19 Manoj Varma Process for extracting periodic features from images by template matching
US20080230605A1 (en) * 2006-11-30 2008-09-25 Brian Weichel Process and apparatus for maintaining data integrity
US7659968B2 (en) * 2007-01-19 2010-02-09 Purdue Research Foundation System with extended range of molecular sensing through integrated multi-modal data acquisition
US7787126B2 (en) * 2007-03-26 2010-08-31 Purdue Research Foundation Method and apparatus for conjugate quadrature interferometric detection of an immunoassay
EP2871243B1 (en) * 2013-11-06 2018-03-21 Omya International AG Nucleic acids and methods for detecting pathogens and beneficial microorganisms
CN112513242B (zh) * 2018-05-16 2024-04-30 深圳华大智造科技股份有限公司 基因测序仪

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
DE69333650T2 (de) * 1992-02-19 2006-01-12 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren
EP0705271B1 (en) * 1993-06-25 2002-11-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Hybridization and sequencing of nucleic acids
CZ90596A3 (en) * 1993-09-27 1996-10-16 Arch Dev Corp Composition for effective sequencing of nucleic acid and process for preparing such composition
US6974666B1 (en) * 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5585069A (en) * 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
JPH08189379A (ja) 1995-01-10 1996-07-23 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 外部燃焼型ガスタービン装置
CA2260361A1 (en) * 1996-07-08 1998-01-15 Burstein Laboratories, Inc Cleavable signal element device and method

Also Published As

Publication number Publication date
PL335226A1 (en) 2000-04-10
AP9901654A0 (en) 1999-09-30
US20020045174A1 (en) 2002-04-18
NO994009L (no) 1999-10-21
ID22708A (id) 1999-12-09
WO1998037238A3 (en) 1998-10-29
CN1251617A (zh) 2000-04-26
SG105505A1 (en) 2004-08-27
WO1998037238A2 (en) 1998-08-27
AU745673B2 (en) 2002-03-28
OA11149A (en) 2003-04-25
US6274373B1 (en) 2001-08-14
EE9900357A (et) 2000-02-15
US6566069B2 (en) 2003-05-20
JP2001512975A (ja) 2001-08-28
EP0968307A1 (en) 2000-01-05
BR9808646A (pt) 2001-07-31
SG105506A1 (en) 2004-08-27
NZ337893A (en) 2001-09-28
AU6662198A (en) 1998-09-09
HUP0002038A2 (hu) 2000-10-28
IL131486A0 (en) 2001-01-28
IS5158A (is) 1999-08-20
CA2281764A1 (en) 1998-08-27
TR199902473T2 (xx) 2000-07-21
KR20000075555A (ko) 2000-12-15
NO994009D0 (no) 1999-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK114499A3 (en) Gene sequencer and methods
JP4294732B2 (ja) アドレス可能アレイでのリガーゼ検出反応を用いた核酸配列の相違の検出
JP4766750B2 (ja) 位置特定可能なアレイによるリガーゼ検出反応を用いた核酸配列差異の検出
US5935793A (en) Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US7083917B2 (en) Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
JP2003520570A5 (sk)
US20220228201A1 (en) Molecular arrays and methods for generating and using the arrays
US20220314187A1 (en) Methods and compositions for light-controlled surface patterning using a polymer
AU776614B2 (en) Gene sequencer and methods
NZ512488A (en) Gene sequencer and methods suitable for long repeat sequences
MXPA99007738A (es) Secuenciador de genes y metodos