CN1251617A - 基因测序仪和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了基因测序仪,生物致密盘和样品制备的方法学。制备了长度恒定的寡核苷酸,并与所描述的生物致密盘和装置结合用于基因测序和策略。

Description

基因测序仪和方法
                           发明领域
本发明总地涉及基因测序领域。更具体地说，本发明涉及一种基因测序仪、和其一起使用的高密度生物致密(光)盘(bio-compact disk)、及其样品制备方法。高密度生物致密盘以及样品制备方法学通常可用于寡核苷酸测序和DNA测序与检测领域。
                           发明概述
一方面，本发明涉及一种从含有寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的样品制备方法，该方法包括：(a)形成一个固体载体，所有可能的n聚体寡核苷酸与该载体表面相连；(b)在使样品寡核苷酸和固体载体上的互补性n聚体寡核苷酸杂交的条件下，使步骤(a)所得固体载体与样品接触；(c)使步骤(b)所得固体载体与水解剂接触；(d)使杂交的寡核苷酸与未结合的寡核苷酸分离；和(e)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得样品中的n聚体寡核苷酸；其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。
另一方面，本发明涉及一种从含有寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)使固体载体与样品的至少一部分接触，该固体载体适合交联样品中的寡核苷酸；(b)使步骤(a)所得固体载体与n聚体寡核苷酸混合物接触，接触时间足以使n聚体寡核苷酸与固体载体上互补的n聚体寡核苷酸杂交；(c)使未杂交的寡核苷酸与杂交的n聚体寡核苷酸分离；(d)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中的寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。
另一方面，样品制备方法包括从含寡核苷酸片段的样品中获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)使固体载体与多个具有(k+m)个聚体的寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上结合了样品中的寡核苷酸，其中k+m＝n，混合物是多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸的混合物，所述各个第一寡核苷酸均是k聚体，其3′端没有游离的羟基，所述各个第二寡核苷酸均是m聚体，其5′端没有游离的磷酸基团；(b)连接步骤(a)所得固体载体上的寡核苷酸；(c)从固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中的寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；其中m，k和n各自是选自6-10,000之间的整数，最佳的为12-40，条件是k+m＝n。
在还有一方面，样品制备方法包括从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)使固体载体与多个h聚体寡核苷酸、多个i聚体寡核苷酸和多个j聚体寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上连接了多个样品中的寡核苷酸，所述h聚体寡核苷酸各自在3′和5′端有磷酸基团，所述i聚体寡核苷酸各自在3′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团，所述j聚体寡核苷酸在5′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团；(b)用化学或酶方法连接步骤(a)所得固体载体上的寡核苷酸；(c)从步骤(b)所得固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中核苷酸互补的n聚体核苷酸；其中h，i和j各为选自6-10,000的整数，最佳的为18-60，条件是h+i+j＝n。
本发明还有一方面描述了一种测定元件，该元件包含：一个基质，该基质具有一个表面，包括该表面上被改成适合(adapt)连接一个间隔物(spacer)分子的多个分开的区域；多个间隔物分子，各分子的第一末端与各个分开区域中的所述表面连接，所述各间隔物分子被改成以其第二末端与金属表面或标记物连接，所述各个间隔物分子的第一末端和第二末端之间有一个能被断裂的位点；具有第一序列的第一n聚体寡核苷酸，它在间隔物分子的断裂位点和间隔物分子第一末端之间与基本上所有的间隔物分子相连，和具有第二序列的第二n聚体寡核苷酸，它与基本上所有的间隔物分子相连；其中基质表面上基本上没有其它分开的区域含有具有n聚体寡核苷酸、其上连接了第一序列的间隔物分子，且n是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28。
本发明还包括一种测定怀疑存在于样品中的基因的(p+q+r)聚体节段序列的方法，该方法包括：(a)形成样品与q聚体寡核苷酸混合物的溶液，该混合物含有q聚体寡核苷酸所有可能的序列、或任选地含有所有这些可能序列的亚组；(b)使测定元件与步骤(a)的溶液的至少一部分接触，该测定元件具有一个表面和结合在该表面上的多个间隔物分子，该间隔物分子的第一末端与该表面结合，第二末端与金属表面或标记物结合，在第一和第二末端之间有一个断裂位点，间隔物分子进一步还具有连接在其断裂位点和第一末端之间的第一p聚体寡核苷酸和连接在其断裂位点和第二末端之间的第二r聚体寡核苷酸，p聚体和r聚体的组合包括了 p聚体和r聚体寡核苷酸的所有寡核苷酸序列组合，或任选地包括了所有这些组合的亚组，p聚体和r聚体寡核苷酸的每个特定的序列组合都位于该表面预定位置上；(c)连接上述步骤(b)所得的与间隔物分子连接的所得杂交寡核苷酸；(d)检测该表面上各预定位置处的杂交寡核苷酸的特定序列组合存在与否；和(e)对步骤(d)所得序列信息进行处理，以推导出样品中存在的(p+q+r)聚体寡核苷酸的序列，其中P，q和r是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-26，且(p+q+r)不超过30,000，最佳是60。对一个基因的不同的、多个节段可平行地进行步骤(a)至(e)。
                           附图简述
参看了下列附图后会更好地了解本发明，其中：
图1表示固体载体上多个n聚体寡核苷酸的合成。
图2表示用图1的固体载体从含有不同n聚体长度的寡核苷酸混合物的样品中选出n聚体寡核苷酸的方法。
图3表示用固体载体通过线性扩增来获得n聚体寡核苷酸的样品。
图4表示扩增来获得标记过的寡核苷酸的样品。
图5表示用连接酶制备长度恒定的寡核苷酸的方法。
图6表示用化学连接或脂肪酶(lipase)制备长度恒定的寡核苷酸的方法。
图7表示用于制备表面上连接了寡核苷酸的生物致密盘的两个互补的印模(stamp)。
图8表示用图7的印模来印制的一个实例，其中待连接到固体上的固定的(stationary)寡核苷酸位于印模中形成的凹槽(grove)壁上。
图9表示用选择性识别-(8，{10}，8-识别)—来测定在染色体上出现两次的16聚体周围的序列。
图10表示疏水表面有亲水性腔穴的印模。
图11表示图10的印模，其中乳胶球用化学方法结合在腔穴内。
图12描述了用来测定一个基因片段有关序列信息的(4，4)聚体识别。
图13描述了用来测定一个基因片段有关序列信息的(4，{5}，4)聚体识别。
图14A表示一个分级(fractionation)盘。第一次分级可在中央16个区室的区域内进行。级分可在螺旋形通道或毛细管中进一步分级。图14B表示在另一个盘置于图14A所示盘上后，可进行进一步的分级。图14C表示毛细管和一类寡核苷酸区域的交叉情况(intersection)的顶视图。
图15表示中央分级区域。样品可围绕该区域循环，在此具体实例中，该区域含有16个区室。每个区室含有一种特异性寡核苷酸亚类探针。
图16描述了寡核苷酸可通过变性后转动盘来洗脱到毛细管中。
                           发明详述
用来实施所附权利要求范围内的本发明特定实例的重要的技术背景信息和其它指导可在PCT/US97/11826中找到，该申请目前已经公开，其公开内容立刻被结合入本文作参考。
样品制备
寡核苷酸阵列在基因测序中有很广阔的前景。目前这些方法大多数局限于基因核查，其中除一些具体点外，基因序列是已知的，故在该阵列中只需有限系列的寡核苷酸。从头测序较为困难，因为很难产生含有恒定长度所有可能的寡核苷酸的非常大的阵列。另外，随机长度的样品寡核苷酸也使得测序复杂化。它们会以比探针寡核苷酸更强的结合相互杂交。与过分长的寡核苷酸相比，最适长度的寡核苷酸的杂交更迅速，保真性更高。本发明描述了可用来从任何DNA样品制备长度均一的寡核苷酸的四种方法。另外，采用这些方法后，经加工的样品含有所有必需的长度均一的，在混合物中没有互补的寡核苷酸(即它们不能形成双链体)。这在以样品和探针寡核苷酸之间的杂交为基础的寡核苷酸阵列方法中是非常有利的。通过(例如)限制所有长度均一的样品寡核苷酸的中央核苷酸为腺苷或胞嘧啶(AC限制)来防止杂交。因此，两个样品寡核苷酸不能相互杂交，相反只能与阵列中的探针寡核苷酸完全杂交。
聚合酶链反应(PCR)是一种高效的DNA扩增方法。然而，当用于寡核苷酸阵列方法和大量从头测序(例如一次性对全部染色体测序)时，PCR却有严重的缺陷。为了使用PCR，需要用短的引物来引发反应。为了用引物完全覆盖染色体，就必须确切地知道大部分序列。另外，PCR每次循环会产生比前一次更短的寡核苷酸。这些特征结合起来就意味着，在对未知样品进行PCR扩增后，会不平衡地出现染色体的不同节段，而一些部分则不能出现。
当序列已知时，连接酶链反应(LCR)提供了长度均一的寡核苷酸。本申请中描述的一种方法是LCR的延伸，它可用于无需预先知道序列的一般场合。
从头测序需要高密度阵列。以前，这些阵列已经用石印(lithographic)法产生。不管其用途如何，这种方法需要复杂的仪器，并会形成大量杂质。在本申请中，描述了两种简单的印制方法，它们允许准确度达到微米级。如图10和11所述，第一种方法采用了固定在疏水性表面上的多孔乳胶球。该乳胶球可用一种化学溶液(如在水中的寡核苷酸)润湿，并压在能结合一种组分(寡核苷酸)的另一个表面上。该方法通常需要多个印制步骤，但是它可用来制造用于互补印制的主印模(master stamp)。互补的印模经过化学方法构模(pattern)，这样它能使某组分从复杂的混合物中结合到特定部位。印模可含有几百万个不同部位供不同组分结合。在清洗后，除去所有未结合的组分，使印模与能化学结合所需组分的表面接触。使组分脱离印模，扩散到通道中并与活性表面反应。因此，在一个印制步骤中，几百万个化学组分(如寡核苷酸)可以微米的准确度转移。通过重复该过程，就可产生数十亿寡核苷酸对的组合。没有其它方法(石印法、喷墨法(ink-jet)或常规印制方法)能在仅仅两个步骤内产生如此高密度的模式。而且，也不需要复杂的仪器。
一次性高分辨印制一种化学物质的方法是众所周知的。另外，将各种化学物质沿通道加到表面上的化学印制也是众所周知的。后一种方法实际上能产生阵列，只是密度不是很高。由于流动的需要，毛细管不能太细。尽管在一个印模上可以有数千个这样的毛细管，但是不可想象的是，数百万个流动毛细管能够置于一个大小合理的表面上。另一方面，数百万个微米级通道可以印模到塑料上。这些通道可被赋予亲水性，它们每一个可用光刻法，或最好用本申请中另有描述的一组乳胶球印模法来涂覆某种寡核苷酸。
很难制造出能对人染色体明确测序的寡核苷酸阵列。迄今为止，寡核苷酸阵列已经能从头测序大约2000个碱基对(bps)。对更长得多的序列(例如20,000bps)可进行序列检查。一个染色体可含2亿5千万个bps，这比用目前的寡核苷酸阵列可常规测序的数量高大约100,000倍。本申请描述的样品制备方法和高密度生物致密盘大大改进了测序。然而，合适的测序方案对于获得可靠的结果同时最大程度地减少必须使用的生物致密盘数量是非常重要的。
该申请中采用的方法如下：1)测定作为染色体一部分的所有16聚体寡核苷酸；和2)测定所有27聚体寡核苷酸的两个8聚体末端，而无需知道这些27聚体中间的11聚体序列。实际数字只是作为例子，对该方法可作一些变化。这两组数据可用相似的一组生物致密盘(即采用(8，8)识别的盘)来获得。数据组1(均为16聚体)允许测定数据组2中各27聚体的中央11聚体序列。因此，可以知道作为整个序列一部分的所有27聚体序列。这样就能大致上明确地推导出原始序列。只有一些长的重复序列在该方法的能力范围之外。即使在这些情况下，也可知道其它可选序列。可能需要按客户需要定制的寡核苷酸阵列来明确地推导出长的重复序列。
在所有生物芯片阵列的DNA试验中，固定的(stationary)寡核苷酸都具有确定的长度，即它们在给定生物芯片阵列中是m聚体，其中m是8-30之间的固定数值。样品用化学或酶法随机水解制得。样品含有不同长度的寡核苷酸。然而，为了避免过度水解，靶向长度约为50碱基(50聚体)。过长和变化不定的长度减慢了杂交，并可能导致不希望的相互反应。理想的样品含有恒定长度的寡核苷酸n聚体，其中n等于或稍稍大于固定的寡核苷酸(m聚体)的长度(n≥m)。下面描述提供具有恒定的所需长度的样品寡核苷酸的四种程序。
方法1.(核酸酶S。图1：n聚体完全混合物的合成；图2：从可变长度的寡聚体制备n聚体；和图3：线性扩增)。
首先，在固体载体上合成所有可能的寡核苷酸n聚体。在每次偶联步骤中，用腺苷、胞嘧啶、鸟苷和胸苷亚磷酰胺或这些核苷酸的其它衍生物的等摩尔混合物很容易完成合成。图1示出了两步合成步骤。在n步偶联步骤后，所有的n聚体在所选固体载体上。在实践中可用该方法合成高达26聚体的寡核苷酸的完全混合物。表1说明了某一寡核苷酸n聚体在10毫克(载体重量未包括在内)混合物中的分子数。
混合物中各种n聚体的量有一定的统计学波动(范围)。对于28聚体，预计可能有几种寡核苷酸根本不存在于10毫克混合物中，而其它一些则超过20个拷贝(拷贝平均值为11)。对于24聚体，此波动并不明显，因为所有可能的24聚体在10毫克混合物中都有2×103个以上的拷贝，因此，这是一种完全混合物。
使样品寡核苷酸片段与结合在固体载体上的n聚体的完全混合物杂交(图2)。加入水解剂(例如核酸酶S)，该水解剂使单链DNA水解。只有杂交的寡核苷酸节段可免受水解。寡核苷酸样品的突出端大部分被除去。固体载体上不与样品中的寡核苷酸匹配的固定n聚体也被水解(图2)。为了有用，水解不需要理想中的那样完全。例如，如果n是16，则当采用生物致密盘时，样品寡核苷酸的有用范围在16-22聚体之间。类似地，如果固定的n聚体只有被部分水解，则残余的n聚体可用于样品扩增。
在水解(例如用核酸酶S处理)后，固体载体含有一组与样品寡核苷酸互补的固定的n聚体。如图2所示，通过使完全可溶的n聚体混合物与这组固定的n聚体杂交，就获得了样品n聚体的完全拷贝。该过程可重复数次，但是其效率较低，因为扩增与时间和精力成线性关系。可用PCR扩增或本领域熟知的类似方法将该过程修改成呈指数关系。
如果碱基选择局限于n聚体的某一确定部位，则分子数相对更大。例如，如果在这些寡核苷酸的中央只允许有腺苷和胞苷(AC限制)，则各个n聚体的拷贝数是表1给出数目的两倍。通过在一指定的步骤中用合适的腺苷和胞苷衍生物的混合物，可达到这种碱基限制。AC限制的25聚体是允许实际的样品制备和可靠地测序的一种折衷方案。
方法2。(只杂交；图3和4：标记的或可激活的n聚体寡核苷酸的扩增)
可以不使寡核苷酸的完全混合物与固体载体相连，而是使寡核苷酸的片段化样品与固体载体连接。固体载体可以是二氧化硅颗粒、磁性球或毛细管。用n聚体的完全混合物处理结合的样品，该n聚体可任选地含有标记(如荧光素或酶)或反应性官能团(如巯基)。洗去未杂交的寡核苷酸n聚体。通过加热，除下并收集杂交的n聚体，以提供一组与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸。该过程可根据需要多次重复。
方法3。(连接，图5：用连接酶制备长度恒定的寡核苷酸。)
这是方法2的一种变通，它表示在图5中。如果“n”是较大的数(例如大于30)，则制备n聚体的完全混合物是不切实际的。而且，如果n很大，寡核苷酸之间的错配也成问题。利用k聚体和m聚体的两个完全混合物(其中k+m＝n)，就可避免这两个问题。在该方法中，k聚体的3′端不含游离的羟基，m聚体的5′端不含游离的磷酸。这可通过使k聚体的3′端被双脱氧终止、或使羟基磷酸化或含有标记(如荧光素)来实现。m聚体的5′端可有一个游离的羟基、标记或活性官能团。混合物在杂交后被连接。只有两个寡核苷酸可通过连接被连在一起。通过升温和洗涤，除去未连接的寡核苷酸。如果m聚体的游离羟基在5′端，则现在可使该羟基任选地磷酸化。此时，新的寡核苷酸可以连接到5′端。该过程可重复数次。脱杂交后，就收集到了与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸。
方法4。(化学连接，图6：用化学连接制备长度恒定的寡核苷酸。)
如果三种样品寡核苷酸(h聚体、k聚体和m聚体)在连接后一起形成了寡核苷酸n聚体，则可获得优良的结果。化学连接是非常有效的方法，但是也可采用酶法。
如图6所示，在这种情况下，再次用所有的寡核苷酸作为完全混合物。一组在两端有磷酸基团，而另两组至少在活性形式中没有末端磷酸。一种完全混合物的3′端有羟基、氨基或巯基，而另一种在5′端有类似的基团。当这三种寡核苷酸杂交并相互处于合适的位置(头对尾)时，它们能相互形成化学键。如果磷酸基团被激活，这就能最好地实现。它们可以是(例如)三酯，这样两个酯化基团是五氟苯基或类似的良好的离去基团。偶联后，多余的五氟苯基可任选地水解除去。脱杂交后，就收集到了与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸。
将线性扩增转变成指数型扩增
用下述方法将上述所有四种线性扩增以及其它类似的线性扩增程序转变成指数型扩增。
在线性扩增方法中，采用样品寡核苷酸作为模板系列来产生互补的寡核苷酸系列。该过程可以重复数次，但是每次只获得数目大约相同的互补寡核苷酸。当合并这些寡核苷酸时，寡核苷酸的总数与扩增步骤的数目呈线性相关。
为了将线性过程转变成指数型过程，需设计第一步获得的互补寡核苷酸，使它们含有受保护的巯基(例如巯基乙酸酯)或脂族氨基。变性后，将这些寡核苷酸转移到第二根柱中，该柱含有能与脂族氨基或巯基结合的反应性基团(例如马来酰亚氨基或异氰酸基)。在转移时，加入去保护剂(如羟胺)，使巯基外露。互补的寡核苷酸会立即与固体载体偶联。此时该载体可用作线性扩增模板。扩增的寡核苷酸与该互补寡核苷酸互补，即与原来的样品寡核苷酸相同，只是它含有受保护的脂族氨基或巯基。在除去受保护基团后，将该产物直接加入原先的柱中，该柱含有能与经氨基或巯基衍生的寡核苷酸结合的类似的活性固体载体。现在，第一柱含有两倍于原先数量的与样品相同的寡核苷酸。当这些寡核苷酸用作扩增模板时，就获得了两倍于原先数量的互补寡核苷酸。在将这些互补寡核苷酸结合到第二柱中后，该柱会含有第一轮循环的3倍数量的互补寡核苷酸。该过程可重复数次。n步后的扩增可大致从以下方程式获得：
a＝5×1.62n-4其中a是扩增系数，即与原来的样品相比，寡核苷酸数量增加了多少倍。增加是指数型的，但是数量并不象PCR中那样在每轮循环中倍增。其与PCR相比的明显优点是在该程序中，样品和互补寡核苷酸系列保持分开。在采用生物芯片阵列时，这是非常重要的，因为这些程序非常依赖于杂交。如果样品中的每个寡核苷酸在混合物中有一个互补对应物，则与阵列杂交的效率会很低。
制备高密度生物致密盘
在实际测序的第一步中，需设计生物致密盘(BCD)，能识别样品中的所有16聚体。这通过(8，{0}，8)识别来实现，即间隔物有两个8聚体侧臂，且不用可溶的探针寡核苷酸。这种识别也称为(8，8)识别。有大约64×103种不同的8聚体，两个8聚体大约有4.3×109种不同配对(表4)。含有一个金球的某区域称为一个生物比特(biobit)。每个生物比特的面积大约为100μm2。该面积被数以千计具有类似(8，8)配对的寡核苷酸作为侧臂的间隔物覆盖。每个生物比特应仅仅含有一种(8，8)配对的寡核苷酸，且每种可能的不同8聚体配对至少应有一个生物比特。目前可得到的CD-ROM读头能从一个致密盘(CD)读取0.6×109个比特。因此，对于所有可能的8聚体组合需要大约8个BCD。当用蓝色半导体激光代替IR-激光时，CD的密度可以增加许多倍，可能20倍。这反映了BCD性能几乎呈线性地增加。
一旦制成互补印模(图7)，本文描述的互补印制方法就可用来在一步印制中制造出复杂的高分辨模型。需要用光刻法或相当高分辨的制模(patteming)方法来制备互补印模。用一个互补印模可在一步内印制所有下侧臂寡核苷酸。同样，所有上侧臂寡核苷酸可在一步内印制。因此，需要用两个印模来制造一个BCD。由于必须产生8种不同的BCD，因此不同印模的总数为16。
制造互补印模
一个互补印模可使用数千次。然而，制造一个互补印模需要数十次光刻或印制步骤。本申请中的印制方法比石印法有利的基本优点在于，寡核苷酸在连接到表面上之前可被纯化。
本文描述了可用于(8，8)和(8，{11}，8)识别策略的互补印模的制造。必须产生总共四种不同的互补印模对，每一对在化学上是相同的，即它们含有相同的16,384种寡核苷酸(8聚体)，但是螺旋通道的走势相反(图7)。由于有65,536种不同的8聚体寡核苷酸，因此需要有4个印模来含有一个完全的组(4×16,384＝65,536)。顺时针和逆时针螺旋印模的所有16种可能的组合提供了总共43亿种不同的16聚体寡核苷酸，这些16聚体寡核苷酸由所有可能的8聚体寡核苷酸对构成(表4)。
首先，将螺旋通道(16,384)印制到软的聚碳酸酯上。每个通道宽约4μm，深1-2μm。这与印制致密盘类似(在印制致密盘时，微米级分辨是标准)。做好的印模中最好有疏水性的脊，而通道是亲水性的。脊的宽度也为4μm。为了这个目的，用抗蚀膜涂覆盘，并再次用印制螺旋通道的相同印模来使通道底部外露。用氧蚀刻法除去通道中任何残余的抗蚀膜。用氨等离子体在表面上涂覆氨基。除去脊上的抗蚀层。使两端有(例如)异硫氰酸基的聚乙二醇间隔物与氨基相连。采用过量的间隔物，只有一端会与表面结合，而另一端可用于结合有另一脂族氨基的寡核苷酸。
螺旋通道(16,348)最好为256组64通道(256×64＝16,384)。这些组是分开的，这样就可用喷墨法或等效方法用具有脂族氨基的某一4聚体寡核苷酸来覆盖一组。因此，在64个不同的靠近的通道中有一种已知的4聚体寡核苷酸。4聚体的256种可能中的每一种在256个通道组的一组通道中出现一次，且仅出现一次。下一步是将64种不同的4聚体寡核苷酸分开置于一组中的64个通道的一个通道内，并使其与第一4聚体寡核苷酸化学结合。在一个盘中，所有这些第二4聚体寡核苷酸可以有相同的末端核苷酸，例如A。在制成四种化学上不同的盘后，所有的寡核苷酸(A、C、G和T)出现在一个盘的末端位置处。由于有256个不同的组，因此，每种第二4聚体寡核苷酸会在同一盘上出现256次。第二4聚体寡核苷酸可同时印制到所有这些位置上。为了避免污染，每种寡核苷酸应用专用的印模来印制。所有印模看上去完全相似。它们有256个间隔相同(约0.6mm)的螺旋通道。一个螺旋通道的宽度为5-8μm。通道可以是亲水性的，但是其间的间隔区域是疏水性的。在用寡核苷酸溶液润湿后，只有通道才保留溶液，溶液在接触基质后被部分转移。另一种方法是在通道底部蚀刻亲水性的腔穴，在这种情况下通道是疏水性的(图10)。这些腔穴宜用乳胶球涂覆，这些乳胶球是多孔的、亲水性的和有弹性的(图11)。通道本身是疏水性的，因此所有溶液保留在球内。这样就能更好地控制溶液量以及溶液在印模中和基质上的位置。该球用常规结合化学物质以适用于乳胶球的方式化学结合到印模上，例如在间隔物和乳胶球之间采用酰胺键。任选地，乳胶球位于印模上的凹槽内以获得更强的结合。
另外，寡核苷酸类似物也可代替上述寡核苷酸。这特别适用于互补印模，因为一些寡核苷酸类似物在水溶液中比寡核苷酸更容易偶联。例如，采用水溶性碳化二亚胺，含有氨基的4聚体可以与含有羧基的另一4聚体偶联。而且，一些寡核苷酸类似物提供了比寡核苷酸本身更强的杂交，它们可用于互补印模和最终的寡核苷酸阵列中。
制造生物致密盘
在下列描述中，假定已经制得所有印模。首先印制下侧臂寡核苷酸。制备8聚体的完全混合物。进行合成，使寡核苷酸的3′端与另一端为巯基的聚乙二醇(PEG)间隔物相连。(或者，巯基可以是基质上的固定间隔物，异氰酸基或马来酰亚氨基可以在PEG间隔物上)。完全混合物的溶液用作墨水(ink)来润湿印模(图7上左图)。在印模的一种构型中，固定的寡核苷酸在深1μm的凹槽的壁上(图8：凹处(concave)互补印制)。杂交后，洗去过量的寡核苷酸。将湿的印模牢牢地压在BCD上，此BCD在间隔物的下部有马来酰亚氨基。巯基会迅速和马来酰亚氨基交联。由于间隔距离相当长，因此在这一阶段只发生少数结合。为了释放寡核苷酸并推动反应完成，用微波或红外辐照约1分钟来加热此薄水层。寡核苷酸从印模上释放下来，然后自由扩散。寡核苷酸在1秒内可扩散1μm，在1分钟内可扩散8μm。由于马来酰亚氨基过量，因此所有经巯基衍生的寡核苷酸会有效地结合。印制步骤完成后可以除去印模。现在，可断裂间隔物分子有完全的下侧臂。从上侧臂位置除去保护性基团，现在重复印制步骤，以插入上侧臂寡核苷酸(图7上右图印模)。在这种情况下，寡核苷酸的5′端与聚乙二醇间隔物相连。BCD在清洗和干燥后待用。
测序策略
可分离染色体，并使各染色体的两条链分开，而不是试图对全基因组一次性测序。每个染色体只有一条链需要测序；另一条链的测序是任选的，可作为复查。为了进行测序，知道已知的n聚体在染色体中出现第二次的可能性非常重要。经鉴定的寡核苷酸越长，它出现两次的可能性就越小。为了完成可靠的测序，这一可能性应当非常小，使得经鉴定的寡核苷酸在染色体中仅出现一次，即该可能性应当小于4×10-9。仔细查看表2B，发现28聚体的这一可能性低于所需的极限值(1.7×10-9)。对于24聚体，其对应的可能性为4.4×10-7，这表明在染色体中约100个24聚体可能出现2次。因此，已知的28聚体可确保唯一的测序，而较短的寡核苷酸可能导致多义性。
不同的28聚体有大约65×1015种。即使一个寡核苷酸仅占10μm2，含有所有这些寡核苷酸的阵列的面积也将达130英亩。显然，此类阵列在实践中不能进行操作、加工和读取。另一方面，表4表明所有14聚体生物比特可安置在单个BCD(BCD面积＝4.2×104mm2)上。因此，单纯从实用角度来看，(7，7)识别是理想的。从表2A可以看出，没有发现给定的14聚体的可能性为0.393，而能发现两次和三次的可能性分别为0.173和0.050。由于重复序列的产生，这些可能性较高，相应地，不同14聚体的数目较低；在一个染色体中可能发现的所有可能的14聚体不足半数。然而，该可能性对所用的测序方案来说太高了，且14聚体太短而不能用于对全染色体一次性测序。
16聚体可能是能为从头测序给出足够信息的最短寡核苷酸，它仍在BCD的实用限度内。测序策略依靠的是采用如上所述制备的BCD。首先用(8，{0}，8)识别。这给出了作为染色体一部分的所有16聚体的信息。已经在一个染色体中的16聚体第二次出现的可能性为0.028。考虑到染色体的大小，该可能性表明有多达1百万个16聚体可以在一条染色体中出现两次。这些16聚体的每一个导致序列信息中产生分支点(branching point)。这显示在图9中，其中α和β表示某一16bp序列γ的到达序列(arriving sequence)，δ和ε表示离去序列(leaving sequence)。在用这种方法获得的序列中其它某点处产生了相同的分支。如果画出所有的分支点，则获得一个网状图形而不是一个序列。覆盖在这些分支点上的可能的序列可以称为α-γ-δ或α-γ-ε和β-γ-δ或β-γ-ε(图9)。而实际的染色体中只有这些可能性中的两种。当然，序列γ出现在这两个序列中，而其它序列α、β、δ或ε仅出现一次。因此，这足以查明序列α-γ-δ或α-γ-ε是否在特定的染色体中。随即可推导出另外二个中的哪一个也在该染色体中。所用的该方法可同时查出两者，因此另一个可用作复查。
固定的寡核苷酸的全长应为26-28个核苷酸，以便获得没有分支点的唯一序列。由于这在实践上是不可能的，因此必须采用其它策略。一种可能是采用(8，{11}，8)识别作为一种替换方案，其中{11}代表11聚体的完全混合物。样品如上文所述进行制备，只是靶长度为27聚体。将样品寡核苷酸施加到上文所用的类似BCD系列上。在杂交后，加入11聚体的完全混合物。在一些情况下正好留有足够的空间使11聚体也杂交。连接后，通过轻度加热和洗涤除去其它所有序列。并不知道那一个11聚体利用了该空间，但是两端的8聚体将会知道。在图9中仅显示了一种可能的杂交。观察到所有可能的杂交，即偏移±1、±2、±3个核苷酸等。这些8聚体的组合携带的信息足以用几乎明确的方式推导出序列(图9B)。
(8，{11}，8)识别基本上与27聚体的竞争性识别等价。尽管每个测定元件只识别16个核苷酸，即每个特定的间隔物分子有8聚体侧臂，但是这种识别图形提供了比识别DNA的16聚体链更多的信息。这在图12和13中有所描述，为了简便起见，用(4，4)和(4，{5}，4)识别的比较作为例子。如果某一8聚体序列(例如图12中的A8)在DNA中出现两次，则可能有两种可供选择的全序列。然而，在一种类似的情况下，如图13所述的(A4+A4)，(4，{5}，4)识别提供了明确的结果。这是因为简并性之前和之后的子序列含有共同的信息(图13中用下划线表示)(即分别为TATT序列和GTGG序列)。因此，可以类似方式用(8，{11}，8)识别来对27聚体节段进行测序而不用(8，8)识别，但是最好相伴采用这两种方法来获得可能的最确定的结果。
在实践中，用几种生物致密盘来对基因组完全测序。在一个较佳的实例中，间隔物分子用两个8聚体寡核苷酸侧臂来制成，在间隔物分子的两个末端和断裂位点之间各有一个。8聚体寡核苷酸的所有可能的序列都在侧臂上。在生产过程中确定了与间隔物分子相连的每个可能的8聚体配对序列的位置，这样就能检测任何特定序列的存在或不存在。在实践中，每个盘可能含有所有可能的序列的已知亚组，为了有一个大小合理、能和通常可获得的仪器一起使用的生物致密盘。在接触测定元件(即具有连接在预定位置上的上述间隔物分子的表面)前，将具有所有可能序列的可溶性11聚体寡核苷酸的混合物加入待测样品中，将所得溶液施加到生物致密盘的表面上。样品寡核苷酸片段的各序列与间隔物分子上的互补序列结合，并连接结合的节段。然后如上所述测定各序列。为了节省成本和时间，可对所有27聚体节段相似地重复上述方法。然后将从27聚体节段收集得到的信息，用已知方法测定基因组的全部序列。尽管上述描述指定用(8，{11}，8)聚体识别，但是该方法总体上也适用于(p，{q}，r)聚体识别，其中P，q和r是选自4-10,000的整数，最好在6-26之间，且(p+q+r)不超过30,000，最好是60。p＝r和q＞p通常是较佳的。由于可溶性寡核苷酸探针(q)应牢固结合使得其在与固定探针(p和r)杂交时不会从样品寡核苷酸上脱离下来，因此需要使q＞p。这也可通过采用一些杂交性极强的可溶性寡核苷酸类似物(如肽寡核苷酸)来实现。为了实现恒温杂交，p和r应相等。然而，出于同样的原因，应将含有很少胞苷或胍的寡核苷酸探针制得更长，以获得更强的结合。
对于小的基因组和对个别人的基因或基因组进行测序，p＝r＝7、q＝9就足够了。在这种情况下，一张盘就足以进行测序。
为了测定包含大部分人基因组的重复序列，p，q和r可能非常大，大约为100-10,000。可用离心或电磁力来衡量结合强度。可任选地进行连接以检查双链螺旋中有无缺口的存在。
用此系统可测定基因的表达水平。通常较佳的是采用非常大的片段来识别。这样就节省了空间。在基因表达的研究中，错配并不是严重的问题，因此采用较小的探针寡核苷酸不会提供更大的好处。
样品的分级
含有寡核苷酸片段的样品可直接施加到BCD的表面上。然而，较佳的是样品被分级成至少一些亚类。如果适当地设计分级和BCD模型，可将给定亚类置于BCD表面上某一区域中，从而增加了杂交的可能性，减少了错配的可能性。
在用寡核苷酸阵列时，错配是最严重的问题之一。仅一个核苷酸不同的寡核苷酸之间发生错配最为频繁。尽管如此，制造了许多寡核苷酸阵列其邻近的寡核苷酸部位只有一个核苷酸不同。下述程序可制造出含有一个寡核苷酸亚类(该亚类中所有寡核苷酸之间至少有两个碱基对不同)的阵列和分级系统。该程序可以延伸产生一个亚阵列，其中每个寡核苷酸与该亚阵列的其它任何寡核苷酸相比至少有三个核苷酸不同。
为了保证在寡核苷酸n聚体的某一亚类中每个寡核苷酸与其它寡核苷酸至少有两个核苷酸不同，应当选择表5的二聚寡核苷酸四重组(quartet)的n/2来构建该亚类。假设n可被2整除。例如，通过选择两个(4/2＝2)二聚体的四重组(例如四重组1和3)，产生四聚体寡核苷酸(n＝4)的亚类。通过四重组1的一个二聚体与四重组3的另一个二聚体组合，可产生16个四聚体寡核苷酸。这16个四聚体显示在表16中。一行中的四聚体有两个核苷酸不同，一列中的四聚体也是如此。从不同行和列中取出的两个四聚体有四个核苷酸不同。用表5可产生四聚体寡核苷酸的所有总共16个亚类。每一亚类含有16个寡核苷酸，因此将产生总共256(16×16＝256)个四聚体寡核苷酸，而且每一个是一个亚类且仅是一个亚类的一个成员。类似地，所有寡核苷酸n聚体(其中n是偶数)可分成亚类。亚类的数目为4n/2，每个亚类含有4n/2个寡核苷酸，即总共应该是4n个。
从二聚体构建寡核苷酸n聚体仅仅是概念上的，对于实际的合成没有限制性，实际合成可用单体、二聚体等以及本文其它地方描述的核苷酸衍生物来进行。然而，二聚体为合成表5设计的阵列提供了最实用的方法。
最好用(8，8)或(8，{11}，8)识别或这些方式的组合来进行测序。首先可根据各寡核苷酸的3′端中的8聚体序列将样品寡核苷酸分成44(256)个亚类。再根据各寡核苷酸的5′端将这些亚类的每一类分成256个亚类。因此，总共获得48(65,536)个亚类。这些亚类的每一类含有48个(8，8)-寡核苷酸对。一个亚类可覆盖BCD上大约0.25mm×0.25mm的面积。
为了在盘上合适的位置上获得48个亚类，必须将样品分级。该任务也可通过下文用于(4，4)识别场合中关闭的BCD(Disklab)来进行。用短的寡核苷酸作为例子来简化数字。现在，可将第一和第二识别寡核苷酸分成42(＝16)个亚类，即有16×16(＝256)种组合。该例子可以明显的方式推广到更长的寡核苷酸。
分级盘由两个分开的盘组成，将它们夹在一起并在需要时拆开。另一半的总体结构显示在图14A中。从内部开始向外移动来描述此盘的结构。中心最小的圆圈是任选地用来操纵和转动的一个洞。两个圆圈之间无结构区域是洗脱缓冲液的容器。被部分双层壁分成16个区室的区域是圆形的分级“柱”。第一次分级在该部分中进行。16个螺旋通道可用作第二分级步骤。最后，无结构的外周用来收集废液。
在第一个盘的顶部放置第二个盘(图14B)，该盘用16类寡核苷酸亚类涂覆，因此它们形成了逆时针样式的螺旋线。该盘称为收集盘。收集盘可以是平的或经机械制模。当两个盘夹在一起时，第一盘中的通道无论如何都必须密封以使被覆盖的通道之间不交换洗脱缓冲液和DNA片段(该通道更合适地称为毛细管)。图14C显示了操作盘的顶视图。为了清楚起见，只显示了一个亚类区域。该区域以及其它所有15个区域均与所有16个毛细管交叉。在本发明的这个实例中，总共有256个交叉。
图15中更详细地示出了含有圆形第一分级区的盘的中央部分。16个区室的每一个含有填充松散的固体载体，固体载体用8聚体寡核苷酸的某一亚类涂覆。根据表5，形成这些寡核苷酸的一个4聚体末端(例如3′端)。另一个4聚体末端(5′端)含有所有可能的4-聚体组合。16个4聚体3′端亚类的每一个均在一个区室且仅在一个区室中。样品在最适温度下通过泵送来循环。泵可以外置或内置。在达到平衡后，除去未结合的样品，洗涤固体载体除去未结合的和结合松散的寡核苷酸。对盘加热(例如用IR-辐射)，使杂交的寡核苷酸变性，并非常快速地转动(例如200-50,000rpm)，使得阀门由于离心力而打开。分级单位也可以是可相对盘其余部分转动的一个组件，这样就所有32个阀门可同时打开。在这种情况下，阀门可以是简单的孔洞，在一个位置上关闭，在另一个位置上打开。洗脱缓冲液会携带变性的寡核苷酸进入毛细管，每个毛细管在它们的一个壁上有16个8聚体寡核苷酸亚类存储区方式(zonewise)。在这种情况下，完全形成了表5各个8-聚体亚类。如此，16份级分的每一份将被进一步分成16个级分。所有这些级分可以和与另一个盘分开的收集盘附着。
将收集盘置于以类似方式置于测序盘的顶部。测序盘中的分辨力通常(但不是必须)比收集盘高得多。
该分级方法的目的是浓缩与其互补性探针寡核苷酸接近的正确类型的序列。用长度恒定的寡核苷酸进一步改善该分级方法。在任何情况下，该方法均大大增加了正确类型的寡核苷酸的浓度，从而使它们可被检测到。
尽管本发明已经参照一些具体的例子进行了描述，但是可以理解，本领域技术人员显然能作各种改动及其等效和变化，这些变化均包括在本文所附权利要求的范围内。
                             表1
         所有n聚体的重量(毫克)      10毫克中每个寡核苷酸的平均拷贝数16聚体           34.3×10-9                     3×10824聚体           33.2×10-4                     3×10326聚体           57×10-3                         18028聚体              0.86                            1131聚体              71.3
            表2A在一条染色体中没有发现给定n聚体(n＝14，16，17，18或19)或发现一次、两次或三次的可能性。
           14聚体    16聚体      17聚体      18聚体     19聚体
P(0)       0.393      0.943       0.986       0.996      0.999
P(1)       0.366    5.5×10-2  1.4×10-2   3.6×10-3  9.1×10-4
P(2)       0.173    1.6×10-3  1.0×10-4   6.6×10-6  4.1×10-7
P(3)       0.050    3.1×10-5  5.1×10-7   8.0×10-9  1.3×10-10
P(2.3)     0.397    2.8×10-2  7.3×10-3   1.8×10-3  4.6×10-4
P(1，3)频率大于1的寡  60×106 7.0×106  1.8×106   0.45×106  0.11×106核苷酸的总数
             表2B在一条染色体中没有发现给定n聚体(n＝20，21，22，24或28)或发现一次、两次或三次的可能性。
             20聚体      21聚体      22聚体       24聚体      28聚体
p(1)       2.3×10-4   5.7×10-5   1.4×10-5    8.9×10-7   3.5×10-9
p(2)       2.6×10-8   1.6×10-9   1.0×10-10   3.9×10-13  6.0×10-18
p(3)       2.0×10-12  3.1×10-14  4.8×10-16   1.2×10-19  7.0×10-27
p(2.3)     1.1×10-4   2.8×10-5   7.1×10-6    4.4×10-7   1.7×10-9
p(1，3)频率大于1的寡  28×103     7.1×103    1.1×103       111        0.43核苷酸的总数
            表3
          重要的事实一个染色体含有最多250×106碱基对(染色体1)。
每个BCD的400.μm2点的数量为105。
BCD的面积为4.2×104mm2。
                      表4
          n聚体的数量以及生物比特的总面积n      4n        含有占100μm2寡像素的          点/BCD
           (oligopixel)所有n聚体的点4      2565      10246      4096           0.4mm2                  1.0×1057    16×103         1.6mm2                  2.5×1048    65×103         6.5mm2                  6.2×1039    260×103        26mm2                   1.6×10310   1.0×106        100mm211   4.2×106        400mm212   16.8×106    1.6×103mm213   67.1×106    6.4×103mm214   268×106     26×103mm215   1.1×10916   4.3×109
                 表5
可用作构建寡核苷酸亚类的二聚寡核苷酸的四个四重组1           2          3           4AA          AC         AG           ATCC          CG         CT           CAGG          GT         GA           GCTT          TA         TC           TG
                表6
用表5的四重组1和3产生的16个四聚寡核苷酸的一个亚类AA-AG      CC-AG      GG-AG      TT-AGAA-CT      CC-CT      GG-CT      TT-CTAA-GA      CC-GA      GG-GA      TT-GAAA-TC      CC-TC      GG-TC      TT-TC

Claims (16)

1.一种从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：
(a)形成一个固体载体，所有可能的n聚体寡核苷酸与该载体表面相连；
(b)在使样品寡核苷酸和固体载体上的互补n聚体寡核苷酸杂交的条件下，使步骤(a)所得固体载体与样品接触；
(c)使步骤(b)所得固体载体与水解剂接触；
(d)使杂交的寡核苷酸与未结合的寡核苷酸分离；和
(e)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，获得样品的n聚体寡核苷酸；
其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。
2.一种从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：
(a)使固体载体与样品的至少一部分接触，该固体载体被改成适合于交联样品中的寡核苷酸；
(b)使步骤(a)所得固体载体与n聚体寡核苷酸混合物接触，接触时间足以使n聚体寡核苷酸与固体载体上的样品寡核苷酸杂交；
(c)使未杂交的寡核苷酸与杂交的n聚体寡核苷酸分离；
(d)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，获得与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；
其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。
3.一种从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：
(a)使固体载体与多个第一k聚体寡核苷酸和多个第二m聚体寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上结合了多个样品寡核苷酸片段，所述第一寡核苷酸每一个的3′端没有游离的羟基，所述第二寡核苷酸每一个的5′端没有游离的磷酸基团；
(b)连接步骤(a)所得的与固体载体上的样品寡核苷酸杂交的第一和第二寡核苷酸；
(c)从固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和
(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，获得与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；
其中m和k各为选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28，条件是k+m＝n。
4.一种从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：
(a)使固体载体与多个h聚体寡核苷酸、多个i聚体寡核苷酸和多个j聚体寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上结合了多个样品的寡核苷酸，所述h聚体寡核苷酸每一个的3′和5′端有磷酸基团，所述i聚体寡核苷酸每一个的3′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团；所述j聚体寡核苷酸每一个的5′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团；
(b)用化学或酶方法连接步骤(a)所得的与固体载体上的样品寡核苷酸杂交的寡核苷酸；
(c)从步骤(b)所得固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和
(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，获得与样品中的n聚体寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；
其中h，i和j各是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28，条件是h+i+j＝n。
5.一种测定元件，它包括：
一个基质，该基质具有一个表面，包括该表面上被改成适合连接一个间隔物分子的多个分开的区域；
多个间隔物分子，各分子的第一末端与各个分开区域中的所述表面连接，所述各个间隔物分子被改成其第二末端与金属表面或标记物连接，所述各个间隔物分子的第一末端和第二末端之间有一个能被断裂的位点；
具有第一序列的第一n聚体寡核苷酸，它在间隔物分子的断裂位点和间隔物分子第一末端之间与基本上所有的间隔物分子连接，和
具有第二序列的第二m聚体寡核苷酸，它与基本上所有的间隔物分子相连；
其中n和m是选自4-10,000之间的整数，最佳的为2-28。
6.一种测定怀疑存在于样品中的基因的(p+r)聚体节段序列的方法，该方法包括：
(a)使测定元件与含有基因的未知(p+r)聚体节段的样品溶液的至少一部分接触，该测定元件具有一个表面和结合在该表面上的多个间隔物分子，间隔物分子的第一末端与该表面结合，第二末端与金属表面或标记物结合，在第一和第二末端之间有一个断裂位点，间隔物分子进一步还具有连接在断裂位点和第一末端之间的第一p聚体寡核苷酸以及连接在断裂位点和第二末端之间的第二r聚体寡核苷酸，p聚体和r聚体的组合包括了p聚体和r聚体寡核苷酸的所有寡核苷酸序列组合，或任选地包括了所有这些组合的亚组，p聚体和r聚体寡核苷酸的每个特定的序列组合都位于该表面预定位置上；
(b)检测该表面上各预定位置处杂交的寡核苷酸特定序列的组合是否存在；和
(c)对步骤(b)所得序列信息进行处理，以推导出样品中存在的(p+r)聚体寡核苷酸的序列；
其中p和r是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28，且(p+r)不超过30,000，最佳是60。
7.根据权利要求6所述的方法，该方法包括如下步骤：在检测表面上各预定位置处杂交的寡核苷酸的特定序列的组合是否存在之前，使步骤(a)所得的与间隔物分子连接的所得杂交寡核苷酸连接。
8.根据权利要求6所述的方法，其中对于一个基因的不同的多个节段同时进行步骤(a)-(d)。
9.一种测定怀疑存在于样品中的基因的(p+q+r)聚体节段序列的方法，该方法包括：
(a)形成样品与q聚体寡核苷酸的混合物的溶液，所述混合物含有q聚体寡核苷酸所有可能的序列、或任选地含有所有这些可能序列的亚组；
(b)使测定元件与步骤(a)的溶液的至少一部分接触，该测定元件具有一个表面和结合于该表面的多个间隔物分子，间隔物分子的第一末端与该表面结合，第二末端与金属表面或标记物结合，在第一和第二末端之间有一个断裂位点，间隔物分子进一步还具有连接在断裂位点和第一末端之间的第一p聚体寡核苷酸和连接在断裂位点和第二末端之间的第二r聚体寡核苷酸，p聚体和r聚体的组合包括了p聚体和r聚体寡核苷酸的所有寡核苷酸序列组合，或任选地包括了所有这些组合的亚组，p聚体和r聚体寡核苷酸的每个特定的序列组合都位于该表面预定位置上；
(c)检测表面上各预定位置处的杂交寡核苷酸的特定序列组合是否存在；和
(d)对步骤(c)所得序列信息进行处理，推导出样品中存在的(p+q+r)聚体寡核苷酸的序列；
其中p，q和r是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28，且(p+q+r)不超过30,000，最佳的是60。
10.根据权利要求9所述的方法，该方法包括使步骤(b)所得的与间隔物分子连接的所得杂交寡核苷酸连接的步骤。
11.根据权利要求9所述的方法，其中对于一个基因的不同的多个节段平行地进行步骤(a)-(e)。
12.根据权利要求9所述的方法，其中p或r中的任一个或p和r两者不等于q。
13.根据权利要求9所述的方法，其中p和r是7至9之间的整数，q是9至12之间的一个整数。
14.一种测定怀疑存在于样品中的未知基因的序列的方法，该方法包括：
(a)进行权利要求6所述的方法，其中对一个基因的不同的多个(p+r)聚体节段平行地进行步骤(a)-(d)；
(b)进行权利要求9所述的方法，其中对一个基因的不同的多个(p+q+r)聚体节段平行地进行步骤(a)-(e)；
(c)对步骤(a)和(b)所得序列信息进行处理，推导出样品中未知基因的序列；
其中p和q是4-10,000之间的整数，最佳的为6-28，且(p+q+r)不超过30,000，最佳的是60。
15.根据权利要求14所述的方法，其中p或r中的任一个或p和r两者不等于q。
16.根据权利要求14所述的方法，其中p和r均为7至9之间的整数，q为9至12之间的一个整数。
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