JPH08508311A

JPH08508311A - 導電性ポリマー／ヌクレオチドコポリマー、その製造方法及びその用途

Info

Publication number: JPH08508311A
Application number: JP6521751A
Authority: JP
Inventors: テオール，ロベール; ロジェ，アンドレ; リバシュ，チエリ; バルテ，クリステル; ビダン，ジェラール
Original assignee: シスバイオインターナショナル
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1996-09-03
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: ES2110228T3; JP3247957B2; US6197949B1; ATE159028T1; DK0691978T3; EP0691978B1; GR3025738T3; WO1994022889A1; FR2703359B1; FR2703359A1; EP0691978A1; DE69406119T2; US5837859A; DE69406119D1

Abstract

(57)【要約】１．一般式（Ｉ）

Description

【発明の詳細な説明】導電性ポリマー／ヌクレオチドコポリマー、その製造方法及びその用途本発明は、導電性ポリマー（ＥＣＰ）と核酸との結合に関する。生物学で通常使用される非常に多くの技術、例えば核酸の合成又はハイブリッド形成において、オリゴヌクレオチドは、固体支持体にそれらの末端で共有結合されている。種々の支持体、紙、ナイロン、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等がこの目的のために使用されている。現在、多くのチームが、予め確立した配列に従って配列された種々の配列で、同時に種々の反応（例えば支持体上のハイブリッド形成）を行うため、多くのオリゴヌクレオチドを支持する支持体の製造について研究している。このように、この研究方法が、例えば、核酸の配列決定を容易にするため提案されている。微細表面（支持体上のオリゴヌクレオチド・マトリクス）上の行及び列に配列した種々のオリゴヌクレオチドが、核酸の配列のために提案されている〔リソフら、プロク．ユーエスエスアールアカッド．サイ．（LYSOV et al.,Proc.USSR Acad．Sci.）、303巻、1508〜1511頁、1988年；キラプコら、エフイービーエスレット.（KHRAPKO et al.,FEBS Lett.）、256巻、 118〜122頁、1989年；キラプコら、ＤＮＡセクエンス（KHRAPKO et al.,DNA S equence）、１巻、375〜388頁、1991年；ベインズアンドスミス、ジェイ．セオル．バイオル．（BAINS & SMITH，J.Theor.Biol.）、135巻、303〜307頁、1 988年；チャーチアンドキーファー・ヒギンス、サイエンス（CHURCH & KIEF FER-HIGGINS,Science）、240巻、185〜188頁、1988年；サザーン、国際特許出願ＷＯ８９／１０９７７号（SOUTHERN,PCT apprication WO89/10977）、1989年〕。その方法は、１組のオリゴヌクレオチド上の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖のハイブリッド形成に基づいている。理論上、標的核酸における配列の存在又は不存在は、定義された厳格な条件下、微細表面上で観察されるハイブリッド形成によって決定してもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドのその場での合成に関して、固相上への化学合成、感光結合法及びフォトリソグラフィを組み合わせることによって、フォドアーら（FODOR et al.）〔サイエンス（Science）、251巻、767〜773頁、1991 年〕は、グリッド（正方形、側長１００μｍ）上に１０２４個のペプチドを合成することに成功している。これらのペプチドは、ペプチド合成のためにフォトリソグラフィマスク及び感光保護基（photolabile protective group）を用いて、同時かつ並行合成によって得られた。ｄＣｐＴジヌクレオチドが、感光保護基によって５′位が保護されたチミジン（５′−ニトロベラトリルチミジン）を用いて、その場に合成された。光がフォトリソグラフィマスクによって導かれ、側長１００μｍを有するチェック・パターン中で堆積物が得られた。マスコスアンドサザーン（MASKOS & SOUTHERN）（ヌクレイックアシッドレス.（Nucleic Acids Res.）、20巻、1675〜78頁、1992年）が、顕微鏡下、スライドガラス上で４つの異なったオリゴヌクレオチドのその場での合成を行った。これまで、オリゴヌクレオチドの直接の堆積に用いられる技術は、マニュアル堆積（depot manuel）（工業規模で使用することはできない）又は“マスク”の使用を必要とし、かつ、さらに、感光性である核酸を利用することが困難であるフォトリソグラフィ技術のいずれかを使用する。本発明の目的は、新規な支持体及び先行技術で提案されている方法の欠点を有さないオリゴヌクレオチドを結合するための新規な方法を得ることである。この目的で、発明者らは、結合支持体として導電性ポリマーを使用する概念を持っている。発明者らは、共有結合を介してヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを導電性ポリマーに安定に結合させることができ、よって新規のコポリマーを得ることができる。本発明の対象は、下記の一般式（Ｉ）に対応するコポリマー（式中、単位Ａは導電性ポリマーのモノマー、単位Ｂはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの類似体の一つ、ｘ，ｙ及びｚは１又は１以上の整数又はｙは０、及びｌは共有結合又はスペーサー手（bras espaceur）を示す。）である。Ａがモノマーを示す導電性ポリマーの限定されていない例として、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール、ポリアニリン等が挙げられる。Ａはピロール単位が有利である。本発明の説明に関して、用語ヌクレオチド類は、例えば、ウールマン（UHLMAN N）〔ケミカルレビュー（Chemical Review）、90巻、４号、543〜584頁、1990 年〕に述べられているような、いずれかの変性ヌクレオチドを意味するものと理解される。単位Ｂがヌクレオチドの時、通常、それは天然のオリゴヌクレオチドの組成の一部を形成するもの１つであるのみならず、実験室において使用されるそれらの類似体又は誘導体でもある。例えば、＊合成オリゴヌクレオチドの組成の一部を形成するヌクレオチド類似体、＊核酸の合成のために通常使用される保護された官能基を有するヌクレオチド誘導体（この場合、Ｂ_zはオリゴヌクレオチドの合成中間体を構成する。）である。Ｂ_zは、ウールマン（UHLMANN）（上述の刊行物）に述べられているような核酸とハイブリッド化しうる非天然化合物であってもよい。Ｂ_zの構成の一部を形成する単位Ｂは、同一又は異なっていてもよく、かつＢ_z はホモポリマー又はヘテロポリマーを構成してもよく、後者の場合、単位Ｂは、予め決定された又は決定されていないいずれかの配列において、ともに結合してもよい。本発明の好ましい実施態様によれば、ｘ／ｙ比は１／５と１／１００，０００の間である。本発明の他の好ましい実施態様によれば、ｆは下記の式の１つ −R₁−［(CH₂)_n−R₂］_x−［(CH₂)_m−R₃］_y−(CH₂)_p− 〔式中、・ｎは１〜１０の整数、・ｍは０又は１〜１０の整数、・ｐは０又は１〜１０の整数、・ｘは０又は１〜８の整数、・ｙは０又は１〜８の整数、・R₁、R₂及びR₃は、同一又は異なっていてもよく、ＣＨ₂、Ｏ、Ｓ、ＮＲ′、ＣＯ、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＲ′ＣＯ、ＣＯＮＲ′、ＮＨＳＯ₂、（式中、Ｒ′は水素原子又はＣ₁〜Ｃ₁₂のアルキル鎖）〕に対応するスペーサ手を示す。本発明の対象は、共有結合を介して、少なくとも１つのヌクレオチドの結合のための支持体としての導電性ポリマーの用途である。本発明の他の対象は、一般式（Ｉ）のコポリマーの製造方法である。第１の変形によれば、この方法は少なくとも以下の工程からなる。・一般式（II） −〔Ａ^*〕_x−〔Ａ］_y− （II）（式中、Ａ，ｘ及びｙは上記定義と同義、及びＡ^*は官能化（fonctionnalise）Ａを示す）のコポリマーを製造する第１工程。・式（II）のポリマーに、一般式（III）ｌ^*−〔Ｂ〕_z （III）（式中、Ｂ及びｚは上記定義と同義、ｌ^*はＡ^*に結合することができる活性化手（bras active）である。）の少なくとも１つの基を結合する第２工程。本発明の認識において、用語“官能化”及び“活性化”は、共有結合を形成するために共に反応することができる化学的な機能をＡ及びｌに付与することを意図するいずれかの化学的変化の結果を意味するものと理解される。他の変形によれば、一般式（Ｉ）のコポリマーの製造方法は、少なくとも以下の工程からなる。・一般式（IV）式中、Ａ、Ｂ、ｚ及びｌは上記定義と同義である。）化合物を製造する工程ａ）、・化合物（IV）をモノマーＡと共重合する工程ｂ）。好ましくは、本発明に対応する方法の１つ又は他の変形の少なくとも１つの工程が、少なくとも１つの電気化学的反応を含むことである。この電気化学的共重合は、電極表面上でなされることが好ましく、よって反応の終わりに、表面が本発明に対応するコポリマーからなる電極が得られる。例えば、本発明に対応する方法の第１の変形をなすために、一般式（II）のコポリマーの製造のための工程及び／又は一般式（III）の基の結合のための工程を、電気化学的反応によって行ってもよく、第２の変形において、工程ｂ）は、化合物（IV）とモノマーＡとの電気化学的共重合によって行うことが好ましい。電気化学的共重合は、例えば、サイクリックボルタンメトリーによって、混合物〔（IV）：Ａ〕を逐次酸化及び還元による重合をなし遂げるに十分な電気的ポテンシャル変化に付すことによってなされ、形成されたポリマーが導電性であるため、酸化−還元サイクルが数回繰り返される。電流が設定された（定電流電解法）又は電位が設定された（定電位電解法）重合のようなＥＣＰの製造のために一般に用いられる電気化学的重合の方法も、本発明による共重合体の製造に応用される。堆積物の品質は実験条件、オリゴヌクレオチド−ピロール／ピロール比、浴温度、溶媒の性質、使用された電気化学的方法（サイクリックボルタンメトリー、定電流電解法又は定電位電解法）の選択によって制御できる。よって、得られるコポリマーは、気孔率及び所望の以後の用途に基づく利用しやすさの異なった品質を有し、結合するオリゴヌクレオチドの量を変化させることができる。本発明による方法の実行に関して、電気化学的反応は、電極表面で行うことが好ましい。反応中に放出される電流の測定によって、電極は有効に重合反応の進行（例えば形成されたポリマーの膜厚）又はコポリマー上で行われる次の反応の進行を監視することができる。１つの又は他の変形における本発明の方法の好ましい実施態様によれば、さらに、いくつかの後続する工程において、オリゴヌクレオチドＢ_zの伸長を含み、これら工程のそれぞれは、１つ以上の単位Ｂの結合からなる。オリゴヌクレオチドＢ_zの伸長は、導電性ポリマーの表面に結合した少なくとも１つのヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドで開始して、保護されたモノマーの組み立てによって支持体の表面で行われる。核酸の化学合成の標準的な方法を、この実施態様の実行において用いてもよい。本発明による支持体は、成長ポリマー鎖の保護、脱保護及び縮合反応を行うために電極電位の変化を用いることにより、さらにオリゴヌクレオチドを電気化学的に伸長させてもよい。本発明の他の目的は、その表面が本発明による式（Ｉ）のコポリマーを有するコーティングからなる電極である。このような電極は、例えば、白金、金、金で被覆されたクロム又はチタン、あるいはガラス質の炭素等からなる電極の表面で式（Ｉ）のコポリマーの層を堆積させることにより得ることができる。好ましくは、異なった性質のコポリマーを有してもよいいくつかの電極を組み合わせてもよい。装置は、このように得られ、核酸の合成のための反応及び／又はハイブリッド形成のための反応を行うために用いることができる。本発明に対応する装置の特に好ましい実施態様は、いくつかの電極、異なった基Ｂ_zを有する少なくとも２つの組み合わせからなる。これは、例えば、それぞれが異なったヌクレオチド（又は類自体）を有する一組の電極、又はそれぞれが異なった配列のオリゴヌクレオチドを有する一組の電極である。オリゴヌクレオチドの非常に小さい表面への結合の結果、電気化学的反応を制限することができる限りにおいて、本発明による装置は、支持体上に分布した微小電極（ＥＰＣマイクロチップ）を有する複数のＥＣＰ微小表面からなってもよい。この点で、所望により、すべての異なるオリゴヌクレオチドＢ_zは、制御され、系統化された方法でこれら微小電極へ結合するであろう。 “ＥＣＰマイクロチップ”は、特に核酸配列及び診断に使用されるであろう。上記に示した限定されていない実施例によって、本発明によるコポリマー〔オリゴヌクレオチドを有するポリピロール／ポリピロール〕を得ることができる。１）ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はこれらの類似体の一つと官能化されたポリピロールとの化学反応による。例えば、アミノエチルピロールと、一端に遊離燐酸又は活性化カルボキシルを有するオリゴヌクレオチドとの縮合を行うことができる。２）ピロールと、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はこれらの類似体の１つとピロールとの縮合の生成物と、ピロールとの化学的又は電気化学的共重合による。例えば、ピロールは、その一端にピロールを有するスペーサ手を持つオリゴヌクレオチドと電気化学的に共重合することができる。白金表面上に強力に密着して得られるコポリマー層の厚さは０．１μｍ〜数μｍであり、例えば１００μｍ²の表面上に形成されていてもよい。干渉されることなく、オリゴヌクレオチドの分解反応を証明することができる。３）保護された化学的機能を有する導電性ポリマーの製造による。これらの機能は局部的かつ選択的に、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとのそれらのカップリングをさせるため脱保護される。例えば、モノメトキシトリチルアミノエチルポリール／ポリピロールを製造し、酸性媒体中又は電位印加のいずれかで局所的にそれを脱保護することが可能である。遊離アミン基はこのようにヌクレオシド、ヌクレオチド又は、例えば活性化燐酸又は活性化カルボキシルを有するオリゴヌクレオチドと反応させることができる。４）種々のオリゴヌクレオチドの立体制御された同時合成による。オリゴヌクレオチドの合成は、コポリマーの表面で影響を受けやすいヌクレオシドを出発原料として、保護されたヌクレオチドを組み立てることにより、支持体上のある点で行われる。保護されたヌクレオチドは、ヌクレオシドホスファーアミジテス（phosphoramidites）、ヌクレオシドホスホネート又はヌクレオシドホスホトリエステルである。局所的に、合成は、オリゴヌクレオチドが、合成装置中でシリカ支持体上に合成されるのと同様の方法で行われる。しかしながら、その差異は、オリゴヌクレオチドの全体の一連の合成が非常に小さい表面上で選択的な脱保護又は縮合操作を電気化学的に行うことによって、同時になされ、よって反応すべきでないオリゴヌクレオチドをマスクすることができることである。これは異なったオリゴヌクレオチドを同時に合成させる。明らかに、コポリマー〔ピロール／オリゴヌクレオチドピロール〕の合成を示すために上記に簡単に要点を述べた方法は、ポリヌクレオチド類似体、例えば、モノ−又はジチオ燐酸塩、メチルホスホン酸塩及びリン酸トリエステルのような糖−燐酸塩鎖類似体、及びホルムアセタール、カルバメート及びスルホキシドのような非イオン性非燐酸化類似体に応用することができる。本発明によるコポリマーは、機械的ストレス、水分、乾燥、熱及び塩基に対して良好な安定性を有し、かつこのように非常に多くの反応と適合し、よって、使用の広範囲の変形が可能である。本発明者らは、選択的にオリゴヌクレオチドが、ポリピロール支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリド形成し、この支持体の使用が、以下の利点を与えることを見出した。・本発明によるコポリマーは多孔質であり、よって支持体に結合したオリゴヌクレオチドに、相補的配列の核酸とハイブリッド形成するために良好な得易さを与える。この得易さは、コポリマー層の厚さに比例するハイブリッド形成の観察によって証明される。ハイブリッド形成媒体における相補的オリゴヌクレオチドは、３倍厚のピロール／オリゴヌクレオチド−ピロールコポリマー層（かつこのように支持体に結合した３倍以上のオリゴヌクレオチドを含有する）の上に３回ものハイブリッド形成を行う。ハイブリッド形成動力学は、従来のハイブリッド形成支持体で観察されるこれらに類似している。同じ条件下で、非相補的オリゴヌクレオチド配列は、支持体に結合しないことに注目すべきである。・発明者らは、また、ハイブリッド形成が可逆的であり、いずれかのハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドは、加熱、又は希釈水酸化ナトリウムとの処理によって、ポリピロール及び結合オリゴヌクレオチドに損傷を与えることなく脱離することを確認している。・上述したように、制御された共重合は、非常に小さい電極表面で行うことができる。これは、支持体上で完全に整理され小型化されたグリッドを製造することを可能にし、このグリッドのそれぞれの点は、十分明確にされた性質のオリゴヌクレオチドを有している。支持体に結合している鎖に対して相補的な配列を有する標的核酸鎖を選択的にハイブリッド形成する。これは、標的核酸の非常に高い局所密度を生じさせ、よって、それらを検出しやすくさせ、又はある場合でさえ、検出の前に拡大のための必要性を排除する。ハイブリッド形成の検出は、特に、コポリマーを製造するために用いられ、次いで、その表面で生じる会合又は解離現象を測定するために使用される電極によってなされる。相補的核酸のハイブリッド形成は、例えば、直接的な測定法、又は例えばフェノチアジンあるいはキノンの電気的活性分子での標的オリゴヌクレオチドの標識のいずれかによって、導電性ポリマーを支持する電極上の電気的測定法によってその場で監視される。核酸の標的配列を検出する従来の方法も応用できることは言うまでもない。発明者らはさらに、その場での電気化学的脱保護によって、本発明によるコポリマー上に直接的にオリゴヌクレオチドを合成することに成功した。一般に、支持体上に成長したポリヌクレオチド鎖上のヌクレオチドの集合は、与えられた官能基への反応を指向するため及び他でのそれを防止するために保護基を含む一連の反応を用いる。発明者らは、ヌクレオチドを挿入することを目的として選択されたオリゴヌクレオチドに相当する表面上での集合のための反応を指向するためにこの性質を利用される。本発明によれば、成長したオリゴヌクレオチド鎖のための保護基は、電気化学的反応によって局所的に移動し、よって選択された位置にヌクレオチドを加えることが可能になる。さらに利点は、本発明による支持体上でその場でのオリゴヌクレオチド合成を行うことを可能にする。実際にこの場合、その場で、かつグリット上に配列する一連のオリゴヌクレオチドと並行して、ピロール手を有する合成オリゴヌクレオチドと別個ではなく合成され、次いで共重合が可能になる。これは数千の微小表面のマトリックスの工業的製造を観察することを可能にする。本発明は以下に述べる明細書、本発明によるコポリマーの製造方法及び用途の例の引用によって、より理解することができるだろう。ピロール及びピロール基を有するオリゴヌクレオチドの共重合によるポリピロール支持体の製造：この支持体の性質実施例１：変性オリゴヌクレオチドの合成Ｉ．ピロールヌクレオシドアミド（AMIDITE）の製造第１方法この合成の全般的な反応体系は図１に示される。・第１化合物の製造（図１）この化合物は、ロゲットら（ROGET et al.）〔ヌクレイックアシッドレス. （Nucleic Acids Res.）、17巻、7643〜7651頁、1989年〕によって述べられた方法によってジアミンと、ジメトキシトリチルチオチミジン又はジメトキシトリチルチオデオキシウリジンとの反応で得られる。・第２化合物の製造（図１）第１化合物（２ｇ；３．１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルとの共蒸発によって乾燥し、ジクロロメタン２０ｍｌに再溶解した。ジスクシンイミジルセバコエイト（dissuccinimidylsebacoate）２当量（２．４５ｇ；６．２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３時間反応をさせた。得られた生成物をシリカのカラム（クロロホルム中、０〜１０％のメタノール勾配）で分離、またはヘキサン中に沈殿させた（収率＝６０％）。第３化合物の合成のため、更に精製をすることなく用いることもできる。・第３化合物の製造（図１）この生成物は、アミノエチルピロール（１．３６ｇ；１２．４ｍｍｏｌ）を前記反応混合物に添加するか、又はアミノエチルピロール２２０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）を精製した後に得られた第２化合物に添加して製造される。ｐＨは第３級アミン（トリエチルアミン）を添加することにより８〜８．５になる。２時間反応をさせ、クロロホルム２５０ｍｌを添加する。得られた有機溶液を０．５ＭＮａＨＣＯ₃１００ｍｌで２度、及び蒸留水１００ｍｌで洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。生成物をクロロホルム中のメタノール（０〜１０％）のシリカのカラムで分離する。溶媒の蒸発後、第３化合物をエタノール１０ｍｌに取り出し、エチルエーテル４００ｍｌ中で沈殿させる（収率＝６０％）。・第４化合物の製造（図１）第３化合物（１００ｍｇ；０．１１ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアンモニウムテトラゾレート（９ｍｇ；０．５当量）とを、無水ジクロロメタン（２ｍｌ）と無水アトニトリル（３ｍｌ）との混合物との共蒸発によって乾燥させる。残渣をアミレンで安定化したジクロロメタン２．５ｍｌに取り出す。ビス（ジイソプロピルアミノシアノエトキシ）ホスフィン（３９μｌ；１．２当量）を隔膜を通して添加する。２時間の反応後、無水ジクロロメタン２０ｍｌを添加する。得られた溶液を、飽和ＮａＨＣＯ₃２５ｍｌで２度、次いで蒸留水２５ｍｌで洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させる。得られたホスホラミデートをジクロロメタン２ｍｌ中に取り出し、ヘキサン１００ｍｌに沈殿させ、乾燥器で一晩乾燥させる。第４化合物は収率８５％で得られる。それを湿気のない２０℃のアルゴンの下で貯蔵する。第２方法この製法の工程は図２に示される。手順：・第１８化合物の製造（図２）この化合物は、ロゲットら（ROGET et al.）〔ヌクレイックアシッドレス. （Nucleic Acids Res.）、17巻、7643〜7651頁、1989年〕によって述べられた方法によってジアミンと、ジメトキシトリチルチオチミジン又はジメトキシトリチルチオデオキシウリジンとの反応によって製造できる。・第１９化合物の製造（図２）第１８化合物（４ｇ；６．６０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン中で共蒸発によって乾燥させ、無水ピリジン４ｍｌと無水ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）４０ｍｌに再溶解させる。無水コハク酸１．２当量（８００ｍｇ；８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１時間反応させる。溶媒を蒸発させ、次いで、ピリジンを除去するため、混合物をトルエンで共蒸発させる。アミノエチルピロール１．５当量（１．１ｍｌ；９．９ｍｍｏｌ）を添加する。混合物をＴＨＦと共蒸発させる。ＴＨＦ３０ｍｌと３０ｍｌのＴＨＦであらかじめ溶解したＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）２当量（２．７０ｇ；１３．２ｍｍｏｌ）を添加する。一晩反応させる。沈殿物を濾過により除去し、白くなるまでジクロロメタンで洗浄する。濾液を蒸発乾固させ、ジクロロメタン２５０ｍｌ中に取り出す。得られた有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ₃２×２５０ｍｌで、次いで蒸留水２５０ｍｌで洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させる。この生成物（第１９化合物）をシリカのカラムによるクロマトグラフィーによって精製する。それはＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ：９７．５／２．５／１．で溶出する。収率＝６７％。・第２０化合物の製造（図２）第１９化合物（６００ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）とジイソプピルアンモニウムテトラゾレート（６３ｍｇ；０．３７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル：２．５ｍｌ／２．５ｍｌ中で共蒸発によって乾燥させ、ジクロロメタン５ｍｌ中に取り出す。ビス（ジイソプロプピルアミノシアノエトキシホスフィン）（２８０μｌ：０．９ｍｍｏｌ）を隔膜を通して添加する。２時間の反応後、ジクロロメタン２０ｍｌを添加する。得られた有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ₃２×２５ｍｌで、次いで飽和ＮａＣｌ１２５ｍｌで洗浄する。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾固させる。蒸発残留物をジクロロメタン５ｍｌ中に取り出す。生成物（第２０化合物）は７８％の収率で、ヘキサン中の沈殿物によって得られる。真空下のデシケーターで一晩乾燥させた後、それを湿気のない−２０℃のアルゴンの下で貯蔵する。 II．ピロールヌクレオシドの製造・第５化合物の製造第４化合物（６８ｍｇ；０．０６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（０．２Ｍ溶液）３００μｌに再溶解させる。この生成物は、配列Ｐｙｒ−ＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴのオリゴヌクレオチド（オリゴ−１ −ｐｙｒ）を製造するために用いられる。ここでｐｙｒは第４化合物に対応するヌクレオチド誘導体を表す。このオリゴヌクレオチドを製造業者によって述べられている手順によって、自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ（ Applied Biosystems）３８１Ａ）で製造する。本発明の第４化合物を標準ホスホラミジト（ＡＣＧＴ）と同様の合成サイクルに付す。濃度（０．１Ｍの代わりに０．２Ｍ）と反応時間（１５秒の代わりに３０秒）のみを第４化合物のために増加させる。合成後、オリゴヌクレオチド−ピロールを支持体で３％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）の作用により脱トリチル化する。それを２８％ＮＨ₄ＯＨ４×５００μｌで支持体から分解する。この溶液を６０℃で１６時間加熱し、保護基を除去する。第５化合物（図３に示す）は、トリエチルアンモニウム酢酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ７）中、アセトニトリル１０〜５０％の勾配を用い、逆相クロマトグラフィーにより得られる。第２０化合物は、第４化合物と同様の方法によって用いることができる。実施例２：電解共重合によるＥＣＰ−ポリヌクレオチド支持体の製造（第６化合物、図３）Ａ−技術原理酸化ピロール環は、不溶性ポリマー、ポリピロールを形成するための重合が可能である。電解共重合セルを図４ａに図解的に示す：このセルは作用電極（１）、対電極（２）及び参照電極（３）からなる。酸化が電気化学的に行われるならば、ポリピロールは作用電極のみで合成されるであろう。従って、これは非常に局在化されたポリマーの合成となる。このように一方の手の端にピロール環を有するオリゴヌクレオチドを単にピロールを共重合することによってポリマーに挿入することができる。このように、所望のポリマーが得られる（第６化合物、図３）。形成されたポリマー（ポリピロール）は導電性であるため、これらの反応は継続し、数回の合成サイクルが行われる（各々のサイクルでの電気抵抗の変化は一つのみである）。Ｂ−方法重合は、１０^-2Ｍピロール、５×１０^-7Ｍ置換ピロール、５’ピロール基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ−１−ｐｙｒ）及び０．１ＭＬｉＣｌＯ₄（ドーピング物質）からなる溶液中、白金電極６０ｍｍ²上で行われる。５’ピロールを有するオリゴヌクレオチド（第５化合物、オリゴ−１−ｐｙｒ）を前述の実施例１に記載した方法によって合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。ピロールを有さない同配列のオリゴヌクレオチド（オリゴ−１）は、負の制御として働く。これら２つの生成物は、共重合反応をより容易に監視するために、³²Ｐで５’ 位をラベルした。モノマーの酸化及びポリマーの還元の反応を、−０．４及び＋０．９Ｖ／ＥＣＳ間での電位のサイクル変化によって与える。図４ｂは１２以上の重合サイクルのサイクリックボルタンメトリー曲線（電位の関数としての強度）を表す。時間に関する電流の集積（電子消費量）は、電極表面上に形成されるポリマーの質量及び（５×１０^-2Ｃに対し０．２μｍの次数の）膜厚を与える。Ｃ−結果＊電解重合条件下でのオリゴヌクレオチドの安定性電解重合に付した溶液中でのオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣの調査では、後者の分解は見られない。＊電位を付したオリゴヌクレオチドの実際の泳動核酸は、電界中で移動可能なポリアニオン分子である。しかしながら、媒体中に過塩素酸塩イオンが存在するため、泳動は観察されない。更に、オリゴヌクレオチドの形成されたポリピロールへの吸着も測定することができない。＊共重合中のオリゴヌクレオチドの取込みの特異性及びレベル１．ピロールの重合は、未変性オリゴヌクレオチド１オリゴ−１（ＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴ）の存在下で行われる。オリゴ−１：反応媒体中で１０^-9Ｍ支持体上のオリゴ−１：４×１０^-12ｍｏｌすなわち非特異的取込み０．４％２．重合は、変性オリゴヌクレオチドオリゴ−１−ｐｙｒ（ＰＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴ）の存在下で行われる。オリゴ−１−ｐｙｒ：反応媒体中で１０^-9Ｍ支持体上のオリゴ−１−ｐｙｒ：７．２×１０^-12ｍｏｌ、すなわち０．７２％取込み支持体上で検出されるオリゴヌクレオチド−ピロール４４％は、ピロール基によって効果的に結合する。しかしながら、電解重合溶液に０．２Ｍチミジン５ ’リン酸塩を添加することにより、未変形オリゴヌクレオチドの結合が減少し、次いで固定の特異性が８０％に増加する。＊オリゴヌクレオチド−ピロールの電気化学反応性出発原料溶液は、２０，０００ピロールモノマーにつき、１オリゴヌクレオチド−ピロールを含む。形成されたポリマーの質量及びオリゴヌクレオチド結合の量を算定することにより、ポリマーが、６０，０００ピロール鎖単位につき、１オリゴヌクレオチド−ピロールから構成されていると判断できる。このようにオリゴヌクレオチド−ピロールを遊離ピロールより３倍少なく取り入れ、これにより全く十分なレベルの取り込みを構成する。＊結合の密度上記で概説した実験条件の下で、オリゴヌクレオチド５．３ｐｍｏｌ／ｃｍ²を結合させる。ポリマー中に組み込まれたオリゴヌクレオチドの割合（１／６０，０００）は、反応媒体中での［オリゴヌクレオチド−ピロール／ピロールモノマー］の比が増大することにより、容易に改善することができる。これは、次の３つの異なった方法により達成することができる：・オリゴヌクレオチドの量の増加；・遊離ピロールの濃度の減少；・反応容積の減少。実施例３：本発明によるオリゴヌクレオチド−ポリピロールコポリマーの性質：ハイブリッド形成支持体としての核酸の使用オリゴヌクレオチドオリゴ−を有するポリピロール支持体を、実施例２に述べられた方法によって合成した。厚さ０．２μｍの支持体を得るために５×１０^-2 Ｃと、厚さ０．６μｍの支持体を得るために１５×１０^-2Ｃの電荷まで電解重合を行った。２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＳＤＳ中でハイブリッド形成反応を行う。同様の緩衝液、但し４倍に希薄したものの中で洗浄する。これらの反応は全て室温で行われれる。結果グラフト化したオリゴヌクレオチドの影響の受け易さは、周囲の液体媒体中において、³²Ｐ−ラベルされた相補的オリゴヌクレオチドとハイブリット形成するためのそれらの許容量で立証できる。ａ）ハイブリッド形成２種の異なる厚み：（●）＝厚さ０．２μｍの支持体；（▲）＝厚さ０．６μ ｍの支持体について、ｘ軸にハイブリッド形成時間（分）及びｙ軸に³²Ｐでラベルされた支持体と結合した相補的オリゴヌクレオチドの量（ｃｐｍ）を表わす図５に示すように、様々な厚さの支持体のハイブリッド形成の速度論は比較でき、またハイブリッド形成容量の総量は支持体の厚さに比例する。ｂ）変性重複の変性を連続的に監視することは可能であり、それによってハイブリッド形成現象の可逆性を示される。図６ａ）及び６ｂ）は、異なる厚さの支持体：（ ●）＝０．２μｍ；（▲）＝０．６μｍ上で、電極上に残存するオリゴヌクレオチドの量及び変性の比率を、洗浄温度（１分につき１℃の温度変動）の関数としてそれぞれ図解している。更に、オリゴヌクレオチド−ピロール支持体が、変性／復元サイクルに影響を及ぼさないことは既に立証されている。用いた実験条件下で、変性の最大比率は約６０℃で達成される。これはオリゴヌクレオチドの理論融点（６１．５℃）に相当する。実施例４：ポリピロール支持体上のオリゴヌクレオチドのその場での合成Ｉ．第１ヌクレオチドの結合第１方法・第１３化合物の製造反応機構を図７に示す。支持体（第８化合物、図７）を、アセトニトリル中０．１ＭＬｉＣｌＯ₄の存在において、ピロール及びアミノエチルピロール（１０^-2Ｍ／１０^-3Ｍ）溶液の電解重合によって製造する。電解重合は、白金電極６０ｍｍ²上で１０^-2ＭＡｇ／Ａｇ⁺に関して広範な−０．３Ｖ〜＋０．８５Ｖで起こる。・第１１化合物の製造（図７）第８化合物を無水アセトニトリル（２×５ｍｌ）で、次いで、アセトニトリル中のトリエチルアミン（５００μｌ／５ｍｌ）で洗浄する。活性ヌクレオシド（第２化合物）１０ｍｇを無水アセトニトリル中で共蒸発によって乾燥させ、無水アセトニトリル５００μｌ中に取り出し、密封共栓フラスコ中で支持体を添加する。その混合物をゆるやかな機械的な撹拌の下で２４時間置く。支持体を除去し、アセトニトリルで、次いでトリチルの色が洗浄溶剤中で消えるまでジクロロメタンで洗浄する。ヌクレオチドと未反応の支持体のアミン基をブロックする必要がある。これは、ピリジン中の無水酢酸／Ｎ−メチルイミダゾール混合物との“カッピング”（ capping）によって行った。６時間反応はさせる。次いで機能支持体（第１１化合物）をピリジン３×１０ｍｌ、アセトニトリル３×１０ｍｌ及びジクロロメタン３×１０ｍｌで入念に連続的に洗浄する。第２方法反応機構は図８に示す。・第１４化合物の製造（図８）アミノポリピロール（第８化合物）を無水アセトニトリル（２×５ｍｌ）で、次いでアセトニトリル中のトリエチルアミン（５００μｌ／５ｍｌ）で洗浄する。活性ヌクレオシド（第２化合物）（２０ｍｇ）を無水アセトニトリルとの共蒸発で乾燥させ、次いで無水アセトニトリル１ｍｌに吸収させ、密封共栓フラスコ中で支持体（第８化合物）を添加する。この混合物をゆるやかな機械的な撹拌の下で２４時間放置する。グラフト化された支持体（第１４化合物）をアセトニトリルで、次いでそれらの酸性化の間、トリチルの色が洗浄溶媒中で消えるまでジクロロメタンで洗浄する。・第１５化合物の製造（図８）ヌクレオシドによって供給された第２級アルコール基及び反応していない支持体のアミン基をマスクしなければならない。このために、ピリジン（１ｍｌ）中の無水酢酸／Ｎ−メチルイミダゾール混合物で６時間、ブロックを行った。ピリジン（２×５ｍｌ）、アセトニトリル（２×５ｍｌ）及びジクロロメタン（２× ５ｍｌ）の洗浄で、第１５化合物が得られる。 II．オリゴヌクレオチドの伸長・第１２化合物の製造（図７）・トリマーｄ（ＣＣＴ）は、ポリピロールで被膜した白金電極上で２つの方法によって製造された。：・ホスホラミデート合成の通常サイクルによる化学的脱保護での合成、・電気化学的脱トリチル化での合成。ａ）化学合成以下の工程は必要な回数行われる。それぞれの工程はヌクレオチドの結合に関する。これらの工程は図９に示される。・ジクロロメタン中、２％トリクロロ酢酸４×５００μｌと支持体の脱トリチル化、・試薬（５×１ｍｌ）を除去するためアセトニトリルでの洗浄、・ＤＮＡ合成（３×１ｍｌ）のため無水アセトニトリルでの洗浄、・０．１Ｍホスホラミジト２５０μｌと０．５Ｍテトラゾール２５０μｌの添加、・カップリング（２分）及びヌクレオチド溶液の除去、・アセトニトリル（５×１ｍｌ）での洗浄、・無水酢酸／メチルイミダゾールのキャッピング（５００μｌ、１分）、・アセトニトリル（２×１ｍｌ）での洗浄、・ヨウ素／ルチジンでの酸化１分間（５００μｌ、１分）、・アセトニトリル５×１ｍｌでの洗浄、・脱トリチル化、及び新サイクルの開始、等。各サイクル後、トリチルの測定は、それぞれ０．０９０ＯＤ／２ｍｌ（ｄＴ）、０．０９５ＯＤ／２ｍｌ（ｄＣＴ）及び０．０８７ＯＤ／２ｍｌ（ｄＣＣＴ）を与える。ｂ）電気化学的脱保護での合成合成工程は、上記化学合成についてと同様である。しかし、脱トリチル化は１．２Ｖの電位を５分間加えることにより行われる。形成されたトリチル陽イオンが、測定からそれを引く陽極によって捕獲されるため、脱トリチル化は定量できない。しかしながら、カップリングサイクルを行った。・第１３化合物の製造（図７）ネジ山栓で閉じたガラス管中において、２ｍｌのアンモニア水で支持体の開裂及び保護基の除去をし、室温で４８時間反応させる。シリカカラム上に製造された対照は、支持体（ｔ＝４×１／２ｈ）から分離するために、アンモニア水４×２５０μｌで脱保護される。次いで、そのアンモニア水を室温で４８時間放置する。その溶液を蒸発させ、２５ｃｍＣ４カラムによる５μｍでの逆相クロマトグラフィーで分析する。Ａ（２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７）中で、Ｂ（２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７及び５０％アセトニトリル）の０〜３０％の勾配が３０分以上付される。・第１６化合物の製造（図１０）第１６化合物は、脱トリチル化ための類似の結果を有する第１２化合物と同様の方法に従って合成される。これは、スペーサー手の性質が化学合成にほとんど影響しないことを示す。・第１７化合物の製造（図１０）第１６化合物は、密封共栓フラスコ中の２８％アンモニア水中で、室温で４８時間脱保護される。次いでジメトキシトリチル基は、３％トリクロロ酢酸（３× ３ｍｌ）で開裂され、オリゴヌクレオチドが依然支持体上にあることを立証するために、測定した。実施例５：微小電極上でのオリゴヌクレオチド−ピロール共重合４つの白金線（１）（直径０．６ｍｍ）のガラスシリンダー（２）（直径５ｍｍ×高さ１０ｍｍ）中への挿入によって、図１１ａに示す４つの電極のマトリックスを作る。電極の１つを対電極（３）に用いる。このマトリックス系は、各々のマトリックス位置で種々のオリゴヌクレオチドを結合することを可能にさせる。電極マトリックスは、反応が行われる容器（４）の中に置かれ、そこには参照電極（５）も浸漬される。３つの作用電極は、ピロール及びハイブリッド形成、ヒトのラスＨ遺伝子のコドン６１における突然変異によって検出可能なオリゴヌクレオチドからなるコポリマーで連続的、電気化学的に被膜される。これら３つの５’ピロール基を有するオリゴヌクレオチドは以下の通りである：・正常オリゴ：５’ＰｙｒＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧ３’ ・Ａ−突然変異オリゴ：５’ＰｙｒＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ３’ ・Ｃ−突然変異オリゴ：５’ＰｙｒＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＣＧＧ３’ 各オリゴヌクレオチドは、各電極上で実施例２で述べられた条件下で連続的に共重合化される。しかし、反応容積は３ｍｌに代えて３００μｌとする。得られたボルタンモグラムを図１１ｂに示す。（（１）第１電極上での重合、（２）第２電極上での重合、（３）第３電極上での重合）。これらのボルタンモグラムは、減少電荷（charge reduite）（２〜４×１０^-4Ｃ、トップ曲線）及び高電荷（forte charge）（１−１．３×１０^-3Ｃ、ボトム曲線）の両方において非常に不変であり、非常に再現性がある。これらの条件下で、オリゴヌクレオチド６×１０^-14ｍｏｌを、０．１μｍの膜厚（１０^-4Ｃの電荷）に対して０．３ｍｍ²（すなわち１８ｐｍｏｌ／ｃｍ²）で結合させる。・３点マトリックス上でのハイブリッド形成による核酸の架橋突然変異の検出長さ５１のヌクレオチドの３つの核酸のフラグメントを、所望の天然ラスＨ突然変異体を擬態するために用いる。これら３つの核酸は、配列：・正常ラスＨ：５’ＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣ３’ ・Ｔ−突然変異ラスＨ：５’ＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣ３’ ・Ｇ−突然変異ラスＨ：５’ＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣ３’を有する。それらは、特に、マトリックス結合プローブとのハイブリッド形成、それぞれ正常オリゴ、Ａ−突然変異オリゴ及びＣ−突然変異オリゴにより認識される。ハイブリッド形成反応は、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、³²Ｐで５’位にラベルされ、検出されるべき核酸０．１ｐｍｏｌを含む０．５％のＳＤＳ中において２５℃で１時間行われる。次いで、マトリックスは同様の緩衝液中で３５℃で洗浄される。検出は写真フィルム上でのマトリックスのオートラジオグラフィーによって行われる。このような条件下で、標的核酸のハイブリッド形成は、厳密な相補的配列のオリゴヌクレオチドを有する電極でのみ行い、クロスハイブリッド形成は検出することはできない。このように架橋突然変異の特定検出は、このマトリックスによって可能になる。実施例６：超微小電極の用途図１２に示したシステムは、ガラス板に配列された１０金電極で構成される。電極の幅は、１０〜１００μｍに変化させてもよく、活性ゾーン（溶液に浸漬させたゾーン）の長さは、２ｍｍ程度である。シリコン酸化物絶縁基板上への金の選択的析出、次いで接合の分離によって、もう１つのシステムを製造した。このようにして、側長２５〜２００μｍの平方電極からなるマトリックスを得る。両方の場合において、実施例５に述べられた方法に従って、ピロール及びオリゴヌクレオチド−ピロールの共重合は各電極上で行われ、実施例２に述べられたように、得られたポリピロールフィルムは良質で、その厚さは十分に制御することができる。実施例７：オリゴヌクレオチドのその場での合成：５’−ＴＴＣＴＧＡＧＧ−３ ’の電気化学的脱保護合成は、形成されたオリゴヌクレオチドの二次分析の必要性のために開裂できる手を有するアミノポリピロール支持体（第８化合物）上で行われる。方法：・５’−ＴＴＣＴＧＡＧＧ−３’の電気化学的脱保護の工程での５’−ＴＴＣＴＧＡＧＧ−３’の合成オリゴヌクレオチドの３’位の端からの位置（５）に導入されたチミジンアミデート（amidites）は、保護基がチオピキシルの時、＋１．１Ｖで１５分間、あるいは保護基がｐ−ニトロベンゾイル基の時、−１．３Ｖで１５分間の電位を加えることによって脱保護される。他のヌクレオシドは、トリチル化したアミデートの形成に導かれ、トリクロロ酢酸の脱トリチル化によって化学的に脱保護される。１）ｐ−ニトロベンゾイル基の保護保護ヌクレオシドの製造工程を図１３に示す。・ｐ−ニトロベンゾイルチミジン（第２１化合物：図１３）の合成チミジン（２．４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をピリジン中での共蒸発により乾燥させ、次いで無水ピリジン２００ｍｌ中に取り出しに、４℃に冷却する。ｐ−ニトロベンゾイルクロライド（２．０４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を添加する。温度を上げ、室温で一晩反応させる。反応は飽和炭酸水素ナトリウム５ｍｌで停止される。反応混合物を濃縮し、次いでクロロホルム５００ｍｌ中に取り出す。得られた有機溶液は、０．５ＭＮａＨＣＯ₃２×５００ｍｌで、次いで飽和ＮａＣｌ２５０ｍｌで洗浄される。水相はＣＨＣｌ₃１００ｍｌで逆抽出される。有機相を蒸発させる。純粋な生成物は、シリカ上のカラムクロマトグラフィーにより得られる。クロロホルム中の５％メタノールで溶出する。収率＝５８％。・ｐ−ニトロベンゾイルチミジンアミデート（第２２化合物：図１３）の合成第２１化合物（１．９６ｇ、５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアンモニウムテトラゾレート（４２８ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）は、無水ジクロロメタン／アセトニトリル溶媒を用いる共蒸発により乾燥される。これらの反応物は、無水ジクロロメタン２５ｍｌ中に取り出され、ビス（ジイソプロピルアミノシアノエトキシ）ホスフィン（１．８ｇ、６ｍｍｏｌ）を添加する。２時間（無酸素、無湿気で）反応後、反応混合物は、ジクロロメタン２５０ｍｌで希釈され、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム２×２５０ｍｌで、及び飽和塩化ナトリウム２５０ｍｌで連続的に洗浄される。有機相を蒸発させる。残留物をジクロロメタン１０ｍｌ中に取り出す。生成物（第２２化合物）は、ヘキサン中の沈殿によって得られ、次いで真空下で乾燥させ、アルゴン中に貯蔵される。収率＝８４％。２）チオピキシル基での保護保護ヌクレオシドの製造工程を図１４に示す。・チオピキシルチミジン（第２３化合物：図１４）の合成チミジン（２．４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をピリジン中で共蒸発により乾燥させ、無水ピリジン１００ｍｌに吸収させ、４℃まで冷却し、チオピキシルクロライド（３．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）と反応させる。温度を室温まで徐々に上昇させた後、反応を続けて一晩（約８〜１２時間）置く。反応は、ＮａＣＨＯ₃１０ｍｌで停止させる。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメタン２５０ｍｌ中に取り出す。得られた有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ₃２×２５０ｍｌで、次いで蒸留水２５０ｍｌで抽出する。水相は、クロロホルム１００ｍｌで逆抽出される。有機相を蒸発させる。生成物を溶媒中の０．５％ＴＥＡ（トリエチルアミン）と共にシリカカラムで精製する。最後にジクロロメタン（＋０．５％ＴＥＡ）中のメタノール５％で溶出する。収率＝５２％。・チオピキシルチミジンアミデート（第２４化合物；図１４）の合成第２４化合物は、第２２化合物と同様の方法に従って、第２３化合物（５ｍｍｏｌ）から製造される。収率＝７８％。３）第１ヌクレオシドの結合この結合工程を図１５に示す。このオリゴヌクレオチドは、共重合させたピロールとアミノエチルピロール（９：１）の混合物上の白金（３×１０ｍｍ）のストリップ上で合成される。第１ヌクレオシド（１−３’位の端）は、活性化したエステル、Ｎ−イソブチリル２’デオキシグアノジン（第２５化合物：図１３ａ）で開始され、シリカ支持体をより機能的にすることを述べた方法〔ケー．ミヨシら、ヌクレイックアシッドレス．（K.MIYOSHI et al.,Nucleic Acids Res．）、８巻、22号、54 73〜5489頁、1989年〕に従って、アミノエチルピロール（第８化合物）とカップリングさせる。第２６化合物（１０ｍｇ）をアセトニトリル５００μｌに溶解させる。機能化したポリピロールで被覆した白金電極、及びトリエチルアミン１μｌを添加する。反応は、室温で２０時間機械的に撹拌させる。グラフト化電極（第２６化合物）を除去し、アセトニトリルで、次いでジクロロメタンで入念に洗浄する。未反応のアミン基を無水酢酸（ピリジン５００μｌ中５０％）と６時間ブロックする。グラフト化電極をピリジン及びメタノールで洗浄し、次いで乾燥させる。４）オリゴヌクレオチドｄＴＴＣＴＧＡＧＧの合成オシステムズ（APPLIED BIOSYSTEMS））に置く。充填は残留物量を最小にするためのテフロンチップで終える。製造業者（アプライドバイオシステムズ（APPL IED BIOSYSTEMS））の使用説明書に従い、３８１Ａ合成機において“１μｍｏｌサイクル”で、２、３及び４位のヌクレオシドを添加する。各工程間のジメトキシトリチル基の化学的脱保護は、製造業者の推奨する条件下で、ジクロロメタン中ＴＣＡで行われる。５位のアミデート（第２２化合物あるいは第２４化合物）を１分間カップリングする正常アミデートと同様の方法に従って、カップリングする。製造したホスフィートトリエステル結合の酸化及びカッピングは、通常の方法に従って行われる。電極はカラムから除去され、電気化学的脱保護が行われる。第２２化合物を用いるならば、ｐ−ニトロベンゾイル基は、次の電解質、メタノール中の０．１Ｍテトラブチルアンモニウムペルクロレートで電極を浸すことにより、及び−１．３Ｖの電位を１５分間印加することにより開裂される。第２４化合物を用いるならば、チオピキシルは、アセトニトリル中の０．１Ｍテトラブチルアンモニウムペルクロレートの電解質で、＋１．１Ｖの電位を１５分間印加することにより開裂される。両方の場合において、５’位のＴヌクレオシドの保護基の開裂後、テフロンチップを有するカラム中に再び電極を置き、アミデートＣ（６位）、Ｔ（７位）及びＴ（８位）を連続的に添加することにより合成が続けられる。合成終了時、オリゴヌクレオチドは支持体から開裂される。電極は、共栓フラスコ中の２８％アンモニア水４×５００μｌで、４×１／２時間処理される。この４留分は、共栓の４ｍｌホイートンフラスコ（flacon WHEATON）で合わされ、オリゴヌクレオチドを脱保護するために５５℃で１６時間置かれる。ＴＥＡ存在下での共蒸発後、得られたオリゴヌクレオチドの１部分（１／１００）は、ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で³²Ｐで５’位にラベルされ、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される。アクリルアミドゲル電気泳動分析は、所望の生成物（８量体）の存在、及びオリゴヌクレオチド（５量体）の欠如、チミジンアミデートの電気化学脱保護が不十分なことを意味する存在を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ２５Ｂ 11/12 9046−4ＫＣ２５Ｂ 11/12 (72)発明者リバシュ，チエリフランス国、38000 グルノーブル、リュフェリックスエスクラニョン 22 (72)発明者バルテ，クリステルフランス国、38600 フォンテーヌ、リュドゥシャルメット７ (72)発明者ビダン，ジェラールフランス国、38100 グルノーブル、リュドゥトロアゼピ３

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式（Ｉ）（式中、単位Ａは導電性ポリマーのモノマーを表し、単位Ｂはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの類自体の一つを表し、ｘ，ｙ及びｚは１又は１以上の整数、或いはｙは０表し、ｌは共有結合又はスペーサー手を表す。）のコポリマー。２．Ａが、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ− フェニレンビニレン）、ポリピレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾール及びポリアニリンからなる群から選択されるＥＣＰのモノマー単位である請求項１記載のコポリマー。３．Ａが、ポリピロール単位である請求項２記載のコポリマー。４．ｘ／ｙ比が、１／５と１／１００，０００の間である請求項１〜３のいずれか１つに記載のコポリマー。５．ｌが、下記の式 −R₁−［(CH₂)_n−R₂］_x−［(CH₂)_m−R₃］_y−(CH₂)_p− 〔式中、・ｎは１〜１０の整数、・ｍは０又は１〜１０の整数、・ｐは０又は１〜１０の整数、・ｘは０又は１〜８の整数、・ｙは０又は１〜８の整数、・R₁、R₂及びR₃は、同一又は異なっていてもよい、ＣＨ₂、Ｏ、Ｓ、ＮＲ′、ＣＯ、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＲ′ＣＯ、ＣＯＮＲ′、ＮＨＳＯ₂、（式中、Ｒ′は水素原子又はＣ₁〜Ｃ₁₂アルキル鎖を表す）を示す〕に対応するスペーサ手である請求項１〜４のいずれか１つに記載のコポリマー。６．少なくとも以下の工程、・一般式（II） −〔Ａ^*〕_x−〔Ａ〕_y− （II）（式中、Ａ，ｘ及びｙは請求項１と同義、及びＡ^*は官能化Ａを表す）のコポリマーを製造する第１工程、・式（II）のポリマーに、一般式（III）ｌ^*−〔Ｂ〕_z （III）（式中、Ｂ及びｚは上記定義と同義、ｌ^*はＡ^*に結合することができる活性化手である。）の少なくとも１つの基のコポリマーを結合する第２工程、からなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の一般式（Ｉ）のコポリマーの製造方法。７．一般式（II）のコポリマーの製造のための工程及び／又は一般式（III）の基の結合のための工程が、電気化学的反応によって行われる請求項６記載の製造方法。８．少なくとも以下の工程、・一般式（IV）（式中、Ａ、Ｂ、ｚ及びｌは上記定義と同義である。）の化合物を製造する工程ａ）・化合物（IV）をモノマーＡと共重合する工程ｂ）、からなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の一般式（Ｉ）のコポリマーの製造方法。９．工程ｂ）が、化合物（IV）とモノマーＡとの電気化学的共重合によって行われる請求項８記載の製造方法。１０．Ｂ_zが、いくつかの後続する工程において、さらに伸長し、これら工程のそれぞれが、１つ以上の単位Ｂの結合からなる請求項６〜９のいずれか１つに記載の製造方法。１１．Ｂ_zの伸長が、一連の電気化学的反応を伴う請求項１０記載の製造方法。１２．電極表面上で行われる請求項７、９及び１１いずれか１つに記載の製造方法。１３．少なくとも１つのヌクレオチド、或いは少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを共有結合によって、結合した支持体の導電性ポリマーの用途。１４．ポリヌクレオチドが、支持体に合成された請求項１〜５のいずれか１つに記載のコポリマーの用途。１５．ハイブリット形成が、核酸に支持される請求項１〜５のいずれか１つに記載のコポリマーの用途。１６．表面が、式（Ｉ）のコポリマーを有するコーティングからなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の電極。１７．同一又は異なってもよい請求項１６記載の１つ以上の電極からなる装置で、核酸合成及びハイブリット形成反応を提供する装置。１８．いくつかの電極が、それぞれ異なった基Ｂ_zを有する少なくとも２つからなる請求項１７記載の装置。