JP3247957B2 - 導電性ポリマー／ヌクレオチドコポリマー、その製造方法及びその用途 - Google Patents

導電性ポリマー／ヌクレオチドコポリマー、その製造方法及びその用途

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、導電性ポリマー（ECP）と核酸との結合に
関する。
生物学で通常使用される非常に多くの技術、例えば核
酸の合成又はハイブリッド形成において、オリゴヌクレ
オチドは、固体支持体にそれらの末端で共有結合されて
いる。種々の支持体、紙、ナイロン、ガラス、シリカ、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド等がこの目的のため
に使用されている。
現在、多くのチームが、予め確立した配列に従って配
列された種々の配列で、同時に種々の反応（例えば支持
体上のハイブリッド形成）を行うため、多くのオリゴヌ
クレオチドを支持する支持体の製造について研究してい
る。
このように、この研究方法が、例えば、核酸の配列決
定を容易にするため提案されている。
微細表面（支持体上のオリゴヌクレオチド・マトリク
ス）上の行及び列に配列した種々のオリゴノクレオチド
が、核酸の配列のために提案されている〔リソフら、プ
ロク．ユーエスエスアール アカッド．サイ．（LYSOV
et al.,Proc.USSR Acad.Sci.）、303巻、1508〜1511
頁、1988年；キラプコら、エフイービーエス レット．
（KHRAPKO et al.,FEBS Lett.）、256巻、118〜122頁、
1989年；キラプコら、DNA セクエンス（KHRAPKO et a
l.,DNA Sequence）、１巻、375〜388頁、1991年；ベイ
ンズ アンド スミス、ジェイ．セオル．バイオル．
（BAINS ＆ SMITH,J.Theor.Biol.）、135巻、303〜307
頁、1988年；チャーチ アンド キーファー・ヒギン
ス、サイエンス（CHURCH ＆ KIEFFER−HIGGINS,Scienc
e）、240巻、185〜188頁、1988年；サザーン、国際特許
出願 WO89/10977号（SOUTHERN,PCT apprication WO89/
10977）、1989年〕。その方法は、１組のオリゴヌクレ
オチド上の標的DNA又はRNA鎖のハイブリッド形成に基づ
いている。理論上、標的核酸における配列の存在又は不
存在は、定義された厳格な条件下、微細表面上で観察さ
れるハイブリッド形成によって決定してもよい。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドのその場での合成
に関して、固相上への化学合成、感光結合法及びフォト
リソグラフィを組み合わせることによって、フォドアー
ら（FODOR et al.）〔サイエンス（Science）、251巻、
767〜773頁、1991年〕は、グリッド（正方形、側長100
μｍ）上に1024個のペプチドを合成することに成功して
いる。これらのペプチドは、ペプチド合成のためにフォ
トリソグラフィマスク及び感光保護基（photolabile pr
otective group）を用いて、同時かつ並行合成によって
得られた。dCpTジヌクレオチドが、感光保護基によって
５′位が保護されたチミジン（５′−ニトロベラトリル
チミジン）を用いて、その場に合成された。光がフォト
リソグラフィマスクによって導かれ、側長100μｍを有
するチェック・パターン中で堆積物が得られた。
マスコス アンド サザーン（MASKOS ＆ SOUTHERN）
（ヌクレイック アシッド レス．（Nucleic Acids Re
s.）、20巻、1675〜78頁、1992年）が、顕微鏡下、スラ
イドガラス上で４つの異なったオリゴヌクレオチドのそ
の場での合成を行った。
これまで、オリゴヌクレオチドの直接の堆積に用いら
れる技術は、マニュアル堆積（depot manuel）（工業規
模で使用することはできない）又は“マスク”の使用を
必要とし、かつ、さらに、感光性である核酸を利用する
ことが困難であるフォトリソグラフィ技術のいずれかを
使用する。
本発明の目的は、新規な支持体及び先行技術で提案さ
れている方法の欠点を有さないオリゴヌクレオチドを結
合するための新規な方法を得ることである。
この目的で、発明者らは、結合支持体として導電性ポ
リマーを使用する概念を持っている。
発明者らは、共有結合を介してヌクレオチド及びオリ
ゴヌクレオチドを導電性ポリマーに安定に結合させるこ
とができ、よって新規のコポリマーを得ることができ
る。
本発明の対象は、下記の一般式（Ｉ）に対応するコポ
リマー （式中、単位Ａは導電性ポリマーのモノマー、単位Ｂは
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの類似体
の一つ、x,y及びｚは１又は１以上の整数又はｙは０、
及びｌは共有結合又はスペーサー手（bras espaceur）
を示す。） である。
Ａがモノマーを示す導電性ポリマーの限定されていな
い例として、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ（ｐ−
フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリ
ピレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフラン、
ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾー
ル、ポリアニリン等が挙げられる。
Ａはピロール単位が有利である。
本発明の説明に関して、用語ヌクレオチド類は、例え
ば、ウールマン（UHLMANN）〔ケミカル レビュー（Che
mical Review）、90巻、４号、543〜584頁、1990年〕に
述べられているような、いずれかの変性ヌクレオチドを
意味するものと理解される。
単位Ｂがヌクレオチドの時、通常、それは天然のオリ
ゴヌクレオチドの組成の一部を形成するもの１つである
のみならず、実験室において使用されるそれらの類似体
又は誘導体でもある。
例えば、 ＊合成オリゴヌクレオチドの組成の一部を形成するヌク
レオチド類似体、 ＊核酸の合成のために通常使用される保護された官能基
を有するヌクレオチド誘導体（この場合、Bzはオリゴヌ
クレオチドの合成中間体を構成する。） である。
Bzは、ウールマン（UHLMANN）（上述の刊行物）に述
べられているような核酸とハイブリッド化しうる非天然
化合物であってもよい。
Bzの構成の一部を形成する単位Ｂは、同一又は異なっ
ていてもよく、かつBzはホモポリマー又はヘテロポリマ
ーを構成してもよく、後者の場合、単位Ｂは、予め決定
された又は決定されていないいずれかの配列において、
ともに結合してもよい。
本発明の好ましい実施態様によれば、x/y比は1/5と1/
100,000の間である。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、ｌは下記の
式の１つ −R1−[(CH2)ｎ−R2]Ｘ−[(CH2)ｍ−R3]ｙ−(CH2)ｐ
− 〔式中、 ・ｎは１〜10の整数、 ・ｍは０又は１〜10の整数、 ・ｐは０又は１〜10の整数、 ・ｘは０又は１〜８の整数、 ・ｙは０又は１〜８の整数、 ・R1、R2及びR3は、同一又は異なっていてもよく、 CH2、Ｏ、Ｓ、NR′、CO、CH＝CH、NR′CO、CONR′、NHS
O2、 （式中、Ｒ′は水素原子又はC1〜C12のアルキル鎖）〕
に対応するスペーサ手を示す。
本発明の対象は、共有結合を介して、少なくとも１つ
のヌクレオチドの結合のための支持体としての導電性ポ
リマーの用途である。
本発明の他の対象は、一般式（Ｉ）のコポリマーの製
造方法である。
第１の変形によれば、この方法は少なくとも以下の工
程からなる。
・一般式（II） −〔Ａ＊〕ｘ−〔Ａ〕ｙ− （II） （式中、A,x及びｙは上記定義と同義、及びＡ＊は官能
化（fonctionnalise）Ａを示す）のコポリマーを製造す
る第１工程。
・式（II）のポリマーに、一般式（III） ｌ＊−〔Ｂ〕Ｚ （III） （式中、Ｂ及びｚは上記定義と同義、ｌ＊はＡ＊に結合
することができる活性化手（bras active）である。）
の少なくとも１つの基を結合する第２工程。
本発明の認識において、用語“官能化”及び“活性
化”は、共有結合を形成するために共に反応することが
できる化学的な機能をＡ及びｌに付与することを意図す
るいずれかの化学的変化の結果を意味するものと理解さ
れる。
他の変形によれば、一般式（Ｉ）のコポリマーの製造
方法は、少なくとも以下の工程からなる。
・一般式（IV） 式中、Ａ、Ｂ、ｚ及びｌは上記定義と同義である。） 化合物を製造する工程ａ）、 ・化合物（IV）をモノマーＡと共重合する工程ｂ）。
好ましくは、本発明に対応する方法の１つ又は他の変
形の少なくとも１つの工程が、少なくとも１つの電気化
学的反応を含むことである。この電気化学的共重合は、
電極表面上でなされることが好ましく、よって反応の終
わりに、表面が本発明に対応するコポリマーからなる電
極が得られる。
例えば、本発明に対応する方法の第１の変形をなすた
めに、一般式（II）のコポリマーの製造のための工程及
び／又は一般式（III）の基の結合のための工程を、電
気化学的反応によって行ってもよく、第２の変形におい
て、工程ｂ）は、化合物（IV）とモノマーＡとの電気化
学的共重合によって行うことが好ましい。
電気化学的共重合は、例えば、サイクリックボルタン
メトリーによって、混合物〔（IV）:A〕を逐次酸化及び
還元による重合をなし遂げるに十分な電気的ポテンシャ
ル変化に付すことによってなされ、形成されたポリマー
が導電性であるため、酸化−還元サイクルが数回繰り返
される。
電流が設定された（定電流電解法）又は電位が設定さ
れた（定電位電解法）重合のようなECPの製造のために
一般に用いられる電気化学的重合の方法も、本発明によ
る共重合体の製造に応用される。
堆積物の品質は実験条件、オリゴヌクレオチド−ピロ
ール／ピロール比、浴温度、溶媒の性質、使用された電
気化学的方法（サイクリックボルタンメトリー、定電流
電解法又は定電位電解法）の選択によって制御できる。
よって、得られるコポリマーは、気孔率及び所望の以後
の用途に基づく利用しやすさの異なった品質を有し、結
合するオリゴヌクレオチドの量を変化させることができ
る。
本発明による方法の実行に関して、電気化学的反応
は、電極表面で行うことが好ましい。反応中に放出され
る電流の測定によって、電極は有効に重合反応の進行
（例えば形成されたポリマーの膜厚）又はコポリマー上
で行われる次の反応の進行を監視することができる。
１つの又は他の変形における本発明の方法の好ましい
実施態様によれば、さらに、いくつかの後続する工程に
おいて、オリゴヌクレオチドBZの伸長を含み、これら工
程のそれぞれは、１つ以上の単位Ｂの結合からなる。
オリゴヌクレオチドBZの伸長は、導電性ポリマーの表
面に結合した少なくとも１つのヌクレオチド又はオリゴ
ヌクレオチドで開始して、保護されたモノマーの組み立
てによって支持体の表面で行われる。
核酸の化学合成の標準的な方法を、この実施態様の実
行において用いてもよい。
本発明による支持体は、成長ポリマー鎖の保護、脱保
護及び縮合反応を行うために電極電位の変化を用いるこ
とにより、さらにオリゴヌクレオチドを電気化学的に伸
長させてもよい。
本発明の他の目的は、その表面が本発明による式
（Ｉ）のコポリマーを有するコーティングからなる電極
である。
このような電極は、例えば、白金、金、金で被覆され
たクロム又はチタン、あるいはガラス質の炭素等からな
る電極の表面で式（Ｉ）のコポリマーの層を堆積させる
ことにより得ることができる。
好ましくは、異なった性質のコポリマーを有してもよ
いいくつかの電極を組み合わせてもよい。装置は、この
ように得られ、核酸の合成のための反応及び／又はハイ
ブリッド形成のための反応を行うために用いることがで
きる。
本発明に対応する装置の特に好ましい実施態様は、い
くつかの電極、異なった基Bzを有する少なくとも２つの
組み合わせからなる。これは、例えば、それぞれが異な
ったヌクレオチド（又は類自体）を有する一組の電極、
又はそれぞれが異なった配列のオリゴヌクレオチドを有
する一組の電極である。
オリゴヌクレオチドの非常に小さい表面への結合の結
果、電気化学的反応を制限することができる限りにおい
て、本発明による装置は、支持体上に分布した微小電極
（EPCマイクロチップ）を有する複数のECP微小表面から
なってもよい。この点で、所望により、すべての異なる
オリゴヌクレオチドBzは、制御され、系統化された方法
でこれら微小電極へ結合するであろう。
“ECPマイクロチップ”は、特に核酸配列及び診断に
使用されるであろう。
上記に示した限定されていない実施例によって、本発
明によるコポリマー〔オリゴヌクレオチドを有するポリ
ピロール／ポリピロール〕を得ることができる。
１）ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
又はこれらの類似体の一つと官能化されたポリピロール
との化学反応による。例えば、アミノエチルピロール
と、一端に遊離燐酸又は活性化カルボキシルを有するオ
リゴヌクレオチドとの縮合を行うことができる。
２）ピロールと、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド又はこれらの類似体の１つとピロールとの
縮合の生成物と、ピロールとの化学的又は電気化学的共
重合による。例えば、ピロールは、その一端にピロール
を有するスペーサ手を持つオリゴヌクレオチドと電気化
学的に共重合することができる。白金表面上に強力に密
着して得られるコポリマー層の厚さは0.1μｍ〜数μｍ
であり、例えば100μm2の表面上に形成されていてもよ
い。干渉されることなく、オリゴヌクレオチドの分解反
応を証明することができる。
３）保護された化学的機能を有する導電性ポリマーの製
造による。これらの機能は局部的かつ選択的に、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとのそれ
らのカップリングをさせるため脱保護される。例えば、
モノメトキシトリチルアミノエチルポリール／ポリピロ
ールを製造し、酸性媒体中又は電位印加のいずれかで局
所的にそれを脱保護することが可能である。遊離アミン
基はこのようにヌクレオシド、ヌクレオチド又は、例え
ば活性化燐酸又は活性化カルボキシルを有するオリゴヌ
クレオチドと反応させることができる。
４）種々のオリゴヌクレオチドの立体制御された同時合
成による。
オリゴヌクレオチドの合成は、コポリマーの表面で影
響を受けやすいヌクレオシドを出発原料として、保護さ
れたヌクレオチドを組み立てることにより、支持体上の
ある点で行われる。保護されたヌクレオチドは、ヌクレ
オシドホスファーアミジテス（phosphoramidites）、ヌ
クレオシドホスホネート又はヌクレオシドホスホトリエ
ステルである。局所的に、合成は、オリゴヌクレオチド
が、合成装置中でシリカ支持体上に合成されるのと同様
の方法で行われる。しかしながら、その差異は、オリゴ
ヌクレオチドの全体の一連の合成が非常に小さい表面上
で選択的な脱保護又は縮合操作を電気化学的に行うこと
によって、同時になされ、よって反応すべきでないオリ
ゴヌクレオチドをマスクすることができることである。
これは異なったオリゴヌクレオチドを同時に合成させ
る。
明らかに、コポリマー〔ピロール／オリゴヌクレオチ
ドピロール〕の合成を示すために上記に簡単に要点を述
べた方法は、ポリヌクレオチド類似体、例えば、モノ−
又はジチオ燐酸塩、メチルホスホン酸塩及びリン酸トリ
エステルのような糖−燐酸塩鎖類似体、及びホルムアセ
タール、カルバメート及びスルホキシドのような非イオ
ン性非燐酸化類似体に応用することができる。
本発明によるコポリマーは、機械的ストレス、水分、
乾燥、熱及び塩基に対して良好な安定性を有し、かつこ
のように非常に多くの反応と適合し、よって、使用の広
範囲の変形が可能である。
本発明者らは、選択的にオリゴヌクレオチドが、ポリ
ピロール支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドに
ハイブリド形成し、この支持体の使用が、以下の利点を
与えることを見出した。
・本発明によるコポリマーは多孔質であり、よって支持
体に結合したオリゴヌクレオチドに、相補的配列の核酸
とハイブリッド形成するために良好な得易さを与える。
この得易さは、コポリマー層の厚さに比例するハイブリ
ッド形成の観察によって証明される。ハイブリッド形成
媒体における相補的オリゴヌクレオチドは、３倍厚のピ
ロール／オリゴヌクレオチド−ピロールコポリマー層
（かつこのように支持体に結合した３倍以上のオリゴヌ
クレオチドを含有する）の上に３回ものハイブリッド形
成を行う。ハイブリッド形成動力学は、従来のハイブリ
ッド形成支持体で観察されるこれらに類似している。同
じ条件下で、非相補的オリゴヌクレオチド配列は、支持
体に結合しないことに注目すべきである。
・発明者らは、また、ハイブリッド形成が可逆的であ
り、いずれかのハイブリッド形成されたオリゴヌクレオ
チドは、加熱、又は希釈水酸化ナトリウムとの処理によ
って、ポリピロール及び結合オリゴヌクレオチドに損傷
を与えることなく脱離することを確認している。
・上述したように、制御された共重合は、非常に小さい
電極表面で行うことができる。これは、支持体上で完全
に整理され小型化されたグリッドを製造することを可能
にし、このグリッドのそれぞれの点は、十分明確にされ
た性質のオリゴヌクレオチドを有している。支持体に結
合している鎖に対して相補的な配列を有する標的核酸鎖
を選択的にハイブリッド形成する。これは、標的核酸の
非常に高い局所密度を生じさせ、よって、それらを検出
しやすくさせ、又はある場合でさえ、検出の前に拡大の
ための必要性を排除する。ハイブリッドの形成の検出
は、特に、コポリマーを製造するために用いられ、次い
で、その表面で生じる会合又は解離現象を測定するため
に使用される電極によってなされる。相補的核酸のハイ
ブリッド形成は、例えば、直接的な測定法、又は例えば
フェノチアジンあるいはキノンの電気的活性分子での標
的オリゴヌクレオチドの標識のいずれかによって、導電
性ポリマーを支持する電極上の電気的測定法によってそ
の場で監視される。
核酸の標的配列を検出する従来の方法も応用できるこ
とは言うまでもない。
発明者らはさらに、その場での電気化学的脱保護によ
って、本発明によるコポリマー上に直接的にオリゴヌク
レオチドを合成することに成功した。
一般に、支持体上に成長したポリヌクレオチド鎖上の
ヌクレオチドの集合は、与えられた官能基への反応を指
向するため及び他でのそれを防止するために保護基を含
む一連の反応を用いる。発明者らは、ヌクレオチドを挿
入することを目的として選択されたオリゴヌクレオチド
に相当する表面上での集合のための反応を指向するため
にこの性質を利用される。
本発明によれば、成長したオリゴヌクレオチド鎖のた
めの保護基は、電気化学的反応によって局所的に移動
し、よって選択された位置にヌクレオチドを加えること
が可能になる。
さらに利点は、本発明による支持体上でその場でのオ
リゴヌクレオチド合成を行うことを可能にする。実際に
この場合、その場で、かつグリット上に配列する一連の
オリゴヌクレオチドと並行して、ピロール手を有する合
成オリゴヌクレオチドと別個ではなく合成され、次いで
共重合が可能になる。これは数千の微小表面のマトリッ
クスの工業的製造を観察することを可能にする。
本発明は以下に述べる明細書、本発明によるコポリマ
ーの製造方法及び用途の例の引用によって、より理解す
ることができるだろう。
ピロール及びピロール基を有するオリゴヌクレオチドの
共重合によるポリピロール支持体の製造：この支持体の
性質 実施例1:変性オリゴヌクレオチドの合成 I.ピロールヌクレオシドアミド（AMIDITE）の製造 第１方法 この合成の全般的な反応体系は図１に示される。
・第１化合物の製造（図１） この化合物は、ロゲットら（ROGET et al.）〔ヌクレ
イック アシッド レス．（Nucleic Acids Res.）、17
巻、7643〜7651頁、1989年〕によって述べられた方法に
よってジアミンと、ジメトキシトリチルチオチミジン又
はジメトキシトリチルチオデオキシウリジンとの反応で
得られる。
・第２化合物の製造（図１） 第１化合物（2g;3.1mmol）を無水アセトニトリルとの
共蒸発によって乾燥し、ジクロロメタン20mlに再溶解し
た。ジスクシンイミジルセバコエイト（dissuccinimidy
lsebacoate）２当量（2.45g;6.2mmol）を添加した。室
温で３時間反応をさせた。得られた生成物をシリカのカ
ラム（クロロホルム中、０〜10％のメタノール勾配）で
分離、またはヘキサン中に沈殿させた（収率＝60％）。
第３化合物の合成のため、更に精製をすることなく用い
ることもできる。
・第３化合物の製造（図１） この生成物は、アミノエチルピロール（1.36g;12.4mm
ol）を前記反応混合物に添加するか、又はアミノエチル
ピロール220mg（2mmol）を精製した後に得られた第２化
合物を添加して製造される。pHは第３級アミン（トリエ
チルアミン）を添加することにより８〜8.5になる。２
時間反応をさせ、クロロホルム250mlを添加する。得ら
れた有機溶液を0.5M NaHCO3100mlで２度、及び蒸留水1
00mlで洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。生
成物をクロロホルム中のメタノール（０〜10％）のシリ
カのカラムで分離する。溶媒の蒸発後、第３化合物をエ
タノール10mlに取り出し、エチルエーテル400ml中で沈
殿させる（収率＝60％）。
・第４化合物の製造（図１） 第３化合物（100mg;0.11mmol）とジイソプロピルアン
モニウムテトラゾレート（9mg;0.5当量）とを、無水ジ
クロロメタン（2ml）と無水アトニトリル（3ml）との混
合物との共蒸発によって乾燥させる。残渣をアミレンで
安定化したジクロロメタン2.5mlに取り出す。ビス（ジ
イソプロピルアミノシアノエトキシ）ホスフィン（39μ
;1.2当量）を隔膜を通して添加する。２時間の反応
後、無水ジクロロメタン20mlを添加する。得られた溶液
を、飽和NaHCO325mlで２度、次いで蒸留水25mlで洗浄す
る。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させ
る。得られたホスホラミデートをジクロロメタン2ml中
に取り出し、ヘキサン100mlに沈殿させ、乾燥器で一晩
乾燥させる。第４化合物は収率85％で得られる。それを
湿気のない20℃のアルゴンの下で貯蔵する。
第２方法 この製法の工程は図２に示される。
手順： ・第18化合物の製造（図２） この化合物は、ロゲットら（ROGET et al.）〔ヌクレ
イック アシッド レス．（Nucleic Acids Res.）、17
巻、7643〜7651頁、1989年〕によって述べられた方法に
よってジアミンと、ジメトキシトリチルチオチミジン又
はジメトキシトリチルチオデオキシウリジンとの反応に
よって製造できる。
・第19化合物の製造（図２） 第18化合物（4g;6.60mmol）を無水ピリジン中で共蒸
発によって乾燥させ、無水ピリジン4mlと無水THF（テト
ラヒドロフラン）40mlに再溶解させる。
無水コハク酸1.2当量（800mg;8mmol）を添加し、混合
物を１時間反応させる。溶媒を蒸発させ、次いで、ピリ
ジンを除去するため、混合物をトルエンで共蒸発させ
る。アミノエチルピロール1.5当量（1.1ml;9.9mmol）を
添加する。混合物をTHFと共蒸発させる。THF30mlと30ml
のTHFであらかじめ溶解したDCC（ジシクロヘキシルカル
ボジイミド）２当量（2.70g;13.2mmol）を添加する。一
晩反応させる。沈殿物を濾過により除去し、白くなるま
でジクロロメタンで洗浄する。濾液を蒸発乾固させ、ジ
クロロメタン250ml中に取り出す。得られた有機溶液を
飽和NaHCO32×250mlで、次いで蒸留水250mlで洗浄す
る。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させ
る。この生成物（第19化合物）をシリカのカラムによる
クロマトグラフィーによって精製する。それはCH2Cl2/M
eOH/TEA:97.5/2.5/1.で溶出する。収率＝67％。
・第20化合物の製造（図２） 第19化合物（600mg;0.75mmol）とジイソプピルアンモ
ニウムテトラゾレート（63mg;0.37mmol）をジクロロメ
タン／アセトニトリル:2.5ml/2.5ml中で共蒸発によって
乾燥させ、ジクロロメタン5ml中に取り出す。ビス（ジ
イソプロプピルアミノシアノエトキシホスフィン）（28
0μ;0.9mmol）を隔膜を通して添加する。２時間の反
応後、ジクロロメタン20mlを添加する。得られた有機溶
液を飽和NaHCO32×25mlで、次いで飽和NaCl25mlで洗浄
する。有機相をNa2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させる。蒸
発残留物をジクロロメタン5ml中に取り出す。生成物
（第20化合物）は78％の収率で、ヘキサン中の沈殿物に
よって得られる。真空下のデシケーターで一晩乾燥させ
た後、それを湿気のない−20℃のアルゴンの下で貯蔵す
る。
II.ピロールヌクレオシドの製造 ・第５化合物の製造 第４化合物（68mg;0.06mmol）を無水アセトニトリル
（0.2M溶液）300μに再溶解させる。この生成物は、
配列Pyr−TGT ACC TGA ATC GTC CGC CATのオリゴ
ヌクレオチド（オリゴ−１−pyr）を製造するために用
いられる。ここでpyrは第４化合物に対応するヌクレオ
チド誘導体を表す。このオリゴヌクレオチドを製造業者
によって述べられている手順によって、自動DNA合成装
置（アプライド バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）381A）で製造する。本発明の第４化合物を標準ホス
ホラミジト（ACGT）と同様の合成サイクルに付す。濃度
（0.1Mの代わりに0.2M）と反応時間（15秒の代わりに30
秒）のみを第４化合物のために増加させる。
合成後、オリゴヌクレオチド−ピロールを支持体で３
％TCA（トリクロロ酢酸）の作用により脱トリチル化す
る。それを28％NH4OH ４×500μで支持体から分解す
る。この溶液を60℃で16時間加熱し、保護基を除去す
る。第５化合物（図３に示す）は、トリエチルアンモニ
ウム酢酸塩（25mM、pH7）中、アセトニトリル10〜50％
の勾配を用い、逆相クロマトグラフィーにより得られ
る。
第20化合物は、第４化合物と同様の方法によって用い
ることができる。
実施例2:電解共重合によるECP−ポリヌクレオチド支持
体の製造（第６化合物、図３） Ａ−技術原理 酸化ピロール環は、不溶性ポリマー、ポリピロールを
形成するための重合が可能である。電解共重合セルを図
4aに図解的に示す：このセルは作用電極（１）、対電極
（２）及び参照電極（３）からなる。
酸化が電気化学的に行われるならば、ポリピロールは
作用電極のみで合成されるであろう。従って、これは非
常に局在化されたポリマーの合成となる。このように一
方の手の端にピロール環を有するオリゴヌクレオチドを
単にピロールを共重合することによってポリマーに挿入
することができる。このように、所望のポリマーが得ら
れる（第６化合物、図３）。
形成されたポリマー（ポリピロール）は導電性である
ため、これらの反応は継続し、数回の合成サイクルが行
われる（各々のサイクルでの電気抵抗の変化は一つのみ
である）。
Ｂ−方法 重合は、10-2Mピロール、５×10-7M 置換ピロール、
５′ピロール基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ−
１−pyr）及び0.1M LiClO4（ドーピング物質）からな
る溶液中、白金電極60mm2上で行われる。
５′ピロールを有するオリゴヌクレオチド（第５化合
物、オリゴ−１−pyr）を前述の実施例１に記載した方
法によって合成し、逆相HPLCによって精製する。ピロー
ルを有さない同配列のオリゴヌクレオチド（オリゴ−
１）は、負の制御として働く。
これら２つの生成物は、共重合反応をより容易に監視
するために、32Pで５′位をラベルした。
モノマーの酸化及びポリマーの還元の反応を、−0.4
及び＋0.9V/ECS間での電位のサイクル変化によって与え
る。図4bは12以上の重合のサイクルのサイクリックボル
タンメトリー曲線（電位の関数としての強度）を表す。
時間に関する電流の集積（電子消費量）は、電極表面
上に形成されるポリマーの質量及び（５×10-2Cに対し
0.2μｍの次数の）膜厚を与える。
Ｃ−結果 ＊電解重合条件下でのオリゴヌクレオチドの安定性 電解重合に付した溶液中でのオリゴヌクレオチドのHP
LCの調査では、後者の分解は見られない。
＊電位を付したオリゴヌクレオチドの実際の泳動 核酸は、電界中で移動可能なポリアニオン分子であ
る。しかしながら、媒体中に過塩素酸塩イオンが存在す
るため、泳動は観察されない。更に、オリゴヌクレオチ
ドの形成されたポリピロールへの吸着も測定することが
できない。
＊共重合中のオリゴヌクレオチドの取込みの特異性及び
レベル 1.ピロールの重合は、未変性オリゴヌクレオチド １
オリゴ−１（TGT ACC TGA ATC GTC CGC CAT）の
存在下で行われる。
オリゴ−1:反応媒体中で10-9M 支持対上のオリゴ−1:4×10-12mol、すなわち非特異
的取込み0.4％ 2.重合は、変性オリゴヌクレオチド オリゴ−１−pyr
（Ｐ TGT ACC TGA ATC GTC CGC CAT）の存在下
で行われる。
オリゴ−１−pyr:反応媒体中で10-9M 支持体上のオリゴ−１−pyr:7.2×10-12mol、すなわ
ち0.72％取込み 支持体上で検出されるオリゴヌクレオチド−ピロール
44％は、ピロール基によって効果的に結合する。しかし
ながら、電解重合溶液に0.2Mチミジン ５′リン酸塩を
添加することにより、未変形オリゴヌクレオチドの結合
が減少し、次いで固定の特異性が80％に増加する。
＊オリゴヌクレオチド−ピロールの電気化学反応性 出発原料溶液は、20,000ピロールモノマーにつき、１
オリゴヌクレオチド−ピロールを含む。形成されたポリ
マーの質量及びオリゴヌクレオチド結合の量を算定する
ことにより、ポリマーが、60,000ピロール鎖単位につ
き、１オリゴヌクレオチド−ピロールから構成されてい
ると判断できる。
このようにオリゴヌクレオチド−ピロールを遊離ピロ
ールより３倍少なく取り入れ、これにより全く十分なレ
ベルの取り込みを構成する。
＊結合の密度 上記で概説した実験条件の下で、オリゴヌクレオチド
5.3pmol/cm2を結合させる。
ポリマー中に組み込まれたオリゴヌクレオチドの割合
（1/60,000）は、反応媒体中での［オリゴヌクレオチド
−ピロール／ピロールモノマー］の比が増大することに
より、容易に改善することができる。これは、次の３つ
の異なった方法により達成することができる： ・オリゴヌクレオチドの量の増加； ・遊離ピロールの濃度の減少； ・反応容積の減少。
実施例3:本発明によるオリゴヌクレオチド−ポリピロー
ルコポリマーの性質：ハイブリッド形成支持体としての
核酸の使用 オリゴヌクレオチド オリゴ−１を有するポリピロー
ル支持体を、実施例２に述べられた方法によって合成し
た。厚さ0.2μｍの支持体を得るために５×10-2Cと、厚
さ0.6μｍの支持体を得るために15×10-2Cの電荷まで電
解重合を行った。20mMのリン酸緩衝液pH7.4、300mMのNa
Cl、0.5％のSDS中でハイブリッド形成反応を行う。同様
の緩衝液、但し４倍に希薄したものの中で洗浄する。こ
れらの反応は全て室温で行われれる。
結果 グラフト化したオリゴヌクレオチドの影響の受け易さ
は、周囲の液体媒体中において、32P−ラベルされた相
補的オリゴヌクレオチドとハイブリット形成するための
それらの許容量で立証できる。
ａ）ハイブリッド形成 ２種の異なる厚み：（●）＝厚さ0.2μｍの支持体；
（▲）＝厚さ0.6μｍの支持体について、ｘ軸にハイブ
リッド形成時間（分）及びｙ軸に32Pでラベルされた支
持体と結合した相補的オリゴヌクレオチドの量（cpm）
を表わす図５に示すように、様々な厚さの支持体のハイ
ブリッド形成の速度論は比較でき、またハイブリッド形
成容量の総量は支持体の厚さに比例する。
ｂ）変性 重複の変性を連続的に監視することは可能であり、そ
れによってハイブリッド形成現象の可逆性を示される。
図6a）及び6b）は、異なる厚さの支持体：（●）＝0.2
μm;（▲）＝0.6μｍ上で、電極上に残存するオリゴヌ
クレオチドの量及び変性の比率を、洗浄温度（１分につ
き１℃の温度変動）の関数としてそれぞれ図解してい
る。
更に、オリゴヌクレオチド−ピロール支持体が、変性
／復元サイクルに影響を及ぼさないことは既に立証され
ている。
用いた実験条件下で、変性の最大比率は約60℃で達成
される。これはオリゴヌクレオチドの理論融点（61.5
℃）に相当する。
実施例4:ポリピロール支持体上のオリゴヌクレオチドの
その場での合成 I.第１ヌクレオチドの結合 第１方法 ・第13化合物の製造 反応機構を図７に示す。
支持体（第８化合物、図７）を、アセトニトリル中0.
1MLiClO4の存在において、ピロール及びアミノエチルピ
ロール（10-2M/10-3M）溶液の電解重合によって製造す
る。電解重合は、白金電極60mm2上で10-2M Ag/Ag+に関
して広範な−0.3V〜＋0.85Vで起こる。
・第11化合物の製造（図７） 第８化合物を無水アセトニトリル（２×5ml）で、次
いで、アセトニトリル中のトリエチルアミン（500μ/
5ml）で洗浄する。
活性ヌクレオシド（第２化合物）10mgを無水アセトニ
トリル中で共蒸発によって乾燥させ、無水アセトニトリ
ル500μ中に取り出し、密封共栓フラスコ中で支持体
を添加する。その混合物をゆるやかな機械的な撹拌の下
で24時間置く。支持体を除去し、アセトニトリルで、次
いでトリチルの色が洗浄溶剤中で消えるまでジクロロメ
タンで洗浄する。
ヌクレオチドと未反応の支持体のアミン基をブロック
する必要がある。これは、ピリジン中の無水酢酸/N−メ
チルイミダゾール混合物との“カッピング”（cappin
g）によって行った。６時間反応はさせる。次いで機能
支持体（第11化合物）をピリジン３×10ml、アセトニト
リル３×10ml及びジクロロメタン３×10mlで入念に連続
的に洗浄する。
第２方法 反応機構は図８に示す。
・第14化合物の製造（図８） アミノポリピロール（第８化合物）を無水アセトニト
リル（２×5ml）で、次いでアセトニトリル中のトリエ
チルアミン（500μ/5ml）で洗浄する。活性ヌクレオ
シド（第２化合物）（20mg）を無水アセトニトリルとの
共蒸発で乾燥させ、次いで無水アセトニトリル1mlに吸
収させ、密封共栓フラスコ中で支持体（第８化合物）を
添加する。この混合物をゆるやかな機械的な撹拌の下で
24時間放置する。グラフト化された支持体（第14化合
物）をアセトニトリルで、次いでそれらの酸性化の間、
トリチルの色が洗浄溶媒中で消えるまでジクロロメタン
で洗浄する。
・第15化合物の製造（図８） ヌクレオシドによって供給された第２級アルコール基
及び反応していない支持体のアミン基をマスクしなけれ
ばならない。このために、ピリジン（1ml）中の無水酢
酸/N−メチルイミダゾール混合物で６時間、ブロックを
行った。ピリジン（２×5ml）、アセトニトリル（２×5
ml）及びジクロロメタン（２×5ml）の洗浄で、第15化
合物が得られる。
II.オリゴヌクレオチドの伸長 ・第12化合物の製造（図７） ・トリマーｄ（CCT）は、ポリピロールで被膜した白金
電極上で２つの方法によって製造された。： ・ホスホラミデート合成の通常サイクルによる化学的脱
保護での合成、 ・電気化学的脱トリチル化での合成。
ａ）化学合成 以下の工程は必要な回数行われる。それぞれの工程は
ヌクレオチドの結合に関する。これらの工程は図９に示
される。
・ジクロロメタン中、２％トリクロロ酢酸４×500μ
と支持体の脱トリチル化、 ・試薬（５×1ml）を除去するためアセトニトリルでの
洗浄、 ・DNA合成（３×1ml）のため無水アセトニトリルでの洗
浄、 ・0.1Mホスホラミジト250μと0.5Mテトラゾール250μ
の添加、 ・カップリング（２分）及びヌクレオチド溶液の除去、 ・アセトニトリル（５×1ml）での洗浄、 ・無水酢酸／メチルイミダゾールのキャッピング（500
μ、１分）、 ・アセトニトリル（２×1ml）での洗浄、 ・ヨウ素／ルチジンでの酸化１分間（500μ、１
分）、 ・アセトニトリル５×1mlでの洗浄、 ・脱トリチル化、及び新サイクルの開始、等。
各サイクル後、トリチルの測定は、それぞれ0.090OD/
2ml（dT）、0.095OD/2ml（dCT）及び0.087OD/2ml（dCC
T）を与える。
ｂ）電気化学的脱保護での合成 合成工程は、上記化学合成についてと同様である。し
かし、脱トリチル化は1.2Vの電位を５分間加えることに
より行われる。
形成されたトリチル陽イオンが、測定からそれを引く
陽極によって捕獲されるため、脱トリチル化は定量でき
ない。しかしながら、カップリングサイクルを行った。
・第13化合物の製造（図７） ネジ山栓で閉じたガラス管中において、2mlのアンモ
ニア水で支持体の開裂及び保護基の除去をし、室温で48
時間反応させる。
シリカカラム上に製造された対照は、支持体（ｔ＝４
×1/2h）から分離するために、アンモニア水４×250μ
で脱保護される。次いで、そのアンモニア水を室温で
48時間放置する。その溶液を蒸発させ、25cm C4カラム
による５μｍでの逆相クロマトグラフィーで分析する。
Ａ（25mM酢酸トリエチルアンモニウム、pH7）中で、Ｂ
（25mM酢酸トリエチルアンモニウム、pH7及び50％アセ
トニトリル）の０〜30％の勾配が30分以上付される。
・第16化合物の製造（図10） 第16化合物は、脱トリチル化のための類似の結果を有
する第12化合物と同様の方法に従って合成される。これ
は、スペーサー手の性質が化学合成にほとんど影響しな
いことを示す。
・第17化合物の製造（図10） 第16化合物は、密封共栓フラスコ中の28％アンモニア
水中で、室温で48時間脱保護される。次いでジメトキシ
トリチル基は、３％トリクロロ酢酸（３×3ml）で開裂
され、オリゴヌクレオチドが依然支持体上にあることを
立証するために、測定した。
実施例5:微小電極上でのオリゴヌクレオチド−ピロール
共重合 ４つの白金線（１）（直径0.6mm）のガラスシリンダ
ー（２）（直径5mm×高さ10mm）中への挿入によって、
図11aに示す４つの電極のマトリックスを作る。電極の
１つを対電極（３）に用いる。このマトリックス系は、
各々のマトリックス位置で種々のオリゴヌクレオチドを
結合することを可能にさせる。
電極マトリックスは、反応が行われる容器（４）の中
に置かれ、そこには参照電極（５）も浸漬される。
３つの作用電極は、ピロール及びハイブリッド形成、
ヒトのラスＨ遺伝子のコドン61における突然変異によっ
て検出可能なオリゴヌクレオチドからなるコポリマーで
連続的、電気化学的に被膜される。これら３つの５′ピ
ロール基を有するオリゴヌクレオチドは以下の通りであ
る： ・正常オリゴ： ５′Pyr TCCTCCTGGCCGG ３′ ・Ａ−突然変異オリゴ： ５′Pyr TCCTCCAGGCCGG ３′ ・Ｃ−突然変異オリゴ： ５′Pyr TCCTCCGGGCCGG ３′ 各オリゴヌクレオチドは、各電極上で実施例２で述べ
られた条件下で連続的に共重合化される。しかし、反応
容積は3mlに代えて300μとする。
得られたボルタンモグラムを図11bに示す。（（１）
第１電極上での重合、（２）第２電極上での重合、
（３）第３電極上での重合）。これらのボルタンモグラ
ムは、減少電荷（charge reduite）（２〜４×10-4C、
トップ曲線）及び高電荷（forte charge）（１〜1.3×1
0-3C、ボトム曲線）の両方において非常に不変であり、
非常に再現性がある。これらの条件下で、オリゴヌクレ
オチド６×10-14molを、0.1μｍの膜厚（10-4Cの電荷）
に対して0.3mm2（すなわち18pmol/cm2）で結合させる。
・３点マトリックス上でのハイブリッド形成による核酸
の架橋突然変異の検出 長さ51のヌクレオチドの３つの核酸のフラグメント
を、所望の天然ラスＨ突然変異体を擬態するために用い
る。
これら３つの核酸は、配列： ・正常ラスH:5′CTGTTGGACATCCTGGATGCCGGCCAGGAGGAGTA
CAGCGCCATGCGCGAC ３′ ・Ｔ−突然変異ラスH:5′CTGTTGGACATCCTGGATGCCGGCCTG
GAGGAGTACAGCGCCATGCGCGAC ３′ ・Ｇ−突然変異ラスH:5′CTGTTGGACATCCTGGATGCCGGCCGG
GAGGAGTACAGCGCCATGCGCGAC ３′を有する。
それらは、特に、マトリックス結合プローブとのハイ
ブリッド形成、それぞれ正常オリゴ、Ａ−突然変異オリ
ゴ及びＣ−突然変異オリゴにより認識される。
ハイブリッド形成反応は、20mMリン酸緩衝液、pH7.
4、300mMのNaCl、32Pで５′位にラベルされ、検出され
るべき核酸0.1pmolを含む0.5％のSDS中において25℃で
１時間行われる。次いで、マトリックスは同様の緩衝液
中で35℃で洗浄される。検出は写真フィルム上でのマト
リックスのオートラジオグラフィーによって行われる。
このような条件下で、標的核酸のハイブリッド形成は、
厳密な相補的配列のオリゴヌクレオチドを有する電極で
のみ行い、クロスハイブリッド形成は検出することはで
きない。
このように架橋突然変異の特定検出は、このマトリッ
クスによって可能になる。
実施例6:超微小電極の用途 図12に示したシステムは、ガラス板に配列された10金
電極で構成される。電極の幅は、10〜100μｍに変化さ
せてもよく、活性ゾーン（溶液に浸漬させたゾーン）の
長さは、2mm程度である。シリコン酸化物絶縁基板上へ
の金の選択的析出、次いで接合の分離によって、もう１
つのシステムを製造した。このようにして、側長25〜20
0μｍの平方電極からなるマトリックスを得る。
両方の場合において、実施例５に述べられた方法に従
って、ピロール及びオリゴヌクレオチド−ピロールの共
重合は各電極上で行われ、実施例２に述べられたよう
に、得られたポリピロールフィルムは良質で、その厚さ
は十分に制御することができる。
実施例7:オリゴヌクレオチドのその場での合成:5′−TT
CTGAGG−３′の電気化学的脱保護 合成は、形成されたオリゴヌクレオチドの二次分析の
必要性のために開裂できる手を有するアミノポリピロー
ル支持体（第８化合物）上で行われる。
方法： ・５′−TTCTGAGG−３′の電気化学的脱保護の工程での
５′−TTCTGAGG−３′の合成 オリゴヌクレオチドの３′位の端からの位置（５）に
導入されたチミジンアミデート（amidites）は、保護基
がチオピキシルの時、＋1.1Vで15分間、あるいは保護基
がｐ−ニトロベンゾイル基の時、−1.3Vで15分間の電位
を加えることによって脱保護される。他のヌクレオシド
は、トリチル化したアミデートの形成に導かれ、トリク
ロロ酢酸の脱トリチル化によって化学的に脱保護され
る。
１）ｐ−ニトロベンゾイル基の保護 保護ヌクレオシドの製造工程を図13に示す。
・ｐ−ニトロベンゾイルチミジン（第21化合物：図13）
の合成 チミジン（2.42g、10mmol）をピリジン中での共蒸発
により乾燥させ、次いで無水ピリジン200ml中に取り出
しに、４℃に冷却する。ｐ−ニトロベンゾイルクロライ
ド（2.04g、11mmol）を添加する。温度を上げ、室温で
一晩反応させる。反応は飽和炭酸水素ナトリウム5mlで
停止される。反応混合物を濃縮し、次いでクロロホルム
500ml中に取り出す。。得られた有機溶液は、0.5M NaH
CO32×500mlで、次いで飽和NaCl250mlで洗浄される。水
相はCHCl3100mlで逆抽出される。有機相を蒸発させる。
純粋な生成物は、シリカ上のカラムクロマトグラフィー
により得られる。クロロホルム中の５％メタノールで溶
出する。収率＝58％。
・ｐ−ニトロベンゾイルチミジンアミデート（第22化合
物：図13）の合成 第21化合物（1.96g、5mmol）及びジイソプロピルアン
モニウムテトラゾレート（428mg、2.5mmol）は、無水ジ
クロロメタン／アセトニトリル溶媒を用いる共蒸発によ
り乾燥される。これらの反応物は、無水ジクロロメタン
25ml中に取り出され、ビス（ジイソプロピルアミノシア
ノエトキシ）ホスフィン（1.8g、6mmol）を添加する。
２時間（無酸素、無湿気で）反応後、反応混合物は、ジ
クロロメタン250mlで希釈され、0.5M炭酸水素ナトリウ
ム２×250mlで、及び飽和塩化ナトリウム250mlで連続的
に洗浄される。有機相を蒸発させる。残留物をジクロロ
メタン10ml中に取り出す。生成物（第22化合物）は、ヘ
キサン中の沈殿によって得られ、次いで真空下で乾燥さ
せ、アルゴン中に貯蔵される。収率＝84％。
２）チオピキシル基での保護 保護ヌクレオシドの製造工程を図14に示す。
・チオピキシルチミジン（第23化合物：図14）の合成 チミジン（2.42g、10mmol）をピリジン中で共蒸発に
より乾燥させ、無水ピリジン100mlに吸収させ、４℃ま
で冷却し、チオピキシルクロライド（3.4g、11mmol）と
反応させる。温度を室温まで徐々に上昇させた後、反応
を続けて一晩（約８〜12時間）置く。反応は、NaCHO310
mlで停止させる。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメ
タン250ml中に取り出す。得られた有機溶液を飽和NaHCO
32×250mlで、次いで蒸留水250mlで抽出する。水相は、
クロロホルム100mlで逆抽出される。有機相を蒸発させ
る。生成物を溶媒中の0.5％TEA（トリエチルアミン）と
共にシリカカラムで精製する。最後にジクロロメタン
（＋0.5％TEA）中のメタノール５％で溶出する。収率＝
52％。
・チオピキシルチミジンアミデート（第24化合物；図1
4）の合成 第24化合物は、第22化合物と同様の方法に従って、第
23化合物（5mmol）から製造される。収率＝78％。
３）第１ヌクレオシドの結合 この結合工程を図15に示す。
このオリゴヌクレオチドは、共重合させたピロールと
アミノエチルピロール（9:1）の混合物上の白金（３×1
0mm）のストリップ上で合成される。
第１ヌクレオシド（１−３′位の端）は、活性化した
エステル、Ｎ−イソブチリル ２′デオキシグアノジン
（第25化合物：図13a）で開始され、シリカ支持体をよ
り機能的にすることを述べた方法〔ケー．ミヨシら、ヌ
クレイック アシッド レス．（K.MIYOSHI et al.,Nuc
leic Acids Res.）、８巻、22号、5473〜5489頁、1989
年〕に従って、アミノエチルピロール（第８化合物）と
カップリングさせる。
第26化合物（10mg）をアセトニトリル500μに溶解
させる。機能化したポリピロールで被覆した白金電極、
及びトリエチルアミン１μを添加する。反応は、室温
で20時間機械的に撹拌させる。グラフト化電極（第26化
合物）を除去し、アセトニトリルで、次いでジクロロメ
タンで入念に洗浄する。
未反応のアミン基を無水酢酸（ピリジン500μ中50
％）と６時間ブロックする。グラフト化電極をピリジン
及びメタノールで洗浄し、次いで乾燥させる。
４）オリゴヌクレオチド dTTCTGAGGの合成 グラフト化電極を、空のOPC カラム（アプライド
バイオシステムズ（APPLIED BIOSYSTEMS））に置く。充
填は残留物量を最小さにするためのテフロンチップで終
える。製造業者（アプライド バイオシステムズ（APPL
IED BIOSYSTEMS））の使用説明書に従い、381A合成機に
おいて“１μmolサイクル”で、２、３及び４位のヌク
レオシドを添加する。各工程間のジメトキシトリチル基
の化学的脱保護は、製造業者の推奨する条件下で、ジク
ロロメタン中TCAで行われる。
５位のアミデート（第22化合物あるいは第24化合物）
を１分間カップリングする正常アミデートと同様の方法
に従って、カップリングする。製造したホスフィートト
リエステル結合の酸化及びカッピングは、通常の方法に
従って行われる。電極はカラムから除去され、電気化学
的脱保護が行われる。
第22化合物を用いるならば、ｐ−ニトロベンゾイル基
は、次の電解質、メタノール中の0.1Mテトラブチルアン
モニウムペルクロレートで電極を浸すことにより、及び
−1.3Vの電位を15分間印加することにより開裂される。
第24化合物を用いるならば、チオピキシルは、アセト
ニトリル中の0.1M テトラブチルアンモニウムペルクロ
レートの電解質で、＋1.1Vの電位を15分間印加すること
により開裂される。
両方の場合において、５′位のＴヌクレオシドの保護
基の開裂後、テフロンチップを有するカラム中に再び電
極を置き、アミデートＣ（６位）、Ｔ（７位）及びＴ
（８位）を連続的に添加することにより合成が続けられ
る。
合成終了時、オリゴヌクレオチドは支持体から開裂さ
れる。電極は、共栓フラスコ中の28％アンモニア水４×
500μで、４×1/2時間処理される。この４留分は、共
栓の4mlホイートンフラスコ（flacon WHEATON）で合わ
され、オリゴヌクレオチドを脱保護するために55℃で16
時間置かれる。
TEA存在下での共蒸発後、得られたオリゴヌクレオチ
ドの１部分（1/100）は、ポリヌクレオチドキナーゼの
存在下で32Pで５′位にラベルされ、次いでポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析される。アクリルアミ
ドゲル電気泳動分析は、所望の生成物（８量体）の存
在、及びオリゴヌクレオチド（５量体）の欠如、チミジ
ンアミデートの電気化学脱保護が不十分なことを意味す
る存在を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リバシュ，チエリ フランス国、38000 グルノーブル、リ ュ フェリックス エスクラニョン 22 (72)発明者 バルテ，クリステル フランス国、38600 フォンテーヌ、リ ュ ドゥ シャルメット ７ (72)発明者 ビダン，ジェラール フランス国、38100 グルノーブル、リ ュ ドゥ トロア ゼピ ３ (56)参考文献 欧州特許出願公開314009（ＥＰ，Ａ ２) 国際公開92／7882（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／8307（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08F 238/02 C08G 61/12 C08G 73/00

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中、単位Ａは導電性ポリマーのモノマーを表し、単
    位Ｂはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの
    類自体の一つを表し、x,y及びｚは又は１以上の整数、
    或いはｙは０表し、ｌは共有結合又はスペーサー手を表
    す。）のコポリマー。
  2. 【請求項２】Ａが、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ
    （ｐ−フェニレン）、ポリ（ｐ−フェニレンビニレ
    ン）、ポリピレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポ
    リフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカ
    ルバゾール及びポリアニリンからなる群から選択される
    ECPのモノマー単位である請求項１記載のコポリマー。
  3. 【請求項３】Ａが、ポリピロール単位である請求項２記
    載のコポリマー。
  4. 【請求項４】x/y比が、1/5と1/100,000の間である請求
    項１〜３のいずれか１つに記載のコポリマー。
  5. 【請求項５】ｌが、下記の式 −R1−[(CH2)ｎ−R2]Ｘ−[(CH2)ｍ−R3]ｙ−(CH2)ｐ− 〔式中、 ・ｎは１〜10の整数、 ・ｍは０又は１〜10の整数、 ・ｐは０又は１〜10の整数、 ・ｘは０又は１〜８の整数、 ・ｙは０又は１〜８の整数、 ・R1、R2及びR3は、同一又は異なっていてもよい、 CH2、Ｏ、Ｓ、NR′、CO、CH＝CH、NR′CO、CONR′、NHS
    O2、 （式中、Ｒ′は水素原子又はC1〜C12アルキル鎖を表
    す）を示す〕に対応するスペーサ手である請求項１〜４
    のいずれか１つに記載のコポリマー。
  6. 【請求項６】少なくとも以下の工程、 ・一般式（II） −〔Ａ＊〕ｘ−〔Ａ〕ｙ− （II） （式中、A,x及びｙは請求項１と同義、及びＡ＊は官能
    化Ａを表す）のコポリマーを製造する第１工程、 ・式（II）のポリマーに、一般式（III） ｌ＊−〔Ｂ〕Ｚ （III） （式中、Ｂ及びｚは上記定義と同義、ｌ＊はＡ＊に結合
    することができる活性化手である。）の少なくとも１つ
    の基のコポリマーを結合する第２工程、 からなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の一般式
    （Ｉ）のコポリマーの製造方法。
  7. 【請求項７】一般式（II）のコポリマーの製造のための
    工程及び／又は一般式（III）の基の結合のための工程
    が、電気化学的反応によって行われる請求項６記載の製
    造方法。
  8. 【請求項８】少なくとも以下の工程、 ・一般式（IV） （式中、Ａ、Ｂ、ｚ及びｌは上記定義と同義である。） の化合物を製造する工程ａ） ・化合物（IV）をモノマーＡと共重合する工程ｂ）、 からなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の一般式
    （Ｉ）のコポリマーの製造方法。
  9. 【請求項９】工程ｂ）が、化合物（IV）とモノマーＡと
    の電気化学的共重合によって行われる請求項８記載の製
    造方法。
  10. 【請求項１０】BZが、いくつかの後続する工程におい
    て、さらに伸長し、これら工程のそれぞれが、１つ以上
    の単位Ｂの結合からなる請求項６〜９のいずれか１つに
    記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】BZの伸長が、一連の電気化学的反応を伴
    う請求項10記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】電極表面上で行われる請求項７、９及び
    11いずれか１つに記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】表面が、式（Ｉ）のコポリマーを有する
    コーティングからなる請求項１〜５のいずれか１つに記
    載の電極。
  14. 【請求項１４】同一又は異なってもよい請求項13記載の
    １つ以上の電極からなる装置で、核酸合成及びハイブリ
    ット形成反応を提供する装置。
  15. 【請求項１５】いくつかの電極が、それぞれ異なった基
    Bzを有する少なくとも２つからなる請求項14記載の装
    置。
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