JP2002516914A - 分子ロッド及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
らの使用、結果として生じる生成物、及び材料及び構造生物学の分野における、
特にバイオセンサー又は生体材料としての前記生成物の応用に関する。
るのに必須である。いくつかの方法がその様な研究を行うために利用される:X
線、NMR及び電気結晶学(electrocrystallography)(2D結晶化)。
結晶化技術(E. E. Ugzirisら、Nature, 1983, 301, 125-129)により、生物学的
マクロ分子(結晶)の自動組織化システムを形成すること、及びこれら分子の構
造を得られた結晶の電子顕微鏡分析により決定することが可能となる。
ンパク質と相互作用するように選択されること、そのタンパク質は脂質に結合し
、それから組織化されたネットワークを形成することにある。
る。これらの相互作用は特異的でない−この場合脂質は、イオン性相互作用によ
り結晶化を起こす、電荷を帯びた極性末端を有する−又は特異的のいずれかであ
る。後者の場合、脂質の極性頭部は結合するたんぱく質と強い親和性を示す配位
子を有している。
り官能基化された脂質フィルム上で、可溶タンパク質は2次元的に結晶化するこ
とができることを示すことが可能になっている(B. J. Japら、Ultramicroscopy,
1992, 46, 45-84)。
ubalekら、J. Struct. Biol., 1994, 113, 117-123)により、いわゆるヒスチジ
ン標識融合タンパク質を結晶化させることが可能となった。これらのタンパク質
は実際、そのN-末端又はC-末端に、いくつかのヒスチジンからなる配列を有して
いる。その様なタンパク質のニッケル官能基化脂質への結合は、ニッケル錯体及
びポリヒスチジン配列間の強い相互作用によるものであることを示すことが可能
になっている(C. Venien-Brianら、J. Mol. Biol., 1997, 274, 687-692)。特に
、適当な配位子が入手できなかった場合に、その様な官能基化された脂質により
、結晶化を達成することが可能になった。
、及び容易に同時にコントロールされることができない多くの要因に依存すると
いった欠点があり、その要因とは: − 脂質により保持される配位子は、タンパク質と相互作用するために十分接近
できるものでないといけない。この接近しやすさは脂質と配位子間のスペーサー
アームの長さに依存する:短すぎると、タンパク質の脂質層内への貫入が起こり
;長すぎると、結合タンパク質上に非常に高い自由度を与え、結晶中の欠陥発生
率を増加させる。 − 脂質単層は結合タンパク質に十分な横方向及び回転の可動性を与えるために
、十分に流動的でないといけなくて、その様にして、タンパク質が互いに関して
自己組織化すること、及び分子間接触を発達させることができ、その結果、結晶
を生成する。 − 脂質単層上での結晶化に固有のもう1つ困難なことは、単層の安定性に関す
る;実際、空気/液体界面の安定性はコントロールしにくい。さらに、たんぱく
質の空間的組織化を可能にするために、脂質単層はタンパク質の結合前だけでな
く、結合後も安定のままでないといけない。 − 結晶化ステップの次にくる顕微鏡研究には、得られる構造の平面性質のため
、多数の面を作り出すことが必要である。
のに適した構造物、以後は分子ロッドと呼ぶ、並びに溶液中前記生物学的マクロ
分子を結合させ、必要に応じてその自動組織化を誘発する方法を提供することを
計画し、前記方法は従来技術で使用される2D結晶化方法より優れた実用的必要性
を満たしている。
ドに関する:
レン、ポリフェニレンエチニレン及びポリビニレンを含む群から選択されるポリ
マーである:
H2、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル; GpF(官能基)は基B-Rであり、ここで: − B(結合アーム)は、必要に応じてアルキル基で置換され、不飽和の単位又は
ポリオキシエチレン単位を有する又は有しない、及び、鎖の中心にフォスフェー
ト基を有する又は有しないC1-C10炭化水素基から選択され、下記のようなもので
ある:
、エステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの有機カップリング基を
構成する;及び − Rは正又は負に電荷をおびた基から選択される親水性基である;配位子又は
、制限を示唆せず、ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド又は抗
原のような生物学的マクロ分子の類似体;又は、IDA、NTA、EDTA、ビピリジン、
又はテルピリジンのような配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、ク
ロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウムの錯体のよう
な、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体、前記配位子は必要に応じて
、(Xで)Eに結合するためにアルキル基で官能基化される;制限を示唆せず、正
又は負の電荷を帯びた基は、アンモニウム、カルボキシレート、フォスフェート
又はスルフォネート基を意味すると理解される;次に挙げる基が例として言及さ
れ得る:-N(CH3)3 +又は-CO2 -; nは5〜1000の整数; pは0〜10の整数;及び E(スペーサーセグメント)はPによって形成された骨格の硬い構造を妨げない性
質の化学単位であり、フェニレン、エチニレン又はビニレン単位、又は下記式に
明示されているようなフェニレンエチニレンのような、これら単位の組み合わせ
である:
、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル。
:
ニレンエチニレン)を有するポリマーはすでに述べられており(Angew. Chem. In
t. Ed., 1998, vol. 37, pp. 402-428)、非線形光学における、その電子及び蛍
光特性のために使用される(Macromolecules, 1994, 27, 562-571、及びJ. Phys.
Chem., 1995, 99, 4886-4893)。
ッドに特有の性質を与える基GpFにより官能基化される: − それは直鎖で、硬く、及び水性媒体中に可溶である; − それは、生物学的マクロ分子に対し非常に強い親和性を有する基により、規
則的に官能基化される;及び − それは、生物学的マクロ分子と溶かされた時、分子認識による前記ロッドへ
/上の前記マクロ分子の結合及び/又は自動組織化に特に適している。
硬く、直線形でないといけない;及び 図2に説明されているように、Eによって、官能基GpF間の距離L2をコントロー
ルすることが可能になり、一方、GpFの結合アームBによって、基R及びポリマー
の軸間の距離L1をコントロールすることが可能になる。
する:
うな基fにより表される基B及び、ニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)に
より表される基Rを含む;及び nは5〜1000の整数である。
を有する:
り表される基Bを含み、その基Bは、配位子NTAがC4アルキル基=(CH2)4により官能
基化されているニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基R
と結合している;及び nは5〜1000の整数である。
ような分子ロッドと、少なくとも15分間、好適の温度及びpH条件下でインキュベ
ートすることを含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び/又は自
動組織化の方法に関する。
じて、分子ロッド周りで生物学的マクロ分子のらせん状結晶に発達することがで
きるだろう。
をコントロールするのに適している。
てその自動組織化を誘起することを可能にする本発明に記載の分子ロッドは、ナ
ノ材料又は構造生物学の分野において重要な応用性: − 結合の配向のコントロールと共に又はそれなしで、分子ロッドへの生物学的
マクロ分子の結合; − 分子ロッド周りでの、生物学的マクロ分子のらせん状結晶化のコントロール
;及び − 得られるらせん状結晶の電子顕微鏡分析による、生物学的マクロ分子の構造
研究、 を提供する。
可溶な膜若しくは貫膜タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸であ
る。
分子を溶かすために、水性又は水性-アルコール性溶媒からなり、結晶化される
生物学的マクロ分子により、必要に応じて少なくとも1つの洗剤(detergent)を含
む。
は好ましくは以下の通りである:室温、15分〜48時間、pH 5.5〜8.5でのインキ
ュベーション。
る。
形成は、マクロ分子の大きさ(直径)及びロッドのパラメーター(距離L1及びL2
、並びに分子ロッドの長さ)間の完全な一致の結果である。距離L1は基R及びポ
リマーの軸間の距離を表す。距離L2は二つの基R間の距離を表す。分子ロッドの
長さはポリマーのポリマー化の程度に等しい(図2参照)。
き、その配列により、電子顕微鏡による構造研究が可能となり、又は物理学的、
電気的、生物学的特性について有用である新しいナノ材料を調製することが可能
となる。
製を含む。
超分子物体に関し、その分子ロッドに生物学的マクロ分子が非共有様式で結合し
、又はその分子ロッド上で結晶形で組織化している。
オセンサー又はバイオ伝導体としての、前記超分子物体の応用、及びそれが結合
しているマクロ分子の構造研究に関する。
うに実施するかの実施例、及び添付の図面について言及する以下の記述から明か
となるであろう他の条件も含む。
本発明の主題を説明するためにだけ提供されていることは、はっきりと理解され
ねばならない。
プトアビジン又は融合ストレプトアビジンの結合及び結晶化を目的として製造し
た。
H2N-(CH2)3-NHBoc, CH2Cl2, TEA; e. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; f. TFA, CH 2 Cl2; g. ビオチン-NHS, DMF, TEA 実験プロトコル t-ブチル(3-アミノプロピル)カルバメート:
を0℃で、10mlのプロパンジアミン(120mmol, 1eq)を含む40mlのMeOHの溶液に
滴下にて加える。室温で撹拌を15時間持続し、次いで反応液を蒸発させる。残渣
を20mlの水及び50mlのCH2Cl2に溶解し、有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、次い
で蒸発させて、1.8gの無色のオイルを得(収率:87%/Boc2O)、これをさらに精
製することなく次の工程に使用する。 実験式:C8H18O2N2 MW:174g/mol TLC:Rf(CH2Cl2/MeOH/TEA:69/30/1):0.26;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ4.92(bs, 1H, H2); 3.16(tt, J3-4=6.6Hz, J3-2=7.2
Hz, 2H, H3); 2.73(t, J5-4=6.6Hz, 2H, H5); 1.57(tt, J4-3及ヒ゛4-5=6.6Hz, 2H , H4); 1.41(s, 9H, H8); 1.17(bs, 2H, H6);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ155.88(1C, C1); 78.73(1C, C7); 39.42(1C, C5) ; 38.15(1C, C3); 33.16(1C, C4); 28.15(3C, C8); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:175(100, [M+1]+); 192(10, [M+18+]); t-ブチル[3-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)プロピル]カルバメート
:
CH2Cl2及び0.5mlのトリメチルアミンの溶液を、369mgの2,5-ジオキソピロリジン
-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエート(1mmol, 1eq)を含む7mlのCH2Cl2の
溶液に添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次いで蒸発させる。得られた残
渣をシリカゲル60H(ヘキサン/EtOAc:1/1)上のクロマトグラフィーで精製し、
97%の収率で、416mgの白色固体を得る。 実験式:C17H21O3N2 MW:428g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAcH:1/1):0.40;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.80(d, J12-13=8.2Hz, 1H, H12); 7.46(d, J15-13=
2.0Hz, 1H, H15); 7.17(dd, J13-12=8.2Hz, J13-15=2.0Hz, 1H, H13); 6.55(bs,
1H, H2); 4.92(bs, 1H, H6); 3.48(tt, J3-4=6.2Hz, J3-2=6.0Hz, 2H, H3); 3.
27(tt, J5-4=5.7Hz, J5-6=6.4Hz, 2H, H5); 1.70-1.78(m, 2H, H4); 1.41(s, 9H
, H8);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ166.70(1C, C1); 156.44(1C, C7); 142.38(1C, C 10 ); 139.63, 133.74(2C, C12, C13); 131.05(1C, C15); 122.22(1C, C14); 92.
81(1C, C11); 81.62(1C, C16); 79.26, 79.17(2C, C17, C7); 37.07, 36.42(2C,
C5, C3); 29.83(1C, C4); 28.14(3C, C8); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:429(26, [M+1]+); 446(100, [M+18+]); t-ブチル[3-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)プロピル]カルバメート
の重合:
メート(0.81mmol, 1eq)を24.5mlのTHF及び24.5mlのトリエチルアミンからなる
混合物中に置き、次いで57mgのビスジクロロビストリフェニルホスフィンパラジ
ウム(0.081mmol, 0.1eq)及び57mgのヨウ化銅(0.28mmol, 0.3eq)を添加する
。反応液を50℃で15時間加熱する。室温に戻した後に、反応液を900mlのアセト
ンに注ぎ入れる。アセトンの遠心分離によって、黄色固体の形態で160mgのポリ
マーを回収する。 ポリマーの加水分解
℃で滴下にて加え、次いで反応液を溶解する。2時間の撹拌の後、反応液を蒸発
させ、次いで1mlのCH2Cl2及び1mlのトリエチルアミンからなる混合物中に再懸濁
する。沈殿を遠心分離によって回収し、水で数回洗浄し、次いで凍結乾燥する。
UV(0.1N HCl, 0.208mg/ml):348(5856); 321(5317); 301(3990); 283(3317);
201(8519); ビオチンの結合
中で懸濁する。48時間撹拌後、反応液をろ過し、蒸発させ、次いでCH2Cl2中で再
懸濁する。沈殿を遠心分離にて回収し、酢酸エチルで数回洗浄し、次いで凍結乾
燥する。
ポリマーを、ポリヒスチジン標識を保有する生物学的なマクロ分子を結合及び結
晶化する目的で、製造した。NTA*、NTAのアナログを製造する方法は、C. Venien
-Brian ら(J. Mol. Biol., 1997, vol. 274, pp. 687-692)の記載と同じであ
る。
. NTA*, CH2Cl2, TEA; e. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; f. KOH, MeOH; g. NiC
l2・6H2O, トリス(10mM, pH8) 実験プロトコル 2-ヨード-5-トリメチルシラニルエチニル安息香酸:
ニルホスフィンパラジウム(II)(0.3, 0.1eq)及び200mgのヨウ化銅(I)(1mmol,
0.34eq)を60mlのTHF/TEA混合物(3/1)中で溶解する。425μlのトリメチルシ
リルアセチレン(3mmol, 1eq)を加えた後、暗室中で室温にて16時間撹拌を続け
る。次いで反応液を蒸発乾固し、得られた残渣をシリカ60H上のフラッシュクロ
マトグラフィー(ヘキサン/EtOAc/AcOH:70/30/1%)により精製し、真空下で乾
燥した後、微細な黄色針状晶の形態で754mgの2-ヨード-5-トリメチルシリラニル
エチニル安息香酸を得る(収率;73%)。 実験式:C12H13IO2Si MW:344.221g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc/AcOH:50/50/1%):0.55;1 H NMR(300MHz, アセトン-d6):δ10.93(ブロード s, 1H, H1), 8.02(d, J4-5=8
.2Hz, 1H, H4); 7.92(d, J5-7=1.8Hz, 1H, H7); 7.27(dd, J4-5=8.2Hz, J5-7=1.
8Hz, 1H, H5); 0.25(s, 9H, H10);13 C NMR(75.47MHz, アセトン-d6):δ166.99(1C, C1); 142.24(1C, C4); 136.85
(1C, C2), 135.57(1C, C5); 134.16(1C, C7); 123.75(1C, C6); 103.59(1C, C3)
; 97.12(1C, C8); 94.52(1C, C9); -0.28(3C, C10); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:362(100, [M+18]+); 2-ヨード-5-エチニル安息香酸:
ルシリラニルエチニル安息香酸(1.45mmol, 1eq)を含む30mlのメタノール溶液
に添加する。室温で2時間撹拌した後、反応液を2×50mlのCH2Cl2で洗浄し、次い
で水相を塩酸モル溶液の添加によってpH2に再酸性化する。2×50mlのCH2Cl2で抽
出した後、有機相を集め、乾燥し、蒸発させ、黄色固体の形態で383mgの2-ヨー
ド-5-エチニル安息香酸を得る(収率:97%)。 実験式:C9H5IO2 MW:272.039g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc/AcOH:50/50/1%):0.4;1 H NMR(300MHz, アセトン-d6):δ8.08(d, J4-5=8.1Hz, 1H, H4); 7.93(d, J5-7 =1.9Hz, 1H, H7); 7.36(dd, J4-5=8.1Hz, J5-7=1.9Hz, 1H, H5); 3.87(s, 1H, H 9 );13 C NMR(75.47MHz, アセトン-d6):δ167.01(1C, C1); 142.22(1C, C4); 137.32
(1C, C2), 135.72(1C, C5); 134.12(1C, C7); 123.00(1C, C6); 94.51(1C, C3);
82.08(1C, C8); 81.22(1C, C9); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:290(100, [M+18]+); 307(66, [M+35]+); 562(
8, [2M+18]+); 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエート:
, 1eq)の2-ヨード-5-エチニル安息香酸及び276mg(2.4mmol, 1.2eq)のNHSを含
む30mlのTHF溶液に添加する。混合物を室温で一晩撹拌する。次に、反応液をろ
過し、続いて蒸発させ、得られた残渣をシリカ60H上のフラッシュクロマトグラ
フィー(ヘキサン/EtOAc:70/30)で精製し、真空下で乾燥後、黄色固体の形態
で568mgの2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエートを
得る(収率:77%)。 実験式:C13H8INO4 MW:369.114g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:50/50):0.46;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ8.18(d, J5-7=2.4Hz, 1H, H7); 8.3(d, J4-5=8.5Hz,
1H, H4); 7.34(dd, J4-5=8.5Hz, J5-7=2.4Hz, 1H, H5); 3.22(s, 1H, H9); 2.9
1(s, 4H, H11);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ168.53(2C, C11); 160.49(1C, C1); 141.92(1C,
C4); 136.97(1C, C5), 135.09(1C, C7); 129.67(1C, C2); 122.60(1C, C6); 95.
60(1C, C3); 80.81(1C, C8); 80.20(1C, C9); 25.46(2C, C12); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:387(100, [M+18]+); 404(27, [M+35]+); メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベ
ンゾイルアミノ)ヘキサノエート:
ド-5-エチニルベンゾエートを含む20mlのCH2Cl2溶液を、320mg(1.05mmol, 1.05
eq)のNTA*を含む20mlのCH2Cl2溶液に添加する。混合物を室温で16時間撹拌する
。次いで反応液を蒸発させ、シリカ上のクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH/TEA
:90/10/1)にかけて、橙色オイルの形態で380mgのメチル 2-(ビスメトキシカル
ボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエー
トを得る(収率:68%)。 実験式:C22H27IN2O7 MW:558.372g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:50/50):;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.74(d, J15-16=8.2Hz, 1H, H15); 7.41(d, J16-18=
2.1Hz, 1H, H18); 7.09(dd, J15-16=8.2Hz, J16-18=2.1Hz, 1H, H16); 6.46(t,
J6-9=5.1Hz, 1H, H9); 3.62及び3.56(s, 13H, H10, H11, H7); 3.38(t, J2-3=7.
3Hz, 1H, H2); 3.36(t, J5-6=6.6Hz, J6-9=5.1Hz, 2H, H6); 1.40-1.80(m, 6H,
H3, H4, H5);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ172.82(1C, C1); 171.54(2C, C8); 168.42(1C, C 12 ); 142.57(1C, C13); 139.49(1C, C15); 133.54(1C, C16), 131.17(1C, C18);
122.00(1C, C17); 93.04(1C, C14); 81.69(1C, C19); 79.19(1C, C20); 63.95(
1C, C2); 52.25(2C, C7); 51.41及び51.22(3C, C10, C11); 39.53(1C, C6); 29.
37(1C, C3); 28.08(1C, C5); 22.71(1C, C4); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:631(9, [M+1]+); 648(100, [M+18]+); C22H27IN2O7の微量分析: 計算値:C, 47.32; H, 4.87; N, 5.02; O, 20.06; I, 22.73 実測値:C, 47.01; H, 4.95; N, 4.87 メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベ
ンゾイルアミノ)ヘキサノエートの重合:
ニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエート(0.15mmol, 1eq)を、6mlのTHF及び2ml
のトリエチルアミンからなる混合物中に置き、次いで11mgのビスジクロロビスト
リフェニルホスフィンパラジウム(17μmol, 0.1eq)及び15mgのヨウ化銅(79μ
mol, 0.5eq)を添加する。反応液を50℃で15時間加熱する。室温に戻した後、反
応液を200mlのアセトンに注ぎ入れる。アセトンの遠心分離により55mgのポリマ
ーを黄色固体の形態で回収する。 ポリマーの加水分解
を0℃で滴下にて加える。96時間撹拌した後、反応液をろ過し、蒸発させ、次い
で最小量の水に溶解する。次いで得られた溶液を、0.1Mの塩酸溶液をゆっくり添
加することにより再酸性化する。生成した沈殿を遠心分離で回収し、水で数回洗
浄し、次いで凍結乾燥する。 ニッケルイオンの錯形成反応:
で20μlのNiCl2・6H2O(500mM)を含むトリス(10mM, pH8)溶液を1mlのポリマー
溶液に加える。透析後、さらに精製することなく、溶液中で該化合物を使用する
。
リマー Ppm)によって官能基化された分子ロッドのライブラリーの設計 間隔L1の制御のための合成的アプローチ
A, CH2Cl2; v. SOCl2/TEA, CH2Cl2; vi. H2, Pd/C, MeOH 間隔L2の制御のための合成的アプローチ
. MeOH, EDC, HOBT, THF; e. HCl, NaNO2/K2CO3, HNPri 2; f. LDA, CIPO(OEt)2;
g. LDA(2eq), Me3SiCl; h. K2CO3, MeOH; i. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; j.
MeI 実験プロトコル 重合及び加水分解のための実験プロトコルは、ロッドP0に関する記載と同様で
ある。
5mol, 1eq)を200mlのジクロロメタン中に溶解する。7.3mlのトリエチルアミン
(0.05mol, 1eq)を滴下にて加えた後、反応液を室温で16時間撹拌する。100ml
の水で加水分解した後、反応液を100mlのジクロロメタンで2回抽出し、有機相
を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、残渣を得、これをシリ
カ60Hのフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc:40/60)で精製する。
これにより無色の軽いオイルの形態で13.4gのO-トシルジエチレングリコールを
得る(収率:99%/TsCl)。 実験式:C11H16O5S MW:260.2g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:7/3):0.32;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.78(d, J6-7=8.1Hz, 2H, H6); 7.33(d, J7-6=8.1Hz
, 2H, H7); 4.18(t, J4-3=3.2Hz, 2H, H4); 3.69-3.63(m, 4H, H2-3); 3.51(t,
J1-2=3.2Hz, 2H, H1); 2.43(s, 3H, H9); 1.98(bs, 1H, H10);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ144.70(1C, C8); 132.82(1C, C5); 129.60(2C, C 6 ), 127.69(2C, C7); 72.24(1C, C2); 68.91(1C, C3); 68.35(1C, C4); 61.40(1
C, C1); 21.33(1C, C9); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:278(100, [M+18]+); 2-(2-アジドエトキシ)エタノール 16a:
l, 1eq)を200mlのアセトニトリル中に溶解し、次いで3.67gの窒化ナトリウム(
0.056mol, 1.2eq)を加える。反応液を80℃で16時間加熱する。100mlの水で加水
分解した後、反応液を100mlの酢酸エチルで2回抽出する。有機相を硫酸マグネ
シウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、3.9gの無色の軽いオイルを得る(収
率:63%)。 実験式:C4H9O2N3 MW:131g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:1/1):0.28;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ3.72(t, J2-1=4.7Hz, 2H, H2); 3.66(t, J3-4=4.8Hz
, 2H, H3); 3.58(t, J1-2=4.7Hz, 2H, H1); 3.38(t, J4-3=4.8Hz, 2H, H4); 2.3
2(bs, 1H, H5);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ72.19(1C, C2); 69.82(1C, C3); 61.53(1C, C1)
†; 50.49(1C, C4); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:149(100, [M+18]+); t-ブチル[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]アセテート 19a:
に懸濁し、次いで3.89gの16a(0.029mol, 1eq)を含む10mlのテトラヒドロフラ
ン溶液を0℃で滴下にて加える。8.71mlのt-ブチルブロモアセテート(0.059mol,
2eq)を緩やかに加える前に、該温度で半時間撹拌を持続する。温度は緩やかに
上昇し、一晩撹拌を持続する。反応液を50mlの水で加水分解し、次いで濃縮して
残渣を得、これをシリカ60H上のフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOA
c:70/30)で精製する。黄色がかったオイルの形態の3.95gの生成物を収率55%
で回収する。 実験式:C10H19O4N3 MW:245g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:7/3):0.47;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ4.02(s, 2H, H2); 3.70-3.66(m, 6H, H3,4,5); 3.39
(t, J6-5=5.0Hz, 2H, H6); 1.46(s, 9H, H8);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ169.37(1C, C1); 81.33(1C, C7), 70.55-70.49(2
C, C3及び4); 69.81(1C, C5); 68.90(1C, C2); 50.46(1C, C6); 27.86(3C, C8);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:207(15, [M+1]+); 263(100, [M+18]+); メチル 6-(2-[2-(2-アジドエトキシ]アセチルアミノ)-2-(ビスメトキシカルボ
ニルメチルアミノ)ヘキサノエート 20a:
lのトリフルオロ酢酸を滴下にて加える。60℃で2時間の撹拌の後、反応液を蒸発
乾固させる。次いで得られた残渣を4mlのチオニルクロリドに溶解し、室温で1時
間撹拌する。液を再び蒸発乾固させ、4mlのジクロロメタンで2回溶解し、次い
で再蒸発させる。生成した該酸塩化物を10mlのジクロロメタンに溶解し、次いで
6.43gの極性ヘッドNTA*(0.016mol, 1eq)を含む10mlのジクロロメタン及び4.46
mlのトリエチルアミン(0.032mol, 2eq)の溶液を加える。反応液を室温で一晩
撹拌し、次いで蒸発乾固させて残渣を得、これをシリカ60H上のフラッシュクロ
マトグラフィー(MeOH/CH2Cl2:3/97)で精製する。これにより黄色オイルの形
態の1.84gの生成物を収率25%で得る。 実験式:C19H33O9N5 MW:475g/mol TLC:Rf(純粋なEtOAc):0.34;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ6.79(bt, J9-6=5.3Hz, 1H, H9); 3.88(s, 2H, H13);
3.59-3.62(m, 15H, H10, H11, H15, H15, H16); 3.54(s, 4H, H7); 3.29-3.34(
m, 3H, H2, H17); 3.18(dt, J6-5=6.5Hz, J6-9=5.3Hz, 2H, H6);1.27-1.65(m, 6
H, H3, H4, H5);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ172.68(1C, C1); 171.42(2C, C8); 169.29(1C, C 12 ); 70.52(1C, C15); 70.20(1C, C13); 69.91(1C, C14); 69.75(1C, C16); 64
.35(1C, C2); 52.10(2C, C7); 51.27及び50.30(2C, C10, C11); 51.06(1C, C17)
; 38.30(1C, C6); 29.74(1C, C3); 28.94(1C, C5); 22.93(1C, C4); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:476(100, [M+1]+); メチル 6-(2-[2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)-2-(ビスメトキシ
カルボニルメチルアミノ)ヘキサノエート 21a:
パラジウム担持チャコール(10重量%)を加える。反応液を水素で3回パージし
、次いで水素雰囲気下で室温にて一晩静置する。パラジウムをセライトでろ別し
た後、ろ液を蒸発させ、1.70gの黄色オイルを得(収率:97%)、これをさらに
精製することなく次の工程に使用する。 実験式:C19H35O9N3 MW:449g/mol TLC:Rf(MeOH/CH2Cl2:1/9):0.17;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ6.92(bs, 1H, H9); 3.85(s, 2H, H13); 3.55-3.13(m
, 26H, H2, H6, H7, H10, H11 H13, H14, H15, H16, H17); 1.24-1.62(m, 6H, H 3 , H4, H5); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:450(100, [M+1]+); メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-[2-(2-(5-エチニル-2
-ヨードベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサノエート 22a :
0.33mmol, 1eq)を含む5mlのCH2Cl2及び0.2mlのトリエチルアミンの溶液を123mg
の21a(0.33mmol, 1eq)を含む2mlのCH2Cl2の溶液中に加える。反応液を室温で2
4時間撹拌し、次いで蒸発させる。残渣をシリカゲル60H(MeOH/CH2Cl2:3/97)
上のクロマトグラフィーにかけて145mgの黄色がかったオイルを収率62%で得る
。 実験式:C28H38O10N3I MW:703g/mol TLC:Rf(MeOH/CH2Cl2:1/9):0.50;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.79(d, J23-25=8.1Hz, 1H, H23); 7.45(d, J25-23=
1.5Hz, 1H, H25); 7.15(dd, J23-25=1.5Hz及びJ23-22=8.1Hz, 1H, H23); 6.76(b
t, 1H, H9); 6.50(bt, 1H, H18); 4.11(s, 2H, H13); 3.58-3.96(m, 17H, H10,
H11, H14, H15, H16); 3.51(s, 4H, H7); 3.20-3.41(m, 5H, H2, H6, H17); 3.1
7(s, 1H, H28);1.44-1.71(m, 6H, H3, H4, H5);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ172.75(1C, C19); 171.64(1C, C1); 171.49(1C,
C8); 169.38(1C, C12); 142.14(1C, C20); 139.69(1C, C25); 133.86(1C, C22)
; 131.21(1C, C23); 122.25(1C, C24); 115.97(1C, C21); 92.71(1C, C26); 79.
45(1C, C27); 70.65(1C, C15); 70.36(1C, C13); 69.87(1C, C14); 69.41(1C, C 16 ); 64.36(1C, C2); 52.39; 51.16(2C, C7); 52.16; 51.37(3C, C10, C11); 39
.46(1C, C17); 39.37(1C, C6); 29.77(1C, C3); 28.95(1C, C5); 22.98(1C, C4)
; MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:704(100, [M+1]+); 721(36, [M+18]+); C28H38N3O10Iの微量分析: 計算値:C, 47.80; H, 5.44; N, 5.97; O, 22.74; I, 18.03 実測値:C, 47.75; H, 5.71; N, 5.72 ロッドP21のためのモノマーの製造 メチル 6-(2-(2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ)-
2-(メトキシカルボニルメチルアミノ)ヘキサノエート 21b:
エチレングリコールから出発する。 実験式:C21H39O10N3 MW:493g/mol TLC:Rf(MeOH/CH2Cl2/TEA:1/9/0.1):0.27;1 H NMR(300MHz, CD3OD):δ4.59(bs, 3H, H9, H20); 3.94(s, 2H, H13); 3.10-3
.61(m, 28H, H2, H6, H7, H10, H11, H14, H15, H16, H17, H18, H19); 1.19-1.
62(m, 6H, H3, H4, H5); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:494(100, [M+1]+); 4-(ジイソプロピルトリアゼニル)アセトフェノン 25:
混合物中に溶解する。反応液を0℃に冷却し、次いで520mg(7.54mmol, 1.02eq)
の亜硝酸ナトリウムを含む1mlの水を加える。30分の撹拌の後、反応液を、0℃で
、8gの炭酸カリウム及び8.17ml(5.82mmol, 7.8eq)のジイソプロピルアミンを
含む50mlの水で構成される溶液に慎重に加える。該温度で30分間撹拌を持続し、
次いで反応液を50mlの水で加水分解し、水相を50mlのエチルエーテルで4回抽出
する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させて残渣を得
、これをシリカゲル60H上のクロマトグラフィー(AcOEt/ヘキサン:2/8)にかけ
て1.18gの黄色粉末を収率64%で得る。 実験式:C14H21N3O2 MW:247.33g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:9/1):0.40;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.92(d, J3-4=8.6Hz, 2H, H3); 7.44(d, J4-3=8.6Hz
, 2H, H4); 5.33(bs, 1H, H6); 4.03(bs, 1H, H6); 2.57(s, 3H, H3); 1.37(bd,
6H, H7); 1.24(bd, 6H, H7);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ197.17(1C, C1); 155.32(1C, C5); 133.11(1C, C 2 ); 129.30(2C, C3); 119.82(2C, C4); 49.17(1C, C6); 46.17(1C, C6); 26.23(
1C, C8); 23.63, 19.11(4C, C7); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:248(100, [M+1]+); 1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゼン 26 :
含む30mlのTHFの溶液を、-78℃で、1.03eqのLDAに滴下にて加える。後者は、5.1
7mlのジイソプロピルアミン(36.9mmol, 1.06eq)及び22.4mlのヘキサン中1.6M
BuLi(35.9mmol, 1.03eq)を含む38.5mlのTHFから0℃で生成する。反応液を-78
℃で1時間撹拌し、次いで5.04mlのジエチルクロロホスフェート(34.9mmol, 1eq
)を滴下にて加え、混合物を室温に加熱する。3時間の撹拌の後、該液を2.25eq
のLDAに加える。後者は11mlのジイソプロピルアミン(78.5mmol, 2.25eq)及び4
9mlのヘキサン中1.6M BuLi(78.5mmol, 2.25eq)を含む80mlのTHFから0℃で生成
する。反応液を一晩静置し、その間温度は緩やかに上昇する。丸底フラスコを0
℃に冷却し、4.86mlのトリメチルシリルクロリド(38.3mmol, 1.1eq)を加え、1
5分間撹拌を持続し、次いで混合物を100mlの水で加水分解する。水相を100mlの
エチルエーテルで3回抽出し、該有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過
し、次いで蒸発させる。得られた残渣をシリカゲル60H上のフラッシュクロマト
グラフィー(純粋なヘキサン)で精製し、58%の収率で6.08gの1-(ジイソプロピ
ルトリアゼニル)-4-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゼンを得る。 実験式:C17H27N3Si MW:301g/mol TLC:Rf(ヘキサン):0.30;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.40(d, J2-3=8.5Hz, 2H, H2); 7.32(d, J3-2=8.5Hz
, 2H, H3); 5.33(bs, 1H, H8); 4.03(bs, 1H, H8); 1.29(bs, 12H, H9); 0.24(s
, 9H, H7);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ151.45(1C, C1); 132.42(2C, C2); 119.82(2C, C 3 ); 118.66(1C, C4); 105.72(1C, C6); 93.05(1C, C5); 48.13, 46.17(2C, C8);
23.80, 19.11(4C, C9); -0.15(3C, C7); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:302(100, [M+1]+); 1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-エチニルベンゼン 27:
ゼン(19.9mmol, 1eq)を100mlのMeOHに溶解し、13.7gのK2CO3(99.5mmol, 5eq
)を少量ずつ加える。反応液を室温で15時間撹拌し、次いで蒸発乾固させ、100m
lの水及び100mlのEtOAcに溶解する。水相を50mlのEtOAcで4回抽出し、その後有
機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、96%の収率で4.38
gの1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-エチニルベンゼンを得る。 実験式:C14H19N3 MW:229g/mol TLC:Rf(純粋なヘキサン):0.30;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.46(d, J2-3=8.6Hz, 2H, H2); 7.37(d, J3-2=8.6Hz
, 2H, H3); 5.33(bs, 1H, H8); 4.03(bs, 1H, H8); 3.06(s, 1H, H7); 1.29(bs,
12H, H9);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ151.75(1C, C1); 132.57(2C, C2); 119.95(2C, C 3 ); 117.56(1C, C4); 84.14(1C, C5); 76.28(1C, C6); 48.68, 45.75(2C, C8);
23.61, 19.28(4C, C9); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:230(100, [M+1]+); メチル 2-ヨード-4-トリメチルシリルエチニルベンゾエート 28:
を50mlのTHFに溶解し、次いで2.17gのN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド(EDC)(11.3mmol, 1.5eq)及び1.52gのヒドロキシベンゾトリ
アゾール(HOBT)(11.3mmol, 1.5eq)を加え、最後に18mlのMeOHを滴下にて加
える。反応液を室温で4時間撹拌し、次いで蒸発乾固させ、50mlの水及び50mlのE
tOAcに溶解する。有機相を25mlの5%KHSO4水溶液、25mlの5%NaHCO3水溶液及び2
5mlの飽和NaCl水溶液で洗浄する。続いて有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、
ろ過し、次いで蒸発させ、2.93gの黄色オイルを得る(収率:定量的)。これを
さらに精製することなく次の工程に使用する。 実験式:C13H15O2ISi MW:357.9g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:9/1):0.46;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ7.91(d, J4-6=8.0Hz, 1H, H4); 7.87(d, J7-6=2.1Hz
, 1H, H7); 7.18(dd, J6-7=2.1Hz, J6-4=8.0Hz, 1H, H6); 3.91(s, 3H, H11); 0
.23(s, 9H, H10);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ165.86(1C, C1); 141.05(1C, C4); 134.99; 133.
90(2C, C6, C7); 134.78(1C, C2); 123.10(1C, C5); 102.61(1C, C3); 96.60(1C
, C9); 93.83(1C, C8); 52.31(1C, C11); -0.44(3C, C10); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:376(100, [M+18]+); メチル 2-(4-トルイソプロピルトリアゼニルフェニルエチニル)-5-トリメチル
シリルエチニルベンゾエート 29:
l, 0.01eq)及び132mgのヨウ化銅(3.76mmol, 0.02eq)を加える。反応液を15分
間撹拌し、次いで430mgの28(1.88mmol, 1eq)を含む7mlのTHFを滴下にて加える
。室温で15時間撹拌を持続する。蒸発乾固後、残渣をシリカゲル60H上(ヘキサ
ン/EtOAc:97/3)で精製し、79%の収率で683mgのレモンイエロー粉末を得る。
実験式:C27H33N3O2Si MW:459g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:9/1):0.28;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ8.06(s, 1H, H3); 7.34-7.57(m, 6H, H5, H6, H11,
H12); 5.27(bs, 1H, H14); 3.96(s, 4H, H14, H19); 1.31(bs, 12H, H15); 0.25
(s, 9H, H18);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ165.84(1C, C1); 151.78(1C, C13); 134.28; 133
.85; 133.45; 132.99(4C, C3, C5, C6); 132.99(2C, C11); 131.36(1C, C2); 12
3.80; 122.16(2C, C7, C10); 102.08(2C, C12); 118.54(1C, C4); 103.47(1C, C 17 ); 97.21; 96.83(2C, C8, C9); 87.69(1C, C16); 52.02(1C, C19); 48.88, 45
.97(2C, C14); 23.72; 19.16(4C, C15); -0.36(3C, C18); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:460(100, [M+1]+); メチル 2-(4-ヨードフェニルエチニル)-5-トリメチルシリルエチニルベンゾエ
ート:
入れる。反応液を120℃で72時間加熱し、次いで蒸発乾固させる。残渣を20mlの
エチルエーテルに溶解し、ろ過し、蒸発させて収率96%で2.2gの黄色オイルを得
る。 実験式:C21H19O2SiI MW:458g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:9/1):0.38;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ8.06(s, 1H, H3); 7.68(d, J11-12=8.0Hz, 2H, H12)
; 7.54(s, 2H, H3, H5); 7.26(d, J11-12=8.0Hz, 2H, H11); 3.93(s, 3H, H17);
0.25(s, 9H, H16);13 C NMR(75.47MHz, CDCl3):δ165.51(1C, C1); 137.36(2C, C12); 134.40; 133
.87; 133.59(3C, C3, C5, C6); 132.97(2C, C11); 131.54(1C, C2); 122.95(2C,
C7, C10); 122.38(1C, C4); 103.21(1C, C15); 97.35; 94.96(2C, C8, C9); 89
.19(13C, C14); 94.54(1C, C13); 52.08(1C, C17); -0.40(3C, C16); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:459(59, [M+1]+); 476(100, [M+18]+); 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 5-エチニル-2-(4-ヨードフェニルエチニル)
ベンゾエート 30:
ベンゾエートを塩基を含むメタノールで処理する;68mgの5-エチニル-2-(4-ヨー
ドフェニルエチニル)安息香酸(0.18mmol, 1eq)を3mlのTHFに溶解し、次いで25
mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(0.22mmol, 1.2eq)及び13mgのジメチルアミ
ノピリジン(0.10mmol, 0.55eq)を加える。反応液を0℃に冷却し、次いで45mg
のジシクロヘキシルカルボジイミド(0.22mmol, 1.2eq)を含む1mlのCH2Cl2の溶
液を滴下にて加える。15の間撹拌を持続しながら、温度を緩やかに上昇させる。
続いて反応液をろ過し、次いで蒸発させて残渣を得、これをシリカゲル上のクロ
マトグラフィーで精製する。生成物をEtOAcで1回洗浄し、60%の収率で50mgの淡
黄色固体を得る。 実験式:C21H12O4NI MW:469g/mol TLC:Rf(ヘキサン/EtOAc:60/40):0.5;1 H NMR(300MHz, CD3OD):δ8.03(s, 1H, H3); 7.44-7.50(m, 4H, H5, H6, H12);
7.06(d, J11-12=8.2Hz, 2H, H11); 3.22(s, 1H, H16); 2.74(s, 4H, H18); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:470(9.8, [M+1]+); 477(100, [M+18]+); メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-[2-(2-(2-[5-エチニ
ル-2-(4-ヨードフェニルエチニル)ベンゾイルアミノ]エトキシ)エトキシ)エトキ
シ]アセチルアミノ)ヘキサノエート 31b:
(1.8mmol, 10eq)の溶液を88mgの21b(0.18mmol, 1eq)を含む2mlのCH2Cl2溶液
に滴下にて加える。反応液を室温にて4時間撹拌し、次いで蒸発乾固させる。得
られた残渣をシリカゲル60H(CH2Cl2/MeOH:97/3)上のクロマトグラフィーにか
けて40%の収率で60mgの黄色がかったオイルを得る。 実験式:C38H46O11N3I MW:847g/mol TLC:Rf(MeOH/CH2Cl2:1/9):0.47;1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ8.00(s, 1H, H27); 7.70(d, J32-31=8.2Hz, 2H, H32 ); 7.50(bs, 3H, H24, H25, H20); 7.26(d, J31-32=8.2Hz, 2H, H31); 6.61(bt,
1H, H9); 3.88(s, 2H, H13); 3.16-3.70(m, 25H, H7, H10, H11, H14, H15, H1 6 , H17, H18, H19); 3.16-3.25(m, 4H, H2, H6, H35); 1.41-1.69(m, 6H, H3, H 4 , H5); MS(70eV/DCI/NH3/強度 %):m/e:848(7, [M+1]+); C30H42N3O11Iの微量分析: 計算値:C, 53.84; H, 5.46; N, 4.95; O, 20.76; I, 14.97 実測値:C, 52.62; H, 5.84; N, 4.98 実施例4:Ni-NTA錯体によって官能基化された分子ロッドへのHis標識タンパ
クの結合 酵母RNAポリマラーゼのABC23-(His)6サブユニットの、ニッケル-NTA錯体によ
って官能基化されたポリマーP0への結合を研究した。浸透クロマトグラフィー(
chromatographie de permeation)による研究は、“ヒスチジン-標識化”タンパ
クの該ポリマーへの特異的な結合を実証することを可能にした。実際に、タンパ
クの溶離はポリマーの存在下で促進される。いくつかのタンパクは、それ自身が
ポリマーに結合してより大きな分子タンパク複合体を形成する。さらに、非標識
ABC23タンパクはポリマーP0への結合がほとんど又は全く見られないようである
ことから、該結合はニッケルとポリヒスチジン標識との間の相互作用によって誘
発される。
-His6タンパクの溶液(10mMトリスバッファー、150mM NaCl中3.2mg/ml)の5μl
、ABC23タンパクの溶液(10mMトリスバッファー、150mM NaCl中2.3mg/ml)の7μ
l又はトリスバッファー(10mM、pH8)の5μlのいずれかに加える。撹拌せずに18
時間後、溶液の体積をトリスバッファー(10mM、pH8)の添加によって50μlに調
整し、全混合物をSmart(登録商標)システムの50μlインジェクションループに
注入する。
10mM、pH8;150mM NaCl)を用いた溶離)を使用した浸透クロマトグラフィー(c
hromatographie de permeation)による、酵母RNAポリメラーゼのABC23-(His)6
のポリマーP0への結合の研究。
クの電子顕微鏡観察 ニッケル-NTA錯体によって官能基化されたポリマーP0へのホスファターゼ-(Hi
s)6の結合を浸透クロマトグラフィー(chromatographie de permeation)で研究
した。形成された超分子物体の構造を電子顕微鏡で観察する。タンパクの線状凝
集体の形成がみとめられた。
10mM、pH8;150mM NaCl)を用いた溶離)上での浸透クロマトグラフィー(chrom
atographie de permeation)による精製の後、5μlの溶液を、真空下にて20mAの
電流で前もって放電され、炭素フィルムでコートされた電子顕微鏡のグリッド上
に置く。次いで該グリッドを酢酸ウラニル溶液で陰性染色し、電子顕微鏡で観察
する。
20 透過型電子顕微鏡で45,000倍に拡大し、写真をKODAK SO163に記録する。
行の形態、具体例及び応用の形態に何ら制限されず、一方で、本発明は、本発明
の枠組み又は範囲から逸脱することなく、当業者の想像するこれらの全ての変化
形を包含する。
記述図である。
ステム)として使用する、Superose(登録商標)6カラム上の浸透クロマトグラフィ
ーによる、イーストRNAポリメラーゼのABC23-(His)6を本発明に記載の分子ロッ
ドへ結合させる研究を説明する図である。
Claims (12)
- 【請求項1】 下記一般式I: 【化1】 ここで: Pは、下記式に示されているような、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレ
ン、ポリフェニレンエチニレン、及びポリビニレンを含む群から選択されるポリ
マーである: 【化2】 *GpFへの結合 ここで: Aは水素原子又は次の基の1つである:アルキル、OH、O-アルキル、NH2、NH-ア
ルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル; GpF(官能基)は基B-Rであり、ここで: − B(結合アーム)は必要に応じてアルキル基で置換され、不飽和の単位又は
ポリオキシエチレン単位を有する又は有しない、及び、鎖の中心にフォスフェー
ト基を有する又は有しないC1-C10炭化水素基から選択され、下記のようなもので
ある: 【化3】 ここで: mは1から10の整数であり、及び XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHであり、前記炭化水素基の末端で
、エステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの有機カップリング基を
構成する;及び − Rは正又は負に電荷をおびた基;配位子又は生物学的マクロ分子の類似体
;又はアミノ酸若しくは核酸と相互作用する有機金属錯体、その配位子は必要に
応じて、Eに結合するためにアルキル基により官能基化されている、から選択さ
れる親水性基である; nは5〜1000の整数; pは0〜10の整数;及び E(スペーサーセグメント)は、Pによって形成された骨格の硬い構造を妨げない
性質の化学単位であり、フェニレン、エチニレン又はビニレン単位、又は下記式
に示されているような、これら単位の組み合わせである: 【化4】 ここでAは水素原子又は次の基の1つである:アルキル、OH、O-アルキル、NH2
、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル、 により表される構造を有することを特徴とする分子ロッド。 - 【請求項2】 下記一般式IIを有することを特徴とする、請求項1に記載の
分子ロッド: 【化5】 ここで: p=0:Eなし; Pは上記で定義されたような基bである; GpFは、m=3、基Xの1つがNHCOであり、もう1つがCH2である上記で定義されたよ
うな基fにより表される基B、及び、ニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)
により表される基Rを含む;及び nは5〜1000の整数である。 - 【請求項3】 下記一般式IIIを有することを特徴とする、請求項1に記載の
分子ロッド: 【化6】 ここで: mは1〜10の整数である; pは0〜10の整数である; Pは上記で定義されたような基bである; GpFは2つの基Xが同一であり、NHCOである、上記で定義されたような基hにより
表される基B、及び、配位子NTAがC4アルキル基により官能基化されているニッケ
ルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基Rを含む;及び nは5〜1000の整数である。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれかに記載の分子ロッドと、溶液中の生物
学的マクロ分子を、少なくとも15分間、好適な温度及びpH条件下でインキュベー
トすることを本質的に含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び/
又は自動組織化の方法。 - 【請求項5】 前記生物学的マクロ分子は、特に可溶な膜若しくは貫膜タン
パク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸であることを特徴とする、請求
項4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記溶液は、前記生物学的マクロ分子を溶かすための水性又
は水性-アルコール性溶媒からなり、必要に応じて少なくとも1つの洗剤(deterge
nt)を含むことを特徴とする、請求項4又は請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 インキュベーション条件は好ましくは次のようである:室温
で、15分〜48時間、pH 5.5〜8.5でのインキュベーション、ことを特徴とする、
請求項4〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 生物学的マクロ分子が非共有様式で結合している、請求項1
〜3のいずれかに記載の分子ロッドからなることを特徴とする超分子物体。 - 【請求項9】 表面で、生物学的マクロ分子が結晶形で自動組織化している
、請求項1〜3のいずれかに記載の分子ロッドからなることを特徴とする超分子物
体。 - 【請求項10】 請求項8又は請求項9に記載の超分子物体の、それと結合し
ているマクロ分子の構造研究への応用。 - 【請求項11】 請求項8又は請求項9に記載の超分子物体の、生物学的試薬
としての応用。 - 【請求項12】 請求項8又は請求項9に記載の超分子物体の、バイオセンサ
ー又はバイオ伝導体としての応用。
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