DE69925120T2

DE69925120T2 - Molekülstäbe und ihre Anwendungen

Info

Publication number: DE69925120T2
Application number: DE69925120T
Authority: DE
Inventors: Fabrice Balavoine; Charles Mioskowski; Patrick Schultz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: JP2002516914A; FR2778918A1; WO1999061912A1; EP1080368A1; US6403705B1; DE69925120D1; JP4521582B2; EP1080368B1; FR2778918B1; AU3830799A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Molekülstäbe, ihre Anwendungen in einem Verfahren zur Fixierung und/oder Kristallisation von Makromolekülen, auf die so erhaltenen Produkte, sowie auf Anwendungen dieser Produkte auf dem Gebiet der Materialien und der strukturellen Biologie, insbesondere als Biosensoren oder als Biomaterialien.
Die Kenntnis der Struktur der Proteine und insbesondere ihrer aktiven Stellen ist für das Verständnis ihres Wirkmechanismus wesentlich. Zur Durchführung solcher Studien hat man mehrere Verfahren zur Verfügung: Röntgenstrahlen, NMR, Elektrokristallographie (2D-Kristallisation).
Um die genannte Kristallisation in geeigneter Weise durchzuführen, erlaubt die zweidimensionale Kristallisation auf einer Lipidmonoschicht oder einem Lipidfilm an der Grenzfläche Luft/Wasser (E. E. Ugziris et al., Nature, 1983, 301, 125–129) die Bildung von selbstorganisierten Systemen aus biologischen Makromolekülen (Kristallen) und die Bestimmung der Strukturen dieser Moleküle durch Analyse der erhaltenen Kristalle mittels Elektronenmikroskopie.
Dieses Verfahren besteht darin, eine Lipidmonoschicht auf dem Niveau einer Grenzfläche Luft/Flüssigkeit zu bilden, wobei die Lipide so ausgewählt sind, dass sie mit den in der Lipidphase vorliegenden Proteinen wechselwirken, die sich auf den Lipiden fixieren und dann ein organisiertes Netz bilden.
Die Fixierung der Proteine auf den Lipiden der Monoschicht spielt bei chemischen Wechselwirkungen auf der Ebene des polaren Kopfs der Lipide eine Rolle. Diese Wechselwirkungen sind entweder aspezifisch, wobei die Lipide geladene polare Enden besitzen, die zu einer Kristallisation durch ionische Wechselwirkungen führen, oder spezifisch. In diesem letzten Fall trägt der polare Kopf der Lipide Liganden, die eine starke Affinität zu den zu fixierenden Proteinen zeigen.
Es konnte insbesondere gezeigt werden, dass lösliche Proteine an Lipidfilmen, die geladen sind, oder durch einen Liganden des untersuchten Proteins funktionalisiert sind, zweidimensional kristallisieren können (F. J. Jap et al., Ultramicroscopy, 1992, 46, 45–84).
In jüngerer Zeit ermöglichten durch Metallkomplexe, wie Nickelkomplexe (E. W. Kubalek et al., J. Struct. Biol., 1994, 113, 117–123), funktionalisierte Komplexe die Kristallisation von sogenannten Histidin-markierten Fusionsproteinen. Diese Proteine besitzen tatsächlich an ihrem N- oder C-terminalen Ende eine Sequenz, die aus mehreren Histidinen besteht. Es konnte gezeigt werden, dass die Fixierung solcher Proteine auf dem Nickel-Lipid aus einer starken Wechselwirkung zwischen dem Nickelkomplex und der Poly-Histidin-Sequenz resultierte (C. Vénien-Brian et al., J. Mol. Biol., 1997, 274, 687–692). Mit solchen funktionalisierten Lipiden konnte man insbesondere in dem Fall, in dem kein geeigneter Ligand zur Verfügung stand, eine Kristallisation erreichen.
Jedenfalls zeigt die Kristallisation der Proteine auf Lipidfilmen den Nachteil, dass sie relativ zufallsbedingt ist und von zahlreichen Faktoren abhängt, die schwer gleichzeitig zu beherrschen sind:

– der von den Lipiden getragene Ligand muss ausreichend zugänglich sein, um mit den Proteinen zu wechselwirken. Diese Zugänglichkeit hängt von der Länge des Spacerarms zwischen dem Lipid und dem Ligand ab: zu kurz, so findet eine Penetration des Proteins in das Innere der Lipidschicht statt; zu lang, dann verleiht er dem gebundenen Protein einen zu hohen Freiheitsgrad und erhöht das Auftreten von Fehlerstellen im Kristall;
– die Lipidmonoschicht muss ausreichend fluid sein, um dem gebundenen Protein eine ausreichende Beweglichkeit in seitlicher Richtung und eine ausreichende Drehmobilität zu verleihen, was es den Proteinen erlaubt, sich untereinander zu organisieren und intermolekulare Kontakte zu entwickeln, was zur Entstehung des Kristalls führt;
– eine andere Schwierigkeit, die der Kristallisation auf Lipidmonoschicht eigen ist, betrifft die Stabilität der Monoschicht; in der Tat ist die Stabilität der Grenzfläche Luft/Flüssigkeit schwer kontrollierbar. Außerdem muss die Lipidmonoschicht stabil bleiben, und zwar nicht nur vor der Fixierung der Proteine, sondern auch nach ihrer Fixierung, um so die räumliche Organisation der Proteine zuzulassen;
– zur mikroskopischen Untersuchung, die auf die Kristallisationsstufe folgt, ist es erforderlich, eine Vielzahl von Flächen zu realisieren, und zwar infolge der ebenen Natur der erhaltenen Struktur.

Folglich haben sich die Erfinder die Aufgabe gestellt, Strukturen bereitzustellen, die im Folgenden Molekülstäbe genannt werden, die für die Fixierung und die Kristallisation von biologischen Makromolekülen in Lösung angepasst sind, sowie ein Verfahren bereitzustellen, das die Fixierung der genannten biologischen Makromoleküle in Lösung und gegebenenfalls eine Induktion einer Selbstorganisation der genannten biologischen Makromoleküle erlaubt und das den Anforderungen der Praxis besser genügt als die früher verwendeten Verfahren der 2D-Kristallisation.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Molekülstäbe, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur aufweisen, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
in der:
P ein Polymer darstellt, das aus der Gruppe, bestehend aus Polyphenylenen, Polyphenylenvinylenen, Polyphenylenethinylenen und Polyvinylenen, wie sie in den folgenden Formeln dargestellt sind, ausgewählt ist:
worin:
A ein Wasserstoffatom oder eine der folgenden Gruppen: Alkyl, OH, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, CO₂H, CO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl darstellt;
GpF (funktionelle Gruppe) eine Gruppe B-R darstellt, in der:

– B (Bindungsarm) ausgewählt ist aus C₁-C₁₀-Kohlenstoffketten, gegebenenfalls substituiert durch Alkylgruppen, enthaltend Unsättigungen oder nicht, oder Polyoxyethylengruppierungen, die in der Kettenmitte Phosphatgruppen aufweisen können oder nicht, wie z.B.
in denen: m eine ganze Zahl zwischen 1 bis 10 darstellt, X für O, NHCO, OCO, COO, CONH, S, CH₂ oder NH steht und an den Enden der genannten Kohlenstoffketten organische Verankerungsfunktionen des Ester-, Amid-, Ether-, Thioether-Typs bildet;
– R eine hydrophile Gruppe darstellt, die aus positiv oder negativ geladenen Gruppen; Liganden oder Analoga biologischer Makromoleküle, wie z.B., aber nicht beschränkt auf, Biotin, Novobiocin, Retinoesäure, Steroide und Antigene; metallorganischen Komplexen, die mit Aminosäuren oder Nucleinsäuren wechselwirken, wie z.B. die Komplexe von Kupfer, Zink, Nickel, Kobalt, Chrom, Platin, Palladium, Eisen, Ruthenium oder Osmium, mit Liganden, wie IDA, NTA, EDTA, Bipyridin oder Terpyridin, wobei die Liganden gegebenenfalls durch Alkylgruppen zur Bindung an E (auf der Ebene von X) funktionalisiert sind, ausgewählt ist; unter positiv geladenen oder negativ geladenen Gruppen versteht man in nicht-beschränkender Weise: Ammonium, Carboxylate, Phosphate, Sulfonate; man kann z.B. die folgenden Gruppen nennen: -N(CH₃)₃ ⁺ oder -CO₂ ^–. n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 darstellt; p eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 darstellt; und E (Spacer) einen chemischen Rest darstellt, dessen Natur die starre Struktur des Skeletts, das durch P gebildet wird, nicht stört und eine Phenylen-, Ethinylen-, Vinylengruppierung oder die Kombination dieser Gruppierungen, wie z.B. Phenylen-Ethinylen, wie es in der folgenden Formel dargestellt ist, darstellt:
worin A ein Wasserstoffatom oder eine der folgenden Gruppen: Alkyl, OH, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, CO₂H, CO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl darstellt.

Die verschiedenen P, wie sie oben definiert sind, bilden mit GpF und E die folgenden Formeln:
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Alkyl: lineare oder verzweigte oder gegebenenfalls substituierte C₁-C₆-Alkylgruppen.
Die Substituenten der C₁-C₁₀-Kohlenstoffketten, die B darstellen, sind insbesondere unter den C₁-C₆-Alkylgruppen ausgewählt.
Polymere, deren Skelett eine große Zahl von Konjugationen aufweist (Polyphenylen; Polyphenylenvinylen; Polyphenylenethinylen), wurden bereits beschrieben (Angew. Chem. Int. Ausg. 1998, Bd. 37, S. 402–428) und werden wegen ihrer elektronischen Eigenschaften und ihrer Fluoreszenzeigenschaften in der nicht-linearen Optik eingesetzt (Macromolecules, 1994, 27, 562–571 und J. Phys. Chem., 1995, 99, 4886–4893).
Die Polymere gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch GpF-Gruppen funktionalisiert, die in Verbindung mit dem Element E dem erfindungsgemäßen Molekülstab besondere Eigenschaften verleihen:

– er ist linear, starr und in wässrigen Medien löslich,
– er ist regelmäßig durch Gruppen, die eine sehr starke Affinität für die biologischen Makromoleküle haben, funktionalisiert und
– wenn er mit einem biologischen Makromolekül in Lösung gebracht wird, ist er zur Fixierung und/oder Selbstorganisation der Makromoleküle auf dem Stab durch molekulare Erkennung besonders geeignet.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Molekülstäbe ist in 1 dargestellt:

P: bildet ein Polymerskelett, das starr und im Ganzen linear sein muss, damit es den Charakter eines Molekülstabs hat;
E: erlaubt es, den Abstand L2 zwischen den funktionellen Gruppen GpF zu kontrollieren, während der Bindungsarm B von GpF es erlaubt, den Abstand L1 zwischen der Gruppe R und der Achse des Polymers zu kontrollieren, wie es in 2 dargestellt ist.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Molekülstäbe weisen sie die folgende allgemeine Formel II auf
in der:
p = 0:Fehlen von E,
P die Gruppe b, wie sie oben definiert wurde, darstellt;
GpF eine Gruppe B umfasst, die durch eine Gruppe f, wie sie oben definiert wurde, dargestellt wird, wobei m = 3, eines der X für NHCO steht und das andere X für CH₂ steht und eine Gruppe R für einen metallorganischen Komplex auf der Basis von Nickel (Ni-NTA-Komplex) steht, und
n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 darstellt.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Molekülstäbe weisen sie die folgende allgemeine Formel III auf:
in der:
m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 darstellt,
p eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 darstellt,
P die Gruppe b, wie sie oben definiert ist, darstellt,
GpF umfasst eine Gruppe B, die durch eine Gruppe h, wie sie oben definiert ist, dargestellt wird, in der die zwei X identisch sind und für NHCO stehen, verbunden mit einer Gruppe R, die für einen metallorganischen Komplex auf der Basis von Nickel (Ni-NTA-Komplex) steht, dessen Ligand NTA durch eine C₄=(CH₂)₄-Alkylgruppe funktionalisiert ist, und
n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 darstellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Fixierung und/oder Selbstorganisation von biologischen Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen die Inkubation eines biologischen Makromoleküls in Lösung mit einem Molekülstab, wie er vorstehend definiert ist, während 15 Minuten unter zweckdienlichen Temperatur- und pH-Bedingungen umfasst.
Nach Fixierung und/oder Selbstorganisation der Makromoleküle erhält man ein supramolekulares Objekt.
In dem Verfahren der Selbstorganisation gemäß der Erfindung wird sich das erhaltene supramolekulare Objekt gegebenenfalls zu einem spiralförmigen Kristall aus biologischen Makromolekülen um den Molekülstab entwickeln können.
Ein derartiges Verfahren ist insbesondere zur Kontrolle der spiralförmigen Kristallisation der biologischen Makromoleküle um die Molekülstäbe geeignet.
Überraschenderweise erlauben die erfindungsgemäßen Molekülstäbe die Fixierung von biologischen Makromolekülen in Lösung und gegebenenfalls eine Induzierung einer Selbstorganisation, bieten wichtige Anwendungen auf den Gebieten der Nanomaterialien oder der strukturellen Biologie:

– Fixierung von biologischen Makromolekülen auf den Molekülstäben, wobei die Orientierung dieser Fixierung kontrolliert wird oder nicht;
– Kontrolle der spiralförmigen Kristallisation der biologischen Makromoleküle um Molekülstäbe;
– Strukturuntersuchung der biologischen Makromoleküle durch Analyse der erhaltenen spiralförmigen Kristalle mit einem Elektronenmikroskop.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens sind die biologischen Makromoleküle insbesondere lösliche, Membran-, Transmembran-Proteine, Enzyme, Antikörper, Antikörperfragmente oder Nucleinsäuren.
Nach einer anderen Ausführungsform des Verfahrens wird die Lösung durch ein Lösungsmittel zur Solubilisierung der biologischen Makromoleküle, das wässrig oder wässrig-alkoholisch ist und gegebenenfalls mindestens ein Detergens enthält, gebildet, und zwar als Funktion des zu kristallisierenden biologischen Makromoleküls.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens sind die Inkubationsbedingungen vorzugsweise die Folgenden: Inkubation bei Umgebungstemperatur für 15 Minuten bis 48 Stunden bei einem pH zwischen 5,5 und 8,5.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von löslichen Proteinen anwendbar.
Die Bildung eines spiralförmigen Kristalls aus einem biologischen Makromolekül, wie einem Protein, auf einem Molekülstab ist das Resultat einer perfekten Übereinstimmung zwischen den Abmessungen des Makromoleküls (Durchmesser) und den Parametern des Stabs (Abstände L1 und L2 und Länge des Molekülstabs). Der Abstand L1 stellt den Abstand zwischen der Gruppe R und der Achse des Polymers dar. Der Abstand L2 stellt den Abstand zwischen zwei Gruppen R dar. Die Länge des Molekülstabs ist zum Polymerisationsgrad des Polymers äquivalent (siehe 2).
Überraschenderweise ermöglicht das Verfahren den Erhalt von Anordnungen biologischer Makromoleküle, die die Strukturuntersuchungen durch Elektronenmikroskopie oder auch die Herstellung neuer Nanomaterialien, die wegen ihrer physikalischen, elektrischen oder biologischen Eigenschaften einsetzbar sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst folglich die Herstellung einer Bibliothek von Molekülstäben, in denen die Abstände L1 und L2 variabel sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein supramolekulares Objekt, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Molekülstab, wie er oben definiert wurde, besteht, auf dem biologische Makromoleküle in nicht-kovalenter Art fixiert sind oder in kristalliner Form organisiert sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem Anwendungen des supramolekularen Objekts für die Strukturuntersuchung der Makromoleküle, die mit ihm assoziiert sind, als biologisches Reagens und insbesondere als immunologisches Reagens und als Biosensoren oder Bioleiter.
Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung auch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, welche sich auf Durchführungsbeispiele des Verfahrens, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, sowie auf die beigefügten Zeichnungen bezieht; unter diesen:
– stellt 1 eine schematische Darstellung eines Elements eines erfindungsgemäßen Molekülstabs dar;
– stellt 2 einen erfindungsgemäßen Molekülstab dar;
– stellt 3 ein Schema der Bildung eines spiralförmigen Kristalls aus biologischen Makromolekülen auf einem Molekülstab dar;
– veranschaulicht die 4 die Untersuchung der Fixierung von ABC23-(His)₆ der Hefe-Polymerase-RNA auf einem erfindungsgemäßen Molekülstab durch Permeationschroma togaphie an einer Superose^® 6-Säule bei Elution mit einem Tris-Puffer (10 mM, pH 8; NaCl 150 mM) (Smart^®-System);
– stellt 5 ein Photo eines erfindungsgemäßen Molekülstabs dar.
Es muss jedenfalls selbstverständlich sein, dass diese Beispiele allein zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung gegeben werden, für den sie keinerlei Beschränkung darstellen.
Beispiel 1: Herstellung eines biotinylierten Molekülstabs für die Fixierung von Streptavidin
Zum Zweck der Fixierung und der Kristallisation von Streptavidin oder einem Fusions-Streptavidin wurde ein Poly(phenylenethinylen)-Polymer, das durch Biotine funktionalisiert ist, hergestellt.
Bedingungen:

a. TMSA, PdCl₂(PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH, c. NHS, DCC, THF; d. H₂N(CH₂)₃-NHBoc, CH₂Cl₂, TEA; e. PdCl₂(PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; f. TFA, CH₂Cl₂; g. Biotin-NHS, DMF, TEA.

Versuchsprotokolle: (3-Aminopropyl)carbamidsäure-t-butylester
VERFAHRENSWEISE
Bei 0°C werden 2,6 g t-Butylbicarbonat (11,9 mmol, 0,1 Äq.) in Lösung in 10 ml MeOH tropfenweise zu 10 ml Propandiamin (120 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 40 ml MeOH gegeben. Über 15 h wird ein Rühren bei Umgebungstemperatur aufrecht erhalten, dann wird das Reaktionsmedium eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser und 50 ml CH₂Cl₂ aufgenommen, die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet, filtriert, dann eingedampft, wodurch 1,8 g eines farblosen Öls resultieren (Ausbeute: 87%/Boc₂O), das ohne weitere Reinigung in den späteren Stufen eingesetzt wird.
Summenformel: C₈H₁₈O₂N₂ MG: 174 g/mol
DSC: Rf(CH₂Cl₂/MeOH/TEA : 69/30/1): 0,26;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 4,92 (s1, 1H, H₂); 3,16 (tt, J_3-4 = 6,6 Hz, J_3-2 = 7,2 Hz, 2H, H₃); 2,73 (t, J_5-4 = 6,6 Hz, 2H, H₅); 1,57 (tt, J_4-3und4-5 = 6,6 Hz, 2H, H₄); 1,41 (s, 9H, H₈); 1,17 (s1, 2H, H₆);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 155,88 (1C, C₁); 78,73 (1C, C₇); 39,42 (1C, C₅); 38,15 (1C, C₃); 33,16 (1C, C₄); 28,15 (3C, C₈);
MS (70eV/DCI/NH3/%Intensität: m/e: 175 (100, [M + 1]⁺); 192 (10, [M + 18]⁺);
[3-(5-Ethinyl-2-iodbenzoylamino)propyl]carbamidsäure-t-butylester:
VERFAHRENSWEISE
174 mg (3-Aminopropyl)carbamidsäure-t-butylester (1 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 7 ml CH₂Cl₂ und 0,5 ml Trimethylamin werden zu 369 mg 2-Iod-5-ethinylbenzoat von 2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl (1 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 7 ml CH₂Cl₂ gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Umgebungstemperatur während 48 h gerührt, dann eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel 60H gereinigt (Hexan/EtOAc: 1/1), wodurch 416 mg eines weißen Feststoffs in einer Ausbeute von 97% erhalten werden.
Summenformel: C₁₇H₂₁O₃N₂ MG: 428 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc: 1/1): 0,40;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,80 (d, J_12-13 = 8,2 Hz, 1H, H₁₂); 7,46 (d, J_15-13 = 2,0 Hz, 1H, H₁₅); 7,17 (dd, J_13-12 = 8,2 Hz, J_13-15 = 2,0 Hz, 1H, H₁₃); 6,55 (s1, 1H, H₂); 4,92 (s1, 1H, H₆); 3,48 (tt, J_3-4 = 6,2 Hz, J_3-2 = 6,0 Hz, 2H, H₃); 3,27 (tt, J_5-4 = 5,7 Hz, J_5-6 = 6,4 Hz, 2H, H₅); 1,70–1,78 (m, 2H, H₄); 1,41 (s, 9H, H8);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 166,70 (1C, C₁); 156,44 (1C, C₇); 142,38 (1C, C₁₀); 139,63, 133,74 (2C, C₁₂, C₁₃); 131,05 (1C, C₁₅); 122,22 (1C, C₁₄) ; 92,81 (1C, C₁₁); 81,62 (1C, C₁₆); 79,26 79,17 (2C, C₁₇, C₇) ; 37,07,36,42 (2C, C₅, C₃); 29,83 (1C, C₄); 28,14 (3C, C₈);
MS(70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 429 (26, [M + 1]⁺); 446 (100, [M + 18]⁺);
Polymerisation von [3-(5-Ethinyl-2-iod-benzoylamino)propyl]carbamidsäure-t-butylester:
VERFAHRENSWEISE
350 mg [3-(5-Ethinyl-2-iod-benzoylamino)propyl]carbamidsäure-t-butylester (0,81 mmol, 1 Äq.) werden in ein Gemisch, bestehend aus 24,5 ml THF und 24,5 ml Triethylamin, gegeben, danach werden 57 mg Palladium-bisdichlorbistriphenylphosphin (0,081 mmol, 0,1 Äq.) und 57 mg Kupferiodid (0,28 mmol, 0,3 Äq.). zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei 50°C erwärmt. Nach Rückkehr auf Umgebungstemperatur wird das Reaktionsgemisch auf 900 ml Aceton gegossen. Durch Zentrifugation des Acetons werden 160 mg Polymer in Form eines gelben Feststoffs gewonnen.
Hydrolyse des Polymers
VERFAHRENSWEISE
50 mg Polymer werden in 1 ml CH₂Cl₂ suspendiert, dann werden bei 0°C 0,5 ml Trifluoressigsäure tropfenweise zugegeben, das Reaktionsgemisch wird damit löslich. Nach 2 h Rühren wird das Reaktionsgemisch eingeengt, dann in einem Gemisch, bestehend aus 1 ml CH₂Cl₂ und 1 ml Triethylamin, erneut suspendiert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, mehrmals mit Wasser gewaschen, dann lyophilisiert.
U.V. (0,1N HCl 0,208 mg/ml): 348 (5856); 321 (5317); 301 (3990); 283 (3317); 201 (8519);
Kopplung des Biotins
VERFAHRENSWEISE
15 mg Polymer und 15 mg Biotin-N-hydroxysuccinimid werden in 10 ml DMF suspendiert. Nach 48 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert, eingeengt, dann in einer CH₂Cl₂-Lösung suspendiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation gewonnen, mehrmals mit Ethylacetat gewaschen, dann lyophilisiert.
Beispiel 2: Herstellung eines Molekülstabs, der durch einen Nickelkomplex Ni-NTA funktionalisiert ist
Mit dem Ziel, die biologischen Makromoleküle, die eine Polyhistidin-Markierung tragen, zu fixieren und zu kristallisieren, haben wir ein Polymer des Typs Poly(phenylenethinylen), das durch Nickel-NTA-Komplexe funktionalisiert war, hergestellt. Das Verfahren zur Herstellung von NTA*, dem Analogon von NTA, ist identisch mit dem, das von C. Vénien-Brian et al. (J. Mol. Biol. 1997, Bd. 274, S. 687–692) beschrieben wurde.
Syntheseschema: Herstellung des Polymers P0
Bedingungen:

a. TMSA, RdCl₂(PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH; c. NHS, DCC, THF; d. NTA* CH₂Cl₂, TEA; e. PdCl₂(PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; f. KOH, MeOH; g. NiCl₂ 6H₂O, Tris (10 mM, pH 8).

Versuchsprotokolle
2-Iod-5-trimethylsilanylethinyl-benzoesäure:
VERFAHRENSWEISE
1,12 g 2,5-Diiodbenzoesäure (3 mmol, 1 Äq.), 210 mg Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) (0,3 mmol, 0,1 Äq.) und 200 mg Kupfer(I)-iodid (1 mmol, 0,34 Äq.) werden in 60 ml eines THF/TEA (3/1)-Gemisches gelöst. Nach Zusatz von 425 μl Trimethylsilylacetylen (3 mmol, 1 Äq.) wird das Rühren bei Umgebungstemperatur 16 Stunden vor Licht geschützt fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann zur Trockene eingeengt und der erhaltene Rückstand wird durch Flashchromatographie an Siliciumdioxid 60H (Hexan/EtOAc/AcOH, 70/30/1%) gereinigt, wobei nach Trocknung im Vakuum 750 mg 2-Iod-5-trimethylsilanylethinylbenzoesäure in Form feiner gelber Nadeln erhalten werden (Ausbeute: 73%).
Summenformel: C₁₂H₁₃IO₂Si MG: 344,221 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc/AcOH: 50/50/1%): 0,55;
¹H-NMR (300 MHz, Aceton-d6): δ 10,93 (s groß, 1H, H₁); 8,02 (d, J_4-5 = 8,2 Hz 1H; H₄); 7,92 (d, J_5-7 = 1,8 Hz, 1H, H₇); 7,27 (dd, J_4-5 = 8,2 Hz, J_5-7 = 1,8 Hz, 1H, H₅); 0,25 (s, 9H, H₁₀);
¹³C-NMR (75,47 MHz, Aceton-d6): δ 166,99 (1C, C₁); 142.24 (1C, C₄); 136,85 (1C, C₂); 135,57 (1C, C₅); 134,16 (1C, C₇); 123,75 (1C, C₆); 103,59 (1C, C₃); 97,12 (1C, C₈); 94,52 (1C, C₉); –0,28 (3C, C₁₀);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 362 (100, [M + 18]⁺);
2-Iod-5-ethinyl-benzoesäure
VERFAHRENSWEISE
Zu einer Lösung von 500 mg 2-Iod-5-trimethylsilanylethinylbenzoesäure (1,45 mmol, 1 Äq.) in 30 ml Methanol gibt man bei 0°C 4,5 ml einer wässrigen Kaliumhydroxidlösung (1N). Nach 2stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 2 × 50 ml CH₂Cl₂ gewaschen, dann wird die wässrige Phase durch Zusatz einer molaren Salzsäurelösung wieder auf pH 2 angesäuert. Nach Extraktion mit 2 × 50 ml CH₂Cl₂ werden die organischen Phasen vereinigt, um nach Trocknung und Einengung 383 mg 2-Iod-5-ethinylbenzoesäure in Form eines gelben Feststoffs zu erhalten (Ausbeute: 97%).
Summenformel: C₉H₅IO₂ MG: 272,039 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc/AcOH: 50/50/1%): 0,4;
¹H-NMR (300 MHz, Aceton-d6): δ 8,08 (d, J_4-5 = 8,1 Hz 1H, H₄); 7,93 (d, J_5-7 = 1,9 Hz, 1H, H₇); 7,36 (dd, J_4-5 = 8,1 Hz, J_5-7 = 1,9 Hz, 1H, H₅); 3,87 (s, 1H, H₉);
¹³C-NMR (75,47 MHz, Aceton-d6): δ 167,01 (1C, C₁); 142,22 (1C, C₄); 137,32 (1C, C₂); 135,72 (1C, C₅); 134,12 (1C, C₇); 123,00 (1C, C₆); 94,51 (1C, C₃); 82,08 (1c, C₈); 81,22 (1C; C₉);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität):m/e: 290 (100, [M + 18]⁺); 307 (66, [M + 35]⁺); 562 (8, [2M + 18]⁺);
2-Iod-5-ethinyl-benzoesäure-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester:
VERFAHRENSWEISE
Eine Lösung von 544 mg (2 mmol, 1 Äq.) 2-Iod-5-ethinyl-benzoesäure und 276 mg NHS (2,4 mmol, 1,2 Äq.) in 30 ml THF wird bei 0°C mit 495 mg (2,4 mmol, 1,2 Äq.) DCC, gelöst in 20 ml THF, versetzt. Das Gemisch wird für eine Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann filtriert, danach eingeengt und der erhaltene Rückstand wird durch Flashchromatographie an Siliciumdioxid 60H gereinigt (Hexan/EtOAc; 70/30), um nach Trock nung im Vakuum 568 mg 2-Iod-5-ethinyl-benzoesäure-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester in Form eines gelben Feststoffs zu erhalten (Ausbeute: 77%).
Summenformel: C₁₃H₈INO₄ MG: 369,114 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc : 50/50): 0,46;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8,18 (d, J_5-7 = 2,4 Hz, 1H, H₇); 8,3 (d, J_4-5 = 8,5 Hz 1H, H₄); 7,34 (dd, J_4-5 = 8,5 Hz, J_5-7 = 2,4 Hz, 1H, H₅); 3,22 (s, 1H, H₉); 2,91 (s, 4H, H₁₁)
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 168,53 (2C, C₁₁); 160,49 (1C, C₁); 141,92 (1C, C₄); 136,97 (1C, C₅); 135,09 (1C, C₇); 129,67 (1C, C₂); 122,60 (1C, C₆); 95,60 (1C, C₃); 80,81 (1C, C₈); 80,20 (1C, C₉); 25,46 (2C, C₁₂);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 387 (100, [M + 18]⁺); 404 (27, [M + 35]⁺);
2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-6-(2-iod-5-ethinyl-benzoylamino)hexansäuremethylester
VERFAHRENSWEISE
Zu einer Lösung von 320 mg (1,05 mmol, 1,05 Äq.) NTA* in 20 ml CH₂Cl₂ werden 1 ml TEA und 370 mg (1 mmol, 1 Äq.) 2-Iod-5-ethinyl-benzoesäure-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester, gelöst in 20 ml CH₂Cl₂, gegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann eingeengt, wobei nach Chromatographie an Siliciumdioxid (CH₂Cl₂/MeOH/TEA; 90/10/1) 380 mg 2-(Bis-methoxycarbonylmethylamino)-6-(2-iod-5-ethinylbenzoylamino)hexansäuremethylester in Form eines orangen Öls erhalten wurden (Ausbeute: 68%).
Summenformel: C₂₂H₂₇IN₂O₇ MG: 558,372 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc : 50/50);
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,74 (d, J_15-16 = 8,2 Hz 1H, H₁₅); 7,41 (d, J_16-18 = 2,1 Hz, 1H, H₁₈); 7,09 (dd, J_15-16 = 8,2 Hz, J_16-18 = 2,1 Hz, 1H, H₁₆); 6,46 (t, J_6-9 = 5,1 Hz, 1H, H₉); 3,62 und 3,56 (s, 13H, H₁₀, H₁₁, H₇); 3,38 (t, J_2-3 = 7,3 Hz, 1H, H₂); 3,36 (t, J_5-6 = 6,6 Hz, J_6-9 = 5,1 Hz, 2H, H₆); 1,40–1,80 (m, 6H, H₃, H₄, H₅)
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 172,82 (1C, C₁); 171,54 (2C, C₈); 168,42 (1C, C₁₂); 142,57 (1C, C₁₃); 139,49 (1C, C₁₅); 133,54 (1C, C₁₆); 131,17 (1C, C₁₈); 122,00 (1C, C₁₇); 93,04 (1C, C₁₄); 81,69 (1C, C₁₉); 79,19 (1C, C₂₀); 63,95 (1C, C₂); 52,25 (2C, C₇); 51,41 und 51,22 (3C, C₁₀, C₁₁); 39,53 (1C, C₆); 29,37 (1C, C₃); 28,08 (1C, C₅); 22,71 (1C, C₄);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität) m/e : 631 (9, [M + 1]⁺); 648 (100, (M + 18]⁺);
Mikroanalyse für C₂₂H₂₇IN₂O₇:
Errechnet: C, 47,32; H, 4,87; N, 5,02; O, 20,06; I, 22,73;
Gefunden: C, 47,01; H, 4,95; N, 4,87
Polymerisation von 2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-6-(2-iod-5-ethinyl-benzoylamino)-hexansäuremethylester:
VERFAHRENSWEISE
84 mg 2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-6-(2-iod-5-ethinyl-benzoylamino)-hexansäuremethylester (0,15 mmol, 1 Äq.) werden in ein Gemisch, bestehend aus 6 ml THF und 2 ml Triethylamin, gegeben, dann werden 11 mg Palladium-bisdichlorbistriphenylphosphin (17 μmol, 0,1 Äq.) und 15 mg Kupferiodid (75 μmol, 0,5 Äq.) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei 50°C erwärmt. Nach Rückkehr auf Umgebungstemperatur wird das Reaktionsgemisch in 200 ml Aceton gegossen. Durch Zentrifugation des Acetons werden 55 mg Polymer in Form eines gelben Feststoffs gewonnen.
Hydrolyse des Polymers
VERFAHRENSWEISE
50 mg Polymer werden in 5 ml MeOH suspendiert, dann werden bei 0°C 5 ml einer molaren Lösung von Kaliumhydroxid tropfenweise zugesetzt. Nach 96 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert, eingeengt, dann in einem Minimum an Wasser wieder aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird dann durch langsamen Zusatz einer 0,1 M Salzsäurelösung erneut acidifiziert. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, mehrmals mit Wasser gewaschen, dann lyophilisiert.
Komplexierung der Nickelionen:
Polymer P0
VERFAHRENSWEISE
1 mg Polymer wird in 5,15 ml Tris-Puffer (10 mM, pH 8) gelöst. 20 μl einer Lösung von NiCl₂·6H₂O (500 mM) in Tris (10 mM, pH 8) werden dann zu 1 ml der Polymerlösung gegeben. Nach Dialyse wird die Verbindung ohne weitere Reinigung in Lösung verwendet.
Beispiel 3: Entwicklung einer Bibliothek von Molekülstäben, die durch Nickel-NTA funktionalisiert sind (Polymer Ppm), zur Fixierung von mit Histidin markierten Proteinen
Syntheseansatz zur Kontrolle des Abstandes L₁
Bedingungen:

i. TsCl, TEA, THF; ii. NaN₃, CH₃CN; iii. NaH, BrCH₂CO₂tBu, THF; iv. TFA, CH₂Cl₂; v. SOCl₂/TEA, CH₂Cl₂; vi. H₂, Pd/C, MeOH.

Syntheseansatz zur Kontrolle des Abstandes L₂
Bedingungen:

a. TMSA, PdCl₂(PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH; c. NHS, DCC, THF; d. MeOH, EDC, HOBT, THF; e. HCl, NaNO₂/K₂CO₃, HNPrⁱ ₂; f. LDA, ClPO(OEt)₂; g. LDA (2 Äq.), Me₃;SiCl; h. K₂CO₃, MeOH; i. PdCl₂ (PPh₃)₂, CuI, THF/TEA; j. MeI.

Versuchsprotokolle
Die Versuchsprotokolle zur Polymerisation und Hydrolyse sind identisch mit denen, die für den Stab P0 beschrieben wurden.
Herstellung des Monomers für den Stab P₁₀
Toluol-4-sulfonsäure-[2-(2-hydroxyethoxy)ethyl]ester:
VERFAHRENSWEISE
50 ml Diethylenglykol (0,5 mol, 10 Äq.) und 10 g Tosylchlorid (0,05 ml, 1 Äq.) werden in 200 ml Dichlormethan in Lösung gebracht. Nach tropfenweiser Zugabe von 7,3 ml Triethylamin (0,05 mol, 1 Äq.) wird das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Hydrolyse mit 100 ml Wasser wird das Reaktionsgemisch zweimal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, die organische Phase wird auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, dann eingeengt, wobei ein Rückstand erhalten wird, der durch Flashchromatographie an Siliciumdioxid 60H gereinigt wird (Hexan/EtOAc: 40/60). 13,4 g O-Tosyldiethylenglykol werden in Form eines farblosen leichten Öls erhalten (Ausbeute: 99%/TsCl).
Summenformel: C₁₁H₁₆O₅S MG: 260,2 g/mol
DSC: Rf (Hexan/EtOAc: 7/3): 0,32
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,78 (d, J_6-7 = 8,1 Hz, 2H, H₆); 7,33 (d, J_7-6 = 8,1 Hz 2H, H₇); 4,18 (t, J_4-3 = 3,2 Hz, 2H, H₄); 3,69–3,63 (m, 4H, H_2-3); 3,51 (t, J_1-2 = 3,2 Hz, 2H, H₁); 2,43 (s, 3H, H₉); 1,98 (s1, 1H, H₁₀);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 144,70 (1C, C₈); 132,82 (1C, C₅); 129,60 (2C, C₆); 127,69 (2C, C₇); 72,24 (1C, C₂); 68,91 (1C, C₃); 68,35 (1C, C₄); 61,40 (1C, C₁); 21,33 (1C C₉);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e : 278 (100, [M + 18]⁺);
2-(2-Azido-ethoxy)-ethanol 16a:
VERFAHRENSWEISE
12,27 g des 2-(2-Hydroxyethoxy)ethylesters der Toluol-4-sulfonsäure (0,047 mol, 1 Äq.) werden in 200 ml Acetonitril in Lösung gebracht, dann werden 3,67 g Natriumnitrid (0,056 mol, 1,2 Äq.) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Stunden auf 80°C erhitzt. Nach Hydrolyse mit 100 ml Wasser wird das Reaktionsgemisch zweimal mit 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, dann eingeengt, wodurch 3,9 g eines farblosen leichten Öls erhalten werden (Ausbeute: 63%).
Summenformel: C₄H₉O₂N₃ MG: 131 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc: 1/1): 0,28;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 3,72 (t, J_2-1 = 4,7 Hz, 2H, H₂); 3,66 (t, J_3-4 = 4,8 Hz 2H, H₃); 3,58 (t, J_1-2 = 4,7 Hz, 2H, H₁); 3,38 (t, J_4-3 = 4,8 Hz, 2H, H₄); 2,32 (s1, 1H, H₅);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 72,19 (1C, C₂); 69,82 (1C, C₃); 61,53 (1C, C₁)†; 50,49 (1C, C₄);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 149 (100, [M + 18]⁺);
[2-(2-Azido-ethoxy)ethoxy]essigsäue-t-butylester 19a:
VERFAHRENSWEISE
1,42 g Natriumhydrid (0,035 mol, 1,2 Äq.) werden in 30 ml Tetrahydrofuran suspendiert, dann werden bei 0°C 3,89 g 16a (0,029 mol, 1 Äq.) in Lösung in 10 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugesetzt. Das Rühren wird bei dieser Temperatur eine halbe Stunde aufrecht erhalten, während langsam 8,71 ml Bromessigsäure-t-butylester (0,059 mol, 2 Äq.) zugesetzt werden. Die Temperatur wird langsam wieder ansteigen gelassen und das Rühren wird während einer Nacht fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit 50 ml Wasser hydrolysiert, dann wird dieses Gemisch konzentriert, was zu einem Rückstand führt, der durch Flashchromatographie an Siliciumdioxid 60H gereinigt wird (Hexan/EtOAc: 70/30). 3,95 g Produkt werden in Form eines leicht gelben Öls mit einer Ausbeute von 55% gewonnen.
Summenformel: C₁₀H₁₉O₄N₃ MG: 245 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc: 7/3): 0,47;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃). δ 4,02 (s, 2H, H₂); 3,7–3,66 (m, 6H, H_3,4,5); 3,39 (t, J_6-5 = 5,0 Hz, 2H, H₆); 1,46 (s, 9H, H₈);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 169,37 (1C, C₁); 81,33 (1C, C₇); 70,55–70,49 (2C, C_3und4) 69,81 (1C, C₅); 68,90 (1C, C₂); 50,46 (1C, C₆); 27,86 (3C, C₈);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 207 (15, [M + 1]⁺); 263 (100, [M + 18]⁺);
6-(2-[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]acetylamino)-2-(bis-methoxycarbonyl(methylamino)-hexansäuremethylester 20a:
VERFAHRENSWEISE
3,95 g 19a (0,016 mol, 1 Äq.) werden in 20 ml Dichlormethan gelöst, dann werden tropfenweise 10 ml Trifluoressigsäure zugesetzt. Nach Rühren des Reaktionsgemisches bei 60°C während 2 Stunden wird dieses zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird dann in 4 ml Thionylchlorid aufgenommen und während einer Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Gemisch wird erneut zur Trockene eingeengt, zweimal mit 4 ml Dichlormethan wieder aufgenommen, dann erneut eingeengt. Das so gebildete Säurechlorid wird in 10 ml Dichlormethan aufgenommen, dann werden 6,43 g NTA* mit polarem Kopf (0,016 mol, 1 Äq.) in Lösung in 10 ml Dichlormethan, und 4,46 ml Triethylamin (0,032 mol, 2 Äq.) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird während einer Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, dann zur Trockene eingeengt, was zu einem Rückstand, der an Siliciumdioxid 60H durch Flashchromatographie gereinigt wird (MeOH/CH₂Cl₂: 3/97) führt. Es werden 1,84 g Produkt in Form eines gelben Öls mit einer Ausbeute von 25% erhalten.
Summenformel: C₁₉H₃₃O₉N₅ MG: 475 g/mol
DSC. Rf(reines EtOAc): 0,34;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃). δ 6,79 (t1, J_9-6 = 5,3 Hz, 1H H₉); 3,88 (s, 2H, H₁₃); 3,59–3,62 (m, 15H, H₁₀, H₁₁, H₁₅, H₁₆); 3,54 (s, 4H, H₇); 3,29–3,34 (m, 3H, H₂, H₁₇); 3,18 (dt, J_6-5 = 6,5 Hz, J_6-9 = 5,3 Hz, 2H H₆); 1,27–1,65 (m, 6H, H₃, H₄, H₅,);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 172,68 (1C, C₁); 171,42 (2C, C₈); 169,29 (1C, C₁₂); 70,52 (1C, C₁₅); 70,20 (1C, C₁₃); 69,91 (1C, C₁₄); 69,75 (1C, C₁₆); 64,35 (1C, C₂); 52,10 (2C, C₇); 51,27 und 50,30 (2C, C₁₀, C₁₁); 51,06 (1C, C₁₇); 38,30 (1C, C₆); 29,74 (1C, C₃); 28,94 (1C, C₅); 22,93 (1C, C₄);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 476 (100, [M + 1]⁺);
6-(2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]acetylamino)-2-(bis-methoxycarbonylmethylamino)-hexansäuremethylester 21a:
VERFAHRENSWEISE
1,84 g 20a (3,88 mmol, 1 Äq.) werden in 30 ml Methanol gelöst, dann werden 184 mg Palladium-auf-Kohle (10% als Masse) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dreimal mit Wasserstoff gespült, dann bei Umgebungstemperatur während einer Nacht unter Wasserstoffatmosphäre belassen. Nach Abfiltrieren des Palladiums über Celite wird das Filtrat verdampft, wodurch 1,70 g (Ausbeute: 97%) eines gelben Öls erhalten werden, das ohne weitere Reinigung in den späteren Stufen verwendet wird.
Summenformel: C₁₉H₃₅O₉N₃ MG: 449 g/mol
DSC: Rf(MeOH/CH₂Cl₂: 1/9): 0,17;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 6,92 (s1, 1H, H₉); 3,85 (s, 2H, H₁₃); 3,55–3,13 (m, 26H, H₂, H₆, H₇, H₁₀, H₁₁, H₁₃, H₁₄, H₁₅; H₁₆, H₁₇,); 1,24–1,62 (m, 6H, H₃, H₄, H₅,);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität): m/e: 450 (100, [M + 1]⁺);
2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-6-(2-[2-(2-(5-ethinyl-2-iod-benzoylamino)ethoxy)-ethoxy]-acetylamino)-hexansäuremethylester 22a:
VERFAHRENSWEISE
150 mg 2-Iod-5-ethinylbenzoesäure-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester (0,33 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 5 ml CH₂Cl₂ und 0,2 ml Triethylamin werden auf 123 mg 21a (0,33 mol, 1 Äq.), das in 2 ml CH₂Cl₂ gelöst ist, mittels Kanüle gegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 24 h bei Umgebungstemperatur gerührt, dann eingeengt. Der Rückstand wird an Kieselgel 60H (MeOH/CH₂Cl₂: 3/97) chromatographiert, was zu 145 mg eines leicht gelben Öls mit einer Ausbeute von 62% führt.
Summenformel: C₂₈H₃₈O₁₀N₃I MG: 703 g/mol
DSC: Rf(MeOH/CH₂Cl₂: 1/9): 0,50;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,79, (d, J_23-25 = 8,1 Hz, 1H, H₂₃); 7,45 (d, J_23-25 = 1,5 Hz, 1H, H₂₅); 7,15 (dd, J_23-25 = 1,5 Hz, und J_23-22 = 8,1 Hz 1H, H₂₃), 6,76 (t1, 1H, H₉); 6,50 (t1, 1H, H₁₈); 4,11 (s, 2H, H₁₃); 3,58–3,96 (m, 17H, H₁₀, H₁₁, H₁₄, H₁₅, H₁₆); 3,51 (s, 4H, H₇); 3,20–3,41 (m, 5H, H₂, H₆, H₁₇); 3,17 (s, 1H, H₂₈); 1,44–1,71 (m, 6H, H₃, H₄, H₅);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 172,75 (1C, C₁₉); 171,64 (1C, C₁); 171,49 (1C, C₈); 169,38 (1C, C₁₂), 142,14 (1C, C₂₀); 139,69 (1C, C₂₅); 133,86 (1C, C₂₂); 131,21 (1C, C₂₃); 122,25 (1C, C₂₄); 155,97 (1C, C₂₁); 92,71 (1C, C₂₆); 79,45 (1C, C₂₇); 70,65 (1C, C₁₅); 70,36 (1C, C₁₃); 69,87 (1C, C₁₄); 69,41 (1C, C₁₆); 64,36 (1C, C₂); 52,39; 51,16 (2C, C₇); 52,16; 51,37 (3C, C₁₀, C₁₁); 39,46 (1C, C₁₇); 39,37 (1C, C₆); 29,77 (1C, C₃); 28,95 (1C, C₅); 22,98 (1C, C₄);
MS(70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 704 (100, [M + 1]⁺); 721 (36, [M + 18]⁺);
Mikroanalyse für: C₂₈H₃₈N₃O₁₀I:
Errechnet: C, 47,80; H, 5,44; N, 5,97; O, 22,74; I; 18,03
Gefunden: C, 47,75; H, 5,71; N, 5,72;
Herstellung des Monomeren für den Stab P₂₁
6-(2-(2-[2-(2-Aminoethoxy)-ethoxy]-ethoxy)-acetylamino)-2-(bis-methoxycarbonylmethylamino)-hexansäuremethylester 21b:
VERFAHRENSWEISE
Das Protokoll war identisch dem, das zur Herstellung des Produktes 21a verwendet wurde, wobei die Synthese ausgehend von Triethylenglykol begonnen wurde.
Summenformel: C₂₁H₃₉O₁₀N₃ MG: 493 g/mol
DSC: Rf(MeOH/CH₂Cl₂/TEA: 1/9/0,1): 0,27;
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 4,59 (s1, 3H, H₉, H₂₀); 3,94 (s, 2H, H₁₃); 3,10–3,61 (m, 28H, H₂, H₆, H₇, H₁₀, H₁₁, H₁₄, H₁₅, H₁₆, H₁₇, H₁₈, H₁₉); 1,19–1,62 (m, 6H, H₃, H₄, H₅);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 494 (100, [M + 1]⁺);
4-(Diisopropyltriazenyl)acetophenon 25:
VERFAHRENSWEISE
1 g (7,4 mmol) 4-Aminoacetophenon wird in einem Gemisch, das aus 30 ml Wasser und 5 ml konzentrierter Salzsäure besteht, gelöst. Nachdem das Reaktionsgemisch auf 0°C gebracht worden war, wurden 520 mg (7,54 mmol, 1,02 Äq.) Natriumnitrit in Lösung in 1 ml Wasser zugegeben. Nach 30minütigem Rühren wird das Reaktionsgemisch vorsichtig auf eine Lösung gegeben, die aus 8 g Kaliumcarbonat und 8,17 ml (5,82 mmol, 7,8 Äq.) Diisopropylamin in 50 ml Wasser besteht und die auf 0°C gebracht worden war, gegeben. Das Rühren wird während 30 Minuten bei dieser Temperatur aufrechterhalten, dann wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml Wasser hydrolysiert und die wässrige Phase wird viermal mit 50 ml Ethylether extrahiert. Die organische Phase wird auf Magnesiumsulfat getrocknet, dann filtriert, dann eingeengt, was zu einem Rückstand führt, der an Kiese1gel 60H chromatographiert wird (AcOEt/Hexan: 2/8), was zu 1,18 g eines gelben Pulvers mit einer Ausbeute von 64% führt.
Summenformel: C₁₄H₂₁N₃O₂ MG: 247,33 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc : 9/1): 0,40;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,92, (d, J_3-4 = 8,6 Hz, 2H, H₃); 7,44 (d, J_4-3 = 8,6 Hz, 2H, H₄); 5,33 (s1, 1H, H₆); 4,03 (s1, 1H, H₆); 2,57 (s, 3H, H₃); 1,37 (d1, 6H, H₇); 1,24 (d1, 6H, H₇);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 197,17 (1C, C₁); 155,32 (1C, C₅); 133,11 (1C, C₂); 129,30 (2C, C₃), 119,82 (2C, C₄); 49,17 (1C, C₆); 46,17 (1C, C₆); 26,23 (1C, C₈); 23,63, 19,11 (4C, C₇);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 248 (100, [M + 1]⁺);
1-(Diisopropyltriazenyl)-4-((trimethylsilyl)ethinyl)benzol 26:
VERFAHRENSWEISE
8,62 g (34,9 mmol, 1 Äq.) 4-(Diisopropyltriazenyl)acetophenon in 30 ml THF gelöst, werden tropfenweise mit –78°C auf 1,03 Äq. LDA, das bei 0°C auf 5,17 ml Diisopropylamin (36,9 mmol, 1,06 Äq.) und 22,4 ml 1,6 M BuLi in Hexan (35,9 mmol, 1,03 Äq.) gebildet worden war, in 38,5 ml THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei –78°C eine Stunde lang gerührt, dann werden 5,04 ml Diethylchlorphosphat (34,9 mmol, 1 Äq.) tropfenweise zugesetzt und die Temperatur wird auf Umgebungstemperatur erhöht. Nach 3stündigem Rühren wird diese Lösung auf 2,25 Äq. LDA, das bei 0°C, ausgehend von 11 ml Diisopropylamin (78,5 mmol, 2,25 Äq.) und 49 ml 1,6 M BuLi gebildet worden war (78,5 mmol, 2,25 Äq.) in 80 ml THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, wobei in dieser Zeit die Temperatur langsam wieder ansteigt. Nachdem der Rundkolben auf 0°C gebracht worden ist, werden 4,86 ml Trimethylsilylchlorid (38,3 mmol, 1,1 Äq.) zugesetzt, das Rühren wird 15 Minuten aufrecht erhalten, dann hydrolysiert man mit 100 ml Wasser. Die wässrige Phase wird dreimal mit 100 ml Ethylether extrahiert, dann wird die organische Phase auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, danach eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird durch Flashchromatographie an Silicagel 60H (reines Hexan) gereinigt, wodurch 6,08 g 1-(Diisopropyltriazenyl)-4-((trimethylsilyl)ethinyl)benzol mit einer Ausbeute von 58% erhalten werden.
Summenformel: C₁₇H₂₇N₃Si MG: 301 g/mol
DSC: Rf(Hexan): 0,30;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,40, (d, J_2-3 = 8,5 Hz, 2H, H₂); 7,32 (d, J_3-2 = 8,5 Hz, 2H, H₃); 5,33 (s1, 1H, H₈); 4,03 (s1, 1H, H₈); 1,29 (s1, 12H, H₉); 0,24 (s, 9H, H₇);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 151,45 (1C, C₁); 132,42 (2C, C₂); 119,82 (2C, C₃); 118,66 (1C, C₄), 105,72 (1C, C₆); 93,05 (1C, C₅); 48,13, 46,17 (2C, C₈); 23,80, 19,11 (4C, C₉); –0,15 (3C, C₇);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 302 (100, [M + 1]⁺);
1-(Diisopropyltriazenyl)-4-ethinylbenzol 27:
VERFAHRENSWEISE
6 g 1-(Diisopropyltriazenyl)-4-((trimethylsilyl)ethinyl)benzol (19,9 mmol, 1 Äq.) werden in 100 ml MeOH gelöst und 13,7 g K₂CO₃ (99,5 mmol, 5 Äq.) werden nach und nach zugege ben. Nach Rühren des Reaktionsgemisches bei Umgebungstemperatur während 15 h wird dieses zur Trockene eingeengt, mit 100 ml Wasser und 100 ml EtOAc wieder aufgenommen. Die wässrige Phase wird viermal mit 50 ml EtOAc extrahiert, dann wird die organische Phase auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann eingeengt, was zu 4,38 g 1-(Diisopropyltriazenyl)-4-ethinylbenzol mit einer Ausbeute von 96% führt.
Summenformel: C₁₄H₁₉N₃ MG: 229 g/mol
DSC: Rf(reines Hexan): 0,30;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,46, (d, J_2-3 = 8,6 Hz, 2H, H₂); 7,37 (d, J_3-2 = 8,6 Hz, 2H, H₃); 5,33 (s1, 1H, H₈); 4,03 (s, 1H, H₈); 3,06 (s, 1H, H₇); 1,29 (s, 12H, H₉);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 151,75 (1C, C₁); 132,57 (2C, C₂); 119,95 (2C, C₃); 117,56 (1C, C₄), 84,14 (1C, C₅); 76,28 (1C, C₆); 48,68, 45,75 (2C, C₈); 23,61, 19,28 (4C, C₉);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 230 (100, [M + 1]⁺);
2-Iod-4-trimethylsilanylethinylbenzoesäuremethylester 28:
VERFAHRENSWEISE
2,6 g 2-Iod-5-((trimethylsilyl)ethinyl)benzoesäure (7,56 mmol, 1 Äq.) werden in 50 ml THF gelöst, dann werden 2,17 g N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (11,3 mmol, 1,5 Äq.) und 1,52 g Hydroxybenzotriazol oder HOBT (11,3 mmol, 1,5 Äq.) zugesetzt und schließlich werden 18 ml MeOH tropfenweise zugesetzt. Nachdem das Reaktionsgemisch während 4 h bei Umgebungstemperatur gerührt worden war, wird es zur Trockene eingeengt, mit 50 ml Wasser und 50 ml EtOAc wieder aufgenommen. Die organische Phase wird mit 25 ml einer wässrigen 5%igen KHSO₄-Lösung, 25 ml einer 5%igen wässrigen NaHCO₃-Lösung und 25 ml einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung gewaschen. Sie wird dann auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann eingeengt, wodurch 2,93 g eines gelben Öls erhalten werden (quantitative Ausbeute), welches ohne zusätzliche Reinigung in den späteren Stufen verwendet wird.
Summenformel: C₁₃H₁₅O₂ISi MG: 357.9 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc : 9/1): 0,46;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,91, (d, J_4-6 = 8,0 Hz, 1H, H₄); 7,87 (d, J_7-6 = 2,1 Hz, 1H, H₇); 7,18 (dd, J_6-7 = 2,1 Hz, J_6-4 = 8,0 Hz, 1H, H₆); 3,91 (s, 1H, H₁₁); 0,23 (s, 9H, H₁₀);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 165,86 (1C, C₁); 141,05 (1C, C₄); 134,99; 133,90 (2C, C₆, C₇); 134,78 (1C, C₂), 123,10 (1C, C₅); 102,61 (1C, C₃); 96,60 (1C, C₉); 93,83 (1C, C₈); 52,31 (1C, C₁₁); –0,44 (3C, C₁₀);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 376 (100, [M + 18]⁺);
2-(4-Triisopropyltriazenylphenylethinyl)-5-trimethylsilanylethinyl-benzoesäuremethylester 29:
VERFAHRENSWEISE
676 mg 27 (1,88 mmol, 1 Äq.) werden in 7 ml THF gelöst, dann werden 132 mg Pd (0,18 mmol, 0,01 Äq.) und 132 mg Kupferiodid (3,76 mmol, 0,02 Äq.) zugesetzt. Nach Rühren des Reaktionsgemisches für 15 Minuten werden 430 mg 28 (1,88 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 7 ml THF tropfenweise zugesetzt. Das Rühren wird 15 h bei Umgebungstemperatur aufrechterhalten. Nach Verdampfung zur Trockene wird der Rückstand an Silicagel 60H (Hexan/EtOAC: 97/3) gereinigt, wobei 683 mg eines zitronengelben Pulvers in einer Ausbeute von 79% erhalten werden.
Summenformel: C₂₇H₃₃N₃O₂Si MG: 459 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc: 9/1): 0,28;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8,06, (s, 1H, H₃); 7,34–7,57 (m, 6H, H₅ H₆, H₁₁, H₁₂); 5,27 (s1, 1H, H₁₄); 3,96 (s, 4H, H₁₄, H₁₉); 1,31 (s1, 12H, H₁₅); 0,23 (s, 9H, H₁₈);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 165,84 (1C, C₁); 151,78 (1C, C₁₃); 134,28; 133,85; 133,45; 132,99 (4C, C₃, C₅, C₆); 132,99 (2C, C₁₁), 131,36 (1C, C₂); 123,80, 122,16 (2C, C₇, C₁₀); 102,08 (2C, C₁₂); 118,54 (1C, C₄); 103,47 (1C, C₁₇); 97,21, 96,83 (2C, C₈, C₉); 87,69 (1C, C₁₆); 52,02 (1C, C₁₉); 48,88, 45,97 (2C, C₁₄); 23,72, 19,16 (4C, C₁₅); –0,36 (3C, C₁₈);
MS(70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 460 (100, [M + 1]⁺);
2-(4-Iodphenylethinyl)-5-trimethylsilanylethinyl-benzoesäuremethylester:
VERFAHRENSWEISE
In ein versiegeltes Rohr werden 2,3 g 29 (5 mmol, 1 Äq.) in 5 ml Methyliodid (90 mmol, 18 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 72 h auf 120°C erhitzt, dann wird es zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 20 ml Ethylether wieder aufgenommen, filtriert, dann eingeengt, wodurch 2,2 g eines gelben Öls in einer Ausbeute von 96% erhalten werden.
Summenformel: C₂₁H₁₉O₂SiI MG: 458 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc : 9/1): 0,38;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8,06, (s, 1H, H₃); 7,68 (d, J_11-12 = 8,0 Hz, 2H, H₁₂); 7,54 (s, 2H, H₃, H₅); 7,26 (d, J_11-12 = 8,0 Hz, 2H, H₁₁); 3,93 (s, 3H, H₁₇); 0,25 (s, 9H, H₁₆);
¹³C-NMR (75,47 MHz, CDCl₃): δ 165,51 (1C, C₁); 137,36 (2C, C₁₂); 134,40; 133,87; 133,59 (3C, C₃, C₅, C₆); 132,97 (2C, C₁₁), 131,54 (1C, C₂); 122,95 (2C, C₇, C₁₀); 122,38 (1C, C₄); 103,21 (1C, C₁₅); 97,35, 94,96 (2C, C₈, C₉); 89,19 (13C, C₁₄); 94,54 (1C, C₁₃); 52,08 (1C C₁₇); –0,40 (3C, C₁₆);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 459 (59, [M + 1]⁺); 476 (100, [M + 18]⁺);
2,5-Dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester von 5-Ethinyl-2-(4-iodphenylethinyl)benzoesäure 30:
VERFAHRENSWEISE
Nach einer basischen Behandlung in Methanol werden 500 mg 2-(4-Iodphenylethinyl)-5-trimethylsilanylethinylbenzoesäuremethylester, 68 mg 5-Ethinyl-2-(4-iodphenylethinyl)benzoesäure (0,18 mmol, 1 Äq.) in 3 ml THF gelöst, dann werden 25 mg N-Hydroxysuccinimid (0,22 mmol, 1,2 Äq.) und 13 mg Dimethylaminopyridin (0,10 mmol, 0,55 Äq.) zugesetzt. Nachdem das Reaktionsgemisch auf 0°C gebracht wurde, werden 45 mg Dicyclohexylcarbodiimid (0,22 mmol, 1,2 Äq.) in Lösung in 1 ml CH₂Cl₂ tropfenweise zugesetzt. Das Rühren wird während 15 aufrechterhalten, wobei die Temperatur langsam ansteigen gelassen wird. Das Reaktionsgemisch wird dann filtriert, eingeengt, was zu einem Rückstand führt, der durch Silicagelchromatographie gereinigt wird. Das so erhaltene Produkt wird einmal mit EtOAc gewaschen und es werden 50 mg eines blassgelben Feststoffs in einer Ausbeute von 60% erhalten.
Summenformel: C₂₁H₁₂O₄NI MG: 469 g/mol
DSC: Rf(Hexan/EtOAc: 60/40): 0,5;
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 8,03, (s, 1H, H₃); 7,44–7,50 (m, 4H, H₅, H₆, H₁₂); 7,06 (d, J_11-12 = 8,2 Hz, 2H, H₁₁); 3,22 (s, 1H, H₁₆); 2,74 (s, 4H, H₁₈);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 470 (9,8, [M + 1]⁺); 477 (100, [M + 18]⁺);
2-(Bis(methoxycarbonylmethylamino))-6-(2-[2-(2-(2-[5-ethinyl-2-(4-iodphenylethinyl)benzoylamino]ethoxy)ethoxy)ethoxy]acetylamino)hexansäuremethylester 31b:
VERFAHRENSWEISE
92 mg 30 (0,18 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 3 ml CH₂Cl₂ und 0,25 ml Triethylamin (1,8 mmol, 10 Äq.) werden tropfenweise zu 88 mg 21b (0,18 mmol, 1 Äq.) in Lösung in 2 ml CH₂Cl₂ gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 4 h bei Umgebungstemperatur gerührt, dann zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in Silicagel 60H (CH₂Cl₂/MeOH: 97/3) chromatographiert, wobei 60 mg eines leicht gelben Öls in einer Ausbeute von 40% erhalten werden.
Summenformel: C₃₈H₄₆O₁₁N₃I MG: 847 g/mol
DSC: Rf(MeOH/CH₂Cl₂: 1/9): 0,47;
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8,00, (s, 1H, H₂₇); 7,70 (d, J_32-31 = 8,2 Hz, 2H, H₃₂); 7,50 (s1, 3H, H₂₄, H₂₅, H₂₀); 7,26 (d, J_31-32 = 8,2 Hz, 2H, H₃₁); 6,61 (t1, 1H, H₉); 3,88 (s, 2H, H₁₃); 3,16–3,70 (m, 25H, H₇, H₁₀, H₁₁, H₁₄, H₁₅, H₁₆, H₁₇, H₁₈, H₁₉); 3,16–3,25 (m, 4H, H₂, H₆, H₃₅); 1,41–1,69 (m, 6H, H₃, H₄, H₅);
MS (70eV/DCI/NH3/% Intensität: m/e: 848 (7, [M + 1]⁺);
Mikroanalyse für: C₃₀H₄₂N₃O₁₁I:
Errechnet: C, 53,84; H, 5,46; N, 4,95; O, 20,76; I; 14,97
Gefunden: C, 52,62; H, 5,84; N, 4,98;
Beispiel 4: Fixierung von His-tag-Proteinen an einen Molekülstab, der durch einen Nickelkomplex Ni-NTA funktionalisiert ist
Die Fixierung der Untereinheit ABC23-(His)₆ der RNA-Polymerasen von Hefe an dem Polymer P0, das durch Komplexe von Nickel-NTA funktionalisiert worden war, wurde untersucht. Eine Untersuchung durch Permeationschromatographie ermöglichte den Beweis der spezifischen Fixierung von „mit Histidin markierten" Proteinen auf dem Polymer. In der Tat ist die Elution des Proteins in Gegenwart des Polymers beschleunigt. Mehrere Proteine fixieren sich auf dem Polymer, bilden so Proteinkomplexe mit höheren Molekulargewichten. Darüber hinaus wird diese Fixierung durch eine Wechselwirkung zwischen dem Nickel und der Polyhistidin-Markierung induziert, denn das Protein ABC23 ohne Markierung scheint sich nicht oder wenig auf dem Polymer P0 zu befestigen.
Protokoll:

1 5 μl einer 500 μM-Lösung des Molekülstabs P0 in Tris-Puffer (10 mM, pH 8) werden entweder zu 5 μl einer Lösung des Proteins ABC23-His₆ (3,2 mg/ml im Puffer 10 mM Tris, 150 mM NaCl) oder zu 7 μl einer Lösung von Protein ABC23 (2,3 mg/ml im Puffer 10 mM Tris, 150 mM NaCl) oder auch zu 5 μl Tris-Puffer (10 mM, pH 8) gegeben. Nach 18 h ohne Rühren wird das Volumen der Lösung durch Zusatz von Tris-Puffer (10 mM, pH 8) auf 50 μl ergänzt und das Gesamte wird in eine 50 μl-Injektionsschleife des Smart^®-Systems injiziert.

Bedingungen:
Untersuchung der Fixierung von ABC23-(His)₆ der RNA-Polymerase von Hefe an dem Polymer P0 durch Permeationschromatographie mittels eines Smart^®-Systems (Säule Superose 6; Elution Tris (10 mM, pH 8; 150 mM NaCl)).
Beispiel 5: Betrachtung der His-tag-Proteine an einem Molekülstab, der durch einen Nickelkomplex Ni-NTA funktionalisiert ist, durch ein Elektronenmikroskop:
Die Fixierung einer Phosphatase-(His)₆ an dem Polymer P0, das durch Komplexe von Nickel-NTA funktionalisiert ist, wurde durch Permeationschromatographie untersucht. Man betrachtet die gebildete Struktur der supramolekularen Objekte durch Elektronenmikroskopie. Man stellt die Bildung von linearen Proteinaggregaten fest.
Versuchsbedingungen:
Nach Reinigung durch Permeationschromatographie am Smart^®-System (Säule Superose 6; Elution mit Tris (10 mM, pH 8; 150 mM NaCl)) werden 5 μl Lösung auf einem Gitter zur Elektronenmikroskopie, das mit einem Kohlenstofffilm bedeckt ist und vorher im Vakuum mit einem Strom von 20 mA entladen wurde, abgeschieden. Das Gitter wird dann mit einer Uranylacetatlösung negativ gefärbt und im Elektronenmikroskop betrachtet.
Die Photos werden auf KODAK SO163-Filmen mit einer Vergrößerung von 45.000 × mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop Philips CM120, das mit 100 kV arbeitet, und unter Minimalbedingungen des Elektronenstrahls (< 10 Elektronen/Å²) aufgezeichnet.

Claims

Molekülstäbe, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur aufweisen, die durch die folgende allgemeine Formel I dargestellt wird:
in der: P ein Polymer darstellt, das aus der Gruppe, bestehend aus Polyphenylenen, Polyphenylenvinylenen, Polyphenylenethinylenen und Polyvinylenen, wie sie in den folgenden Formeln dargestellt sind, ausgewählt ist:
worin: A ein Wasserstoffatom oder eine der folgenden Gruppen: Alkyl, OH, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, CO₂H, CO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl darstellt; Gpf (funktionelle Gruppe) eine Gruppe B-R darstellt, in der: – B (Bindungsarm) ausgewählt ist aus C₁-C₁₀-Kohlenstoff ketten gegebenenfalls substituiert durch Alkylgruppen, enthaltend Unsättigungen oder nicht, oder Polyoxyethylengruppierungen, die in der Kettenmitte Phosphatgruppen aufweisen können oder nicht, wie zum Beispiel:
in denen: m ein ganze Zahl zwischen 1 und 10 darstellt, X für O, NHCO, OCO, COO, CONH, S, CH₂ oder NH steht und an den Enden der genannten Kohlenstoffketten organische Verankerungsfunktionen des Ester-, Amid-, Ether-, Thioethertyps bildet; – R eine hydrophile Gruppe darstellt, die aus positiv oder negativ geladenen Gruppen; Liganden oder Analoga biologischer Makromoleküle, ausgewählt aus Biotin, Novobiozin, Retinoesäure, Steroiden und Antigenen; metallorganischen Komplexen, die mit Aminosäuren oder Nukleinsäuren wechselwirken und deren Liganden gegebenenfalls durch Alkylgruppierungen zur Bindung an E funktionalisiert sind, ausgewählt ist; n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 ist; p eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 ist und E (Spacer) einen chemischen Rest darstellt, dessen Natur die starre Struktur des Skeletts, das durch P gebildet wird, nicht stört und einen Phenylen-, Ethinylen-, Vinylenrest oder die Kombination dieser Reste darstellt, wie es in der folgenden Formel dargestellt ist:
worin A ein Wasserstoffatom oder eine der folgenden Gruppen: Alkyl, OH, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, CO₂H, CO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl darstellt.
Molekülstäbe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende allgemeine Formel II aufweisen:
in der: p = 0: Fehlen von E, P die Gruppe b, wie sie oben definiert wurde, darstellt; Gpf eine Gruppe B, die durch eine Gruppe f, wie sie oben definiert wurde, dargestellt wird, umfasst, wobei m = 3, eines der X für NHCO steht und das andere X für CH₂ steht und eine Gruppe R für einen metallorganischen Komplex auf der Basis von Nickel (Ni-NTA-Komplex) steht, und n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 darstellt.
Molekülstäbe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende allgemeine Formel III aufweisen:
in der: m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 darstellt, p eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 darstellt, P die Gruppe b, wie sie oben definiert ist, darstellt, Gpf eine Gruppe B, die durch eine Gruppe h, wie sie oben definiert ist, dargestellt wird, umfasst, wobei die zwei X identisch sind und für NHCO stehen und eine Gruppe R für einen metallorganischen Komplex auf der Basis von Nickel (Ni-NTA-Komplex) steht, dessen Ligand NTA durch eine C₄-Alkylgruppe funktionalisiert ist, und n eine ganze Zahl zwischen 5 und 1000 darstellt.
Verfahren zur Fixierung und/oder Selbstorganisation von biologischen Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen die Inkubation eines biologischen Makromoleküls in Lösung mit einem Molekülstab nach einem der Ansprüche 1 bis 3 während 15 Minuten unter zweckdienlichen Temperatur- und pH-Bedingungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Makromoleküle insbesondere lösliche, Membran-, Transmembran-Proteine, Enzyme, Antikörper, Antikörperfragmente oder Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung durch ein Lösungsmittel zur Solubilisierung der biologischen Makromoleküle, das wässrig oder wässrig-alkoholisch ist und gegebenenfalls mindestens ein Detergenz enthält, gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationsbedingungen vorzugsweise die folgenden sind: Inkubation bei Umgebungstemperatur für 15 Minuten bis 48 Stunden bei einem pH zwischen 5,5 und 8,5.
Supramolekulares Objekt, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Molekülstab nach einem der Ansprüche 1 bis 3 besteht, auf dem biologische Makromoleküle in nicht kovalenter Art fixiert sind.
Supramolekulares Objekt, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Molekülstab nach einem der Ansprüche 1 bis 3 besteht, auf dem biologische Makromoleküle in kristalliner Form selbstorganisiert sind.
Anwendung des supramolekularen Objekts nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Strukturuntersuchung der Makromoleküle, die mit ihm assoziiert sind.
Anwendung des supramolekularen Objekts nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 als immunologisches Reagenz.
Anwendung des supramolekularen Objekts nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 als Biosensoren oder Bioleiter.