JP2012188420A - エチニル基含有環状イミド化合物、並びに、それを用いたチオール基修飾剤及びそれを用いたアミノ基修飾剤 - Google Patents
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Abstract
Description
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1) の合成
4-Iodobenzoic acid (2.5 g, 10.1 mmol)、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride (420 mg, 600 μmol)、CuI (230 mg, 12.1 mmol) をTHF (40 mL) とtriethylamine (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、trimethylsilylacetylene (2.5 mL, 15.0 mmol) を加え、室温で18 時間撹拌した。セライト濾過し、酢酸エチル (300 mL) で洗浄した。濾液を 1N 塩酸 (150 mL) 、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 50:1 → 1:1) にて精製し、4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (2.01 g, 91%) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 0.27 (s, 9H).
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.6 g, 7.33 mmol)、FK (2.44 g, 41.8 mmol) をMeOH (40 mL) と THF (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で17 時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 50:1 → 1:1) にて精製し、4-ethynylbenzoic acid (500 mg, 47 %) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 13.42 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.72 (s, 1H).
4-Ethynylbenzoic acid (181 mg, 1.28 mmol) を DMF (4 mL) に溶解した後、60 ℃ で撹拌しながら、N-hydroxysuccinimide (176 mg, 1.53 mmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (295 mg, 1.53 mmol)、4-dimethylaminopyridine (31.3 mg, 256 μmol) を加え、30分撹拌後、室温で12 時間撹拌した。蒸留水 (50 mL) を加え、桐山ろ過によりろ取し、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (227 mg, 73 %) を淡黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 2.90 (s, 4H).
LiAlH4 (173 mg, 4.6 mmol) をTHF (45 mL) に懸濁し、0 ℃ で撹拌しながら4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.0 g, 4.58 mmol) の THF (10 mL) 溶液を加え、2 時間加熱還流した。氷冷下で酒石酸ナトリウムカリウム飽和水溶液 (50 mL) を滴下し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 20:1 → 5:1) にて精製し、4-ethynylbenzyl alcohol (473 mg, 78 %) を黄褐色オイルとして得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.66 (s, 2H), 3.08 (s, 1H).
Triphenylphosphine (85.1 mg, 324 μmol) を THF (2 mL) に溶解した後、-78 ℃ で撹拌しながら、diethyl azodicarboxylate (2.2 M in toluene, 140 μL, 308 μmol) を滴下した。5 分後、4-ethynylbenzyl alcohol (40.9 mg, 309 μ mol) のTHF (2 mL) 溶液を加え、5 分間撹拌した。maleimide (36.3 mg, 373 μmol) を加え、さらに5 分間撹拌した後、室温で24時間撹拌した。1N 塩酸 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 20:1 → 10:1 → クロロホルム:メタノール =100:1) にて精製し、1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (26.0 mg, 40%) を白色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 2H), 4.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.07 (s, 1H).
4-Ethynylbenzoic acid (28.0 mg, 200 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (54.0 mg, 400 μmol)、 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (76.0 mg, 400 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。2-aminoethanol (30.3 μL, 400 μmol) を加え、室温で 20時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 5:1 → 1:10) にて精製し、4-ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (24.0 mg, 63 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.20 (s, 1H).
4-Ethynylbenzoic acid (43.8 mg, 300 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (61.1 mg, 450 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (86.3 mg, 450 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。5-aminopentan-1-ol (80.0 μL, 768 μmol) を加え、室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 10:1 → 2:3) にて精製し、4-ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (42.7 mg, 62 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.23 (s, 1H), 3.67 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.47 (dd, J = 13.2 Hz, 7.1 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.70-1.59 (m, 4H), 1.51-1.43 (m, 2H).
4-Ethynylbenzoic acid (154 mg, 1.0 mmol)、N-hydroxybenzotriazole (270 mg, 2.0 mmol) 及び1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (380 mg, 2.0 mmol) をDMF (30 mL) に加えた。室温で3 時間撹拌した後、8-aminooctan-1-ol (290 mg, 2.0 mmol) を加えた。室温で 17時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 30:1 → 1:1) にて精製し、4-ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (176 mg, 64 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.49-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.63-1.25 (m, 12H).
4-Ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (56.8 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム:メタノール = 50:1 → 5:1) にて精製し、2-(4-ethynylbenzamido)acetic acid (58.0 mg, 95%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 12.60 (s, 1H), 8.88 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 4.34 (s, 1H), 3.88 (d, J = 5.6 Hz, 2H).
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (693 mg, 3.0 mmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (93.8 mg, 600 μmol)、NaClO2 (687 mg, 6.0 mmol)、NaOCl (5% in H2O, 1.5 mL, 1.01 mmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (15 mL)とMeCN (15 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で11時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム:メタノール = 1:0 → 5:1) にて精製し、5-(4-ethynylbenzamido)pentanoic acid (736 mg, 100%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 11.99 (s, 1H), 8.53 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 3.24 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.52-1.51 (m, 4H).
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム:メタノール = 10:0 → 5:1) にて精製し、8-(4-ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 72%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.17 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.18 (s, 1H), 2.36-2.33 (m, 2H), 1.68-1.57 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 8H).
5-(4-Ethynylbenzamido)acetic acid (21.0 mg, 100 μmol) をTHF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (48.0 mg, 300 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (57.0 mg, 300 μmol)を加え、5時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 10:1 → 3:1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate (7.5 mg, 27%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 1H), 4.24 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 4H), 3.20 (s, 1H).
5-(4-Ethynylbenzamido)pentanoic acid (73.5 mg, 300 μmol) をDMF (5 mL) に加え、60 ℃ で撹拌しながらN-hydroxysuccinimide (41.4 mg, 360 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (69.0 mg, 360 μmol)、4-dimethylaminopyridine (7.3 mg, 60.1 μmol) を加えた後、30分間撹拌した。室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 5:1 → 2:3) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (53.9 mg, 56%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.32 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.69 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.91-1.84 (m, 2H), 1.80-1.73 (m, 2H).
5-(4-Ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 200 μmol) をDMF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (28.0 mg, 240 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (46.0 mg, 200 μmol)を加え、室温で19時間撹拌した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 30:1 → 1:1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminooctanoate (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.83 (s, 4H), 2.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 2H), 1.47-1.34 (m, 8H).
4-Ethynyl-N-(5-hydroxyethyl)benzamide (95.0 mg, 500 μmol) をDMF (5 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (148 μL, 1.0 mmol)、diphenylphosphorylazide (215 μL, 1.0 μmol) を加えた後、8時間撹拌した。室温で30分間撹拌した後、蒸留水 (5 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 30:1 → 1:1) にて精製し、N-(5-azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (18.0 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.90 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H).
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (69.3 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (89 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 5:1 → 1:1) にて精製し、N-(5-azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (49.0 mg, 64%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.20 (s, 1H), 3.48-3.43 (m, 2H), 3.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.69-1.61 (m, 4H), 1.50-1.43 (m, 2H).
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (90 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 30:1 → 1:1) にて精製し、N-(8-azidooctyl)-4-ethynylbenzamide (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.17 (s, 1H), 1.74-1.24 (m, 12H).
N-(2-Azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、5時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(2-aminoethyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideを acetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 50:1 → 0:1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole (37.2 mg, 80%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
N-(5-Azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (40.1 mg, 150 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (59.5 mg, 225 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(5-aminopentyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (5 mL) に溶解した後、NaOMe (20.4 mg, 300 μmol)、maleic anhydride (29.4 mg, 300 μmol) を加え、6時間加熱還流した。蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 50:1 → 0:1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (135 mg, 43%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
N-(8-Azidooctyll)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL)、蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(8-aminooctyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:酢酸エチル = 10:1 → 2:1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole (5.6 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.67 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 4.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.52-3.42 (m, 4H), 3.19 (s, 1H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.45-1.20 (m, 8H).
以上のようにして合成した実施例2のエチニル基含有環状イミド化合物5を、トリペプチドの一種であるグルタチオン(還元型)のチオール基に修飾させた。反応式を化12に示し、反応条件及び結果を表1に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のEtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の DMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
上記のようにして得られたグルタチオン(酸化型)−エチニル基含有環状イミド化合物5修飾体について、アジド化合物とのクリック(Huisgen)反応を行った。反応式を化13に示し、反応条件及び結果を表2に示す。表2から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック(Huisgen)反応が起こることがわかった。
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (4 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。5分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
実施例1のエチニル基含有環状イミド化合物3をトリペプチドの一種であるグルタチオン(酸化型)のアミノ基に修飾させた。反応式を化14に示し、反応条件及び結果を表3に示す。
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック(Huisgen)反応を行った。反応式を化15に示し、反応条件及び結果を表4に示す。表4から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック(Huisgen)反応が起こることがわかった。また、還元性の強いアスコルビン酸ナトリウムを添加しているにもかかわらず、S−S結合は維持されることが分かった。
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、DMSO (16 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (10 μL) 溶液、DMSO (10 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
実施例1のエチニル基含有環状イミド化合物3を14アミノ酸からなる生体ペプチド(ペプチドホルモン)であるソマトスタチンのアミノ基に修飾させた。反応式を化16に示し、反応条件を表5に示す。また、UPLC-MSの測定結果を図1に示す。図1のUPLC-MSの測定結果より、モノ標識体及びジ標識体が生成していることが分かった。さらには、エドマン分解により、エチニル基含有環状イミド化合物3は N末端アミノ基よりリジン残基側鎖のアミノ基と優先的に反応することが分かった。
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。2時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
上記のようにして得られたソマトスタチン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック(Huisgen)反応を行った。反応式を化17に示し、反応条件及び結果を表6に示す。表6から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック(Huisgen)反応が起こることがわかった。
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1896.8; observed mass [M+H]- 1896.3
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1915.8; observed mass [M+H]- 1916.6
実施例4のエチニル基含有環状イミド化合物19を、トリペプチドの一種であるグルタチオン(還元型)のチオール基に修飾させた。反応式を化18に示し、反応条件及び結果を表7に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (1.0 mg) の EtOH (100 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
上記のようにして得られたグルタチオン(酸化型)−エチニル基含有環状イミド化合物19修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック(Huisgen)反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化19に示す。化19から、室温において短時間かつ高収率でクリック(Huisgen)反応が起こることがわかった。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 768.3; observed mass [M-H]- 769.6
実施例4のエチニル基含有環状イミド化合物12をトリペプチドの一種であるグルタチオン(酸化型)のアミノ基に修飾させた。反応式を化20に示し、反応条件及び結果を表8に示す。
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液:0.1 % TFA/Milli-Q water、B液:0.1 % TFA/MeCN、binary gradient:初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物12修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック(Huisgen)反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化21に示す。化21から、室温において短時間かつ高収率でクリック(Huisgen)反応が起こることがわかった。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 989.3; observed mass [M-H]- 989.7
Claims (18)
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、R3は水素であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びR3はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
- nは1以上10以下であることを特徴とする請求項2又は4に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
- R1及びR2は水素であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか1項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
- 請求項1又は2のエチニル基含有環状イミド化合物からなるアミノ基修飾剤。
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、R3は水素であることを特徴とする請求項9に記載のアミノ基修飾剤。
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びR3はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項9又は10に記載のアミノ基修飾剤。
- nは1以上10以下であることを特徴とする請求項9乃至11のいずれか1項に記載のアミノ基修飾剤。
- R1及びR2は水素であることを特徴とする請求項9乃至12のいずれか1項記載のアミノ基修飾剤。
- 請求項3又は4のエチニル基含有環状イミド化合物からなるチオール基修飾剤。
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、R3は水素であることを特徴とする請求項14項に記載のチオール基修飾剤。
- ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びR3はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項14又は15に記載のチオール基修飾剤。
- nは1以上10以下であることを特徴とする請求項14乃至16のいずれか1項に記載のチオール基修飾剤。
- R1及びR2は水素であることを特徴とする請求項14乃至17のいずれか1項記載のチオール基修飾剤。
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