CN1820025A - 荧光素标记的肽 - Google Patents

荧光素标记的肽 Download PDF

Info

Publication number
CN1820025A
CN1820025A CN200480019515.0A CN200480019515A CN1820025A CN 1820025 A CN1820025 A CN 1820025A CN 200480019515 A CN200480019515 A CN 200480019515A CN 1820025 A CN1820025 A CN 1820025A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
acid
cys
amino
fluorescein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200480019515.0A
Other languages
English (en)
Inventor
A·库思伯特森
B·因德雷沃尔
M·索尔巴肯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ANCHEN PHARMACEUTICALS AS
GE Healthcare AS
Original Assignee
ANCHEN PHARMACEUTICALS AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ANCHEN PHARMACEUTICALS AS filed Critical ANCHEN PHARMACEUTICALS AS
Publication of CN1820025A publication Critical patent/CN1820025A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546Integrin superfamily
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及新的基于肽的化合物及其在诊断性光学成像中的应用。更具体地,本发明涉及这些基于肽的化合物作为靶向性载体的用途,所述载体结合与血管生成相关联的受体。所述化合物用荧光素进行标记并且可以在血管生成相关疾病诊断的光学成像中用作造影剂。

Description

荧光素标记的肽
发明领域
本发明涉及新的基于肽的化合物及其在诊断性光学成像中以及在疾病治疗中的应用。更加具体地,本发明涉及这些基于肽的化合物作为靶向性载体的用途,所述载体结合与血管生成相关联的受体。所述化合物可以在血管生成相关疾病的诊断中用作造影剂。
发明背景
通常,新的血管可以通过两种不同机制形成:血管发生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)。血管生成是通过由现有血管中分枝而形成新血管。这一过程的原发刺激可以是对组织中的细胞供应营养和氧气不足(组织缺氧)。所述细胞可以通过分泌血管生成因子来应答,所述因子有多种;一种经常提到的例子是血管内皮生长因子(VEGF)。这些因子引发破坏基膜蛋白质的蛋白分解酶以及限制这些潜在有害酶作用的抑制剂的分泌。血管生成因子的其它显著作用是引发内皮细胞迁移和分裂。附着于基膜上的内皮细胞不进行有丝分裂,所述基膜在腔面对侧(contralumenal side)围绕血管形成连续的薄层。附着的缺失和来自血管生成因子受体的信号的合并效果导致内皮细胞移动、增殖和自身重排,并最终围绕新血管合成基膜。
血管生成在组织的生长和改型,包括伤口愈合和炎症过程中是显著的。血管生成的抑制也被视作抗肿瘤疗法的有希望的策略。伴随血管生成的转化对于诊断也是非常有希望的,一个明显的例子是恶性疾病,不过这种概念在炎症和多种与炎症相关疾病,包括动脉粥样硬化症中也显示了很大希望,因为早期动脉粥样硬化病变的巨噬细胞是血管生成因子的潜在来源。这些因子也参与心肌梗塞部分的血管再形成,这发生在狭窄在很短时间内被缓解的情况下。
与新血管形成或血管生成,新血管的成长或增殖有关的其它不希望的状况的例子在下面显示。关于这一点也可参见WO98/47541。
与血管生成相关的疾病和征候(indications)是,例如不同形式的癌症和转移,例如乳房、皮肤、结肠直肠、胰腺、前列腺、肺或卵巢癌。
其它疾病和征候是炎症(例如慢性的)、动脉粥样硬化症、风湿性关节炎和牙龈炎。
与血管生成相关的其它疾病和征候是动静脉形成异常、星细胞瘤、绒毛膜癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管瘤(儿童,毛细血管)、肝细胞瘤、子宫内膜增生、心肌局部缺血、子宫内膜异位、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、阻塞性外周动脉疾病、骨关节炎、牛皮藓、视网膜病(糖尿病性的、增生性的)、硬皮病、精原细胞瘤和溃疡性结肠炎。
血管生成涉及内皮细胞和周围组织特有的受体。这些标记包括生长因子受体如VEGF和受体的整合素(integrin)家族。免疫组化研究已经显示多种整合素,也许最重要地是αν类,在血管的顶端表面表达[Conforti,G.,et al.(1992)Blood 80:37-446]并且可用作循环配体的靶[Pasqualini,R.,et al.(1997)Nature Biotechnology 15:542-546]。在促进纤连蛋白基质组装以及引发细胞与纤连蛋白的附着中,α5β1也是一种重要的整合素。它还在细胞迁移中发挥重要作用。
整合素ανβ3是已知与血管生成相关的受体的其中一种。在血管生成过程的关键时期中,受刺激的内皮细胞似乎依赖于这种受体存活,因为整合素ανβ3受体/配体相互作用的拮抗剂诱导凋亡并且抑制血管生长。
整合素是异源二聚体分子,其中α-和β-亚基穿透细胞膜脂质双分子层。α-亚基在其细胞外链上有四个Ca2+结合结构域,β-亚基有多个细胞外半胱氨酸富集结构域。
许多参与细胞粘附的配体(例如纤连蛋白)含有三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。RGD序列似乎作为提呈该序列的配体和细胞表面受体之间的主要识别位点而起作用。一般认为,配体和受体之间的二级相互作用增强了相互作用的特异性。这些二级相互作用可能在配体和受体的紧邻RGD序列的部分(moieties)之间或在远离RGD序列的位点上发生。
已知RGD肽与一定范围的整合素受体结合,并且具有调节多种在临床中有重要应用的细胞内事件的潜力。也许RGD肽及其模拟物的被最广泛研究的效应涉及它们作为抗血栓形成剂的用途,其中它们靶向的是血小板整合素GpIIbIIIa。
在例如WO97/06791和WO95/25543中,已经描述了使用抗体或含RGD的肽,通过给药ανβ3或ανβ5拮抗剂抑制组织中的血管生成。EP578083描述了一系列含单环RGD的肽。
在WO98/54347和WO95/14714中,也描述了包含多个桥键的环状RGD肽。
基于包含RGD的肽的化合物的其它例子还见于WO01/77145,W002/26776和W003/006491。
临床上有必要发展对血管生成相关疾病更加特异的非侵入性成像技术。这些成像技术将在新型抗血管生成疗法的评估中发挥主要作用。能够评估血管生成的实际水平将在早期诊断血管生成相关疾病中具有临床益处。现在已经令人吃惊地发现光学成像可以用于评估血管生成的水平,并且为此目的本发明提供了新的光学成像造影剂。
发明概述
考虑到本领域的需要,本发明提供用荧光素标记的基于肽的化合物,用作光学成像中或治疗性处理的造影剂。与体内血管发生相关的整合素受体的有效靶向和成像需要选择性的、高亲和性的基于RGD的载体,其在化学上是坚实的(robust)和稳定的。而且,当设计成像剂以便减少背景嗓音的问题时,排出途径是一个重要因素。本发明中所述荧光素标记的肽化合物符合这些严格条件。
发明详述
从一方面来看,本发明提供如权利要求书中所定义的新的基于肽的化合物。这些化合物具有对于整合素受体的亲和性,例如,对于整合素ανβ3的亲和性,并且用荧光素染料报告分子进行标记。
所述化合物或其生理上可接受的盐,包含肽性载体(peptidicvector)和至少一种荧光素染料,其中所述肽性载体包含氨基酸序列X3-G-D并且其中所述肽性载体和荧光素染料优选通过共价键偶联。X3代表精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物,G代表甘氨酸而D代表天冬氨酸。所述肽性载体具有对于整合素受体的亲和性,如,对于ανβ3受体的亲和性。
本发明的化合物包含对整合素受体具有亲和性的氨基酸序列X3-G-D。所述化合物优选进一步包含氨基酸,以及任选的其它部分,其中所述X3-G-D序列是肽性载体的结合座位,所述肽性载体作为结合整合素型受体的载体而起作用。
本发明的化合物可以例如通过在肽性载体部分上形成一个或多个环化桥键而进行限定。单环肽化合物可以通过在氨基酸之间形成二硫键或硫醚键而获得。包括一个环化桥键的基于肽的化合物对于ανβ3更加特异,并且比线性肽更加优选。本发明的化合物优选包含所述化合物不同氨基酸之间的两个环化桥键。术语“环化桥键(cyclisingbridges)”指氨基酸或带有氨基酸和-(CH2)n-或-(CH2)n-C6H4-基团与允许引入桥键的官能团的任意组合。n代表从1到10的正整数。一些优选的例子是二硫化物、二硫化物类似物,例如-(CH2)4-碳桥键(carba bridge)、硫缩醛、硫醚桥键(胱硫醚或羊毛硫氨酸)以及含酯和醚的桥键。优选地,一个桥键形成二硫键而第二个桥键包含硫醚(硫化物)键。
在另一个实施方案中本发明的化合物由包含两个环化桥键的式(I)进行鉴别,
Ra-C(=O)-X1-X2-X3-G-D-X4-X5-X6-X7
                     (I)
其中,
X3,G和D由先前所定义;和
Ra代表与X2,X4或X6形成桥键的-(CH2)n-或-(CH2)n-C6H4-;
其中
n代表从1到10的正整数;和
X1代表键或1、2、3、4或5个氨基酸残基,其中一个氨基酸残基任选地用间隔物部分进行功能化,并且优选地所述氨基酸残基具有功能性侧链,例如酸或胺基,优选选自天冬氨酸或谷氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、diaminoalcylic acid或二氨基丙酸;和
X2和X4独立地代表能够形成环化桥键的氨基酸残基,如形成二硫键或硫醚键的半胱氨酸或高半胱氨酸残基,或能够形成环化桥键的其它氨基酸残基,如天冬氨酸和赖氨酸,优选地X2和X4代表半胱氨酸或高半胱氨酸的残基;
X5代表疏水氨基酸或其衍生物,并且优选代表酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸(naphthylalanine)残基,并且更加优选为苯丙氨酸或3-碘-酪氨酸残基;
X6代表能够形成环化桥键的氨基酸残基,优选为包含硫羟基的氨基酸残基,优选为半胱氨酸或高半胱氨酸残基;
X7代表间隔物或生物修饰物部分或不存在,并且优选基于包含1-10个单位所述结构单元的单分散性聚乙二醇(PEG)结构单元上,所述生物修饰物具有改变所述试剂的药物动力学和血液清除速率的功能。此外,X7还可以代表1-10个氨基酸残基,优选包含甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或丝氨酸。更加优选地,X7代表包含氨基酸残基和PEG样结构的间隔物或生物修饰物,如1-10个氨基酸残基结合PEG样结构,优选双氨基乙基乙二醇甘氨酸组合。在一个优选的实施方案中,X7代表包含单分散性PEG样结构、式(II)的17-氨基-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸的单元,
其中m相当于从1-10的整数并且其中C末端是酰胺或酸部分。据发现所述生物修饰剂,X7,改变所述化合物的药物动力学和血液清除速率。所述生物修饰剂造成在组织,即肌肉、肝等中更少吸收所述化合物,因而由于更小的背景干扰而给出更好的诊断图像。由于所述生物修饰剂的另一种优点,分泌主要是通过肾进行的;以及
将进一步包含至少一个基团Z的化合物任选地通过间隔物基团连接于X1,X6或X7中的一个或多个,所述Z代表荧光素基团。
所述基于肽的化合物包含由氨基酸序列定义的肽性载体并且这种肽构成对血管生成相关整合素受体具有亲和性的靶向载体(targetingvector),所述氨基酸序列是由式I的X1、X2、X3、G、D、X4、X5和X6形成的。
依赖于环化桥键的位置,所述化合物将包括“离散”、“巢式(nested)”或“联锁”的构型。优选地每种化合物中的两个桥键是:
在Ra和X6之间,以及在X2和X4之间(形成巢式构型);
在Ra和X2之间,以及在X4和X6之间(形成离散构型);在Ra和X4之间,以及在X2和X6之间(形成联锁构型)。
在另一个实施方案中,通过以下式的其中之一来表征本发明的化合物:
Figure A20048001951500101
其中Ra、X1、X3、G、D、X5和X7如式I所定义的;并且其中
X2、X4和X6代表能够形成二硫键或硫醚键的氨基酸残基,如半胱氨酸或高半胱氨酸;
W1是间隔物部分或不存在,并且优选源自戊二酸和/或琥珀酸和/或基于聚乙二醇的单元,例如,包括如式II所给出的部分,将荧光素染料连接于所述肽上。其它的示例性间隔物(W1)元件包括结构型多糖、贮存型多糖、多聚氨基酸及其甲酯和乙酯,以及多肽、寡糖和寡核苷酸,其可以包含或可以不包含酶剪切位点。间隔物部分W1的作用是使相对庞大的染料远离所述肽组分的受体结合结构域;
h是正整数1或2;
并且其中至少存在Z基团的一种,代表荧光素染料。
所述化合物优选只包括一种Z基团。
由Z表示的荧光素染料可以连接于X1、W1、X6或X7上,优选通过酰胺键的形成。
在一个优选的方面,式III-V的化合物或其生理上可接受的盐具有下列特性:
Ra优选代表-(CH2)-。
另外,X1代表具有功能性侧链,如酸或胺基的氨基酸残基,所述氨基酸优选选自天冬氨酸或谷氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、diaminoalcylicacid或二氨基丙酸;更加优选天冬氨酸或赖氨酸。
X2、X4和X6优选独立地代表半胱氨酸或高半胱氨酸残基。
X3优选代表精氨酸。
X5优选代表酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸残基,并且更加优选为苯丙氨酸或3-碘-酪氨酸。
X7和W1分别为式I和II-V所定义。优选地X7包含1-10个单位单分散性PEG结构单元或不存在,而W1优选是不存在的。
Z代表荧光素染料或不存在,从而使所述化合物至少包含一种荧光素染料。
在一个优选的方面所述化合物是式III(巢式)或其生理上可接受的盐,并且更加优选地它们具有上述优选方面中所给出的特性。
式III-V的化合物包含至少两个桥键,其中一个桥键形成二硫键而第二个桥键包含硫醚(硫化物)键。式III的优选化合物具有这样定位的桥键,即所述桥健将肽部分折叠成‘巢式’构型。因而本发明这个实施方案的化合物每个分子部分具有最多一个二硫桥键。本发明所定义的化合物在体内和在用荧光素标记期间采用的条件下令人惊讶地稳定。
报告物Z包含荧光素染料,即荧光素或荧光素的衍生物。荧光素是一种黄色染料,它在可见光下发光。荧光素一般由氩激光器的488nm光线激发,于530nm处收集发射光。荧光素及其衍生物具有相对高的吸收率,优异的荧光量子输出和良好的水溶性。过去的广泛使用使得它们得到充分的特征鉴定,可获得性非常好并且它们每mg具有一般性的低成本。
式(VI)给出荧光素,其中显示了不同位置的编号。
Figure A20048001951500121
                    (VI)荧光素
荧光素的相关衍生物是例如羧基荧光素,如式VII所显示的5-羧基荧光素或6-羧基荧光素。
                  (VII)羧基荧光素
另一种相关的荧光素衍生物是式VIII给出的荧光素异硫氰酸盐:
Figure A20048001951500123
                 (VIII)荧光素异硫氰酸盐
更加优选地是使用激活的荧光素羧酸盐/酯,如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,称作荧光素NHS酯,显示于式IX中。琥珀酰亚胺基酯是极好的试剂,因为形成的酰胺产物十分稳定。
Figure A20048001951500131
                    (IX)荧光素NHS酯
由Z所代表的荧光素染料可以连接于式I的X1,X6或X7上,或者任选地通过如式III-V中给出的间隔物W1进行连接。优选地,荧光素通过与所述肽的合适氨基形成酰胺键而偶联到肽性载体上。在合成所述化合物时,荧光素的活性酯如NHS酯(Pierce Catalog 46100)被认为特别有用。优选的荧光素偶联位点是位置5和6。
优选地所述氨基酸可以代表天然发生的氨基酸。在大多数情况下,优选所述肽中的氨基酸全部都是L-形式的。不过,在本发明的某些实施方案中所述肽的一个、两个、三个或更多个氨基酸优选是D-形式的。加入这种D-形式的氨基酸可以对所述化合物的血清稳定性具有显著作用。
本发明的某些化合物是高亲和性基于RGD的载体。如本文所用的,术语“高亲和性基于RGD的载体”指在对ανβ3整合素的竞争性结合测试中具有<10nM,优选<5nM的Ki的化合物,其中通过与已知的高亲性配体小蝰蛇毒素(echistatin)进行竞争来测定Ki值。实施这种竞争性测试的方法是本领域公知的。
下面例示一些优选的本发明的化合物。化合物A和B包含通过形成酰胺键缀合到包含RGD的肽(Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys)上的荧光素,二者都给出“巢式”构型。
化合物A:
Figure A20048001951500141
化合物B:
Figure A20048001951500142
通过下面的化合物C和D例示本发明化合物的其它例子。
化合物C:
该化合物包含连接于荧光素上的RGD肽(Lys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly),形成“离散的”构型。
Figure A20048001951500151
化合物D:
该化合物包含连接于荧光素上的RGD肽(Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys),形成“联锁的”构型。
本发明的新化合物可以用作光学成像中的造影剂或用于疾病的治疗。因此所述用于治疗或在光学成像中作为造影剂的化合物的用途是本发明的实施方案。本发明的优选的实施方案是所述化合物,用作光学成像造影剂,特别用于血管生成相关疾病的光学成像和诊断。
本发明的化合物在人和动物中都可以用作血管生成检测的成像试剂。所述产物还可以用于临床前的动物模型并且可以在药学研究,例如肿瘤学中监测新药物的疗效。
本发明还提供药物组合物,其包含与一种或多种药学可接受的辅剂、赋形剂或稀释剂一起的有效量的(例如对于增强体内成像对比度有效量的)本发明的化合物,或其盐。
本发明进一步提供用于治疗疾病的药物组合物,其包含与一种或多种可药用的辅剂、赋形剂或稀释剂一起的有效量的本发明的化合物,或其盐。
从另一方面来看,本发明提供了本发明化合物的用途,用于生产光学成像对比介质以用在诊断方法中,所述诊断方法包括向人或动物躯体施用所述对比介质以及产生至少部分所述躯体的图像。
因此认为所述化合物在治疗性组合物(药物)生产中以及在对人或动物躯体的治疗性或预防性处理,优选血管生成相关疾病的处理方法中的用途代表本发明的另外的方面。
仍然从另一方面来看本发明提供通过光学成像生成人或动物躯体的图像的方法,包括向所述躯体施用造影剂,例如施用于血管系统并生成已分布所述造影剂的至少一部分所述躯体的图像,其中所述造影剂被用作所述的化合物。
仍然从另一方面来看本发明提供通过光学成像预先施用包含所定义化合物的造影剂组合物生成人或动物躯体改进的图像的方法,所述方法包括生成至少部分所述躯体的图像。
从另一方面来看本发明提供监测用一种药物治疗人或动物躯体以对抗与血管生成相关的状况的效果,所述方法包括向所述躯体施用本发明的试剂并且检测细胞受体,优选内皮细胞受体特别是ανβ3受体对所述试剂的吸收,任选地但优选地反复进行所述施用和检测,例如,在用所述药物治疗之前、之中和之后。所述检测包含光学成像技术。
由于本发明的荧光素以及荧光素-肽化合物在光谱的可见光范围内发射,可以使用传统的检眼镜检查设备来获得图像。另外,可以应用体内共焦显微镜。还可能利用荧光团的其它特性,如寿期,而使用最近发展的时域和频域(time-domain and frequency-domain)成像技术。
利用所有已知的化学合成方法可以合成本发明的化合物,但特别有用的是采用自动肽合成仪的Merrifield固相方法(J.Am.Chem.Soc.,85:2149(1964))。此外,还可以自动地进行荧光素,如荧光素活性酯的偶联,产生在肽性载体和荧光素基团之间的酰胺键。在体外筛选中的测试之前,所述肽性载体和肽化合物可以利用高效液相色谱(HPLC)进行纯化并通过质谱分析和分析型HPLC进行特征鉴定。
现在将通过下列非限制性实施例的方式对本发明作进一步说明。
实施例
实施例1:二硫[Cys2-6]硫醚环[CH2CO-Lys(荧光素)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-PEG-NH2的合成
1a)17-(Fmoc-氨基)-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸的合成
利用Fmoc化学将这种结构单元偶联于固相上。这种结构单元的偶联形式将被简称为PEG。
1,11-二叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷
将干燥四甘醇(19.4g,0.100mol)与甲磺酰氯(25.2g,0.220mol)在干燥THF(100ml)中的溶液保持于氩气下并在冰/水浴中冷却至0℃。将干燥THF(25ml)中的三乙胺(22.6g,0.220mol)逐滴加至烧瓶中持续45分钟。1小时后去除冷浴并继续搅拌4小时。加入水(60ml)。向混合物中依次加入碳酸氢钠(6g,至pH 8)和叠氮化钠(14.3g,0.220mmol)。通过蒸馏去除THF并将该水溶液回流24小时(形成两层)。将混合物冷却并加入乙醚(100ml)。将水相用氯化钠进行饱和。分离各相并用乙醚(4×50ml)对水相进行萃取。将合并的有机相用盐水洗涤(2×50ml)并进行干燥(MgSO4)。过滤和浓缩给出22.1g(91%)的黄色油。将产物用于下一步而无需进一步纯化。
11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一胺
在3小时中于室温将三苯膦在乙醚(150ml)中的溶液(19.9g,0.073mol)加入到机械剧烈搅拌的1,11-二叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷(20.8g,0.085mol)在5%盐酸(200ml)中的悬浮液里。将反应混合物再搅拌24小时。分离各相并用二氯甲烷(3×40ml)对水相进行萃取。将水相在冰/水浴中冷却并通过加入KOH将pH调节到约12。将产物萃取入二氯甲烷(5×50ml)中。对合并的有机相进行干燥(MgSO4)。过滤和蒸发给出14.0g(88%)的黄色油。通过MALDI-TOF质谱分析(基质:α-氰基-4-羟基肉桂酸)进行分析如预期地那样于219处给出M+H峰。利用1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR光谱分析作进一步特征鉴定证实了该结构。
17-叠氮-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸
向11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一胺(10.9g,50.0mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中加入二甘醇酸酐(6.38g,55.0mmol)。将反应混合物搅拌过夜。HPLC分析(柱Vydac 218TP54;溶剂:A=水/0.1%TFA和B=乙腈/0.1% TFA;梯度4-16% B 20min;流速1.0ml/min;UV检测于214和284nm),显示起始物质完全转变为具有18.3min滞留时间的产物。将溶液进行浓缩以给出定量的黄浆产出。通过LC-MS(ES电离)分析产物,如所预期地于335处给出[MH]+。1H(500MHz)13C(125MHz)NMR光谱分析与该结构一致。将产物用于下一步而无需进一步纯化。
17-氨基-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸
利用H2(g)-Pd/C(10%)还原17-叠氮-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸(8.36g,25.0mmol)在水(100ml)中的溶液。进行反应直到LC-MS分析显示起始物质(柱Vydac 218TP54;溶剂:A=水/0.1%TFA和B=乙腈/0.1% TFA;梯度4-16% B 20min;流速1.0ml/min;UV检测于214和284nm,ES电离对于起始物质于335处而对于产物在309处给出M+H)完全转变。过滤溶液并直接用于下一步骤中。
17-(Fmoc-氨基)-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸
将碳酸氢钠(5.04g,60.0mmol)和二噁烷(40ml)加入到以上17-氨基-5-氧-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸(对应于25.0mmol氨基酸)的水溶液中。逐滴加入二噁烷(40ml)中的Fmoc-氯化物(7.11g,0.275mol)溶液。将反应混合物搅拌过夜。蒸发出二噁烷(旋转蒸发仪)并用乙酸乙酯萃取水相。通过加入盐酸将水相酸化并将沉淀物质萃取入氯仿中。将有机相干燥(MgSO4)、过滤并浓缩以给出11.3g黄浆(85%)。通过LC-MS分析(柱Vydac 218TP54;溶剂:A=水/0.1%TFA和B=乙腈/0.1% TFA;梯度40-60% B 20min;流速1.0ml/min;UV检测于214和254nm,ES电离如所预期地在第5、8分钟于531处给出产物峰的M+H)确认结构。分析显示极低含量的副产品并且利用该物质而不需进一步纯化。
1b)ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-PEG-NH2的合成
开始以0.25mmol的规模,通过HATU活化进行介导,将PEG单元手工偶联到Rink Amide AM树脂上。利用1mmol氨基酸存储器在ABI 433A自动肽合成仪上装配剩余的肽。在偶联前利用HBTU对氨基酸进行预活化。利用氯乙酸酐在DMF中的溶液将N末端胺基基团氯乙酰化30分钟。在包含TIS(5%),H2O(5%)和苯酚(2.5%)的TFA中从树脂上同时去除肽和侧链保护基团(除了tBu)两小时。加工后获得322mg的粗制肽(分析型HPLC:梯度,5-50% B 10min,其中A=H2O/0.1% TFA和B=CH3CN/0.1% TFA;柱,Phenomenex Luna 3μCl8(2)50×4.6mm;流速,2mL/min;检测,UV 214nm;产物滞留时间,6.37min)。利用质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1409处,发现,于1415处。
1c)硫醚环[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-PEG-NH2的合成
Figure A20048001951500192
将322mg的ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2溶于水/乙腈中。用氨溶液将混合物调节到pH8并搅拌16小时。加工后获得粗制肽(分析型HPLC:梯度,5-50% B10min,其中A=H2O/0.1% TFA和B=CH3CN/0.1% TFA;柱,Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm;流速,2mL/min;检测,UV 214nm;产物滞留时间,6.22min)。利用质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1373处,发现,于1378处。
1d)二硫[Cys2-6]硫醚环[CH2CO-Lys-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-PEG-NH2的合成
Figure A20048001951500201
用茴香醚(200μL),DMSO(2mL)和TFA(100mL)的溶液处理硫醚环[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2 60分钟,然后真空除去TFA并通过添加二乙基醚沉淀肽。利用0-30% B实施由制备型HPLC(Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm柱)进行的70mg粗制物质的纯化,其中A=H2O/0.1%TFA而B=CH3CN/0.1% TFA,40min,流速为10mL/min。冻干后获得46mg的纯物质(分析型HPLC:梯度,0-30% B,10min,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;柱,Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm;流速,2mL/min;检测,UV 214nm;产物滞留时间,6.80min)。利用质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1258.5处,发现,于1258.8处。
1e)二硫[Cys2-6]硫醚环[CH2CO-Lys(荧光素)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-PEG-NH2的合成
将30mg的[Cys2-6]环[CH2CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-PEG-NH2,16.2mg的荧光素NHS酯和4μL的N-甲基吗啉溶于DMF(3mL)中。将混合物避光保护并搅拌过夜。利用20-30% B,实施由制备型HPLC(Vydac 218TP1022 C18柱)进行的反应混合物的纯化,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA,40min,流速为10mL/min。冻干后获得21.6mg的纯物质(分析型HPLC:梯度,10-40%B,10min,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;柱,Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm;流速,2mL/min;检测,UV 214nm;产物滞留时间,7.0min)。利用质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1616.5处,发现,于1616.3处。
实施例2:
二硫[Cys2-6]硫醚环[CH2CO-Asp-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly]-双(氨基乙基)乙二醇-荧光素的合成
2a.ClCH2CONH-Asp-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2的合成
利用1mmol氨基存储器以0.25mmol规模的邻双-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂起始在ABI 433A自动肽合成仪上合成所述肽。在偶联前利用HBTU对氨基酸进行预活化。利用氯乙酸酐将N末端氯乙酰化。在包含TIS(5%),H2O(5%)和苯酚(2.5%)的TFA中从树脂上同时去除肽和侧链保护基团(除了tBu)两小时。加工后获得364mg的粗制肽(分析型HPLC:梯度,5-50% B 10min,其中A=H2O/0.1%TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;2mL/min;柱,Phenomenex Luna 3μCl8(2)50×4.6mm;检测,UV 214nm;产物滞留时间,6.55min)。利用电喷射质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1293.5处,发现,于1293.4处。
2b.环[CH2CONH-Asp-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2的合成
Figure A20048001951500221
将250mg的ClCH2CONH-Asp-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2溶于水/乙腈中。用氨溶液将混合物调节到pH 8并搅拌18小时。冻干后获得的粗制肽为白色粉末。(分析型HPLC:梯度,5-50% B 10min,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;流速,2mL/min;柱,Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm;检测,UV 214nm;产物滞留时间,6.17min)。利用电喷射质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1257.5处,发现,于1257.6处。
2c.[Cys2-6]环[CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2的合成
Figure A20048001951500231
将环[CH2CONH-Asp-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2溶于茴香醚(500μl)、DMSO(4ml)和TFA(200ml)的溶液中。将混合物于室温搅拌15分钟,其后在真空中除去TFA并通过添加二乙基醚将肽沉淀。利用0-30% B实施由制备型HPLC(Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm柱)进行的粗制物质的纯化,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1%TFA,40min,流速为10mL/min。冻干后获得44mg的纯物质。(分析型HPLC:梯度,0-30%B,10min,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;流速,2mL/min;柱,Phenomenex Luna 3μC18(2)50×4.6mm;检测,UV 214nm;产物滞留时间,5.88min)。利用电喷射质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1143.4处,发现,于1143.5处。
2d.[Cys2-6]环[CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2与荧光素的缀合
Figure A20048001951500232
将10mg的[Cys2-6]环[CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Pbe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH2O)2CH2CH2NH2,4.7mg的荧光素NHS酯和5μL的4-甲基吗啉溶于DMF(0.5mL)中并将溶液搅拌3小时。利用0-30% B实施由制备型HPLC(Phenomenex Luna 5μC18(2)250x21.20mm柱)进行的粗制物质的纯化,其中A=H2O/0.1% TFA而B=CH3CN/0.1% TFA,40min,流速为10mL/min。冻干后获得6mg的纯物质。(分析型HPLC:梯度,0-30% B,10min,其中A=H2O/0.1%TFA而B=CH3CN/0.1% TFA;流速,2mL/min;柱,Phenomenex Luna3μC18(2)50x4.6mm;检测,UV 214nm;产物滞留时间,10.07min)。利用电喷射质谱分析实施进一步的产物特征鉴定:预期,M+H于1501.4处,发现,于1501.4处。
                               序列表
<110>Amersham Health AS
<120>基于肽的化合物
<130>PN0353
<150>N020033115
<151>2003-06-08
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<400>1
Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1               5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>THIOETH
<222>(1)..(8)
<223>氨基酸1和8之间的硫醚桥键
<220>
<221>DISULFID
<222>(2)..(6)
<223>氨基酸2和6之间的二硫桥键
<400>2
Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1               5
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<400>3
Lys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly
1               5                   10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>THIOETH
<222>(1)..(3)
<223>氨基酸1和3之间的硫醚桥键
<220>
<221>DISULFID
<222>(7)..(9)
<223>氨基酸7和9之间的二硫桥键
<400>4
Lys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly
1               5                   10
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<400>5
Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1               5
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>THIOETH
<222>(1)..(6)
<223>氨基酸1和6之间的硫醚桥键
<220>
<221>DISULFID
<222>(2)..(8)
<223>氨基酸2和8之间的二硫桥键
<400>6
Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1                5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<400>7
Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1               5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>THIOETH
<222>(1)..(8)
<223>氨基酸1和8之间的硫醚桥键
<220>
<221>DISULFID
<222>(2)..(6)
<223>氨基酸2和6之间的二硫桥键
<400>8
Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1               5

Claims (13)

1.一种化合物或其生理上可接受的盐,所述化合物包含肽性载体和至少一种荧光素染料,其中所述肽性载体包含氨基酸序列X3-G-D,其中所述肽性载体和所述荧光素染料是偶联的,并且其中
X3代表精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物,
G代表甘氨酸,
D代表天冬氨酸。
2.一种由式I给出的权利要求1中所要保护的化合物,
        Ra-C(=O)-X1-X2-X3-G-D-X4-X5-X6-X7
                       (I)
包含两个环化桥键,
其中X3,G和D如权利要求1中所定义的,并且其中
Ra代表与X2,X4或X6形成桥键的-(CH2)n-或-(CH2)n-C6H4-,其中n代表从1到10的正整数,并且
X1代表键或1、2、3、4或5个氨基酸残基,其中一个氨基酸残基任选地用间隔物部分进行功能化,或者所述氨基酸残基具有功能性侧链,如酸或胺基基团,
X2和X4独立地代表能够形成环化桥键的氨基酸残基,
X5代表疏水氨基酸或其衍生物,
X6代表能够形成环化桥键的氨基酸残基,
X7代表间隔物或生物修饰物部分或不存在,并且
所述化合物进一步包含至少一个基团Z,代表任选地通过间隔物基团连接于基团X1、X6或X7中的一个或多个的荧光素染料。
3.如权利要求2中所要保护的化合物,选自下列式中的一种;
Figure A2004800195150003C1
其中Ra,X1,X3,G,D,X5和X7如权利要求1和2中所定义的,并且其中
X2,X4和X6代表能够形成二硫键或硫醚键的氨基酸残基,
W1是间隔物部分或不存在,
h是正整数1或2,并且
其中至少存在一种Z基团,代表荧光素染料。
4.如权利要求3中所要保护的式III的化合物,其中Ra代表-(CH2)-。
5.如权利要求3或4所要保护的式III的化合物,其中X1代表具有功能性侧链如酸或胺基基团的氨基酸残基,所述氨基酸选自天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、高赖氨酸或diaminoalcylic acid或其衍生物。
6.如权利要求3-5中任一项所要保护的式III的化合物,其中X2、X4和X6独立地代表半胱氨酸或高半胱氨酸残基。
7.如权利要求3-6中任一项所要保护的式III的化合物,其中X3代表精氨酸。
8.如权利要求3-7中任一项所要保护的式III的化合物,其中X5代表苯丙氨酸、酪氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸。
9.如权利要求3-8中任一项所要保护的式III的化合物,其中X7代表1-10个单位的单分散性PEG结构单元或不存在。
10.一种药物组合物,其包含有效量的在前权利要求中任一项的化合物,以及一种或多种药学可接受的辅剂、赋形剂或稀释剂。
11.用作光学成像造影剂的如权利要求1-9中任一项的化合物。
12.如权利要求1-9中任一项所要保护的化合物在生产光学成像造影剂中的用途,所述造影剂用于诊断方法中,所述诊断方法包括向人或动物躯体施用所述造影剂以及产生至少部分所述躯体的图像。
13.一种通过光学成像生成人或动物躯体图像的方法,包括向所述躯体施用造影剂,并且生成已分布所述造影剂的至少一部分所述躯体的图像,特征是所述造影剂包含如权利要求1-9中任一项所要保护的化合物。
CN200480019515.0A 2003-07-08 2004-07-07 荧光素标记的肽 Pending CN1820025A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20033115 2003-07-08
NO20033115A NO20033115D0 (no) 2003-07-08 2003-07-08 Peptid-baserte forbindelser

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1820025A true CN1820025A (zh) 2006-08-16

Family

ID=27800789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200480019515.0A Pending CN1820025A (zh) 2003-07-08 2004-07-07 荧光素标记的肽

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7608243B2 (zh)
EP (1) EP1639004B1 (zh)
JP (1) JP4993463B2 (zh)
CN (1) CN1820025A (zh)
AT (1) ATE500271T1 (zh)
DE (1) DE602004031617D1 (zh)
ES (1) ES2361670T3 (zh)
NO (2) NO20033115D0 (zh)
WO (1) WO2005003166A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1272507B1 (en) * 2000-04-12 2005-06-29 Amersham Health AS Integrin binding peptide derivatives
AU2002313616A1 (en) * 2001-07-10 2003-01-29 Amersham Health As Peptide-based compounds for targeting intergin receptors
NO20034350D0 (no) * 2003-09-29 2003-09-29 Amersham Health As Optisk avbilding av kolorektal kreft
NO20035681D0 (no) * 2003-12-18 2003-12-18 Amersham Health As Optisk avbildning av lungekreft
NO20035683D0 (no) * 2003-12-18 2003-12-18 Amersham Health As Optisk avbildning av prostatakreft
CN101001870A (zh) * 2004-06-16 2007-07-18 通用电气医疗集团股份有限公司 基于肽的化合物
WO2005123767A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-29 Ge Healthcare As Peptide-based compounds
EP1814598B1 (en) 2004-11-22 2011-01-12 Ge Healthcare As Contrast agents to target extracellular matrix
GB0428012D0 (en) 2004-12-22 2005-01-26 Hammersmith Imanet Ltd Radiolabelling methods
US8236283B2 (en) * 2005-01-06 2012-08-07 Ge Healthcare As Optical imaging
ES2554993T3 (es) 2009-09-17 2015-12-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Sistema de análisis para el análisis de muestras biológicas, métodos y producto de programa informático
PL238871B1 (pl) * 2018-02-13 2021-10-18 Univ Gdanski Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
DE19808591C2 (de) * 1998-02-28 2000-02-03 Univ Leipzig Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay
EP1272507B1 (en) 2000-04-12 2005-06-29 Amersham Health AS Integrin binding peptide derivatives
NO20004795D0 (no) * 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
AU2002313616A1 (en) * 2001-07-10 2003-01-29 Amersham Health As Peptide-based compounds for targeting intergin receptors
GB0206750D0 (en) * 2002-03-22 2002-05-01 Amersham Plc Radiofluorination methods
GB0317815D0 (en) * 2003-07-30 2003-09-03 Amersham Health As Imaging agents

Also Published As

Publication number Publication date
NO20033115D0 (no) 2003-07-08
NO20056055L (no) 2006-02-13
ES2361670T3 (es) 2011-06-21
EP1639004B1 (en) 2011-03-02
NO332926B1 (no) 2013-02-04
EP1639004A1 (en) 2006-03-29
US20070183977A1 (en) 2007-08-09
ATE500271T1 (de) 2011-03-15
US7608243B2 (en) 2009-10-27
JP2007528846A (ja) 2007-10-18
JP4993463B2 (ja) 2012-08-08
DE602004031617D1 (de) 2011-04-14
WO2005003166A1 (en) 2005-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1088456C (zh) 取代的噁唑烷需钙蛋白酶和/或组织蛋白酶b抑制剂
CN1203090C (zh) 环化粘合抑制剂
CN1622830A (zh) 肽基化合物
CN1072647C (zh) 新的骨吸收的抑制剂和玻连蛋白受体的拮抗药
CN1073560C (zh) 环缩酚酸肽pf1022衍生物
CN1073113C (zh) 喜树碱衍生物及其制备方法和用途
CN1182154C (zh) 新的多拉抑放素衍生物及其制备方法和用途
CN1906209A (zh) 稳定的α螺旋肽及其用途
CN1820025A (zh) 荧光素标记的肽
CN1968928A (zh) 用于治疗高脂血症及相关疾病的杂环衍生物
CN1150206C (zh) 含有n-取代甘氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂肽
CN1161374C (zh) 环肽
CN1422278A (zh) kahalalide F及相关化合物
CN1119351C (zh) 环状粘着抑制剂
CN1956994A (zh) 上皮系细胞增殖促进剂
CN1491942A (zh) N-[n-n-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-n-乙基甘氨酰基]化合物的不吸湿的稳定结晶形式
CN1351505A (zh) 作为光学诊断用造影剂的短链肽-染料结合物
CN1116305C (zh) 肽衍生物
CN1361792A (zh) 作为整合蛋白αvβ6抑制剂的环肽衍生物
CN1086825A (zh) 三环和四环化合物
CN1255926A (zh) 20(s)一喜树碱的糖结合物
CN1166683C (zh) 具有器官保护活性的新的bpc肽盐,其制备方法及其在治疗中的应用
CN1051914A (zh) 肽类
CN1237075C (zh) 用作层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂的低分子量肽衍生物
CN1106001A (zh) 乳醇衍生物及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20060816