CN1150206C

CN1150206C - 含有n-取代甘氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂肽

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Publication number: CN1150206C
Application number: CNB951930176A
Authority: CN
Inventors: V��S��ŷ��; V·S·古费罗; M·V·马拉特; E·T·瓦利; �Ƴ�; T·D·菲茨帕特里克; K·G·库尔曼
Original assignee: Cortech Inc
Current assignee: Cortech Inc
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2015-03-07
Also published as: ATE280777T1; TW408133B; WO1995024422A1; CA2184824A1; DE69533704D1; JPH09511500A; EP0813544B1; ZA951974B; EP0813544A4; CN1148393A; KR100360639B1; AU1932595A; US5700779A; AU696429B2; EP0813544A1

Abstract

本发明提供了含有N-取代甘氨酸的血管舒缓激肽类肽，特别是血管舒缓激肽拮抗剂肽，可用于治疗某些由血管舒缓激肽介导的，包括疼痛和炎症的病理状态。

Description

含有N-取代甘氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂肽

本发明涉及一种激肽，更具体地说，涉及血管舒缓激肽受体拮抗剂。

血管舒缓激肽(BK)是一种内源性肽类激素，通过一组被称为激肽释放酶的肽链内切酶的作用，使激肽原蛋白水解断开而释放。在由刺激外周A-和C-纤维神经元而引发的包括疼痛和痛觉过敏等多种病理生理学反应中，血管舒缓激肽是介体。有证据表明，BK在炎症反应中起重要的作用，并且是几种病症的重要介体，包括与脓毒症有关的低血压，以及肺支气管疾患，如气喘。

BK拮抗剂被认为在阻止或降低BK的作用，并随之消除或减轻上面提到的疾病是有用的。还有令人信服的证据表明，血管舒缓激肽在治疗如下病症中可能是有用的：头部创伤性水肿(肿胀)，严重烧伤引起的水肿和疼痛，以及与手术或癌症有关的疼痛。

血管舒缓激肽是一个具有精氨酸¹-脯氨酸²-脯氨酸³-甘氨酸⁴-苯丙氨酸⁵-丝氨酸⁶-脯氨酸⁷-苯丙氨酸⁸-精氨酸⁹序列的九肽。在此所用的数字编码通常用于将激动剂或拮抗剂的相关序列与血管舒缓激肽的亲本结构进行比较的场合中。K.G.Claeson及其同事(美国专利4,242,329)证明，含有以D-苯丙氨酸或D-脯氨酸置换脯氨酸⁷的经修剪的血管舒缓激肽，显示出有弱的，但是可测定的血管舒缓激肽拮抗剂活性。Stewart将D-苯丙氨酸引入血管舒缓激肽序列的第7位置，结果产生对血管舒缓激肽受体具有拮抗活性的肽(美国专利No.4,801,613)。尽管这些化合物在理论上是令人感兴趣的，但它们缺乏作为有活性药剂的足够的效力和体内稳定性。

G.Breipohl和其同事在Hoechst(EPA 0 455 133 A2)以及D.Kyle和其同事在Scios-Nova(PCT/US92/03031)已经开发出一种高效血管舒缓激肽拮抗剂，它是在血管舒缓激肽序列的第7位置引入D-Tic，D-环己丙氨酸或者引入取代的D-脯氨酸类似物。在Hoechst合成的化合物含有D-Tic⁷，并且在第8位置必须含有一个杂环氨基酸，其中α-氨基酸氮和α-碳被引入到一个杂环中，除此之外，这种残基的例子还包括L-Oic或L-Tic。Kyle合成的化合物在第8位置引入了类似的杂环或者取代的4-羟基脯氨酸或取代的4-硫代脯氨酸。Young和其协作者已将N-苄基甘氨酸引入到血管舒缓激肽序列的第7位置，并且得到了具有中度血管舒缓激肽受体激动剂活性的肽(第十三届美国肽研讨会，埃德蒙顿，阿尔伯他，1993年6月20日)。

尽管已经有了一些成果，但仍然非常需要提供新的，经过改进的，具有有用的拮抗剂特性的BK拮抗剂。本发明的主要目的就是提供这样一种在其肽链中含有N-取代甘氨酸的拮抗剂。

用N-取代的甘氨酸作为其中设计关键的有效的血管舒缓激肽拮抗剂，在以前尚未被报导过。

发明概述

本发明提供了一种血管舒缓激肽拮抗剂，它们含有一个或者多个N-取代的甘氨酸残基，其中的N-取代基可以是一个烷基，环烷基，杂环基，芳香基，或芳香杂环基。这些化合物已显示出是血管舒缓激肽的高效拮抗剂，并且已证明在体内有极好的稳定性和作用持续时间。作为有效的血管舒缓激肽拮抗剂，本发明的化合物被认为对治疗由血管舒缓激肽所介导的一些病理状况是有用的，包括：疼痛，炎症，水肿，与头部损伤有关的水肿，叮咬和刺痛，周期性偏头痛，SIRS/脓毒症，慢性炎症，烧伤，小细胞癌，与气喘有关的呼吸道超敏感性和炎症。

发明详述

概括地说，本发明的血管舒缓激肽受体拮抗剂是一种含有一个或者多个N-取代的甘氨酸残基的肽。

更具体地说，本发明设计了有如下面通式(1)的血管舒缓激肽受体拮抗剂：

Z’-Z⁰-A¹-B²-C³-D⁴-E⁵-F⁶-G⁷-H⁸-I⁹-J¹⁰ (I)

其中：

Z’可任选为不存在，但如果存在，则是氢，乙酰基，金刚烷羟基，金刚烷乙酰基，(C₁～C₈)-烷基，烷酰基，芳基磺酰基，烷氧羰基，或者是一个二氧奎宁环基-羧酸的衍生物；

Z⁰可任选为存在，或者Z⁰和A¹(可能相同或不同)代表一个直链，氢，从如下氨基酸衍生而来的氨基酸残基：D或L精氨酸，D或L赖氨酸，D或L鸟氨酸，或者H₂N(NH＝C)NHCH₂CH₂CH₂(CH₂)_nCO-(其中n＝0-3)，或者是按照药物化学技术进行的在生理pH下含带正电荷的杂原子的精氨酸的普通取代，例如含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍或烷基鳞部分(moieties)的鸟氨酸，精氨酸，或赖氨酸的类似物或同系物，条件是当A¹是H₂N(NH＝C)NHCH₂CH₂CH₂(CH₂)_nCO-(其中n＝0-3)时，Z’和Z⁰不存在；当A¹是氢时，Z⁰和Z’不存在。

B²和C³可能相同或不同，是脯氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，硫脯氨酸，N-(甲基)丝氨酸，N-(甲基)苏氨酸，N-甲苯基丙氨酸，甘氨酸或NR’CHR”CO，其中R’和R”独立地是氢，烷基(例如C₁～C₈直链或支链烷基或C₃～C₈环烷基)，芳基，杂芳基，或烷氨基；

D⁴是甘氨酸，丙氨酸，或噻吩丙氨酸；

B²C³D⁴E⁵可以被-NH(C-₂)_nCO-取代，其中n是从4到14的整数；

E⁵是苯丙氨酸，甲基取代的苯丙氨酸，甘氨酸，环戊基甘氨酸，环己基甘氨酸，环己基丙氨酸，2-二氢化茚甘氨酸，噻吩丙氨酸，N-(2-二氢化茚)甘氨酸，或N-取代的甘氨酸，其中取代基是烷基(C₁-C₈)，环烷基(C₃-C₈)，CH₂Ar，CH₂CH₂Ar其中Ar是芳基，烷噻吩基，芳香族氨基酸，或者是在α-氮原子或α-碳原子上以甲基或乙基取代的芳香族氨基酸；

F⁶是一个侧链可能被取代的中性、碱性或酸性的脂肪族或芳香族氨基酸，例如被取代的丝氨酸，或半胱氨酸，其取代基可选自如下基团：N-(烷基)-琥珀酰亚胺，N-(烷基)吡咯烷酮，烷基(C₁-C₂₀)，链烯烷基(C₂-C₂₀)，芳基，或烷芳基(C₇-C₂₀)；

G⁷是一个芳香氨基酸，包括D-Tic，D-Dic，D-苯丙氨酸，二氢化茚甘氨酸，D-环戊基甘氨酸，D-环己基甘氨酸，D-脯氨酸，或者是在第3或第4位置以烷基，芳基，硫代烷基(thioalkyl)，硫代芳基(thioaryl)，氧烷基(oxyalkyl)，或氧代芳基(oxyaryl)取代的脯氨酸；或者是一个N-取代的甘氨酸残基，其中取代基可以是芳基，烷芳基，-CH₂R或-CH₂CH₂R，其中R是二氢化茚，吲哚，萘基或苯基；

H⁸是一个选自如下式所示的氨基酸残基：

或

其中m是一个1～6的整数；

R₁是烷基(C₁-C₁₂，直链或支链)，环烷基(C₃-C₈)，单环或多环芳基(例如苯基或萘基)，含有3-8个选自碳、氮、氧或硫原子的单环或多环的杂芳基或杂环基。

R₁还可以是被取代的环烷基，含有1～4个选自如下的取代基：氨基，苯并基，羟基，巯基，巯基烷基，烷基，氧烷基(oxyalkyl)，烷氧基(alkyloxy)，羧基，卤素，苯基，三氟甲基，三氟甲氧基，氨烷基，烷氨基，或氨甲酰基；

或者R₁也可以是被取代的芳基或杂芳基，含有1～4个选自从如下基团的取代基：氨基，苯基，羟基，巯基，巯基烷基，烷基，氧烷基，烷氧基，羧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，氨烷基，烷氨基，或氨甲酰基；R₂是氢，甲基或高级烷基(例如直链或支链的1～8个碳原子的烷基)，或者是一个氨基酸的酸性，碱性或中性的侧链(烷基或芳香基)；当G⁷是一个N-取代的甘氨酸时，H⁸可以是顺-内-八氢吲哚-2-羰基。

I⁹不存在或者是一个直链，羟基，或一个碱性、酸性或中性氨基酸，具体地说，是精氨酸或赖氨酸或H₂N(NH＝C)NHCH₂CH₂CH₂(CH₂)_n-NH-其中n＝0～3，或者按照药物化学技术进行的在生理pH下含带正电荷的杂原子的精氨酸的普通取代，例如含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍，或烷基膦部分的精氨酸或赖氨酸的类似物或同系物，条件是当J10存在时，I9不是OH，当J¹⁰不存在时，I⁹不存在或不是一个直键；

J¹⁰不存在，或者如果存在，则是羟基，或者是一个碱性，酸性或中性的氨基酸，或O-R，或NHR，在此R是一个含有1～15碳原子的烷基(直链或分支链的)。

本发明是建立在如下发现的基础上：把一个或多个N-取代的甘氨酸残基引入与血管舒缓激肽有关的肽序列中，将产生基本上具有血管舒缓激肽拮抗剂活性的拮抗剂。另外还发现，肽链中含有N-取代甘氨酸的某些肽，会显示出有用的激动剂活性。但是，本发明主要是涉及一种在肽链中含有N-取代甘氨酸的新型肽，并证明具有突出的血管舒缓激肽活性以及伴随的其他一些以后将要谈到的有用特性。

重要的是，同一些已有的高效化合物相比较，该化合物的药理学表现显著不同，已有的高效化合物例如HOE-140，即具有如下通式的肽：

D-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸-Thi-丝氨酸-D-Tic-Oic-精氨酸

尽管HOE-140对2型血管舒缓激肽(BK₂)受体非常有效，但在多数体外或体内药理学实验中，对1型血管舒缓激肽(BK₁)受体没有活性。新近的资料表明，B₁受体的激活对慢性炎症或持久性痛觉过敏症状的各种模型是重要的(Dray，A.等，TIPS， 14 287(1993))。在一种B₁受体拮抗剂模型中(LPS处理的免血压测定法)，本发明的优选化合物显示出基本的体内试验活性。与之相比较，在该试验中HOE-104没有活性。

在此公开的化合物比以前设计的化合物更具经济上的优势，合成本发明中的N-取代甘氨酸将非常节约，因为没有多重立体中心结构，否则需涉及复杂，昂贵的残基，如Oic或4-取代的羟脯氨酸或硫代脯氨酸。

在本发明的一个优选实施方案中，通过在血管舒缓激肽的肽序列第7或第8位置引入N-取代的甘氨酸残基，可以产生高效的血管舒缓激肽受体拮抗剂。这些化合物与以前设计的不同，其中所含的杂环氨基酸不受限制，环中仅含有氨基酸残基的氮原子，例如取代的脯氨酸或八氢-吲哚-2-羧酸(Oic)。在一个特别优选的实施方案中包括有这样一种化合物：在其如前面规定的血管舒缓激肽序列中的第8位置，含有N-环戊基，N-环己基，N-芳香基或N-烷芳基甘氨酸。

本领域的技术人员都认识到，在组织中可能存在不同的受体亚型。因此，对于一种特效的化学治疗，其最优的实施方案将取决于治疗作用所针对的疾病状态和血管舒缓激肽拮抗剂所针对的组织。对于这些参数只能通过对人的临床测定来进行确实的研究，但是在本发明公开内容中所显示的对动物组织的作用和受体结合资料可作为选择活性化合物的一种指导。

在此所使用的“血管舒缓激肽受体拮抗剂”，其定义为，一种能阻断血管舒缓激肽与其受体结合的能力，或者能引起血管舒缓激肽对其受体的结合发生某种改变，以至使有效的信号传递不能发生的分子拮抗剂可以是典型的竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂。因此，受体拮抗剂不必像天然配体那样结合在相同的位点或以相同的取向相结合，但是应该证明，其分子与受体的物理性相互作用而阻断了受体的活性。

对这里使用的其他术语可作如下定义：“血管舒缓激肽型肽”是一种含有至少一个连接二个氨基酸的酰胺键的分子，并具有与哺乳动物血管舒缓激肽受体相结合的能力。血管舒缓激肽型肽可能是激动剂，部分激动剂，拮抗剂，或者在小于1mmol的浓度下，除了可测定的与哺乳动物血管舒缓激肽受体相结合外，没有可测定的生物活性。

术语“芳香杂环”和“杂芳基”指的是单环或多环的芳香族环系统，含有氮，氧，或硫，并且包括(但不局限于)吡咯，吡啶，吲哚，噁唑，吡唑，嘧啶，嘌呤，鸟嘌呤，腺嘌呤，吡嗪，喹啉，异喹啉，呋喃，苯并呋喃，苯并噁唑，噻吩，苯并噻吩和噻唑。

术语“芳香基”或“芳基”包括苯基，萘基，二苯基，二氢化茚，或芴。

“杂环”指的是含有3～8个原子的单环或多环，原子包括碳和至少1个选自氮、氧或硫的原子。这些结构包括上述定义的芳香杂环结构，以及环氧化物，环氧乙烷，四氢呋喃，四氢吡喃，氮丙啶，β-内酰胺，γ-内酰胺，哌啶，哌嗪，吡咯烷酮，二氮杂_，氮杂_，噁唑烷，或噁唑烷酮。

前面提到的“烷酰基”或“烷氧基”应被理解为分别含有2-8个和1-8个碳原子。前面提到的烷基取代基，例如在烷基中，可能独立地或共同含有1～8个碳原子。

前面提到的脯氨酸的第3或第4位置可表示如下：

这里使用的“精氨酸取代物”指的是按照药物化学技术进行的精氨酸的普通取代，在生理pH下它将具有一个带正电荷的杂原子。它们包括，但不局限于，含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍或烷基鏻部分的精氨酸，鸟氨酸或赖氨酸的类似物和同系物。

在描述氨基酸时，如欧洲生物化学杂志，138，9(1984)所述，通用于氨基酸的三字母编码已被通常采用。但是，对于描述新型N-取代的甘氨酸，用这些缩写有时会引起混淆。因此，为明了起见，对在此所使用的某些残基的几个缩写表述如下：

Igl＝2-二氢化茚 NMch＝N-(甲基环己基) NPeg＝N-(苯乙基

甘氨酸甘氨酸甘氨酸

NBng＝N-(苄基) NPhg＝N-(苯基) NCpg＝N-(环戊基)

甘氨酸甘氨酸甘氨酸

NChg＝N-(环己基) Cpg＝环戊基甘氨酸 δ-Gpa＝δ-胍基戊酸

甘氨酸

本发明中使用的另一些缩写表示如下：

BOC 叔-丁基氧羰基

Bop-C1 双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯

D-Dic 二氢异喹啉-3-基-羟基

DMF 二甲基甲酰胺

Oic 顺式-内-八氢吲哚-2-羰基

PyBrop 溴代-三-吡咯烷子基六氟磷酸鏻

TFA 三氟乙酸

Tic 1，2，3，4-四氢异喹啉-3-基-羰基

与本发明有关的肽可以用各种本领域的人员熟悉的常规途径来制备。例如，很多肽可以通过液相或者固相技术，用本领域人员熟知的程序来合成(J.史泰华等，固相肽合成，皮尔斯化学公司，(1984)(M.伯丹斯基等，肽合成实践，斯普林杰.维拉格出版社，1984，伯丹斯基，肽合成原理，斯普林杰.维拉格出版社(1984))(G.巴兰尼等，国际肽及蛋白研究杂志30：705739(1987))。但是，要把氨基酸偶联到受阻的N-取代甘氨酸上，只能用特殊的缩合剂，从被适当地保护的氨基酸得到，所用缩合剂包括Bop-C1(R.D.唐等，美国化学学会杂志107，4342(1985)或PyBrop(Coste，J.，肽：第二十一届欧洲肽研讨会进展(1990))或酰基氯(贝尔曼等，有机化学杂志55，721-728，(1990))或酰基氟(L.A.卡皮诺等，美国化学学会杂志112，9652(1990))。固相技术(R.N.祖科尔曼，美国化学学会杂志114，10646(1992)是已知的借助固相合成法达到合成包含N-取代甘氨酸的肽的途径，它是通过用α-卤代羰基化合物，使胺和苯胺N-烷基化来合成N-取代的甘氨酸。但是，允许使用廉价而有效的偶联剂Bop-C1的固相技术，以前未被报导过。

新的N-取代甘氨酸或N-取代氨基酸可用下述方法合成：

结构为R₁NH₂的胺或苯胺可以与一个被适当保护的，具结构A的α-卤代乙酸盐反应，生成N-取代的氨基酸B，反应是在极性溶剂中进行的，例如可用乙腈，二氯甲烷，氯仿，四氢呋喃，或二甲基甲酰胺，其中可加入或不加入另外的碱，如叔胺，金属氢化物，金属碳酸盐或磷酸铵，金属二磷酸盐或二磷酸铵。通过用本领域技术人员周知的方法对α-氨基实行保护，可得到适合用于肽合成常规方法的氨基酸衍生物C，(T.格林尼和P.G.M.武兹提供了许多适合于通常用于肽合成技术的保护基实例(J·格林尼等，有机合成中的保护基团，第二版，约翰·威利父子，(1991))。

其中X＝卤素或离去基团，P₁和P₂是保护基，

可选地，使适合的被保护的氨基酸与包含一个离去基团X的部分反应而生成B，离去基团包括例如，氯，溴，碘，甲基磺酸盐，甲磺酰盐，三氟化物的酯等。通过用本领域技术人员周知的方法对该胺进行保护，可得到一个用于肽合成的中间体(见J·格林尼等，有机合成中的保护基团，第二版，约翰·威利父子，(1991))。在受限制的情况下，X可能被阴离子置换，并通过此阴离子的烷基化作用而直接生成C，在此阴离子是通过使一个N-保护的(用基于氨基甲酸乙酯或氨磺酰的保护基)氨基酸，用强碱如NaH使之去质子化而形成的。

其中X＝卤素或离去基团，P₁和P₂是保护基

最后，中间体B可能通过还原性胺化作用来形成，在此适合的胺和醛或酮被缩合形成席夫碱或亚胺，然后用氢和催化剂或者活性氢化物试剂(例如氰基氢硼化钠或氢硼化钠)还原成目的胺B。再通过用本领域的技术人员周知的方法对该胺进行保护，可得到一个适合用于肽合成的中间体C。

其中P₁和P₂是保护基，而R₃-Co-R₄代表-环酮或一个直链酮，或者是一个醛，并由于还原性胺化作用而提供一个R₁。

血管舒缓激肽拮抗剂的应用是用于治疗由血管舒缓激肽或其密切相关的代谢物所中介的，包括创伤，炎症或其它一些病理状态。其应用可能包括治疗叮咬，刺伤，一般的创伤，头部创伤，包括炎症性肠道疾病在内的各种炎症，烧伤，皮疹，休克或与脓毒症有关的低血压，以及疼痛，特别是与外科手术或牙科手术有关的疼痛。此外，血管舒缓激肽拮抗剂还可能用于治疗呼吸道超敏和炎症，以及其他与气喘有关的症状。血管舒缓激肽是一个公认的促有丝分裂剂，并且在本发明中公开的化合物，在体外试验中已显示不出表明它们可能具有作为抗癌剂用途的活性。

这些化合物可能被局部给药，或通过注射，输液给药，或者在适当的赋形剂中以口服悬液或以片剂，丸剂，胶囊，Caplets等剂型给药。给药剂量和方式将由血管舒缓激肽的应用情况来确定，并且可通过临床检验的常规方法来测定，以找到最佳的剂量。这些剂量预期在0.001mg/kg 100mg/kg活性化合物的范围内。

应当理解，本发明的化合物是由氨基酸组成的，并由于其酸性或碱性而可能形成盐，因此任何药理学允许的，由在此所述的化合物衍生而来的盐，都认为是本发明的一部分，例如盐酸盐，乙酸盐，磷酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，琥珀酸盐，抗坏血酸盐等。药物化学中的一个通常途径是修饰巳知的，以肽为基础的药物，以形成显示出较较大生物有效度的酯或酰胺前体药，因此由在此所公开的化合物衍生而来的前药，也是本发明的组成部分。设计和制备前药的方法在药物化学文献中已有详细的叙述(Bundgaard，H，前药的设计，Elsevier(1985))。

本发明的化合物可以与其它药理学制剂一起同时给药，例如激肽拮抗剂，包括神经激肽拮抗剂，或类阿片激动剂，蛋白酶抑制剂，特别是弹性蛋白酶抑制剂，或者还可以与其它镇痛药或抗癌药共同给药。

本发明的代表性化合物包括如下的化合物，在此NBng，NChg，NCpg，NPeg，NMch和NPhg分别代表N-苄基甘氨酸，N-环己基甘氨酸，N-环戊基甘氨酸，N-苯乙基甘氨酸，N-甲基环己基甘氨酸和苯基甘氨酸，包括如下：

化合物1. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic

化合物2. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-Nchg

化合物3. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl^*-NChg-Arg

^*异构体A

化合物4. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl^*-NChg-Arg

^*异构体B

化合物5. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

化合物6. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-Oic-Arg

化合物7. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-NChg-Arg

化合物8. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg-Arg

化合物9. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NChg-Arg

化合物10.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg-Arg

化合物11.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-Oic-Arg

化合物12.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch-Arg

化合物13.δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

化合物14.δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

化合物15.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg-Arg

化合物16.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg-Arg

化合物17.D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Nchg-Arg

化合物18.δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg

上面列出的代表性化合物中，相当于通式(I)的化合物如下：

Z’不存在

Z⁰是D-Arg或δ-Gpa或不存在

A¹是Arg或δ-Gpa

B²是Pro或Hyp

C³是Hyp

D⁴是Gly

E⁵是Thi

F⁶是Ser

G⁷是NBng，NPeg，NChg或D-Tic，Igl，D-Phe或D-Cpg

H⁸是Oic，Arg，NChg，MNch，NPhg，G⁷和H⁸至少一个是N-取代的甘氨酸

I⁹不存在或是Arg；和

J¹⁰不存在

尽管在前面已说明N-取代的甘氨酸残基是位于所例证肽的第7和/或第8位置(用BK序列数字编码)，但是应该理解，N-取代甘氨酸的定位是可以改变的。同样，根据本发明，除了已说明的以外，其它的N-取代基和变通也是可用的。例如，略去末端精氨酸基就可以得到有用的例举化合物的类似物。但是，根据本发明，一组优选的肽应包括含有8-10个氨基酸的通式(1)化合物，其中第7和/或第8位置(用BK序列数字编码)是一个N-取代甘氨酸，优选的取代基是苯基，苄基，苯乙基，环烷基如环戊基或环己基，或者低碳烷基环己基如甲基环己基。

本发明的另一个优选化合物亚组由下式定义：

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly-Arg或

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly其中甘氨酸残基的取代基R是下列基团取代的环己基：甲基、乙基，丙基，异丙基，甲氧基，乙氧基，正或异丙氧基，CH₂OCH₂CH₃，CH₂CH₂OCH(CH₃)₂，CH₂CH₂OCH₃，CH₂CH₂OCF₃，硫代甲基，硫代乙基，硫代丙基(正丙基或异丙基)。

通过下列实施例对本发明作进一步描述，其中的拮抗剂代表本发明的优选实施方案。列举这些实施例的目的是例证性的和启发性的，而不是作为一种限制。

实施例1

合成例举肽的一般程序

在精氨酸C-末端作肽端接：

对所有的氨基酸α-氮用叔丁氧羰基保护。丝氨酸用苄基醚保护。精氨酸胍基用甲苯磺酰基保护，除非另有说明。对羟脯氨酸的侧链不作保护。

树脂的制备：

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸(每克约0.25～0.75当量)衍生的聚丙烯酰胺(PAM)树脂(通常用0.20～2g，Bachem)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内(Stewart，J.M.等，固相肽合成，皮尔斯化学公司(1984))。用25ml干燥的CH₂Cl₂处理该树脂，并通过氮气发泡提供搅拌1分钟。将此溶液干燥脱水，并用CH₂Cl₂重复洗2次(每次用25mlCH₂Cl₂)。同样用二甲基甲酰胺重复洗3次(每次25ml)随后再用二氯甲烷洗3次(每次25ml)。

去保护：

将洗过的树脂用25ml 1∶1的三氯乙酸和二氯甲烷的混和液处理。用氮气发泡搅拌持续5分钟后，滤去溶剂。树脂再用25ml 1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合液处理，用氮气发泡搅拌持续25分钟后，滤去溶剂。

中和：

将该树脂依次用二氯甲烷洗(3次，每次25m1)，用二甲基甲酰胺洗(2次，每次25ml)，再用二氯甲烷洗。然后该树脂再用10％(v/v)的二异丙基乙基胺在二氯甲烷中的溶液洗(3次，每次25ml)。该树脂再用二氯甲烷洗(3次，每次25ml)，以便除去微量的碱。

与N-Boc-氨基酸HOBt酯偶联的方法：

将4当量Boc保护的氨基酸溶解于最小量的二甲基甲酰胺(DMF)中，随后再加入4当量HOBt(1-羟基苯并三唑单水化物)。其中再加入4当量DCC(二环己基碳化二亚胺)。在室温下搅拌反应1小时。过滤除去二环己基脲，将得到的滤液加到装有N-去保护肽基树脂的肽合成容器内。继续搅拌1小时。

将Boc保护的氨基酸偶联到含有受阻仲胺(例如D-Tic，Oic或一个N-取代甘氨酸残基)N-未端的肽基树脂上的步骤：

将2当量Boc保护的氨基酸，以及2当量二异丙基乙基胺溶解于最小量二氯甲烷中。将该溶液在氮中冷却至0℃，并用2当量Bop-Cl处理。在氮中，0℃下搅拌反应3小时。再将该均匀溶液加到装有N-去保护肽基树脂的肽合成容器中，随后加入另含有2当量二异丙基乙基胺的等体积二甲基甲酰胺。继续搅拌2小时。在实施例中确定的特殊情况下，此步骤中使用了4当量活化的氨基酸，同时也使用了加倍量的试剂和溶剂。

偶联后的洗涤步骤：

该树脂先用二甲基甲酰胺洗(3次，每次25ml)，随后再用二氯甲烷洗(3次，每次25ml)。

对偶联是否完成的评估：

用改进的Kaiser方法(Stewart，J.M.等，固相肽合成，皮尔斯化学公司，(1984))，取少量该树脂颗粒与茚三酮反应，以定性测定偶联反应是否已经完成。如果反应已完成，该树脂再用二氯甲烷洗，并去保护，使偶联步骤继续如上述进行。如果看来还存在未反应的胺，应再次对树脂进行中和和偶联步骤。进行Kaise测定时，N-烷基氨基酸残基可能会给出不规则的结果，在这种情况下，为了测定偶联反应是否完成，在将少量肽基树脂样品水解后，用定量氨基酸分析法可能是有价值的。

用氟氢酸(HF)去保护：

仔细使该肽树脂干燥后，将其移入特制的HF反应容器中(Peninsula实验室)，先用1ml茴香醚处理肽，然后在低温下凝集大约9ml HF。使反应在0℃下持续45-60分钟，然后在真空下仔细除去HF。将树脂和清除剂混合物在真空下干燥1小时，然后仔细用无水乙醚洗该残留物，并将此肽萃取到10％乙酸溶液中。将该乙酸溶液用反相制备型C18高效液相色谱仪纯化(Dynamax or Vydac 30×2.5cm，10μC18)，然后冷冻干燥成固体，得到目的肽。

在Oic或N-取代的甘氨酸C-未端作肽端接：

将C-未端Boc-氨基酸(1.0mmol)溶解于10ml 95％乙醇和3ml水的混合液中。加入碳酸氢铯(1mmol)，搅拌反应1小时。在旋转蒸发器上真空除去溶剂。加入少量苯并通过真空除苯而去除残留的水分，直到形成白色的可游离移动的粉未。将梅里菲尔德树脂(Bachem，1％交链的，100-200目，～1meq/g，1.0meq)和铯盐悬浮于干燥的，用氮气清洁过的二甲基甲酰胺(6-8ml/g树脂)，在氮中，50℃下搅拌反应24到36小时。将此溶液过滤，树脂每次用下列溶剂50ml，顺序地洗3次：二甲基甲酰胺，50％二甲基甲酰胺水溶液，二甲基甲酰胺，以及乙醇。然后将树脂干燥过夜。用在衍生化作用过程中得到的一部分树脂，可制备接近Boc-氨基酸取代浓度的树脂。象上述PAM树脂一样，可制备Boc-氨基酸衍生的树脂用于肽合成和去保护。

肽指征：

在此所使用的氨基酸分析方法，对通常存在的氨基酸可提供精确的定量分析。对特殊氨基的定量分析往往需要作彻底的方法改进。用氨基酸分析仪，通过保留时间测定，可对一些特殊氨基酸如D-Tic，Oic，和N-取代甘氨酸作定性鉴定。类似的说明也适用于肽链测序。对于能够作定性鉴定，但不能以定量方式测定的残基，被用星号(*)作标记。从对化合物得到的数据表明，所有的化合物的序列都是正确的，在详细的实验论述中，对这些已作了明确的验证。通过肽测序法可鉴定特殊的残基，但是对特殊残基的定量分析还未能实现。用于本目的的低分辨率激光解吸附质谱仪，能以大约0.1％的精密度测定分子离子。这种在精确度上的较小的预期局限性，证明是在计算的和表观测定分子量之间存在约1a.m.u差异的原因，对几个化合物报告了这种情况。

实施例II

化合物1的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic

N-α-Boc-N-苄基甘氨酸乙酯：

将碳酸二特丁基酯(1.28g，5.7mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(2.0ml)的溶液，在搅拌下加到N-苄基甘氨酸乙酯(1.0g，5.17mmol，97.0％)和三乙胺(0.79ml，5.7mmol)溶于DMF(1.0ml)的溶液中。该溶液在氮气中，于室温下搅拌19小时。在真空下蒸发除去二甲基甲酰胺，将得到的油状物溶解于乙酸乙脂(50ml)中。用10％NaCO₃溶液洗此乙酸乙脂层(二次，每次25ml)，再用盐水冼(二次，每次30ml)，然后用MgSO4干燥，最后蒸发去除溶剂，得到标题所示的化合物(1.48g，98.0％)为油状物。¹H NMR(CDCl₃)，化学位移(δ)1.2-1.3(t，3H)，1.49(s，9H)，3.8(s.1H)，3.9(s，1H)，4.1-4.2(q，4H)，4.5-4.55(d，2H)，7.2-7.4(m，5H)；¹³C核磁共振(NMR)(CDCl₃) 化学位移(δ)13.95，14.04，28.06，28.12，47.54，47.93，50.85，51.33，60.70，80.16，80.33，127.22，127.31，127.93，128.36，137.195，137.43，155.40，155.56，169.67，169.71。

N-α-Boc-N-苄基甘氨酸：

将溶于最小量水的NaOH(0.3g，7.57mmol)搅拌下加到N-α-Boc-N-苄基甘氨酸乙酯(0.74g，2.52mmol)溶于甲醇(5.0ml)的溶液中。此反应混合物在室温下搅拌18小时。真空蒸发去除甲醇，将得到的残留物溶解于水中。此含水层用氯仿萃取(2次，每次50ml)，冷却至0℃，然后用1N HCl调节pH至2.0，再用乙酸乙脂抽提该溶液。然后该乙酸乙酯层用盐水洗，用MgSO4干燥，真空蒸发处理，产生1.18g(88.0％)标题所示化合物。¹H NMR(CDCl₃)；δ1.49(s，9H)，3.82(s，1H)，3.98(s，1H)，4.52(s，1H)，4.56(s，1H)7.2-7.4(m，5H)，11.5(br s，1H)；¹³C NMR(CDCl₃)，δ 28.19，28.26，47.43，47.57，50.85，51.49，80.92，81.10，127.46，127.52，128.08，128.6，136.98，137.16，155.58，155.99，175.40，175.70。

按前面所述的方法制备Nα-Boc-Oci树酯(0.6g，0.83meq/g)，顺序地偶联形成肽，然后用前述方法将肽从树酯上断裂下来，得到91∶3mg粗制品。用高效液相色谱法(HPLC)纯化(10-65％CH₃CN，0.1％三氟乙酸(TFA)，梯度时间大于55分钟，(20ml/min)最后得到冷冻干燥的无色化合物146.1mg。激光解吸附质谱(LD-MS)分析：计算值1136(M+H)，测定值1136(M+H)。氨基酸分析(AAA)：精氨酸(Arg)2.06(2)，羟脯氨酸(Hyp)0.83(1)，脯氨酸(Pto)0.99(1)，甘氨酸(Gly)0.99(1)，Thi^*，丝氨酸(Ser)1.12(1)，Nbng^*，Oic^*。得到正确的序列分析结果。

实施例III

化合物2的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-Nchg

N-(环己基)甘氨酸苄基酯：

将环己胺(14.3ml，125mmol)溶于50ml四氢呋喃(THF)中，在氮中冷却至0℃，再将α-溴乙酸苄基酯(79.3ml，50mmol)溶于50mlTHF的溶液，滴加到此溶液中。使该反应液升温至室温，然后搅拌大约15小时。真空下除去溶剂，将残留物溶解于200ml二氯甲烷中，并用100ml 10％碳酸钠洗。再用50ml二氯甲烷对该碳酸钠溶液萃取二次。合并所有的二氯甲烷层，用无水硫酸镁干燥，然后进行真空浓缩。该残留物用溶于二氧六环的4N HCl 26ml处理，真空除去挥发性物质，残留物用冷无水乙醚研磨。收集此固体物，在真空下干燥几小时，得到混杂有微量环己胺盐酸盐的该化合物盐酸盐15g。将此混合物溶于300ml二氯甲烷，并用100ml 10％碳酸钠溶液洗此溶液。然后用二氯甲烷对此水溶液作及萃取。合并全部二氯甲烷层，先用硫酸镁干燥，再用高真空(约1托)下干燥，得到标题所述的11.63g纯油状化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ1.0-1.32(m，4H)，1.55-1.78(0m，4H)，1.83(m，2H)，2.41(tt，J＝10，4H₃，1H)，3.48(s，2H)，5.17(s，2H)，7.36(s，5H)，¹³C NMR(DMSO)，δ24.62，25.82，33.08，48.02，56.12，66.28，128.15，128.36，135.47，142.53。

Boc-N-(环己基)甘氨酸苄基酯：

将N-(环己基)甘氨酸苄基酯溶于44.4ml＝氧六环中，和44.4ml1N NaOH的溶液，随后再加入碳酸二特丁基酯(10.68g)。连续搅拌大约15小时，然后通过旋转蒸发除去挥发性物质。得到的残留物在100ml水和100ml乙酸乙酯之间作分配萃取。将二层分离，水层用5％硫酸氢钾酸化至pH3。然后用乙酸乙酯萃取此水层，再将全部乙酸乙酯溶液合并，并用饱和碳酸氢钠和饱和的氯化钠溶液洗，用硫酸镁干燥。先通过旋转蒸发除去溶剂，再在高真空下进一步干燥，最后得到14.50g油状的，标题所示化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ0.95-1.55(m，14H)，1.63(m，1H)，1.77(m，4H)，3.70-4,1(m，3H)，5.16(s，2H)，7.36(s，5H)。

Boc-N-(环己基)甘氧酸：

将Boc-N-(环己基)甘氨酸苄基酯(14.0g，40mmol)溶于240ml无水乙醇中，用干燥的氮气吹洗，并在惰性气体下，小心地将10％的钯炭加入伯尔装置，以氢气(4.3p.s.I)置换氮气，将此混合物在室温下振摇24小时以上。再用氮气吹洗混合物，并通过一层硅藻土垫片过滤除去催化剂和固体物。滤液通过旋转蒸发而浓缩，残留物被溶解于300ml乙酸乙酯中。用150ml 1N氢氧化钠溶液萃取此乙酸乙酯层。然后在冰浴内，用1N盐酸将此碱性溶液酸化至pH3。再用乙酸乙酯萃取此酸性溶液(3次，每次用乙酸乙酯100ml)。然后用饱和氯化钠溶液洗，真空浓缩成无色油状物，并在高真空下进一步干燥。将得到的玻璃状固体用乙烷研磨，再经过滤，干燥处理后，得到无色粉未状的标题所示化合物(8-89g)，熔点(M.P)103-104℃(不对)，C.H.N分析(C₁₃H₂₃NO₄)，C：计算值60.68，测定值60.77，H：计算值9.01，测定值9.20，N：计算值5.44，测定值5.44。¹H NMR(CDCl₃)，δ1.07(m，1H)，1.10-1.55(m，4H)；1.43(s，9H)，1.55-1.9(m，5H)，3.67-4.13(m，3H)，11.33(br s，1H)，¹³C NMR(CDCl₃)δ25.43，25.68，28.20，30.91，44.03，44.26，44.36，44.42，54.03，54.18，56.13，80.36，80.47，154.81，176.83。

按前面所述方法制备Nα-Boc-NChg树酯(0.63g，0.79meq/g)，顺序地偶联形成肽，然后用前述方法将肽从该树酯上断裂下来，得到71mg粗制品。用HRLC纯化(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)最后得到23g冷冻干燥的无色化合物2。LD-MS分析：计算值1136.6(M+1)，测定值1136.5(M+1)，AAA：精氨酸2.01(2)，羟脯氨酸0.81(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸0.98(1)，Thi^*，丝氨酸1.27(1)，NChg^*，Tic^*。得到正确的序列分析结果。

实施例IV

化合物3和化合物4的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl^*-NChg-Arg

^*异构体A和B

(D.L)-N-(Boc)-2-二氢化茚甘氨酸：

按Porter和Shive的方法(Porter，T.H.和Shive，W.J.Med，Chem.11：402(1968))制备(D.L)-2-二氢化茚甘氨酸。将D、L-2-二氢化茚甘氨酸(3.36g，17.54mmols)溶解于含有氢氧化钠(1.76g，1.1当量)的二氧六环(30ml)和水(15ml)的混合物中。加入碳酸二特丁基酯(4.35g，19.3mmol)。在室温下搅拌反应18小时。用旋转蒸发器除去挥发性物质，并用氮仿萃取含水的残留物，然后用HCl酸化至pH2-3，再用乙酸乙酯萃取。用盐水洗此乙酸乙酯溶液，并用无水硫酸镁干燥。除去溶剂后得到2.87g(56％)(D.L)-N-(Boc)-2-二氢化茚甘氨酸。

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸聚丙烯酰胺(PAM)树脂(1.52g，Bachem，1.0meq)，装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被顺序地偶联合成后，用前述的方法从树脂上断裂下来，得到330mg粗制品。用HPLC法纯化。100mg这种粗制品(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20m²/min)，得到30.4mg异构体A(化合物3)和31.5mg异构体B(化合物4)。HPLC保留时间：(5-55％CN₃CN，0.1％TFA超过50分钟，C18 5μ，分析柱)异构体A(化合物3)27.9分钟，异构体B(化合物4)28.6分钟，化合物3(异构体A)：LD-MS分析：计算值1306(M+H)，测定值1307(M+H)。AAA：精氨酸3.36(3)，羟脯氨酸0.93(1)，脯氨酸0.90(1)，甘氨酸0.90(1)，Thi^*，丝氨酸0.91(1)，Nchg^*，Igl^*。化合物4(异构体B)LD-MS分析：计算值1306(M+H)，测定值1305.8(M+H)。AAA：精氨酸3.43(3)，羟脯氨酸0.92(1)，脯氨酸0.89(1)，甘氨酸0.89(1)，Thi^*，丝氨酸0.91(1)，NChg^*，IgI^*。

实施例V

化合物5(CP-0597)的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树酯装入用于人工固相肽合成而设计的容器内，肽被顺序地偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来，得到330mg粗制品。整个合成过程中用了4当量预先活化的Boc-氨基酸。粗制品HPLC纯化(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)后得到131.8mg化合物5。HPLC保留时间：(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C18 5μ，分析柱，保留时间(R.t)＝30.3分钟，LD-MS分析：计算值1293，测定值1293(M+H)，氨基酸分析：精氨酸3.13(3)，羟脯氨酸0.90(1)，脯氨酸0.95(1)，甘氨酸0.98(1)，THi^*，丝氨酸1.04(1)，NChg^*，Tic^*。得到正确的序列分析结果

实施例VI

化合物6的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-Oic-Arg

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯酰基-L-精氨酸衍生化的Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(0.24g，Bachem，0.14meq)，装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被顺序地偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。一部分该粗制品用HPLC纯化(5-55％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)，得到8.3mg化合物6，HPLC：保留时间(R.t)＝14.0分钟(20-60％CH₃CN，0.1为TFA超过30分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS分析：计算值1293，测定值1293(M+H)。AAA：精氨酸2.98(3)，羟脯氨酸1.08(1)，脯氨酸0.97(1)，甘氨酸1.10(1)，Thi^*，丝氨酸0.87(1)，NBng^*，Oic^*。得到正确的序列分析结果。

实施例VII

化合物7的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-NChg-Arg

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(0.240g，Bachem，0.14meq)，装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。一部分粗制品用HPLC纯化(5-55％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)，得到42mg化合物7。HPLC：R.t＝13.5分钟，(20-60％CH₃CN，0.1％TFA大于30分钟，C18 5μ分析柱)。LD-MS分析：计算值1280，测定值1280。AAA：精氨酸3.03(3)，羟脯氨酸1.06(1)，脯氨酸0.99(1)，甘氨酸1.02(1)，THi^*，丝氨酸0.90(1)，NBng^*，NChg^*。得到正确的序列分析结果。

实施例VIII

化合物8的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg-Arg

N-环戊基甘氨酸苄基酯

在0℃，搅拌下，将溶于20ml CH₂Cl₂的2-溴乙酸苄基酯(3.30ml，20.0mmol)溶液滴加到溶于20mlCH₂Cl₂的环戊基胺(8.60g，100mmol)溶液中。加完-2-溴乙酸苄基酯后，继续搅拌反应17小时。真空除去有机溶剂，将残留物溶于乙酸乙酯，并用饱和的Na₂CO₃溶液洗。用1N HCI萃取该溶液。用Na₂CO₃使此含水层成碱性，然后用氯仿萃取。有机溶剂层用MgSO₄干燥并蒸发除去溶剂。残留物用快速硅胶柱层析法纯化，依次用己烷和己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)洗脱，得到2.3g(50.0％)标题所示油状化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ1.25-1.85(m，9H)，3.0-3.12(m，1H)，3.43(s，2H)，5.15(s，2H)，7.27-7.42(m，5H)，¹³C NMR(CDCl₃)δ23.72，32.71，49.53，59.03，66.24，128.1，128.32，135.42，172.29。

N-α-Boc-N-环戊基甘氨酸苄基酯

先将N-环戊基甘氨酸苄基酯(2.31g，9.9mmol)和三乙胺(1.66ml，11.9mmol)溶于3.0ml二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在搅拌下向此溶液加入溶于DMF(3.0ml)的碳酸二特丁基酯(2.16g，9.9mmol)。此溶液在N₂中，在室温下继续搅拌19小时。真空蒸发除去DMF，得到的油状物溶解于乙酸乙酯(50ml)。此乙酸乙酯层先用10％Na₂CO₃溶液洗(2次，每次25ml)，再用盐水洗(2次，30ml)，用MgSO₄干燥，蒸发除去溶剂后得到标题所示的油状化合物(3.28g，99.0％)。使用前对此化合物不作进一步纯化。¹³C NMR(CDCI₃)δ23.44，28.13，29.11，29.80，44.86，56.28，66.61，79.96，128.15，128.30，128.46，135.5，155.0，170.48。

N-α-Boc-N-环戊基甘氨酸

将N-α-Boc-N-环戊甘氨酸苄基酯(3.28g，9.9mmol)溶解于有10％钯炭(0.33g)脱氧酯化的乙醇(30ml)中。此反应混合物在帕尔氧化器中，在氢气下(30p.s.I)搅拌17小时。用一层硅藻土垫片过滤，蒸发除去乙醇。将得到的残留物溶解于乙酸乙酯中，然后先用冷的1N Hcl(100ml)洗此乙酸乙酯层，再用盐水洗(2次，每次100ml)，用MgSO₄干燥并真空蒸发处理。将得到的化合物用乙酸乙酯/己烷重结晶，产生1.09g(47.0％)无色固体状的标题所示化合物。C，H，N分析，(C₁₂H₂₁NO₄)C：计算值59.24，测定值58.94，H：计算值8.70，测定值8.69，N：计算值5.76，测定值6.00。¹H NMR(CDCl₃)δ1.2-1.72(m，15H)，1.76-1.96(m，2H)，3.64-4.0(br s，2H)，4.1-4.6(m，1H)，10.36(br s 1H)。

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(1.52gBachem，0.5meq)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸被用于偶联。用氟化氢(HF)去保护基后，得到428mg粗制品。将100mg粗制品用HPLC纯化(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)，得到22.3mg白色冷冻干燥的化合物8。HPLC：R.t＝28.7分钟(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C185μ，分析柱)。LD-MS：计算值1278.6，测定值1279.6(M+1)。AAA：精氨酸2.93(3)，羟脯氨酸0.96(1)，脯氨酸1.01(1)，甘氨酸1.04(1)，THi^*，丝氨酸0.90(1)，Tic^*，Ncpg^*。得到正确的序列分析结果。

实施例IX

化合物9的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NChg-Arg

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(1.52g，Bachem，0.5meq)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸被用于偶联。用氟化氢(HF)去保护基后，得到586.7mg粗制品。将100mg粗制品用HPLC纯化(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)，得到72.8mg化合物9。HPLC：R.t＝30.5分钟(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS：计算值1281.5，测定值1281.5(M+H)。AAA：精氨酸3.11(3)，羟脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.95(1)，甘氨酸1.00(1)，THi^*，丝氨酸1.06(1)，苯丙氨酸0.97(1)，Nchg^*。

实施例X

化合物10

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg-Arg

N-α-Boc-环戊基甘氨酸：

按Dunn的方法合成D-环戊基甘氨酸(Hill，J.T和Dunn.F.W.，J.Org.Chem，30：1321(1965))。向150ml二氧六环和75ml水的混合液中加入D-环戊基甘氨酸(3.93g，27.5mmol)和氢氧化钠(27.5ml，1M溶液)。将溶液冷却到0℃，加入碳酸二特基酯(6.60g，30.2mmol)。使反应混合液升温至室温，搅拌约15小时。真空除去挥发性物质，将残留物溶于水，用5％NaOH碱化至pH9。含水层用乙酸乙酯萃取3次，合并提出物，用盐水洗，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到5.44g(81.5％)玻璃状标题所示化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ1.15-1.9(m，8H)，1.45(s，9H)，2.25(m，1H)，3.99(dd，0.32H)，4.25(dd，0.68H)，5.01(d，7.0Hz，0.68H)，6.27(d，7.0Hz，0.32H)，NH和α-H产生由旋转异构体引起的二个信号。

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(1.52g，Bachem，0.5meq)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸被用于偶联。用氟化氢(HF)去保护基后，得到349mg粗制品。用HPLC纯化100mg此粗制品(10-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于55分钟，20ml/min)，得到30.2mg化合物10。HPLC：R.t＝29.2分钟(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS：计算值1258.9，测定值1258.9(M+H)。AAA：精氨酸3.13(3)，羟脯氨酸0.92(1)，脯氨酸0.96(1)，甘氨酸0.98(1)，THi^*，丝氨酸1.02(1)，Cpg^*，NChg^*。

实施例XI

化合物11的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-Oic-Arg

N-苯乙基甘氨酸苄基酯盐酸盐：

将溶解于CH₂Cl₂(30ml)的2-溴乙酸苄基酯(3.3ml，20.0mmol)溶液，在0℃，搅拌下滴加到溶解于CH₂Cl₂(30ml)的苯乙基胺(12.6ml，100mmol)中。温度升至室温后，搅拌反应24小时，然后过滤，真空蒸发去溶剂。将得到的残留物溶解于乙酸乙酯，再用盐水洗，用硫酸钠干燥。真空蒸发除去乙酸乙酯。粗制品用快速硅胶柱层析纯化，用已烷和乙酸乙酯-己烷(9∶1 v/v)顺序洗脱。含有产物的组分中存在微量杂质-2-溴乙酸苄基酯。将此部分再溶解于CHCl₃中，用1N HCl洗。干燥氯仿层，用石油醚沉淀出盐酸盐。生成2.3g无色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ1.95(br s 1H)，2.73-2.9(m，3H)，3.44(s，2H)，5.12(s，2H)，7.13-7.36(m，10H)。¹³C NMR(CDCl₃)δ36.17，50.46，50.63，66.32，26.06，128.18，128.3，128.4，128.50，135.4，139.4，171.88。

N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸苄基酯：

将溶解于DMF(3.0ml)的二特丁基酯(1.87g，8.54mmol)溶液，在搅拌下加到溶解于DMF(3.0ml)的N-苯乙基甘氨酸苄基酯(2.30g，8.54mmol)和三乙胺(1.31ml，9.4mmol)溶液中。得到的溶液在N₂中，室温下搅拌22小时。真空蒸发除去DMF，将得到的油状物溶解于乙酸乙酯(50ml)。乙酸乙酯层用10％Na₂CO₃溶液洗(2次，每次25ml)，用盐水洗(2次，每次30ml)，用MgSO4干燥，溶剂被蒸发后，得到3.13g油状的标题所示化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ1.37，1.44(旋转异构体，9H)，2.75-2.9(m，2H)，3.33-3.55(m，2H)，3.8，3.92(旋转异构体，2H)，1.15(s，2H)，7.1-7.4(m，10H)，¹³C NMR(CDCl₃)δ28.09，28.20，34.64，35.02，49.16，50.07，50.39，66.62，66.68，80.12，126.18，126.26，128.14，128.21，128.31，128.38，128.43，128.73，135.41，138.95，138.99，154.85，155.49，169.84，169.89。

N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸：

将N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸苄基酯(3.13g，8.47mmol)溶解于乙醇(50ml)中，小心地充入氮气后，将10％钯碳(pd/c)(0.3g)悬浮于此溶液中。在Parr氢化器中，在氢气下(约40p.s.I)，此反应混合物被搅拌18小时。然后使混合物通过一层硅藻土过滤，蒸发除去乙醇。将得到的残留物溶解于乙酸乙酯中，用冷1NHCI(100ml)洗，再用盐水洗(2次，每次100ml)，用MgSO₄干燥，真空蒸发后得到2.16g(88.2％)无色固体状标题所示化合物。¹H NMR(CDCl₃)δ1.45(s，9H)，2.8-2.92(m，2H)，3.44-3.6(m，2H)，3.8，3.92(旋转异构体，2H)，7.12-7.36(m，5H)，113 2(br s，1H)，¹³C NMR(CDCl₃)δ34.65，35.01，49.15，49.69，50.37，50.55，80.64，80.77，126.32，126.42，128.5，128.56，128.80，138.79，138.93，155.97，175.32，176.02。

将预先用Nα-Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(1.52g，Bachem，0.5meq)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸被用于偶联。用氟化氢(HF)脱保护基后，得到487mg粗制品。将100mg粗制品用HPLC纯化(10-70％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于60分钟，20ml/min)，得到23.0mg无色冷冻干燥的化合物11。HPLC：R.t＝32.8分钟(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS：计算值1305，测定值1305。AAA：精氨酸3.16(3)，羟脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸1.00(1)，THi^*，Ser1.00(1)，Oic^*，NPeg。

实施例XII

化合物12的合成

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch-Arg

N-环己烷甲基甘氨酸苄基酯

以2.38g(10mmol)2-溴乙酸苄基酯和5.66g环己烷甲基胺开始，用与合成N-苯乙基甘氨酸苄基酯同样的程序合成该化合物。产物通过盐酸盐沉淀作用纯化。然后将该盐酸盐溶解于CHCI₃中，用Na₂Co₃10％洗CHCL₃层，最后离析出1.3g(52.0％)油状的标题所示化合物。盐酸盐的13C NMR(CDCl₃)，δ25.21，25.27，25.72，25.83，30.43，30.68，30.84，34.64，37.58，46.25，46.46，54.17，68.11，128.63，128.70，128.81，134.243，165.63。

N-α-Boc-N-环己烷甲基甘氨酸苄基酯：

以1.39g N-环己烷甲基甘氨酸苄基酯开始，合成方法与合成Boc-N-苯乙基甘氨酸苄基酯相同。生成1.8g(94.0％)油状物。

N-α-Boc-N-环己烷甲基甘氨酸：

以1.80g N-α-Boc-N-环己烷甲基甘氨酸苄基酯开始，合成方法与合成Boc-N-苯乙基甘氨酸相同。生成1.28g(95.0％)无色的离析固体。¹H NMR(CDCl₃)δ 0.84-1.8(m，20H)，3.04-3.2(m，2H)，3.9-4.04(旋转异构体，2H)，11.44(br s，1H)，¹³C NMR(CDCl₃)δ25.67，25.78，26.25，26.36，28.13，28.19，28.24，30.59，30.63，30.72，36.85，37.08，37.69，45.53，49.08，49.69，54.47，54.62，80.17，80.37，155.46，156.37，174.68，175.06。

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM树脂(1.52g，Bachem，0.5meq)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树酯上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸用于偶联。用氟化氢(HF)去保护基后，得到480mg粗制品。HPLC纯化(5-70％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于60分钟，20ml/min)，总共得到191mg无色的冷冻干燥化合物12。HPLC：R.t＝33.7分钟(5-70％CH₃CN，0.1％TFA大于65分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS：计算值1307，测定值1308(M+H)。AAA：精氨酸3.16(3)，羟脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸1.00(1)，THi^*，丝氨酸0.99(1)，Tic^*，NMch^*。

实施例XIII

化合物13的合成

δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸梅里菲尔德树酯(4.20g，Bachem Rboc20，0.48meq/g)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联，形成一个四肽(丝氨酸-(OBn)偶联)，然后，加甘氨酸，羟脯氨酸，脯氨酸和精氨酸的操作被转移给CS-BIO自动肽合成仪。从反应容器内取出一部分这种肽基树酯(0.53g)。此树酯样品如上述用TFA去保护，并用上述用于HOBt/二亚酰胺活化的方法偶联N-(BOC)-右旋-氨基戊酸。此残基如前所述用三氟乙酸去保护，再通过顺次用二氯甲烷，10％二异丙基乙基胺的二氯甲烷溶液，二氯甲烷，最后是二甲基甲酰胺(DMF)洗来使之中和。将树酯同0.566g 1氢-吡唑-1-甲酰脒(Bernatowicz，M.S.等，有机化学杂志57：2497(1992))和溶解于20ml DNF的0.76ml二异丙基乙基胺的混合物一起，在47℃加热2.25小时。用二氯甲烷和二甲基甲酰胺洗树酯，并将于1氢-吡唑-1-甲酰脒的反应另重复二次。依次用二氯甲烷，甲醇，再二氯甲烷洗树酯，并真空干燥。用HF去保护后得到80mg无色冷冻干燥的化合物13。HPLC：R.t＝22.6分钟(5-55％CH₃CN，0.1％TFA大于50分钟，C18 5μ，分析柱)LD-MS：计算值1278(M+H)，测定值1278.7(M+H)。

实施例XIV

化合物14

δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸梅里菲尔德树酯(4.20g，Bachem Rboc20，0.48meq/g)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联，形成一个四肽(丝氨酸-(OBn)偶联)，然后，加甘氨酸，羟脯氨酸，和脯氨酸的操作被转移给CS-BIO自动肽合成仪。从反应容器内取出一部分这种肽基树酯(0.260g)。此树酯被如上所述用TFA去保护，.并用上述用于HOBt/二亚酰胺活化的方法偶联N-(BOC)-右旋-氨基戊酸。此残基如前所述用三氟乙酸去保护，再通过依次用二氯甲烷，10％二异丙基乙基胺的二氯甲烷溶液，二氯甲烷，最后是二甲基甲酰胺(DMF)洗而使之中和。将树酯同0.405g 1氢-吡唑-1-甲酰脒(Bernatowicz，M.S.等，有机化学杂志14：48-58(1959))和溶解于14.5ml DMF的0.545ml二异丙基乙基胺的混合物一起，在47℃加热2.25小时。用二氯甲烷和二甲基甲酰胺洗树酯，并重复于1氢-吡唑-1-甲酰脒的反应。依次用二氯甲烷，甲醇，再二氯甲烷洗树酯，并真空干燥。用HF去保护后得到30mg无色冷冻干燥的化合物14。HPLC：R.t＝22.3分钟(5-55％CH₃CN，0.1％TFA大于50分钟，C18 5μ，分析柱)，LD-MS：计算值1123(M+H)，测定值1123(M+H)。

实施例XV

化合物15

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg-Arg

Fmoc-D-Tic酰氯：

将1当量Fmoc-D-Tic溶解于CH₂Cl₂(0.3M)中，并置于备有搅拌棒和回流冷凝器的烧瓶内。搅拌下加入亚硫酰氯(10当量)，此混合物在氮中回流2小时。通过旋转蒸发使反应混合物浓缩，残留物用CH₂Cl₂稀释，再浓缩除去过剩的亚硫酰氯。照此重复二次，得到的酰氯用己烷研磨(或者按另一种方法，从CH₂Cl₂/己烷中重结晶)直至得到细粉未。使用时不需进一步纯化。

Fmoc-D-Tic-N-苄基甘氨酸：

在烧瓶内，将N-苄基甘氨酸(1.2当量)悬浮于干燥的四氢呋喃(THF)中，加入3当量二异丙基-乙基胺。将烧瓶置于冰水浴中，在氮气下搅拌15分钟。将1当量Fmoc-D-Tic酰氯溶解于干燥的THF(0.15M)中，缓慢地加到此冷却的烧瓶中。立即开始生成沉淀，使升温至室温后，搅拌反应2小时。反应完成后，立即用旋转蒸发除去溶剂，将残留物溶于乙酸乙酯中，用5％KHSO₄，水，和盐水洗。用Na₂SC₄干燥，在高真空下旋转蒸发和放置，产生白色泡沫状物。此二肽用HPLC作纯度分析(C18 RP柱，4.6×250mm流速1ml/min，从含有0.1％TFA的30-100％CH₃CN/H₂O，梯度时间为30分钟，在254nm检出)，使用时不需进一步纯化。

Fmoc-D-Tic-NPhg-OH附着子精氨酸-OHMP树脂：

用Bop-C1，在前述用于将N-保护的氨基酸偶联于受阻的N-取代氨基酸的条件下，将Fmoc-D-Tic-Nphg-OH二肽(约0.785mmol)偶联于肽基树脂(0.25mmol)。

肽合成：

通过在二甲基甲酰胺(DMF)中与20％哌啶反应(2次，每次30分钟)，使Fmoc-D-Tic-Nphg-Arg-OHMP树脂脱去N-保护基。然后按顺序洗树脂，用DMF洗3次，用二氯甲烷洗2次，用甲醇洗2次，再用二氯甲烷洗2次。用如前面所述的BOP-C1程序使Fmoc-丝氨酸-(O-t-Bu)-OH被偶联。然后将树脂移入ABI型431自动肽合成仪，用标准的Fmoc/HBTV偶联程序加入另外的残基(ABI 431 Fmoc程序，应用生物系统431A型肽合成仪用户手册，第二版，1992年1月)

然后树脂用二氯甲烷洗几次，在无水氮气流中干燥。然后用含有0.5ml苯硫基甲烷和0.25ml乙烷二硫酚的10ml三氯乙酸处理树脂。在室温下通入氮气鼓泡反应3小时。将混合物过滤，用约1ml三氯乙酸洗树脂。合并滤液，在真空下浓缩，残留物用无水乙醚处理，并在冰浴温度下放置15分钟。然后通过过滤收集沉淀，再仔细用冷无水乙醚洗，真空干燥，得到205mg无色粉末。取一小部分这种物质用HPLC纯化(0-35％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于50分钟，10ml/min)，得到10mg无色冷冻干燥的化合物15。HPLC：R.t＝20.9分钟(5-55％CH₃CN，0.1％TFA大于50分钟，C18 5μ，分析柱)。LD-MS：计算值1287.5(M+H)，测定值1287.5(M+H)。得到正确的氨基分析数据。

实施例XVI

化合物16

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg-Arg

按照用于制备化合物15中Fmoc-D-Tic-NPhg-OH的方法制备二肽Fmoc-D-Phe-NPhg-OH。用化合物15中所述的程序，将此二肽Fmoc-D-Phe-NPhg-OH(约0.5mmol)偶联到Arg-HMP树脂(0.25mmol)。肽被合成后，如化合物15中所述，从树脂上断裂下来，得到260mg粗制品肽。将此肽75mg用HPLC纯化(5-50％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于60分钟，10ml/min)，得到18.9mg无色冷冻干燥的化合物16。HPLC：R.t＝21.9分钟(5-55％CH₃CN，0.1％TFA大于50分钟，C18 5μ分析柱)。LD-MS：计算值1275(M+H)，1298(M+Na)，测定值1274(M+N)，1298(M+Na)。

实施例XVII

化合物17

D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg

将Boc-Ng-对-甲苯磺酰基-L-精氨酸梅里菲尔德树酯(4.2g，Bachem，RBOC20，0.48meq/g)装入为用于人工固相肽合成而设计的容器内。肽被按顺序偶联合成后，用前述的方法从树脂上断裂下来。4当量预先活化的氨基酸被用于偶联。用HF去保护基后，得到1.05g粗制品。将一小部分该粗制品用HPLC纯化(0-65％CH₃CN，0.1％TFA，梯度时间大于50分钟，10ml/min)得到无色冷冻干燥的化合物17。得到正确的氨基酸和肽序列分析数据。

实施例XVIII

生物学数据

本发明的最优选化合物是血管舒缓激肽拮抗剂，因此，对涉及血管舒缓激肽作用的疾病或病理生理学状态，具有广泛的治疗用途。下列方案将针对本说明的各种化合物描述在此使用的，以体外或体内法测定其血管舒缓激肽拮抗剂活性的实验方法，以及用于表明其选择性和体内稳定性特点的实验方法。

B₂拮抗剂活性的体外法测定：

按照如下所述，进行标准的大鼠子宫PA2测定实验：

选用雌性Spragne-Dawley大鼠(200-250g)，预先用己烯雌酚(100μg/kg)处理，18小时后重击头部放血活杀。分离出子宫角，置于4ml的组织浴中，施加1g静止张力，组织浴中充有De Jalon氏液，温度31℃，并吹入气体。在不加和加入拮抗剂的二种情况下制作对血管舒缓激肽的浓度-作用曲线(预先温育15分钟)。按照Arunlakshana和Schild提供的方法(Arunlakshana，O.，Schild，H，O.，英国药理学杂志14：48-58(1959))计算拮抗剂的效力。在暴露于高浓度的拮抗剂(通常是10^-5克分子浓度)后，每个组织被冲洗4次，每次10分钟，此后可再次制作血管舒缓激肽的浓度-作用曲线。计算此时对血管舒缓激肽的PD²(对血管舒缓激肽产生50％最大初始反应的克分子浓度的负对数)，并与开始时制作的对照血管舒缓激肽浓度-作用曲线的PD²相比较。这种与同时制作的对照曲线相比较的PD²差值，可用于表示对激动剂反应的“恢复百分率”。

B₁拮抗剂活性的体外法测定

用雌性新西兰大白兔，通过给予超大剂量戊巴比妥(80mg/kg，静脉注射)而活杀后，分离出胸主动脉。将血管条安装在5ml的组织浴内，施加2g静止张力，组织浴液是Krebs溶液(118.3mM NaCl，4.7mM KCl.2.5mM CaCl₂，1.2mM MgSO₄，1.2mM KH₂PO₄，25mMNaHCO₃，25mM葡萄糖，及2.8μmM抗炎吲哚酸)，并以95％O₂/5％CO₂通气。在第1小时和第3小时制作脱-精氨酸⁹-血管舒缓激肽的二条浓度-作用曲线。在第5小时，向组织浴内加入脱-精氨酸⁹-血管舒缓激肽，使其最后浓度为10^-7M。这将引起持续，时间长达45分钟的稳定收缩。然后根据所得到的曲线，可计算出半数抑制浓度(IC₅₀)或引起50％收缩逆转的浓度。结果如表1所示。

稳定性研究：

从男和女志愿者或从豚鼠收集全血，制备血浆样品。将样品装入加有肝素钠的培养管内，在4℃，以2000rpm的转速离心10分钟。吸出上清液部分，置于小瓶内，贮存于-20℃。用如SKidgel和Booth所述的差速离心法，制备大鼠或猪的肺和肾脏及质膜(Booth，AG.等，生化杂志142：575-581 1974，对于肺，Erdos，E.G.等，生化药理学33：3471-34781984，对于肾)。膜制备贮存于-20℃。用PBS(0.0132M磷酸盐，0.1454M NaCl，pH7.2)将血管舒缓激肽拮抗剂稀释成1mM浓度。在一排Eppendorf管内各加入这种工作液10μl，接着加入人或豚鼠血浆(90μl)，或加入PBS用作空白对照，然后被温育不同的时间。在每个时间点，通过加入100μl在乙腈或乙醇中的1N HCl，使反应终止。样品先放置大约15分钟，然后以14000rpm的转速离心10分钟。分离出上清液部分，用孔径0.22μm的滤器(Milliproe)过滤，用HPLC分析(C18，12-80％乙腈水溶液，都含有0.1％三氯乙酸，在波长214nm下进行探测)。

猪的肾、肺制备用PBS作1∶10稀释，大鼠肾制备用PBS作1∶100稀释，猪肺制备在PBS内作1∶1稀释。在一排Eppendorf管内各加入血管舒缓激肽拮抗剂溶液(10μl)，接着加入各种稀释的膜制备(90μ1)。在不同的时间点，通过加入100μl乙醇使反应终止，然后如上所述进行离心和HPLC分析。用计算机程序ENZFIT(Elsevier)测定HPLC峰消失的半衰期。稳定性数据见表2。表1。在体外功能性组织测定中的血管舒缓激肽拮抗剂的活性

B₂

化合物 pA₂ n ％恢复 B₁ n

(大鼠子宫) (兔主动脉)

1 5.67±0.17 3 32 6.41±0.25 3

2 6.76±0.71 3 0 5.79±0.065

3 6.41±0.49 3 100 ＜5 4

4 激动剂＜5 4

5 9.5±0.05 10 71 ＜5 3

6 7.3±0.03 3 93 ＜5 2

7 激动剂＜5 2

8 8.50±0.09 3 56 ＜5 4

9 7.73±0.09 3 87 5.52 4

10 5.85±0.09 3 75 5.34 4

11 激动剂＜5 4

12 激动剂＜5 4

13 9.09±0.25 10 66

14 7.65±0.25 6 81

15 8.88±0.12 6 54

16 7.68±0.09 6 60

17 8.48±0.38 5 60

CP-0589^* 6.9±0.89 3 57 未测定

CP-0601^* 7.0±0.20 3 75 未测定

HOE-140 10.3 7 41 无活性

^*CP-0589 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Thi-Gly-Ser-D-Tic-Oic-Arg

^*CP-0601 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Gly-Ser-D-Tic-Oic-Arg二种化合物都是用合成化合物1-12所述的常规固相肽合成法合成的。

拮抗剂对豚鼠回肠制备的结合：

用雄性化Hartley种豚鼠，颈部脱位处死，取得回肠。用冰冷的生理盐水灌洗回肠，使之外翻并用棉纱布擦净。然后，将该组织冷冻，贮于-70℃。使用时，取35g回肠在冰上解冻，用组织绞碎器将回肠仔细地绞碎，然后加入10倍体积(350ml)的三甲基氨基乙磺酸(TES)匀浆缓冲液(25mM，pH6.8)，其中含有一种混合的蛋白质抑制剂，(1mM1，10-邻二氮杂菲，5μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml杆菌肽，1mM苯甲脒，以及100μM苯基甲基磺酰氟)。用Brinkman PT-20Polytron匀浆器将此混合物作匀浆(设定7，4×20秒间隔)，然后作差速离心(1000xg，4℃，10分钟)。弃去沉淀，溶液部分加新鲜匀浆缓冲液使之恢复到原体积，然后在4℃，以43000xg的转速再离心15分钟。将沉淀仔细地再混悬于匀浆缓冲液中，如上再次离心。再次弃去上清液部分，沉淀部分混悬于TES缓冲液中(25mM，pH6.8)，再离心(43000g，15分钟)。将最后得到的沉淀再混悬于5倍体积(165ml)的TES缓冲液中，得到浓度大约为2.0mg/ml的蛋白质，贮存于-70℃备用。温育反应在总体积0.315ml下进行，温育液由下列成分组成：20ul氚标记的血管舒缓激肽溶液(0.3nM)，20ul非-特异对照，药物或赋形剂，150μl试样缓冲液(25mM TES，pH6.8，1mM 1，10邻二氮杂菲，1nM二硫苏糖醇(DTT)，2μM卡托普利，140μg/ml杆菌肽，100μMthiorphan和0.1％牛血清白蛋白)，和125μl稀释的膜制备(1∶4稀释，最后浓度为0.2mg/ml)，最后加入膜制备开始结合反应。检测试验在聚丙烯试管内进行，样品在24℃温育45分钟。然后，将此样品混合物通过经0.1％聚乙烯胺水溶液预处理(2小时以上)的Whatman GF/B玻璃纤维滤纸，快速过滤。滤纸和试管均用冰冷的洗涤缓冲液洗8次，每次用1.0ml，洗涤缓冲液含有10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.5)，100mM NaCl和0.02％牛血清白蛋白。用液体闪烁计数器测定放射活性。

被称为CP-0597的化合物5和标准品的数据见表2。

CP-0597(实施例5)

表2 体外测定数据小结HOE-140 CP-0597 CP-127 血管舒缓激肽B2pA2(大鼠子宫) 10.3 9.5 8.5与β₂结合 1.4pM 1.3pM 4.8nM 30.1pM(G.P.I.)半衰期数据人血浆＞6hr. ＞6hr. 2.75hr. 0.45hr.大鼠肾 N.D. ＞6hr. 0.66hr. 0.13hr.猪^*肾 N.D. ＞6hr. ＞6hr. 0.05hr.猪肺 N.D. ＞6hr. 0.15hr 0.05hr.^*NPC17761 1.17 hour^*NPC17731 4.34 hour

在实施例1中公开的，具有专利申请序列号07/859,582的CP-127，是一个二聚体，其结构通式如下：

此化合物本身是一个高活性的血管舒缓激肽拮抗剂体内试验生物学数据

兔血压：

雄性新西兰白兔用戊巴比妥麻醉，作股动脉插管用于记录血压。并在股静脉上作一插管用于快速浓注或持续滴注化合物。股动脉导管与Gould压力转换器相连，记录血压，并显示在Grass多导生理记录仪上。平衡期之后开始进行特定的实验程序。

BK₂ ED₅₀-稳定的基线血压确定之后，对动物单次快速注射血管舒缓激肽(0.2和0.4nmol，静脉注射)，引起血压降低约15-25％。先不给预待测化合物，测定血管舒缓激肽的作用，然后，再给予各种剂量(0.01，0.03，和0.10μg/kg/min静脉注射)CP-0597(化合物5)的同时，给予血管舒缓激肽，测定化合物的ED₅₀(即CP-0597引起对血管舒缓激肽最大反应的50％的剂量)。在此实验系统中，测定的ED₅₀是0.51±0.006μg/kg/min(29.2Pmol/kg/min)。

BK₁ ED₅₀-在实验前12-18小时，给兔静脉注射大肠杆菌脂多糖(LPS)(10μg/每只动物)。预先给予内毒素导致血管系统中的BK₁受体激活(upregulation)，可用于评价BK₁拮抗剂活性。刺激原先存在的BK₂受体和诱导产生的BK₁受体，都能引起低血压。血压稳定之后，对动物单次快速注射血管舒缓激肽(0.2和0.4nmol)和去-Arg⁹血管舒缓激肽(4.0和8.0nmol)。然后在不给予和给予CP-0597的情况下，对这二个激动剂进行测定，CP-0597是以递增剂量的方式给药(1，3，和10μg/kg/min)。在此实验系统中，测定发现CP-0597对BK₁活性的ED₅₀是2.9±0.92μg/kg/min(1.7nmol/kg/min)，HOE140在剂量高达10μg/kg/min时仍无活性。

静脉内给予CP-0597的选择性作用：

先测定对乙酰胆碱(20nmol)，去甲肾上腺素(20nmol)，P物质(20Pmol)，血管紧张肽(100Pmol)，血管紧张肽II(2Pmol)，和血管舒缓激肽(200Pmol)产生的血压反应，待血压稳定后，再在给予CP-0597(0.1μg/kg/min静脉注射)之后，测定每个血管作用剂的反应，并与预先的拮抗剂反应相比较。在此项研究中，与对照实验相比较，仅血管舒缓激肽的反应受到了拮抗作用，其它血管作用剂的反应未受影响。

CP-0597静脉内输注给药的作用持续时间：

CP-0597以静脉内输注给药的方式作上述选择性实验。在选择性实验完成之后，停止输注CP-0597，测定对血管舒缓激肽(0.2和0.4nmol)的反应，最初30分钟之内，每隔5分钟测定一次，以后每隔15分钟测定一次，直到停药后1小时。在输注给药停止后1小时，仍然对血管舒缓激肽的反应有100％的抑制作用。

大鼠血压：

雄性Sprague-Dawley大鼠用戊巴比妥麻醉，作股动脉插管用于记录血压。每只动物的双侧股静脉也作插管，用于待测化合物给药。股动脉导管与Gould压力转换器相连，记录血压，并显示在Grass多导生理记录仪上。平衡期之后开始进行特定的实验程序。

CP-0597皮下给药的选择性作用：

血压稳定之后，测定对乙酰胆碱(20nmol)，去甲肾上腺素(1nmol)，P物质(2Pmol)，血管紧张肽(20Pmol)，血管紧张肽II(2Pmol)，和血管舒缓激肽(20Pmol，腹膜内注射)的反应。然后，用CP-0597处理动物(1.0mg/kg皮下注射)。皮下注射CP-0597后30分钟，再测定每个血管作用剂的反应，并与预先的拮抗剂反应相比较。在此研究中，与对照相比较，仅血管舒缓激肽的反应受到了拮抗，其它血管作用剂的反应未受影响。

CP-0597静脉内单次快速注射的作用持续时间：

血压稳定后，测定对血管舒缓激肽(10Pmol和20Pmol，腹膜内注射)的反应，作为对照。然后以CP-0597作静脉内单次快速注射(3mg/kg，10mg/kg或30mg/kg)后，再测定对血管舒缓激肽的反应，每间隔5分钟测定一次，直到反应恢复到对照水平。在3μg/kg的剂量，反应被抑制了约50％，30分钟后恢复到对照水平。在10μg/kg和302g/kg的，的反应被100％抑制，60分钟后，50％恢复到对照水平，90分钟后，反应完全恢复。

CP-0597皮下给药的作用持续时间：

主动脉血压稳定之后，对动物给予血管舒缓激肽(10Pmol和20Pmol，腹膜内注射)。用于建立对照血压反应。然后动物被皮下注射给予CP-0597(1mg/kg和3mg/kg)。在注射CP-0597后30分钟，以及此后每隔30分钟，再测定动物对血管舒缓激肽的血压反应，直到反应恢复到对照水平。皮下注射CP-0597 1mg/kg时，在注射后3小时，反应仍然被100％抑制。皮下注射CP-0597 3mg/kg时，在注射后5小时，反应仍然被100％抑制。

体内试验生物学数据摘要于表3。

表3：实施例5(CP-0597)体内试验生物学数据

实验	种类	剂量	(n)	结果
实验	种类	剂量	(n)	结果	BK₂ ED₅₀	兔	.01，.03，.10μg/kg/min	(3)	ED₅₀＝.051μg/kg/min(2.92poml/kg/min)
BK₁ ED₅₀	兔	1，3，10μg/kg/min	(4)	ED₅₀＝2.9μg/kg/min(1.7nmol/kg/min)	BK₂ ED₅₀	兔	.01，.03，.10μg/kg/min	(3)	ED₅₀＝.051μg/kg/min(2.92poml/kg/min)
BK₁ ED₅₀	兔	1，3，10μg/kg/min	(4)	ED₅₀＝2.9μg/kg/min(1.7nmol/kg/min)	作用持续时间(静脉内输注)	兔	0.1μg/kg/min	(3)	注射后60分钟被100％抑制
选择性(静脉内输注)	兔	0.1μg/kg/min	(3)	仅BK₂阻滞	作用持续时间(静脉内输注)	兔	0.1μg/kg/min	(3)	注射后60分钟被100％抑制
选择性(静脉内输注)	兔	0.1μg/kg/min	(3)	仅BK₂阻滞	作用持续时间(皮下注射)	大鼠	1ml/kg	(2)	注射后3小时被100％抑制
作用持续时间(皮下注射)	大鼠	3ml/kg	(3)	注射后5小时被100％抑制	作用持续时间(皮下注射)	大鼠	1ml/kg	(2)	注射后3小时被100％抑制
作用持续时间(皮下注射)	大鼠	3ml/kg	(3)	注射后5小时被100％抑制	作用持续时间(静脉单次快速注射)	大鼠	3.0μg/kg/min10μg/kg/min30μg/kg/min	(3)(3)(3)	抑制50％，30分钟后100％恢复；抑制100％，60分钟后50％恢复，90分钟后100％恢复；抑制100％，60分钟后50％恢复，90分钟后100％恢复；

表1说明，能够开发出在血管舒缓激肽序列的第8位置，含有N-取代甘氨酸残基的高效血管舒缓激肽拮抗剂。例如，化合物5，8，13，15，和17都是高效拮抗剂，并表明具有可作为有效药剂的高度可能性。

在用大鼠子宫作为功能性组织进行测定时发现化合物4，7，11，和12是激动剂。本领域的技术人员都能理解，激动剂也是有潜在价值的心脏防护剂。并且，从事血管舒缓激肽拮抗剂开发研究的技术人员都理解，对一类组织是激动剂的化合物，对另一类组织有可能是拮抗剂。例如，Stewart已公开了一种在血管舒缓激肽序列的第7位置含有D-苯丙氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂。Stewart，发现根据豚鼠回肠的实验数据在第6位置和第7位置含有D-苯丙氨酸的拮抗剂，如Npc-360，对大鼠子宫是激动剂(见美国专利4,693,993，和J.Stewart血管舒缓激肽；基础和临床研究，P，60，1991)。的确，类似现象也同样表现于在此公开内容的所选化合物中。例如，化合物12对大鼠子宫组织显示出是一个激动剂，但对豚鼠回肠显示出拮抗剂活性，并且有非常高的结合常数(Ki＝0.2Pmol豚鼠回肠)。具有高度组织选择性的化合物，可能作为双重作用的药剂发挥功能，对一种组织可能希望它具有拮抗剂活性，但对另一些组织则可能它具有拮抗剂活性。这种考虑特别运用于开发心脏保护药剂。

本发明最优选的化合物在第7位置含有一个芳香族D-氨基酸，在第8位置含有一个N-取代的甘氨酸，在此，取代基是中等大小的环烷基或苯基。这些类似物对许多种组织具有BK₂拮抗剂活性。在芳香族环或环烷基环之间，引入一个亚甲基单位，将增加其对多种组织具有激动剂活性的可能性。类似的情况是，倘若在第8位置存在一个构型受约束的残基如Oic，在第7位置存在N-苄基甘氨酸或环取代的N-苄基甘氨酸将产生具有中等效力的拮抗剂。如果使另一个亚甲基间隔基加入甘氨酸N-取代作用，那么可以预期，这种空间延伸将产生对多种重要组织的激动剂。类似情况是，如果将在第8位置受约束的残基用一个非约束性残基如亮氨酸，或N-Chg置换，预期将产生对多种重要组织的激动剂活性。

选择性置换N-取代的甘氨酸残基，特别是在第8位置上，其重要价值是，取代基的明智选择，对化合物与血管舒缓激肽受体的结合有非常大的影响，这将导致产生有效的拮抗剂或非常紧密结合的激动剂。

通过引入N-取代甘氨酸残基，可开发出具有非常好的药剂特性的高效分子。引入N-取代甘氨酸所赋与的最重要的特性之一是对酶解作用的稳定性。表2说明，在第8位置具有N-取代甘氨酸残基的优选化合物，如化合物5，表现出对特定组织具有非常有效的受体结合作用。这些类似物，例如在实施例1中公开的，通常拥有美国专利申请序列号，07/859,582的血管舒缓激肽拮抗剂CP-127，比血管舒缓激肽本身或一些药物更加有效。

更重要的是，表2说明化合物5对一些重要酶系统的降解作用，具有不寻常的稳定性。肽类药物将被肽酶迅速降解。特别是与血管舒缓激肽有关的分子，将被下列多种酶迅速降解：氨基肽酶，羧基肽酶(CP)和肽内切酶如中性肽内切酶(NEP)和心血管紧张肽转化酶(ACE)。人血浆具有来源于羧基肽酶N和氨基肽酶M作用的，丰富的肽酶活性。在此公开内容中所述的组织制备，都显示有很强的蛋白酶活性，如下所示：

猪肾猪肺大鼠肾大鼠肺

NEP ACE NEP ACE

ACE CP-M ACE NEP

MCPrin CP-M

肽内切酶-24，16

表2中摘要的稳定性测定数据是体外试验测定结果。个别化合物在活动物的血浆，肾或肺组织中的实际稳定性可能与此不同。但是，体外试验测定法提供了一种用于比较许多化合物的可重复性方法，而不必为体内实验牺牲大量的动物。因此，这一套血浆和组织制备，可非常广泛地用于筛选肽类化合物对蛋白酶活性的稳定性，肽类药物可能遇到这种稳定性问题。在所有这些测定中，化合物5是具有大于6小时半衰期的非常有效的化合物。与此相比较，血管舒缓激肽表现出相当低的稳定性。并且看来化合物5比CP-127具有更高的稳定性。其他一些参考化合物如在Scios-Nova实验室开发的NPC 17761和NPC 17731，在第7位置含有被取代的脯氨酸残基，在第8位置含有Oic的化合物，它们在关键性的测定中，显示出可测定的较低的稳定性。

表3中提供的数据确证了体外试验测定和体内试验测定之间的互相关系。在活体兔实验中，化合物5对阻断血管舒缓激肽在BK₂受体的作用特别有效(ED₅₀ 0.051μg/kg/min)。此外，在活体兔实验中，化合物5还显示出对BK₁有基本的阻断活性(2.9μg/kg/min)。这二个实验测定结果与在中毒性休克中，血管舒缓激肽降低血压的作用非常一致，并且对预测在治疗SiS/脓毒症中的有效作用有重要的意义。所例举的化合物不仅在活体动物实验中有效力，并且还显示出长的作用持续时间(兔静脉注射给药60分钟后反应100％被抑制)。的确，已证明皮下注射下给药(大鼠，3mg/kg)后，可使激动剂作用完全阻断达5小时。一个从肽衍生的激动剂具有如此的稳定性，是非常不寻常的，并证明，含有N-取代甘氨酸的激动剂，作为药剂可能非常有用。

最后应指出用兔和大鼠二种血压模型进行的研究证明，降血压作用的阻断，与血管舒缓激肽受体的阻断有关。其他血管作用剂，如乙酰胆碱，去甲肾上腺素，P物质，血管紧张肽和血管紧张肽II的活性，都不受化合物5的影响。

参考文献

1.J.史泰华和R.瓦里克，美国专利号4,801,613。

2.J.史泰华和R.瓦里克，美国专利号4,693,993。

3.G.伯里波尔，S.亨克，J.诺里，F.霍克和B.斯库尔金斯，欧洲专利申请号0 455 133 A2。

4.D.凯利，PTC申请号：PTC/US92/10469。

5.D.凯利，PTC申请号：PTC/US92/03031。

6.D.凯利，PTC申请号：PTC/US92/03033。

7.D.杨等，含有N苄基甘氨酸的血管舒缓激肽类似物的合成，P375，第十三届美国肽研讨会，埃德蒙顿，阿尔伯他，1993年6月20日。

8.D.杨等，N苄基甘氨酸在制备有生物活性的肽的肽-类胨类似物中的应用，P323，第十三届美国肽研讨会，埃德蒙顿，阿尔伯他，1993年6月20日。

9.D.杨等，N苄基甘氨酸作为芳香氨基酸残基取代物的应用，第十一届美国肽研讨会进展，P155(1990)。

10.S.G.法玛尔和R.M.伯奇，血管舒缓激肽的药理学，血管舒缓激肽拮抗剂，R.M.伯奇编辑，马歇尔·德克公司，纽约，PP1-31，(1991)。

11.T.格里斯巴彻尔，F.兰贝克，血管舒缓激肽拮抗剂在血管舒缓激肽诱导的血浆外渗、静脉狭窄、前列腺素E2释放、伤害感受器激活和兔Iris括约肌收缩中的作用，英国药理学杂志，92：333-340(1987)。

12.Y.O.泰沃和J.D.莱文，介导血管舒缓激肽和去甲肾上腺素痛觉过敏的花生四烯酸代谢的表征，脑研究，458：402-406(1988)。

13.I.R.斯特兰卡等，作为疼痛介体的血管舒缓激肽：受体位于感觉神经元，拮抗剂具有止痛作用，美国国家科学院院刊，85：3245-3249(1988)。

14.A.德瑞，J.贝坦尼，P.福斯特和M.N.波金斯，血管舒缓激肽诱导的传入纤维的激活是能过蛋白激酶C介导的，神经科学通讯，91：301-307(1988)。

15.L.R.斯特尔兰肯，S.G.法玛尔和R.M.伯奇，B2血管舒缓激肽受体抗剂，FASEB杂志，32019-2025(1989)。

16.J.哈利，A.H.迪肯逊和M.沙克特，血管舒缓激肽在大鼠化学伤害中的作用的电生理学证据，神经科学通讯，97：198-202(1989)。

17.F.马休，A.路斯尔，D.莱格利，J.D.盖洛德，激肽药理学：它们与组织损伤和炎症的相关性，普通药理学，14：209-229(1983)。

18.D.普洛德，A.P.开普兰，激肽制剂：在炎症失调中的机制和作用，免疫学研究年鉴，6：49-84(1988)。

19.R.W.科尔曼，P.Y.王，病理状态下的激肽释放酶-激肽系统，血管舒缓激肽、赖氨酰缓激肽和激肽释放酶，药理学实验手册，第25卷，E.G.埃尔多斯编辑，斯普林杰·维拉格出版社，纽约(1979)。

20.M.W.格里维斯，炎症及介体，英国皮肤学杂志，119：419-426(1988)。

21a.F.马丁尼兹-布洛登，J.R.昂辛斯，J.麦斯特斯，V.阿马哥斯，C.瑞纳尔多，非复杂脓毒症病人中的血浆激肽释放酶-激肽系统和脓毒症休克-与心脏性休克的对比，血栓形成和血栓溶解杂志，58：709-719(1978)。

21b.E.T.威尔利，J.A.所罗门，D.M.摩达菲利，K.a.伯恩海姆，J.C.凯各尼斯，CP-0127，一种新的，强有力的血管舒缓激肽拮抗剂，提高了患内毒素休克疾病模型的大鼠和兔的存活率，试剂和作用，38：413-420(1992)。

22.S.G.法玛尔，血管舒缓激肽的气管药理学，亚伯拉罕，M.威廉，患过敏性气喘疾病模型的羊中的血管舒缓激肽，血管舒缓激肽拮抗剂，R.M.伯奇编辑，马歇尔·德克公司，纽约，PP.213-236和261-276(1991)。

23.A.昂腾伯格，C.道特尔曼，A.白特曼，W.慕勒尔-埃斯特尔，作为血管性脑水肿介体的激肽释放酶-激系统，神经外科杂志，64：269-276(1986)。

24.I.A.赫德尔和A.N.尼利，哈格曼因子依赖性激肽在出生时的活化及其与出生后免疫抑制综合症和感染的理论联系，出生看护和恢复杂志，11：496503(1990)。

25.F.西库特里，血管神经活性物质及其与血管疼痛的关系，头疼的临床学研究，1：6(1967)。

26.J.C.凯洛尼斯，E.T.威尔利，K.T.古任，S.R.尤班克，L.G.艾伦，M.J.杠甘，S.D.洛依，K.A.伯恩海姆，J.K.布洛盖特，一类新的血管舒缓激肽拮抗剂：双琥珀酰亚胺烷烃肽二聚体的合成和体外活性，医学化要志，1563-1572(1992)。

27.A.德瑞和S.贝万，TIPS， 14 287(1993)。

28.J.M.史泰华和J.D.杨，固相肽合成，皮尔斯化学公司(1984)。

29.M.伯丹斯基和A.伯丹斯基，肽合成实践，斯普林杰·维拉格出版社，1984。米克洛斯·伯丹斯基，肽合成原理，斯普林杰·维拉格出版社，(1984)。

30.G.巴兰尼等，固相肽合成25周年报告，国际肽和蛋白研究杂志，30：705739(1987)。

31.R.D.唐，D.H.里奇，M.豪安，美国化学学会杂志， 107 4342(1985)。

32.J.科斯特，肽：第二十一届欧洲肽研讨会进展(1990)。

33.M.贝尔曼；M.贝纳特；H.内里奇；L.A.卡斯皮诺；D.萨达特-阿里；通过FMOC氨基酸氯化物偶联和4-(氨甲基)六氢吡啶去封闭作用快速而连续地合成肽，有机化学杂志，55，721-728(1990)。

34.L.A.卡皮诺，D.萨达特-阿里，H.G.曹，R.H.德萨尔姆，美国化学学会杂志， 112 9652(1990)。

35.R.N.祖科尔曼，美国化学学会杂志， 114 10646(1992)。

36.T.格林尼和P.G.M.武兹提供了大量的保护基因的例子，它们与现有的肽合成技术相容，T.格林尼，P.G.M.有机合成中的保护基因，第二版，约翰·威利父子出版社(1991)。

37.H.邦德加德，前药设计，艾斯维尔出版社(1985)。

38.参考文献28，P.105-107。

39.T.H.波特尔和W.希福，医学化学杂志， 11 402(1968)。

40.J.T.希尔和F.W.道恩，有机化学杂志， 30 1321(1965)。

41.ABI 431 Fmoc步骤，应用生物系统431A型肽合成仪用户手册，第2.0版，1992年1月。

42.M.S.伯纳托维兹，G.马苏达和Y.吴，有机化学杂志， 57 2497(1992)。

43.0.阿伦拉克沙纳，H.O.希尔德，英国药理学杂志， 14 48-58(1959)。

44.A.G.布斯和A.J.肯尼，生物化学杂志， 142 575-581(1974)。

45.E.G.埃多斯，A.R.约翰逊，R.A.斯基格尔，生化药理学，33 3471-3478(1984)。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：GOODFELLOW，VAL S.

MARATHE，MANOJ V.

WHALLEY，ERIC T.

FITZPATRICK，TIMOTHY D.

KUHLMAN，KAREN G.

(ii)发明的题目：含有N-取代甘氨酸的血管舒缓激肽拮抗剂肽

(iii)序列数目：8

(iv)通讯地址

(A)收信人： CUSHMAN，DARBY & CUSHMAN

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(D)州： D.C.(哥伦比亚特区)

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(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

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(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

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1 5

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(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID N0：2：

Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa

1 5

(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Xaa Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg

1 5

(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Xaa Arg Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Xaa Arg Pro Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Xaa Arg Pro Xaa Gly Gly Ser Xaa Xaa Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Xaa Arg Pro Xaa Gly Phe Cys Xaa Leu Arg

1 5 10

Claims

1.一种下式表示的血管舒缓激肽拮抗剂，G⁷或H⁸中至少一个是N-取代甘氨酸残基，

Z’-Z⁰-A¹-B²-C³-D⁴-E⁵-F⁶-G⁷-H⁸-I⁹

其中：

Z’是氢、乙酰基、金刚烷羧基或金刚烷乙酰基，或者不存在；

Z⁰是直键、氢、D或L-Arg、D或L-Lys、D或L-鸟氨酸或δ-Gpa；

A¹是D或L-Arg、D或L-Lys、D或L-鸟氨酸或δ-Gpa；

B²是Pro、Hyp、肌氨酸、Ser、Thr或Gly；

C³是Hyp、Pro、肌氨酸或Gly；

D⁴是Gly、Ala或Thi；

E⁵是Phe、Igl或Thi；

F⁶是Ser或Cys；

G⁷是DTic、Igl、DPhe、DCpg，或者是选自NBng或DNBng的N-取代甘氨酸残基；

H⁸是Oic或者是N-取代甘氨酸残基，其选自NChg、NCpg、NPhg或C₁-C₁₂烷基取代的NChg；并且

I⁹不存在或者是Arg。

2.根据权利要求1的血管舒缓激肽拮抗剂，其中，G⁷是DTic；且H⁸是NChg、NCpg或NPhg。

3.根据权利要求2的血管舒缓激肽拮抗剂，其式为

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg。

4.根据权利要求2的血管舒缓激肽拮抗剂，其式为

δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg。

5.根据权利要求2的血管舒缓激肽拮抗剂，其式为

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NPhg-Arg。

6.根据权利要求1的血管舒缓激肽拮抗剂，其式为

D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NCpg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Igl-Ser-DTic-NChg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-DTic-NChg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-NChg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DCpg-NChg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-NPhg-Arg；

D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DNBng-Oic-Arg；或

δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg。

7、权利要求1所述的血管舒缓激肽拮抗剂在制备用于治疗血管舒缓激肽作为病原、中介体或激素信号的创伤、炎症或病理状态的药物中的用途。

8.根据权利要求7的用途，其中病理状态是疼痛或炎症。

9.根据权利要求7的用途，其中病理状态是气喘。

10.根据权利要求7的用途，其中病理状态是炎症性肠道疾病。

11.根据权利要求7的用途，其中病理状态是与头部外伤有关的水肿。

12.权利要求1所述的血管舒缓激肽拮抗剂在制备用于治疗心血管功能障碍的药物中的用途。