PL238871B1 - Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest peptydomimetyk oraz zastosowanie tego związku do wykrywania kwasów nukleinowych w jądrach komórkowych jako środek fluorescencyjny do użycia in vitro.

Peptydy penetrujące błonę komórkową (ang. cel penetrating peptides, CPPs) zawierają zazwyczaj w sekwencji do 30 reszt aminokwasowych i są w stanie wydajnie przenikać przez błonę komórkową bez istotnych oznak cytotoksyczności. Są to peptydy amfipatyczne i dodatnio naładowane zdolne do transportu przyłączonej do nich cząsteczki chemicznej (ang. cargo) do wnętrza komórki. Jednym z przykładów syntetycznych CPP jest motyw poliargininy - peptydu zawierającego co najmniej sześć reszt Arg. Dane literaturowe wskazują na większą wydajność translokacji tego peptydu w porównaniu do naturalnych CPP. Wiadomo też, że peptydy o tych właściwościach wydajnie transportują przyłączony do nich związek o masie 100-krotnie większej niż sam peptyd. Przenoszony związek może być przyłączony do CPP wiązaniami kowalencyjnymi lub też niekowalencyjnie (wykorzystując odziaływania hydrofobowe lub elektrostatyczne) poprzez utworzenie kompleksu CPP-cargo.

Istnieje szereg teorii opisujących mechanizm przenikania CPP przez błonę komórkową. Zalicza się do nich transport bezpośredni oraz różne formy endocytozy. Transport bezpośredni przebiega poprzez wytworzenie porów w błonie komórkowej, która po wniknięciu peptydu ulega regeneracji. Istnieje również szereg doniesień o transporcie CPP poprzez różne szlaki endocytozy w tym makropinocytozę lub endocytozę wykorzystującą kaweole lub tratwy lipidowe.

Niezależnie od mechanizmu w jaki CPP przenikają przez błonę fosfolipidową, związki te są wykorzystywane w terapii wybranych chorób w tym nowotworowych, w których cargo stanowią chemoterapeutyki w niewielkim stopniu penetrujące komórkę.

Lindgren i współautorzy wykorzystali metotreksan skonjugowany z peptydem YTA2 uzyskując zniesienie oporności na ten lek w liniach komórkowych raka piersi.

W chwili obecnej wykorzystanie peptydów penetrujących błonę komórkową stanowi część badań klinicznych w terapii zapalenia skóry, raka i niewydolności kardiologicznej.

Jądro komórkowe jak powszechnie wiadomo stanowi główny i najważniejszy składnik większości komórek, w którym zachodzi transkrypcja przez co stanowi cel molekularny wielu terapii. Transport substancji terapeutycznych do wnętrza jądra komórkowego wciąż stanowi wyzwanie dla świata nauki. Wiadomo, że aby efektywnie dostarczyć cząsteczkę do jadra należy oznaczyć ją sekwencją lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization sequences (NLSs)). Sekwencja ta musi zawierać co najmniej dwa fragmenty składające się z czterech lub więcej reszt aminokwasów zasadowych. Typowym przykładem tego typu sekwencji jest PKKKRKV stanowiąca fragment antygenu T małpiego wirusa 40 (SV40). Wykorzystanie tej sekwencji prowadzi do efektywnego wprowadzenia do jądra komórkowego szeregu związków takich jak peptydy, białka czy DNA.

Istnieje szereg patentów dotyczących tematyki związków penetrujących błonę komórkową które wykorzystywane są jako nośniki substancji czynnych (terapeutycznych). Związki te w ogromnej swej większości stanowią zasadowe syntetyczne peptydy zbudowane z znaczącej ilości reszt argininy lub lizyny [1, 2] lub fragmenty białek lub peptydów naturalnych [3, 4].

Znane peptydomimetyki (związki zawierające aminokwasy niebiałkowe) o podobnych właściwościach to grupa peptydów zawierających reszty aminokwasowe w konfiguracji D (4).

W opisie wynalazku WO 2015075747 ujawniono peptyd penetrujący komórki poprzez dostarczanie biomolekuł do komórki eukariotycznej. Niniejszy wynalazek w szczególności dotyczy układu dostarczania leku opartego na peptydzie do dostarczania kwasów nukleinowych i/lub białek i/lub peptydów / małych cząsteczek do komórek, in vitro lub in vivo. W innym opisie wynalazku WO2014053880A1 również ujawniono nowy peptyd do penetracji komórek.

Wynalazek US 9572900 dotyczy koniugatu peptydu penetrującego komórki i składnika aktywnego oraz jego zastosowania.

W opisie WO 2007076904 A1 ujawniono peptyd, który ma sekwencję aminokwasową obejmującą co najmniej 8 kolejnych aminokwasów białka ludzkiej laktoferyny lub białka laktoferyny bydlęcej, przy czym peptyd jest odpowiedni do działania jako peptyd penetrujący komórkę.

Twórcy przedmiotowego wynalazku zaprojektowali i zsyntetyzowali nowy rodzaj peptydomimetyków składających się z reszt kwasu L-2,3-diaminopropinowego, którego grupy aminowe łańcucha bocznego zostały zmodyfikowane przez krótkie sfunkcjonalizowane reszty glikolu etylenowego. W efekcie otrzymano szereg mimetyków reszt aminokwasowych o wysokim stopniu rozpuszczalności i posiadająPL 238 871 B1 cych w łańcuchu bocznym szereg grup funkcyjnych (aminową, hydroksylową, guanidynową, karboksylową, alifatyczną i aromatyczną). Związki składające się z tak otrzymanych monomerów charakteryzują się wysoką odpornością na proteolizę oraz stabilnością w warunkach hodowli komórkowej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest peptydomimetyk o strukturze przedstawionej na schemacie 1. Związek ten ma wzór F1-O2Oc-[Dap(GO2)]6-O2Oc-NH2, gdzie F1 to fluoresceina, O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy, Dap to kwas L-2,3-diaminopropionowy, GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy. Związek zawiera w sekwencji ugrupowanie fluorescencyjne (5/6-karboksyflouresceinę). Związek ten inkubowany z komórkami skóry (fibroblasty i keratynocyty) efektywnie przenika do jądra komórkowego, a co więcej ulega w tej organelli zauważalnej akumulacji. Związek ten zbudowany jest z sześciu reszt DAPEG (kwasu L-2,3-diaminopropionowego (DAP) modyfikowanego w łańcuchu bocznym resztami sfunkcjonalizowanego glikolu etylenowego (PEG). Nasze badania dowodzą, że związek ten efektywnie penetruje błonę komórkową testowanych komórek i jest akumulowany w jądrze komórkowym nie wykazując przy tym istotnej cytotoksyczności. Ponadto związek ten jest stabilny proteolitycznie.

Wynalazek stanowi zastosowanie związku przedstawionego na wykresie 1 jako środek in vitro do fluorescencyjnej wizualizacji kwasów nukleinowych obecnych w jądrze komórkowym.

Sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego powyżej, następuje w etapach:

a) usuwa się ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTAGEL SRAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF,

b) następnie do tak przygotowanego nośnika przyłącza się cząsteczkę linkera będącego O2Oc za pomocą standardowej procedury syntetycznej z wykorzystaniem diizopropylodiimidu, oba składniki rozpuszcza się w DMF,

c) roztwór ten łączy się z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny, d) następnie odsącza się żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukuje się, e) procedurę przyłączania linkera do polimeru powtarza się dwukrotnie,

f) do tak przygotowanej żywicy przyłącza się Fmoc-Dap(Mtt) wg standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2),

g) czynność tą powtarza się sześciokrotnie,

h) następnie do grupy aminowej kwasu diaminopropionowego przyłącza się Fmoc-O2Oc (kwas fluororenylometyloksykarbonylo-amino)-3,6-dioksaoktanowy,

i) następnie po usunięciu ugrupowania Fmoc z grupy aminowej przyłącza się 5/6-fluoresceinę służącą jako znacznik fluorescencyjny,

j) następnie z F1-O2Oc-[Dap(Mtt)]6-O2Oc-żywicy w kolejnym kroku usuwa się ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu, czas mieszania 15 minut,

k) po tym czasie do próbki żywicy dodaje się trzy krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwuje powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt, l) procedurę powtarza się aż do uzyskania bezbarwnego roztworu, m) następnie żywicę przepłukuje się trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%),

n) otrzymuje się F1-O2Oc-Dap6-O2Oc-żywicę do której dodaje się roztwór GO2//DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v), gdzie DIPCI to diizopropylokarbodiimid a GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy,

o) reakcję acylowania prowadzi się aż do uzyskania negatywnego testu Kaisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy,

p) otrzymany peptydomimetyk usuwa się następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v) otrzymując F1-O2Oc-[Dap(GO2)]6-O2Oc-NH2.

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Peptydomimetyk - oznacza związek o strukturze naśladującej peptyd zawierający aminokwasy niebiałkowe.

Cargo - oznacza cząsteczki chemiczne przyłączone do peptydów.

Dap - oznacza pochodną kwasu 2,3-diaminopropionowego.

DAPEG - oznacza związek zawierający reszty Dap i PEG.

PL 238 871 B1

PEG - oznacza sfunkcjonalizowane reszty glikolu mono lub dietylenowego (na przykład O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy lub GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy).

DIPCI - oznacza diizopropylokarbodiimid.

O2Oc - kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy

F1 - oznacza fluoresceinę.

Wynalazek przybliżono na schematach gdzie na schemacie 1 pokazano wzór związku zaś na schemacie 2 wizualizację ścieżki powstawania związku - etapy metody syntezy.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia analizę MS MALDI-TOF. Masa obliczona wynosi 2306,45. Sygnał 2037,6 stanowi jon pseudomolekularny [M+H]+. Pozostałe sygnały pochodzą z fragmentacji związku.

Fig. 2 - przedstawia chromatogram RP-HPLC peptydomimetyku w gradiencie 10-90% B w ciągu 40 minut. Faza A: 0,1% roztwór TFA w wodzie, faza B: 80% roztwór acetonitrylu w fazie A. Przepływ fazy ruchomej 1 ml/min. Detekcja prowadzona przy długości fali 226 nm.

Fig. 3A i B - przedstawia zdjęcie z mikroskopu gdzie widać fluorescencję jądra komórki - związek inkubowany z ludzkimi fibroblastami A) oraz związek inkubowany z ludzkimi keratynocytami B).

Fig. 4 - Przedstawia zdjęcie Western-Blot jako efekt doświadczenia gdzie związek w różnych stężeniach inkubowany był z DNA plazmidowym (10 nmol), co powoduje powstanie kompleksu o zmienionej szybkości migracji w stosunku do samego DNA gdzie systemy 2-11 to mieszanina związku (o wzrastającym stężeniach) i DNA, system 12 to samo DNA, 13 sam związek, linie 1 i 14 stanowią marker masowy DNA o różnych masach.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1

Potwierdzenie struktury chemicznej

Widmo mas oraz analiza HPLC (odpowiednio Fig. 1 i Fig. 2) jednoznacznie potwierdzają właściwą masę związku oraz jego jednorodność. Sygnał jonu masowego m/z=2307 oraz pik o czasie retencji 21,06 potwierdzają jednorodność i właściwą masę otrzymanego związku.

P r z y k ł a d 2

Synteza chemiczna

W syntezie związku wykorzystano nowe bloki budulcowe będące pochodnymi kwasu diaminopropionowego (Dap) zmodyfikowane sfunkcjonalizowanymi resztami glikolu mono lub dietylenowego (PEG) (których proponowana nazwa ogólna to DAPEG (DAP+PEG)) których przykładowa synteza przedstawiona jest na schemacie 2.

Synteza peptydomimetyku F1-O2Oc-Dap[(GO2)]6-O2Oc-NH2, składa się z następujących etapów:

1) Pierwszy z nich to usunięcie ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTA GEL S RAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF. W kolejnym kroku do tak przygotowanego nośnika przyłącza się cząsteczkę linkera będącego O2Oc za pomocą standardowej procedury syntetycznej z wykorzystaniem diisopropylodiimidu. Oba składniki rozpuszcza się w DMF. Roztwór ten połączono z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny. Po tym czasie odsączono żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukano. Procedurę przyłączania linkera do polimeru powtórzono dwukrotnie.

Do tak przygotowanej żywicy przyłączono Fmoc-Dap(Mtt) wg standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2). Czynność tą powtórzono sześciokrotnie. W kolejnym kroku do grupy aminowej kwasu diaminopropionowego przyłączono Fmoc-O2Oc (kwas fluororenylometyloksykarbonylo-amino)-3,6-dioksaoktanowy, a następnie po usunięciu ugrupowania Fmoc z grupy aminowej przyłączono 5/6-fluoresceinę służącą jako znacznik fluorescencyjny.

Następnie z F1-O2Oc-Dap(Mtt)6-O2Oc-żywicy w kolejnym kroku usunięto ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu. Czas mieszania 15 minut. Po tym czasie do próbki żywicy dodano 3 krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwowano powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt. Procedurę powtarzano aż do uzyskania bezbarwnego roztworu.

PL 238 871 B1

2) W kolejnym etapie żywicę przepłukano trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%). W efekcie otrzymano F1-O2Oc-Dap6-O2Oc żywicę do której dodano roztwór GO2/DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v), gdzie DIPCI to diizopropylokarbodiimid a GO2 kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy.

Reakcję acylowania prowadzono aż do uzyskania negatywnego testu Kaisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy.

Otrzymany peptydomimetyk usunięto następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v). otrzymując F1-O2Oc-Dap[(GO2)]6-O2Oc-NH2.

P r z y k ł a d 3

Właściwości

Związek został rozpuszczony w PBS (bufor fosforanowy z dodatkiem NaCl) i wprowadzony w stężeniu 10 μM do hodowli komórkowej fibroblastów ludzkich. Po inkubacji trwającej 1 godzinę hodowlę przemyto PBS i analizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Axio Vert Zeis stosując filtr umożliwiający detekcję fluoresceiny.

Analogiczny eksperyment przeprowadzono wykorzystując ludzkie keratynocyty. W efekcie zaobserwowano silną fluorescencję jądra komórki (Fig. 3A i 3B).

Związek inkubowany (w stężeniach od 10 nmol/dm³ do 8 μmol/dm³) z plazmidowym DNA (10 nmol) powoduje powstanie kompleksu o zmienionej szybkości migracji w stosunku do samego DNA (Fig. 4).

Literatura

1. Chugh A, Eudes F, Shim YS. IUBMB Life. 2010 Mar; 62(3): 183-93.

2. Lindgren M, Hallbrink M, Prochiantz A, Langel U. Trends Pharmacol Sci. 2000 Mar;

21(3): 99-103.

3. Frankel AD, Pabo CO. Cell. 1988 Dec 23; 55(6): 1189-93.

4. Reyes-Cortes R, Acosta-Smith E, Mondragón-Flores R, Nazmi K, Bolscher JG, Canizalez-Roman A, Leon-Sicairos N. Biochem Cell Biol. 2017 Feb; 95(1): 76-81.

5. Robison AD, Sun S, Poyton MF, Johnson GA, Pellois JP, Jungwirth P, Vazdar M, CremerPS. J Phys Chem B. 2016 Sep 8; 120(35): 9287-96.

6. Munoz-Alarcón A, Eriksson J, Langel ϋ. Nucleic Acid Ther. 2015 Dec; 25(6): 306-10.

7. Jones AT, Sayers EJ. J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2): 582-91.

8. Wadia JS, Stan RV, Dowdy SF. Nat Med. 2004 Mar; 10(3): 310-5.

9. Wallbrecher R, Ackels T, Olea RA, Klein MJ, Caillon L, Schiller J, Bovee-Geurts PH, van Kuppeveit TH, Ulrich AS, Spehr M, Adjobo-Hermans MJW, Brock R. J Control Release. 2017 Jun 28; 256: 68-78.

10. Chugh A, Amundsen E, Eudes F. Plant Cell Rep. 2009 May; 28(5): 801-10.

11. Eudes F, Chugh A. Plant Signal Behav. 2008 Aug; 3(8): 549-50.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek o wzorze:

   F1-O2Oc-Dap[(GO2)]s-O2Oc-NH2, gdzie F1 to 5,6-fluoresceina, O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy, Dap to kwas L-2,3-diaminopropionowy, GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy.
2. 2. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 jako środek fluorescencyjny do wykrywania substancji in vitro w jądrach komórkowych.